ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

טרשת נפוצה היא מחלה אנושית מאופיינת בדלקת כרונית ניווניות של מערכת העצבים של מערכת העצבים המרכזית אשר נחשב להיות מונע על ידי תגובה אוטואימונית מכוונת המיאלין. ההפסד של המיאלין אקסונים לאורך הזמן לגרום לירידה ההדרגתית של מנוע קוגניטיבית פונקצית 1. "Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית" הוא מונח כללי עבור במודלים של בעלי חיים של מחלה אוטואימונית מכוונת המיאלין במערכת העצבים המרכזית. כמו MS האדם, EAE מאופיין בדרך כלל על ידי חדירה של תאי מערכת החיסון של מערכת העצבים המרכזית, ובמקרים מסוימים, demyelination 2. עם זאת, את המידה שבה נתון כל מודל EAE דומה האדם MS בחלקו תלוי המין או זן בשימוש ועל המורכבות של תגובה אוטואימונית נגד המיאלין הבסיסי.

אוטואימוניות נגד המיאלין יכולות להיגרם באופן ניסיוני במספר דרכים, אך השיטה הנפוצה ביותר בשימוש כיום היא לחסן עכברים עם פפטיד קצר של חומצות אמינו מחק את CD4 immunodominant 35-55), אשר משמש כדי לגרום EAE ב C57Bl / 6 עכברים 3. עם זאת, עבור כמה מטרות ניסוי רצוי או אפילו צורך לחסן עם אנטיגנים חלבון גדולים ואכן ישנם מספר יתרונות לכך על חיסון עם פפטיד קצר. ראשית, בגלל הגבלת MHC, פפטידים קצרים הם בדרך כלל יעילים רק בטווח מצומצם מאוד של זנים, בעוד אנטיגנים חלבון גדולים המייצגים גם את החלבון השלם או תחום מסוים יכולים להיות מעובד בדרך כלל לצורך הציג זני עכבר מרובים טהור או אפילו במינים שונים 4. שנית, אנטיגן חלבון גדול מסוגל גרימת תגובה חיסונית מורכבת יותר שילוב סוגים נוספים של הלימפוציטים הכרת אנטיגן, ולא limitinהכרת אנטיגן גרם לתאי T מסוג CD4 +. לדוגמא, תאי B באמצעות קולטן תא B שלהם (BCR) אינטראקציה ישירה עם שלם ולא חלבון מעובד. אנחנו ואחרים הראו תאי B מופעל על ידי חיסון MOG 35-55 אינם מכירים MOG חלבון 5. מאחר ותאי B הודגמו לאחרונה לשחק תפקיד פתוגניים האדם MS 6, מודלים EAE המשלבים תאי B בפתולוגיה אוטואימוניות חשובים יותר ויותר.

למרות היתרונות של שימוש אנטיגנים חלבון גדול יותר כדי לגרום EAE, נותרו כמה מקורות זמינים מסחרית עבור חלבונים כאלה. ואכן, בעוד פפטידים קצרים כמו MOG 35-55 יכול להיות מסונתזים מהר מאוד ובעלות נמוכה יחסית, האפשרויות המסחריות לחלבון MOG מוגבלות עלות משמעותית יותר לרכוש. עם זאת, ישנם מספר וקטורי ביטוי זמין עבור קבוצות מחקר כדי ליצור תחום תאי ש"א (ש"א 1-125) עצמם. However, כל מערכות הביטוי שזיהינו בספרות מבוססת על טכנולוגיות ישנות יותר כי הוחלפו מאז עם מערכות ביטוי יעילות יותר 7. יתר על כן, רובם מבוססים על MOG חולדה או אדם 8. עבור חקירות כמה אוטואימיוניות בעכברים, אנטיגן מבוסס על autoantigen העכבר MOG עדיף. לבסוף, כל חלבונים המבוססים MOG שזיהינו, או המסחריים או כמו וקטורי ביטוי, הם חלבוני היתוך המכילים חומצות אמינו נוספות לבסיס MOG 1-125. אלה כוללים תג לטיהור ובדרך כלל רצפים אחרים גם כן, רבים מהם עם פונקציה לא הצלחנו לזהות.

כדי לטפל במגבלות אלה, שעוררנו חלבון היתוך רומן המבוסס על תחום MOG העכבר התאי התמזג תג המכיל thioredoxin כדי להילחם insolubility הידוע של MOG חלבון 5. רצף תג גם מכיל רצף 6xHis לטיהור וכן CLE פרוטאז TEVavage אתר המאפשר עבור הסרה מלאה של כל רצפי תג, אם תרצה בכך. זוהי השיטה היחידה שאנו מודעים לייצר חלבון MOG 1-125 טהור. כדי להקל על ייצור של כמויות גדולות של חלבון, רצף MOG 1-125 היה קודון אופטימיזציה עבור ביטוי חיידקים חלבון היתוך תג MOG הוכנס למערכת הביטוי PET-32. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הפרוטוקול לייצר ולטהר חלבון תג MOG, וטהור MOG 1-125, תוך שימוש בציוד שאינו מתמחה לרשות ברוב מעבדות אימונולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אינדוקציה חלבון

הערה: בשלבים הבאים, חיידקי קולי BL21 Escherichia הפך עם וקטור PET-32 המכיל את רצף עבור היתוך תג MOG חלבון (ראה התייחסות 5 ואיור 1) גדלים לצפיפות גבוהה הם המושרה אז לבטא את חלבון תג MOG . ראה איור 2 עבור ציר זמן כולל - לב שימים הם נקודות עצירה משוערות חלופיות מצוינות בפרוטוקול. אם מתחילים עם DNA וקטור PET-32 ש"א תג מטוהרים, יהיה צורך להפוך אותה כימית לתוך BL21 E. המוסמכת חיידקי קולי באמצעות מבחר אמפיצילין, כפי שכבר היטב תיאר 9. טרנספורמציה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי טיהור DNA מחיידקים שנבחרו באמצעות ערכת מסחרי רגיל, ואחריו עיכול עם הגבלה אנזימים AGE1 ו Sac1 לייצר להקה 424 נ"ב על ג'ל agarose 10.

    תג BL21-ש"א דגירה זה לילה בשעה 37 ° C, 200 סל"ד.
  1. מניחים שתי 1 צלוחיות L Erlenmeyer המכיל 500 מ"ל של מרק LB סטרילי בתוך 37 ° C חממה לקראת היום הבא.
  2. הוסף 500 μl של 100 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין לכל אחד צלוחיות המכיל 500 מ"ל LB משלב 1.2 (מ"ג 0.1 לריכוז סופי / אמפיצילין מ"ל). העבר 1 מ"ל של תרבות לילה משלב 1.1 לכל אחד משני צלוחיות של מרק LB. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 5 שעות או עד צפיפות אופטית של 0.6.
  3. קח אחד aliquot 1 מ"ל מאחד צלוחיות ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל נפרד. גלולת התאים ב XG 16,000 עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant. לייבל הצינור כמו T 0 (טרום אינדוקציה) ולאחר מכן לשים את גלולת החיידקים לתוך -20 ° C במקפיא במשך ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן בעתיד (SDS-PAGה) ניתוח (ראה סעיף 8 ואיור 3).
  4. הוסף 0.5 מ"ל של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside, איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) לכל בקבוק תרבות. דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 4 שעות, ולאחר מכן בטמפרטורת החדר ב 75 סל"ד לילה.

