简单而高效的生产和鼠标髓鞘少突胶质糖蛋白的纯化的实验性自身免疫性脑脊髓炎研究

Immunology and Infection

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Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

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Abstract

Introduction

MS是人类疾病的特点是慢性炎症和这被认为是由针对髓鞘自身免疫应答被驱动的中枢神经系统的神经变性。髓鞘和轴突随时间的