2. חלבון תג קציר MOG

הערה: בשלב זה, החיידק יהיה הניבה כמויות גדולות של חלבון תג MOG. כדי לקצור תג MOG, חיידקים הם lysed הראשון חיץ X-100 Triton ואחריו sonication. תג ש"א הוא שוחרר אז מגופי הכלה מפוגל עם imidazole ו guanidine, וכתוצאה מכך פתרון חלבון גולמי המכיל את חלבון תג MOG.

  1. קח אחד aliquot 1 מ"ל מאחד תרבויות לילה משלב 1.5 ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. גלולת התאים ב XG 16,000 עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant. לייבל באמבטיהדואר T O / N (שלאחר אינדוקציה) ואז לשים גלולה החיידקים לתוך -20 ° C במקפיא לניתוח דף SDS בעתיד (איור 3).
  2. הפץ את תרבויות שווה בין 250 מ"ל בקבוקים תואם צנטריפוגה במהירות גבוהה ולשמור על הקרח הללו מכאן ולהבא. גלולה תאים חיידקיים על 22,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
  3. בטל supernatant. אחסן את כדורי החיידקים ב -20 ° C או המשך לשלב 2.4.
  4. הכן חיץ תמוגה (0.1 מ"ג / ליזוזים ביצה תרנגולת מ"ל, 0.1% Triton-X (V / V) ב בופר פוספט (PBS)) על ידי הוספת 60 μl של טריטון X-100 ו -120 μl של 50 מ"ג / ליזוזים ביצה תרנגולת מ"ל פתרון מניות 60 מיליליטר של PBS.
  5. Resuspend ולשלב את כל כדורי חיידקי משלב 2.3 ב סך של 30 מ"ל של חיץ תמוגה. העבר בכרך זה לצינור מ"ל עגול התחתונה 50 מסוגל צנטריפוגה במהירות גבוהה. מניחים צינור זה באמבט מים C ° 30 למשך 30 דקות. בזמן הדגירה, לנער את הצינורפעמיים כדי resuspend התאים.
  6. לאחר דגירה, להעביר את הצינור על הקרח sonicate הפתרון ב 20 קילוהרץ, משרעת 70%, דופק על 3 שניות, דופק את 3 שניות, וחמישה פולסים בכל סבב. Sonicate הפתרון במשך שישה סיבובים הכוללים ולאפשר הפתרון לצנן על קרח-בין סיבובים.
  7. צנטריפוגה הפתרון ב 24,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant וחזור על שלבים 2.5-2.7 פעם. אחסן את הגלולה ב -20 ° C או המשך לשלב 2.8.
  8. הכן הצפת (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 imidazole מ"מ, pH 7.9) על ידי הוספת 0.8766 גרם של NaCl, 0.09456 גרם של טריס-HCl, ו 0.01021 גרם של imidazole מבחנה 100 מ"ל. הוסף H 2 O עד נפח מגיע 28 מ"ל ולאחר מכן להתאים את ה- pH של התמיסה עד 7.9. ואז, להעביר את פתרון 100 מ"ל סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח הוא 30 מ"ל.
  9. Resuspend גלולה משלב 2.7 ב 30 מ"ל של חיץ דגירה הפתרון הזה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. בזמן הזהלשקול את 17.2 גרם של-HCl guanidine.
  10. Sonicate הפתרון על הקרח באמצעות אותן הגדרות כמו בשלב 2.6. לאחר מכן להוסיף 17.2 גרם של guanidine-HCl לפתרון. לדגור על הקרח הזה במשך שעה 1 כדי solubilize חלבון תג MOG.
  11. צנטריפוגה הפתרון ב 24,000 XG במשך 30 דקות ב 4 °. איסוף supernatant ולאחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס עד טיהור חלבונים.

3. טיהור חלבון

הערה: בשלבים הבאים חלבון תג MOG יהיה מטוהר באמצעות 4 סיבובים של קליטה על שרף ניקל טעון (באמצעות התג שלו) ו elution.

  1. הפוך את החוצצים בעקבות:
    1. הכן הצפת B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 imidazole מ"מ, 6 M guanidine HCl, pH 7.9). הוסף 5.844 גרם של NaCl, 0.6304 גרם של טריס-HCl, 0.0681 גרם של imidazole, ו 114.64 גרם guanidine-HCl כדי מבחנה 500 מ"ל. לאחר מכן מוסיפים H 2 O עד שהוא מגיע 190 מ"ל ולהתאים את ה- pH ל -7.9. מעביר את הסולution על 250 מ"ל סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח של 200 מ"ל.
    2. הכן חיץ Elution (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M imidazole, 6 M guanidine HCl, pH 7.9). הוסף 5.844 גרם של NaCl, 0.6304 גרם של טריס-HCl, 6.808 גרם של imidazole, ו 114.64 גרם guanidine-HCl כדי מבחנה מ"ל 500. הוסף H 2 O עד שהוא מגיע 190 מ"ל ולהתאים את ה- pH ל -7.9. מעבירים את הפתרון על 250 מ"ל סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח של 200 מ"ל.
    3. הכן חיץ עזה (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 מ"מ EDTA, pH 7.9). הוסף 5.844 גרם של NaCl, 0.6304 גרם של טריס-HCl, 40 מ"ל 500 mM EDTA כדי מבחנה מ"ל 500. הוסף H 2 O עד שהוא מגיע 190 מ"ל ולהתאים את ה- pH ל -7.9. מעבירים את הפתרון על 250 מ"ל סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח של 200 מ"ל.
    4. הכין חיץ טעינה (0.1 M סולפט ניקל). הוסף סולפט ניקל 5.257 גרם מבחנה 500 מ"ל ולהוסיף H 2 O עד שהוא מגיע 190 מ"ל (זהירות, אל תגעו ניקלסולפט מחוץ במנדף עד סולפט ניקל כבר מומס O H 2). לאחר סולפט ניקל נמס, להעביר את הפתרון 250 מ"ל סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח יגיע ל- 200 מ"ל.
  2. פיצול 10 מ"ל של שרף ניקל בין שני צינורות צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל מסוגל לעמוד בפני כוחות צנטריפוגליים מעל 4,500 XG (5 מ"ל בצינור אחד).
  3. הטען לאזן שרף ניקל:
    1. שטפו את שרף על ידי הוספת 40 מ"ל H 2 O על צינור אחד המכיל שרף. הנח את הצינורות אופקיים על כיסא נדנדה ולתת להם להתסיס במשך 5 דקות ב 4 ° C. פעם סיים, צנטריפוגה צינורות ב 4500 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C.
    2. בטל supernatant ידי pipetting להימנע להפריע גלולה. הוסף 40 מ"ל של חיץ תשלום על צינור אחד. העברת הצינורות על כיסא נדנדה ולתת להם להתסיס במשך 15 דקות ב 4 ° C. פעם סיים, צנטריפוגה צינורות ב 4500 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C.
  4. אופציונלי: קח 150 μl של החלבון solubilized שנאספו בשלב 2.11 ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. לייבל הצינור כמו-דגירה מראש ולהקפיא זה ב -20 ° C לניתוח בעתיד דף SDS (איור 3, תג הגולמי ש"א).
  5. לטהר את חלבון תג MOG:
    1. מעביר את כל הנפח של חלבון solubilized משלב 2.11 (~ 40 מיליליטר, מינוס המדגם הקטן שהסיר בשלב 3.4) אל הצינור הראשון (איור 2, צינור 1) המכיל שרף ניקל משלב 3.3, לערבב, ומניחים אופקיים על כיסא נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. צנטריפוגה הצינור ב 4,500 XG במשך 8 דקות ב 4 °. בסיום, להעביר את supernatant השניצינור (איור 2, צינור 2) של שרף ניקל דגירה כפי שמתואר בשלב הקודם. בינתיים, ממשיכים בצעדים 3 עד 6 מתחת עם צינור 1.
    3. Resuspend שרף ניקל צינור 1 ב 40 מ"ל של חיץ elution ובמקום הצינור אופקית על כיסא נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגות הצינור ב 4,500 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C.
    4. מעבירים את supernatant המכיל eluted חלבון MOG תג לתוך בקבוק מ"ל 250 שכותרתו 'חלבון תג MOG מטוהרים' ולשמור את הבקבוק הזה ב 4 ° C. עם כל צעד elution, לרכז את supernatant וכתוצאה מכך הבקבוק הזה.
    5. הוסף 40 מ"ל של חיץ רצועת שרף ניקל ומניחים אופקית על כיסא נדנדה במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    6. צנטריפוגה הצינור ב 4,500 XG במשך 8 דקות ב 4 °. בטל supernatant, ולאחר מכן לטעון את שרף ניקל כמפורט בשלב 3.3.
    7. לאחר שסיים, להתקדם עם הצינור השני כמו המפורטים בשלב 3.5. סך של 4 עגולים של ספיגת חלבון solubilized משלב 2.11 על שרף ניקל טעון elution יתאושש ביותר של החלבון אם כי, אם ירצה בכך, חלבון נוסף יכול להיות התאושש ב סיבובים נוספים של קליטת elution.
  6. לאחר ארבעה (או יותר) סיבובי קליטת elution הושלמו, לאחסן החלבון המטוהר ונקווה ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. שרף ניקל ניתן לאחסן 40 מ"ל של פתרון אתנול 20% ב 4 ° C עד שיהיה בו צורך שוב.

4. מדידת ריכוז חלבון

הערה: לפני שתמשיך יש צורך לכמת את כמות החלבון המטוהר MOG תג שנוצר בסעיף 3. ערך זה ישמש כדי לקבוע את הנפח הסופי לרכז את החלבון בסוף הפרוטוקול. אנו מתארים ברדפורד Assay תקן כאן. ריכוז חלבון תג MOG מטוהר נקבע על ידי השוואת ספיגת ספקטרלי של סדרתי dilutחלבון תג ed MOG כדי עקומת סטנדרט של אלבומין בסרום שור (BSA) בריכוז ידוע.

  1. הפוך 10x חיץ אצטט ידי הוספת 23 מ"ל חומצה אצטית קרחונית כדי נתרן אצטט 8.2 גרם בכוס 3 L ולאחר מכן להוסיף 1.9 ליטר של H 2 O לפרק את אצטט נתרן. העבר את הפתרון הזה על L 2 סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח מגיע 2 L. ואז לאחסן אותו בתוך בקבוק 2 ליטר בטמפרטורת החדר. הפוך 1 מ"ל של חיץ אצטט 1x ידי הוספת 100 μl של 10x חיץ אצטט עד 900 μl של H 2 O.
  2. הגדרת צלחת 96-גם עבור דילולים על ידי הוספת 30 μl של חיץ אצטט 1x לבארות G2-8 ו -60 μl כדי G9. להוסיף 48 μl של חיץ אצטט 1x ל H2 ו- H3.
  3. הגדר את דילול סדרתי ההתקן לראשונה BSA בשורת G כדלקמן: להוסיף 216 μl של חיץ יצטט 1x ו -54 μl לסטנדרטים זמינים מסחרי 2 מ"ג / מיליליטר BSA ב G1 היטב ומערבב היטב. להוסיף 210 μl מ G1 היטב G2 טוב, ומערבבים היטב,ולאחר מכן להוסיף 180 μl של היטב G2 כדי גם G3. הוספת 150 μL של G3 היטב G4 היטב, ומערבבים היטב, ולהמשיך במגמה זו של הוספת 30 μl פחות היטב כל הבאים, עד G8 היטב. (ראה טבלה מס '1 עבור רשימות של גורמים לדילול שווה ערך).
  4. הגדר דגימות בשלושה עותקים של כל דילול על ידי העברת 10 μl של ה- G1 גם לבארות A1, B1, ו- C1, ו -10 μl של G2 גם לבארות A2, B2, ו- C2, וכן הלאה. השתמש פיפטה רבה.
  5. כדי להגדיר דילולים של תג MOG, להוסיף 60 μl של חלבון תג MOG מטוהרים מן הצעד 3.6 טוב H1. להוסיף 12 μl מבאר H1 ל H2 היטב, ומערבבים היטב, ולאחר מכן להוסיף 12 μl של H2 לבאר H3, ומערבבים היטב (זה מייצר דילול 1x ב H1, 1/5 דילול H2 ו- 1/25 דילול H3) .
  6. הגדר דגימות בשלושה עותקים עבור דילולים תג MOG ידי העברת 10 μl של בארות H1-H3 לשורות D, E ו- F, כמתואר בשלב 4.4.
  7. מערבבים 2 מ"ל של צבע assay חלבון תרכיז מגיב עם 8 מ"ל של H 2 O. הוסף 200 μl של תערובת זו לכל הבארות שנטענו מראש בשורות A, B, C, D, E ו- F, באמצעות פיפטה רבה, אם הוא זמין. פופ כל בועות בבארות באמצעות מחט לפני שתקרא את ריכוז החלבון.
  8. בתוך 10 דקות של הוספת ריאגנט צבע, למדוד את ספיגת 595 ננומטר של כל בארות בשורות A, B, C, D, E, ו- F.
  9. שורות השתמש A, B, ו- C להקים עקומת סטנדרט שבו עמדות 1-9 מתאימות 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1, 0.05, ו 0 מ"ג / מ"ל ​​BSA. בהתבסס על עקומה זו, לחשב את הריכוז של חלבון תג MOG באמצעות דילול של תג MOG המתאים ביותר עקומת סטנדרט. בדרך כלל, יהיה בין 200 ל -250 מ"ג של חלבון התג ש"א מ 1 ליטר של תרבית חיידקים באמצעות הפרוטוקול מתואר כאן.
    הערה: כדי להפוך MOG 1-125 להמשיך מכאן אל בסעיף האופציונלי 7 מופיע בסוף הפרוטוקול. אחרת, המשך לסעיף 5.

ילדה = "jove_title"> 5. דיאליזה

הערה: הדיאליזה מבוצעת כדי להסיר guanidine בהדרגה מהפתרון המכיל תג מטוהר, מפוגל MOG לאפשר החלבון ולקפל. יש להקפיד במהלך שלב זה כמו MOG עצמו הוא מאוד מסיס, ובזמן הזה הוא השתפר על ידי נוכחות של תג thioredoxin, הוא עדיין נוטה לבוא מתוך פתרון. לכן, מקפל צריכה להתבצע בהדרגה בריכוז תג יחסי נמוך MOG.

  1. לפני שמתחילים דיאליזה, לדלל את חלבון תג MOG מטוהרים עם חיץ B (חיץ B יכול להתבצע כפי המפורטים בשלב 3.1) עד ריכוז הוא 0.5 מ"ג / מ"ל או פחות, בהתבסס על כמות של תג MOG מחושב בסעיף 4.
  2. חותך כ 30 סנטימטרים של צינורות נחש דיאליזה ומאובטחים קצה אחד עם hemostat נעילה על ידי קיפול סוף עור הנחש מעל שלוש פעמים הלופתים את הקצה המקופל עם hemostat. מלא את הנחש עם מדוללחלבון תג ש"א (בין 60 ל 90 מיליליטר של חלבון תג MOG לכל צינור) ולאחר מכן להסיר בועות אוויר מן הנחש כופים עליהם מהמבוי הפתוח. לבסוף, לאטום את הקצה השני של הצינור באמצעות hemostat נעילה שני.
  3. חזור על שלב 5.2 למלא קטעים נוספים של צינורות דיאליזה עד שכל חלבון תג MOG הועבר לתוך צינורות דיאליזת נחש. ודא שאין נזילות.
  4. הפוך אצטט 1x עם 4 M guanidine בשקילה החוצה 382.12 גרם של guanidine-HCl והוספת 100 מ"ל של 10x חיץ אצטט עשה צעד 4.1 כדי מבחנה L 2. הוסף 0.5 ליטר של H 2 O ל כוס ולאפשר guanidine-HCl לפזר. לאחר מומס, ולהעביר את פתרון L 1 סיימה גליל ולהוסיף H 2 O עד נפח מגיע 1 ל חזור המתכון הזה עבור כל 2 נחשים הנדרשים.
  5. בצע דיאליזה כדלקמן: למלא דלי גדול (מינימום 10 L) עם 1 ליטר של חיץ אצטט 1x עם 4 M guanidine משלב 5.4. הנח עד to 2 קטעים של צינורות דיאליזה המכיל תג MOG לתוך הדלי, משאיר מקום בר ומערבבים מגנטי להסתובב באין מפריע בחלק התחתון. שים את הדלי בחדר 4 ° C. בצלחת ומערבבים מגנטי ולהדליק אותו לשיעור סיבוב איטי (כלומר לא גבוה, רק מספיק כדי להעביר את הנוזל):
    הערה: בצע את השלבים הבאים כדי להפחית בהדרגה את כמות guanidine במאגר. פעמים מערבבות ניתנות מינימום, אך ניתן להשאיר לילה. דיאליזה תיקח מינימום של 3 ימים, אבל זה יכול להתארך אם ירצה בכך. בדוק בקביעות כדי לוודא כי הצינורות לא נפגעו וכי הקצוות סגורים היטב.
    1. תן הדלי לשבת ומערבבים במשך 4-5 שעות.
    2. להוסיף 1 ליטר של חיץ אצטט 1x (100 מ"ל חיץ אצטט 10x ו -900 מ"ל של O H 2) כל אחת מהקטגוריות.
    3. חזור על שלבי 5.5.1 ו 5.5.2 סך של 3 פעמים עבור סכום כולל של 4 ליטר של חיץ בתוך הדלי.
    4. מחק מחצית החיץ בתוך הדלי ולמלא עם 1 ליטר של חיץ יצטט 1x (100 מ"ל 10x חיץ אצטט ו -900 מ"ל של H 2 O, לא guanidine) ולהגדיר את בר צינורות ומערבבים.
    5. חזור על שלבים 5.5.1 ו 5.5.2 פעם (כלומר עד שלא יהיה סך של 4 ליטר של חיץ בתוך הדלי).
    6. לבסוף, להחליף את נפח 4 L כולו בתוך הדלי עם 4 ליטר של חיץ אצטט 1x טרי ולתת ומערבבים במשך 4-5 שעות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לעשות את הצעד הזה ביום ריכוז חלבון.
    7. מוציאים בזהירות את צינורות דיאליזה עם תג MOG וקיפלתי וזורקים חיץ דלי.

6. חלבון תג ריכוז MOG

הערה: בשלב האחרון, וקפל MOG חלבון תג מרוכז הדילול עובד לאחסון. כמו תג MOG מאוד מסיס, זה לא יעלה על 5 מ"ג / מ"ל. ריכוז זה כ equimolar עם 0.4 מ"ג / מ"ל MOG 35-55 פפטיד, אשר משמש בדרך כלל כדי לגרום EAE בעכברים (מעורב 1: 1 עם adjuv של פרוינד המלאהנמלה (CFA)). במהלך תהליך הריכוז אין זה נדיר עבור כמות קטנה של חלבון לבוא מתוך פתרון בצורת משקע לבן. ממטרי יתר הוא בעיה, עם זאת.

  1. חשב את נפח הרצוי הסופי כדי להשיג ריכוז תג MOG של 5 מ"ג / מ"ל, בהתבסס על השווי מחושב בסעיף 4.
  2. מרפדים בנייר אלומיניום ומכסים בנייר אלומיניום עם פוליאתילן גליקול (PEG) 3350 ו PEG 8,000 ביחס של 1: 1. קולב 3350 הוא שולב תערובת זו כפי שהוא יכול לעזור למנוע הצטברות חלבון במהלך ריכוז והוא מהווה 11 cyropreservative יעיל.
  3. שים את צינורות נחש (עם חלבון תג MOG בפנים) על גבי נייר האלומיניום ומכסי PEG 8000. בואו לשבת זו בטמפרטורת חדר ולבדוק את הנפח קבוע עד הנפח שווה או מתחת לנפח הסופי המוערך (מחושב בשלב 6.1), ההיקף בפועל יימדד לשלב הבא. אם המחבת הופכתoversaturated עם מים בתהליך הריכוז, להגדיר במחבת טריה עם רדיד אלומיניום PEG 3350 ו PEG 8000.
  4. שטוף את החלק החיצוני של הנחשים עם H 2 O ולהעביר את חלבון תג MOG בקבוק זכוכית נפרד בעזרת פיפטה סרולוגיות. עקוב אחר הנפח כמו החלבון מועבר להבטיח את הנפח נכון.
    1. אם הנפח הופחת מתחת הנפח הסופי המוערך, להוסיף למאגר יצטט 1x עד הנפח הרצוי הוא הגיע. אם הנפח מעל הנפח הסופי המוערך, להעביר את חלבון תג MOG חזרה לתוך צינורות הדיאליזה ולהמשיך את הריכוז (שלבי 6.2-6.3).
    2. הפץ את חלבון תג ש"א בין 1.5 מ"ל צינורות (0.5 מ"ל לכל צינור), אחסן את צינורות ב -80 מעלות צלזיוס עד הצורך. כדי לגרום EAE, לערבב נפח 1: 1 עם CFA.
  5. הפעל ג'ל עמוד SDS כדי לאשר את הביטוי של החלבון תג MOG באמצעות דגימות שנלקחו בשלבים 1.4, 2.1, 3.4, ואת החלבון MOG מטוהרים מן הצעד 6.4.

7. יצירת MOG 1-125 מהתג MOG שימוש פרוטאז TEV (אופציונלי)

הערה: צעד אופציונאלי זה ממשיך מסוף בשלב 4. אם MOG 1-125 ללא כל רצפי תג נוספים נדרש, רצפי התג ניתן להסיר באמצעות פרוטאז TEV (איור 4). ככל שאנו מודעים, אין מערכת ביטוי אחרת מסוגלת לייצר 1-125 MOG טהור. עם זאת, יש לציין כי ללא תג thioredoxin, MOG 1-125 הוא מסיס מאוד וזה עלול לגרום לבעיות במהלך טיהור וטיפול, ומסיבה זו להסיר את התיוג אם הכרחי מסיבות ניסיון. כמה שלבים נדרשים ליצור 1-125 MOG טהור. תג ש"א הוא dialyzed הראשון למאגר מחשוף פרוטאז TEV. בעקבות עיכול עם פרוטאז TEV, הנפח מצטמצם לסייע עם הטיהור מאוחר steps, אז dialyzed למאגר B, ולאחר מכן רצף התג המכיל התג שלו מוסר באמצעות שרף ניקל. לבסוף, חלבון כימות הטהור MOG 1-125 מרוכז לריכוז הסופי.

  1. הפוך 1 ליטר של חיץ מחשוף 10x TEV (500 מ"מ טריס-HCl, 5 EDTA מ"מ) על ידי הוספת EDTA 1.861 גרם, 44.4 גרם טריס-HCl, ו -26.5 גרם טריס מבחנה L 2. הוסף H 2 O עד נפח מגיע 990 מ"ל ולאחר מכן להתאים את ה- pH ל 8 לפזר את EDTA. מעביר את פתרון L 1 סיים גליל ולהביא את הנפח עד 1 L באמצעות H 2 O.
  2. לדלל חלבון תג MOG משלב 3.6 ל 0.5 מ"ג / מ"ל באמצעות B חיץ (אותו למאגר שמתואר בשלב 3.1), מבוסס על כמות חלבון מחושב בסעיף 4. העברת 120 מ"ל של חלבון תג בדילול MOG כדי צינורות דיאליזה נחש כמתואר בצעדים 5.2 כדי 5.3. ההיקף וניתן לשנותם עד אולם כמות פרוטאז TEV נדרשה לדבוק כל חלבון תג MOG תהיה substantial.
  3. פעל על פי פרוטוקול דיאליזה המפורטים בשלב 5.5, למעט להחליף למאגר 10x אצטט עם חיץ מחשוף 10x TEV עשה צעד 7.1.
  4. מעביר את תג MOG, עכשיו במאגר TEV מחשוף, בקבוק זכוכית חדש 250 מיליליטר ו לפקח על הנפח גדל מ דיאליזה. הוסף 1 μl של אתנול β-mercapto לכל כל חלבון תג 2.85 מ"ל של MOG מתווסף הבקבוק. הוסף לפחות מ"ג 1 של פרוטאז TEV (פתרון TEV המניה ב 5 מ"ג / מ"ל) לכל 50 מ"ג של חלבון תג ש"א (פרוטאז TEV ניתן להוסיף עד 1:10 TEV: יחס חלבון ש"א) דגירה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור במשך שעה 72 לפחות.
    הערה: בסוף דגירת פרוטאז TEV, משקעים לבנים יש לראות בתחתית של בקבוק הזכוכית.
  5. לפני העברת החלבון כדי צינורות דיאליזה, להוסיף guanidine-HCl לפתרון עד החלבונים לפזר למנוע חלבון משקעים יידבקו אל בקבוק הזכוכית. העבר 150 μl שלפתרון זה צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו לתייג את הצינור כפי "MOG עם TEV". אחסן את הפתרון ב -20 ° C לניתוח SDS-PAGE בעתיד.
  6. להעביר את כל הנוזל משלב 7.5 לתוך צינורות דיאליזה כמופיע צעדים 5.2 כדי 5.3. ממלאי דלי גדול עם 2 ליטר של H 2 O ובמקום צינור הדיאליזה לתוך הדלי. דגירה זה ב 4 ° C עם אור ערבוב בין לילה. שלב זה חשוב כדי לדלל את guanidine לאפשר את ריכוז החלבון להתרחש במהירות להתחיל הסרת EDTA מהפתרון יפריע טיהור חלבונים.
  7. לרכז את חלבון צינורות הדיאליזה כמופיע צעדים 6.2 כדי 6.3 (למעט רק להשתמש PEG 8000) כך הנפח הסופי של הפתרון הוא ~ 40 מיליליטר. שטוף את צינורות דיאליזת באות O H 2 וסר מצורף שיורית PEG עדיין 8000 אל הצינורות. הפחתה זו בנפח מאפשרת להתאים את כל החלבון מתעכל לתוך צינור 50 מ"ל המכיל מחדש ניקלחטא, כפי שמתואר בשלב 3.5.
  8. Dialyze חלבון מתעכל כדי הצפת B:
    1. ממלאים דלי גדול עם 1 ליטר של חיץ B (29.22 גרם NaCl, 3.152 גרם טריס-HCl, 0.3405 גרם Imidazole, 573.18 g של guanidine HCl, pH 7.9).
    2. מניח את הנחשים המכילים חלבון מתעכל משלב 7.7 בדלים יחד עם מגנט ומערבבים (כמתואר ביתר פירוט בשלב 5.5). שים את הדלי לחדר 4 ° C קר בצלחת ומערבבים מוגדר ומערבבים לאט ולאפשר נחשים כדי dialyze עבור 5 או יותר שעות.
    3. רוקן את הדלי למלא אותו עם עוד 1 ליטר של B חיץ ולתת זה לשבת בחדר הקר 4 ° C בצלחת ומערבבים מוגדרים ומערבבים לאט ולאפשר הנחשים כדי dialyze עבור h 5 או יותר.
  9. בצע טיהור של חלבון MOG 1-125 כמפורט בסעיף 3, עם ההבדל החשוב כי רצפי התג בקעו ויוגבלו שרף ניקל, עוזבים MOG 1-125 בתמיסה. שוב, 4 סיבובים של טיהור יהיונעשה בהתאם לאותו הנפח, אבל במקרה הזה המטרה היא לשפר טוהר, ולא לשחזר חלבון ככל האפשר. ראה איור 4.
    1. הפוך את מאגרי טיהור חלבונים המפורטים בשלב 3.1
    2. לחייב את שני הצינורות של שרף ניקל כמתואר בשלב 3.3.
    3. לטהר MOG 1-125 ידי פרוטוקול מפורט בשלב 3.5, למעט חיוני כי eluate מן שרף ניקל המכיל תג נמחקת (לשמור 150 μl של eluate צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge לניתוח SDS-PAGE בעתיד), בעוד הפתרון המכיל MOG 1-125 נשמר כמוצר הסופי.
  10. למדוד את הריכוז של 1-125 חלבון MOG כמתואר בסעיף 4:
    1. הגדרת דילולים עקומת סטנדרט BSA כמתואר בשלבים 4.2 ו -4.4.
    2. הגדרת דילולים של MOG 1-125 כמתואר בשלבים 4.5 ו -4.6. לחלופין, הוא עשוי להיות יקר כדי ליצור מגוון רחב יותרשל דילולים (1x, 1/2, 1/4, 1/8 ו, למשל). התאם כרכים של חיץ אצטט 1x ו MOG 1-125 בהתאם.
    3. לבצע את assay ברדפורד כמתואר בשלבים 4.7 כדי 4.9 ואת לחשב את הכמות של MOG 1-125 שנוצר. התשואה הצפויה היא כ 4 מ"ג או יותר חלבון.
  11. ולקפל MOG 1-125 ידי הסרה הדרגתית של guanidine באמצעות דיאליזה, כמפורט בסעיף 5.
  12. תתרכז MOG 1-125 חלבון כמפורט בסעיף 6. הריכוז הסופי צריך להיות 2.24 מ"ג / מ"ל, שהוא equimolar עד 5 מ"ג / מ"ל תג MOG.

8. SDS-PAGE ג'ל כדי לאשר הפקת תג MOG וטוהר

הערה: דגימות שנלקחו צעדים 1.4, 2.1, 3.4, ו -6.4 מנותחים על ידי SDS-PAGE תקן לאשר ייצור תג MOG וטוהר. צעד זה צריכה להתבצע לאחר הטיהור הסופית של תג או ש"א או ש"א 1-125.

    <li> הפוך חוצץ טעינת 2x SDS-PAGE ידי הוספת 1.576 גרם של טריס-HCl 2 מ"ל של H 2 O ולהגדיר את ה- pH ל 6.8. להוסיף 0.4 גרם SDS לתוך התמיסה Tris-HCl ולאחר מכן להוסיף H 2 O עד נפח מגיע 7 מ"ל.
  1. להוסיף 0.2 גרם של bromophenol כחול 10 מ"ל של H 2 O ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של זה הפתרון עשה צעד 8.1. לבסוף, להוסיף 2 מ"ל של גליצרול לסיים למאגר טעינת 2x SDS-PAGE. בעת אחסון פתרון זה, ולשמור על 4 ° C ולהגן עליו מפני האור עד 3 חודשים.
  2. הפשרת aliquots הקפוא של חיידקים מן הצעדים 1.4 ו -2.1, כמו גם את חלבון תג MOG solubilized מן הצעדים 3.4 ו -6.4 בטמפרטורת חדר.
  3. הסר את המלחים פתרונות שנאספו צעדים 3.4 ו -6.4 על ידי הוספת 60 μl של כל לעמודות desalting חלבון. לטהר את החלבונים הבאים הוראות היצרן.
  4. הוסף 20 μL של אתנול β-mercapto עד 1 מ"ל של הפתרון עשה צעד 8.2. הוסף 40 μl של זה על שני BACterial כדורי משלב 8.3 ו 60 μl את החלבונים desalted משלב 8.4 ו דגירה אלה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. הפוך חיץ ריצה דף 1x SDS בשקילה מתוך 5 גרם של טריס, 28.8 גליצין גרם, ו -1 גרם SDS. הוספת אלה כדי מבחנה 1 L ולהוסיף 500 מ"ל H 2 O לפזר הכל. לאחר מומס, ולהעביר את פתרון L 1 סיימה גליל ולמלא עם H 2 O עד נפח מגיע 1 ל
  6. הגדרת ג'ל polyacrylamide 12% במנגנון ג'ל מכן להוסיף למאגר ריצה 1x SDS-PAGE למנגנון ג'ל כך למאגר פועל רק מעל החלק העליון של בארות בתוך הג'ל. לשטוף את הבארות של הג'ל על ידי pipetting 50 μl של הפעלת המאגר לתוך הבארות חמש פעמים כל אחד.
  7. טען 10 μl של סולם החלבון לתוך הבאר הראשונה ולהוסיף 10 μl של פתרונות מבושלים משלב 8.5 להפריד בארות. הפעל את הג'ל על 115 וולט במשך 60 דקות.
  8. הסר את הג'ל מן המנגנון ולהעבירו מיכל קטן. מלאו את contaINER עם 100 מ"ל של H 2 O טהור ולהעביר את המיכל כדי פלטפורמה מסתובבת לאט במשך 8 דקות. לאחר דקות 8, שפך את המים ולשטוף את הג'ל פעמיים נוספות עם H 2 O.
  9. הטל את H 2 O ממיכל ולהוסיף 100 מ"ל של ריאגנט כתם מהירה המיכל. אפשר זה לשבת על במה מסתובבת לאט לילה, מכסים ברדיד אלומיניום.
  10. דאמפ מגיב כתם מהירה ולהוסיף כ 100 מ"ל של H 2 O למיכל. אפשר זה לשבת על במה מסתובבת במשך 8 דקות. הטל את H 2 O וחזור על לשטוף H 2 O פעמיים.
  11. תמונה הג'ל באמצעות תרמי עבור כתמים כחולים coomassie. חפש להקה סביב 31.86 kDa (חלבון תג ש"א) ולהקה חוורים ב 63.72 kDa (דימרים תג ש"א).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר הטיהור הושלמה, דגימות שנאספו צעדים 1.4, 2.1, 3.4, ואת המוצר הסופי משלב 6.4 צריך לרוץ על ג'ל חלבון (איור 3 א). תג MOG צריך להופיע תחילה כלהקת 31.86 kDa במדגם T O / N, אך לא T 0, וצריך להיות בלהקה היחידה במוצר הטהור הסופי. כדי לבדוק אם חלבון תג MOG התקפל כראוי, חלבון תג MOG יכול לשמש תווית תאי MOG-חלבון מסוימים B על ידי FACS. על ידי לימפוציטים תיוג עכבר עם דילול 1: 1,000 של תג MOG יחד עם נוגדנים משני המכוון נגד התג שלו ואת הנוגדן אנטי IgG1 שליישוני fluorescently שכותרתו, MOG ספציפי בתא B ניתן לזהות (איור 3 ב). לחלופין, תג MOG ניתן מצומדות ישירות fluorophores להפחית מכתים רקע (הנובעים תאי B מחייב נוגדנים משני ושלישוני) כמומתואר התייחסות 5 לזהות תאי B MOG-ספציפי. זה הכרחי כאשר מנסה לזהות תאי B MOG-מחייב בעכברי סוג ברים, כמו תאים אלה הם בדרך כלל מאוד נדירים 5. עכברי IGH MOG יש Knockin שרשרת כבד כי, כאשר יחד עם שרשרת קאפה אור מתאימה, מקנה וספציפי MOG. ככל המחייב של תג MOG מוגבר בקרב תאי IGH MOG B, זה מאשר את עובדת פרוטוקול זה מייצר אנטיגן מקופל כראוי. חשוב לציין, תאים IGH MOG B לתרום פתולוגיה אוטואימוניות במודלים של MOG מכוונת EAE 12, המאשר כי תג MOG משרה הן T ו- אוטואימוניות תאי B.

לפני שמתחילים דיאליזה לקפל את החלבון כמפורט בסעיף 5, יש צורך למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay ברדפורד, כמפורט בסעיף 4. נציג התוצאות של assay ברדפורד מוצגים בלוח 1 באיור 5.

הדור של MOG הטהור 1-125 מושג על ידי התוספת של פרוטאז TEV לחלבון תג MOG בסופו של דבר וכתוצאה מכך המחשוף של חלבון תג MOG לתוך MOG 1-125 ורצף תג כפי שמוצג באיור 6. טיהור שרף ניקל לאחר מסירת MOG תג, רצף תג, וזיהומים פרוטאז TEV בסופו של דבר וכתוצאה מכך MOG 1-125 טהור כפי שמוצג באיור 6.

איור 1
איור 1: חלבון תג ש"א (כפולות כאן באישור דאנג ואח 5..).. מבנה ליניארי, ו חומצת אמינו רצפי DNA של חלבון היתוך תג MOG. רצף ה- DNA של תחום תאי של MOG העכבר (ש"א1-125, רצף תחתון בכחול) היה קודון אופטימיזציה עבור ביטוי בחיידקים (שחור). רצף זה היה מסונתז ונוסף וקטור ליצור היתוך N-terminal לתגית המכילה thioredoxin ו S-Tag כדי לנטרל את insolubility הידוע של החלבון MOG 13,14, כמו גם תג 6x שלו לטיהור 15. אתר מחשוף פרוטאז TEV מפריד בין MOG 1-125 מן רצפי התג. TEV בתיווך המחשוף בין גלוטמין-164 ו גליצין-165 באמצעות אתר מחשוף TEV הסכמה חלופית 16 תוצאות סילוק כל חומצות האמינו הלא-MOG. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מבט כולל על הצעדים הנדרשים כדי לייצר חלבון MOG תג טהור כדי.ליצור חלבון תג MOG, חיידקים המבטאים את החלבון MOG תג גדלים לצפיפות גבוהה המושרה אז להביע תג MOG באמצעות IPTG כמפורט בסעיף 1. לאחר תרבות לילה, חיידקים הם lysed ו באמצעות סדרה של pelleting צעדים השבר חלבון המכיל גופי הכללה, אשר מכיל תג MOG, מופקים כמופיע התג ש"א סעיף 2. מטוהרים אז מן שבר החלבון הגולמי באמצעות ארבעה מחזורים של קליטה על שרף ניקל טעון elution של חלבון תג MOG כמפורט בסעיף 3. חלק של eluate ונקווה הוא נלקח לאחר מכן עבור assay ברדפורד לקבוע את התשואה של חלבון תג MOG ואת שאר eluate הוא dialyzed למאגר אצטט במשך כמה ימים כמפורט בסעיפים 4 ו -5 לבסוף, חלבון מרוכז באמצעות PEG 3350 ו PEG 8000 לריכוז סופי של 5 מ"ג / מ"ל מבוסס על תשואה של תג MOG שנקבע Bassay רדפורד כמפורט בסעיף 6. התהליך כולו יכול לקחת מינימום של 10 ימים, עם יום ההתחלה כל שלב מוצג בסוגריים. עם זאת, תחנת אלטרנטיבה ונקודות להתחיל מפורטות בפרוטוקול, וצעדים יכולים להתפרס על פני כמות גדולה יותר של זמן אם תרצו בכך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. טיהור של חלבון תג MOG וערכת פעילותה (א) מוצגים הן דגימות חלבון שנגבו מנקודות שונות ברחבי הליך חלבון הטיהור ולהפעיל על ג'ל SDS-PAGE. T 0 = BL21 חיידקים לפני אינדוקציה חלבון (שנאספו בשלב 1.4), T O / N = BL21 חיידקים שלאחר אינדוקציה של ביטוי חלבון (אסףבשלב 2.1), תג MOG הגולמי = תג חלבון solubilized MOG לפני טיהור חלבונים (שנאספה בשלב 3.4), תג MOG טהור = חלבון תג MOG לאחר הטיהור (שנאספה בשלב 6.4). (ב) עקדת החלבון תג MOG לתאי CD19 pos CD4 נג נאיבי B מ בלוטות הלימפה גם מן סוג בר C57Bl / 6 עכברים או עכברים IGH MOG המבטאים שרשרת כבדה אימונוגלובולינים ספציפיים לחלבון MOG 7,17 הוערכה באמצעות cytometry זרימה . תג MOG תאי B -specific זוהו על ידי מכתים תאים בלוטת לימפה עם תג MOG ואחריו נוגדן תג משני אנטי שלו נוגדן אנטי IgG1 שלישוני ניאון. צביעת תאי C57BL / 6 או עכברי IGH MOG מוצגת יחד עם קרינת תג MOG מינוס אחד כתם מלא (FMO) של תאי IGH MOG. אנא גללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: סקירה כללית של צעדים כדי ליצור MOG 1-125 מחלבון תג MOG. לאחר איסוף eluate תג MOG כמתואר בשלב 3.5 של פרוטוקול, החלבון תג ש"א הוא dialyzed למאגר מחשוף פרוטאז TEV. לאחר הדיאליזה תושלם, פרוטאז TEV מתווסף פתרון MOG התג וכתוצאה מכך המחשוף של תג MOG לתוך חלבון MOG 1-125. היקף הפתרון מחשוף מצטמצם אז dialyzed למאגר B לפני טיהור חלבונים. זיהומים מהפתרון המחשוף מופקים באמצעות ארבעה סיבובים רצופים של קליטה על שרף ניקל טעון elution של הזיהומים שבסופה בתמיסה של MOG הטהור < sub> 1-125. ריכוז החלבון MOG 1-125 נקבע באמצעות assay ברדפורד ואת החלבון מקופל במשך מספר ימים באמצעות דיאליזה. לאחר דיאליזה תושלם, החלבון MOG 1-125 מרוכזת כדי 2.24 מ"ג / מ"ל באמצעות PEG 3350 ו PEG 8000. פרוטוקול זה נדון בפירוט בסעיף 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: דוגמה של עקומת סטנדרט assay ברדפורד לקביעת ריכוז של תג MOG חלבון. קריאות BSA סטנדרטית שיש ליטול מטבלת 1 הייתה זממה להשיג נוסחא רגרסיה ליניארית לחישוב ריכוז תג MOG מבוסס על הצפיפות האופטית ב 595 ננומטר.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:. מחשוף TEV של חלבון תג MOG וטיהור הבאות של MOG 1-125 המוצגים הם דגימות חלבון לרוץ על טיהור הוכחת ג'ל SDS-PAGE של MOG 1-125 תג MOG טהור = חלבון תג MOG לפני Tev מחשוף (אסף. בשלב 6.4), MOG תג w / TEV = שבר חלבון שנאסף לאחר 72 שעות של דגירה של תג MOG עם פרוטאז TEV (שנאספו בשלב 7.5), Elution = שבר חלבון כי נשאר צמוד שרף ניקל במהלך MOG 1- פרוטוקול טיהור 125 (שנאסף בשלב 7.9), Pure MOG 1-125 = MOG1-125 חלבון לאחר הטיהור (שנאסף בשלב 7.12). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

BSA (מ"ג / מ"ל) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1.079 .998 .948 .853 .769 .699 .583 .493 .373
1.071 1.014 0.95 .854 .777 .681 .579 .484 0.375
1.069 1.017 .944 .848 .781 .592 .494 .374
דילול תג MOG 1 1/5 1/25
1.327 1.013 .493
1.332 1.063 0.491
1.367 1.088 .488

טבלה 1: ערכים נציג מתוך assay ברדפורד לקביעת ריכוז חלבון תג MOG BSA dilu.משא בריכוזים ידועים משמש לקביעת עקומת הסטנדרט שמוצגת באיור 5. הדילולים של טיהור פוסט חלבון תג MOG משמשים כדי לקבוע את ריכוז חלבון תג MOG הסופי. שורות המכילות את הצפיפות האופטית הנמדדים 595nm וכל שורה המייצגת לשכפל אחד סך של 3 משכפל בכל ריכוז מצוין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנה, יש לנו תיאר פרוטוקול לייצור חלבון תג MOG וכיצד ליצור MOG טהור 1-125 מן החלבון תג MOG. פרוטוקול זה מבוסס הוא על שיטות טיהור חלבונים מבוססות תקן שלו-תג, כמו גם פרוטוקול שתואר לעיל עבור הדור של חלבון MOG מבוסס מבוגר 15. למרות זאת הוא לא תיאר כאן, השימוש העיקרי של חלבון תג ש"א היא לגרום EAE באמצעות חיסון עם אנטיגן חלבון. פרוטוקול המתאר כיצד EAE מושרה בעכברים, אשר תואם את חלבון תג MOG, ניתן למצוא התייחסות 3. אנחנו הוכחנו בעבר כי חיסון עם תג ש"א או ש"א 1-125 נגזר תג MOG לא רק גורם CNS מחלה אוטואימונית עם דלקת חוט שדרה יותר demyelination לעומת הפפטיד MOG 35-55 הסטנדרטי, אלא גם כי תאי IGH MOG B פתוגניים thaלא זיהו חלבון MOG מופעל כדי לייצר תגובת מרכז נבטיה בתגובת התג ש"א או ש"א 1-125, אבל לא MOG 35-55 5. לכן, חיסונים עם תג MOG אכן לגרום לתגובה תא B מתאים אנטי MOG.

חלבון תג MOG מטוהר באמצעות קליטה על שרף ניקל טעון (באמצעות התג שלו) ו elution. בגלל הכמות הגדולה של חלבון שנוצר בשלבים הקודמים, סבבים רבים של קליטת elution נדרשים לאסוף את רוב החלבון. מצאנו כי לפחות 4 כדורים נדרשים לבודד את רוב החלבון אם באמצעות נפח מתאים של שרף במשך 50 מ"ל צינורות. אם ירצה, הפרוטוקול יכול להיות scaled עד לשימוש יותר או גדול יותר צינורות ועוד שרף ניקל לצמצם את מספר סבבי הקליטה. לחלופין, כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודות ניקל יכולה למעשה לטהר החלבונים שלו מתויג 18 </ sup> ואכן מצאנו כי HPLC יכול ביעילות לטהר MOG תג חלבון (תצפיות לא פורסם). כפי HPLC אינו נגיש למעבדות אימונולוגיה סטנדרטיות רבות, הפרוטוקול המפורטים כאן נועד להתבצע באמצעות ציוד מעבדה נפוץ. בנוסף לטיהור שלו-תג, חלבון תג MOG עושה להכיל S-תג התואמת פרוטוקולי טיהור S-תג אם 14 מועדפת.

חלבונים רקומביננטי המבוסס על ש"א (בעיקר אדם או עכברוש) תוארו 8 בעבר. אלו התבססו על מערכות ביטוי ישנות הוחלפו מאז על ידי מערכות מונעות על ידי יזמים תעתיק חזקים מסוגלים לייצר כמויות גדולות יותר של חלבון חיידקי קולי Escherichia. מערכת ביטוי MOG תג שלנו משתמשת אמרגן T7 היעיל וקטור PET-32a (+), שהוא יעיל יותר באופן משמעותי מאשר מערכות זמינות in-house הייצור של חלבון MOG 19. עם זאת, זה זהhould לציין כי חלבון תג MOG המתואר כאן מבוסס על MOG עכבר. חיסון עם חלבון MOG האדם הוכח לגרום EAE בעכברים כי יש תכונות שונות לעומת מחלה הנגרמת באמצעות murine MOG 8. יתר על כן, עכברוש MOG יכול להיות immunogenic יותר MOG עכבר בעכברים ובמקרים מסוימים 20. לכן, עבור כמה מטרות ניסוי עכבר מבוסס MOG תג לא יכול להיות אידיאלי. אנחנו נמצאים בתהליך של יצירת גרסה שונה של חלבון תג MOG ממה עשויים להתאים כמה מטרות טובות יותר, ואת פרוטוקול הטיהור המתואר כאן יעבוד עבור כל אלה. בינתיים, יתכן כי פרוטוקול הטיהור המתואר כאן יפעל למערכות ביטוי MOG אחרות, או אפילו חלבונים אחרים, כל עוד הם משלבים תג 6x שלו לספיגת שרף ניקל. עם זאת, ללא תג thioredoxin, מסיסות של חלבון MOG בריכוזים גבוהים עשויה להיות בעיה, וכמובן שזה לא יהיה ניתן ge nerate טהור MOG 1-125 כמו זה ייחודי למערכת תג MOG.

מדידת ריכוז חלבון MOG התג לפני refolding חלבון באמצעות דיאליזה היא חיונית להצלחת פרוטוקול טיהור זה. אם הריכוז גבוה מדי, החלבון עשוי לצבור נפולת של פתרון במקום לקפל לתוך חלבונים בודדים. ניתן לראות זאת במהלך הפרוטוקול דיאליזה משקע לבן להרכיב בתחתית של צינורות דיאליזה. אם זה מתרחש, לפזר את החלבון תג MOG שוב עם 6 guanidine M ולמדוד את ריכוז החלבון. לדלל את החלבון ל -0.5 מ"ג / מ"ל ​​ולאחר מכן להתחיל דיאליזה שוב אין משקעים צריך להיווצר 0.5 מ"ג / מ"ל. עבור MOG 1-125, ניתן לצפות משקעים כדי ליצור כמו החלבון הוא מסיס מאוד. מצאנו כי זה לא ישפיע על הקיפול של MOG 1-125 ובלבד החלבון היה מדולל לפני הדיאליזה כראוי.

NT "> עבור פרוטאז TEV לדבוק החלבון תג MOG ביעילות לתוך טהור MOG 1-125 חשוב להשתמש בכמות מספקת של פרוטאז TEV. גרסאות ישנות יותר של פרוטאזות TEV הם מומת דרך מחשוף עצמי 21 אולם גרסאות מודרניות יותר סובלים insolubility מנפיקה 22 ולכן חשוב להוסיף מספיק פרוטאז TEV להשיג מחשוף המספק של חלבון תג MOG לפני איון פרוטאז TEV. מאז פרוטאז TEV הזמין מסחרי יכול להיות יקר, אנו ממליצים ייצור פרוטאז TEV טיהור כפי מתואר התייחסות 22. בעת השימוש עכבר טהור MOG 1-125 חלבון לניסויים, חשוב לציין כי החלבון הוא מסיס מאוד עלול לעורר מתוך פתרון, ולכן חייב להיות מעורב באופן נרחב לפני השימוש.

לסיכום, כאן יש לנו תיאר פרוטוקול פשוט לייצור וטיהור כמויות גדולות של חלבון תג MOG. Furthermבצר, תוספת של אתר מחשוף פרוטאז TEV לחלבון תג MOG שלנו מספקת את האפשרות ליצור טהור MOG 1-125 במידת הצורך. חלבון תג MOG מוכר מחויב תאי B אוטואימוניות אנטי המיאלין תג MOG -induced EAE משלבת בתיווך תאי B פתולוגיה 5. לכן, חלבון תג MOG מתגבר על המכשולים העיקריים הגבלת השימוש התפשטות רחבה של אנטיגן חלבון כדי לגרום EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics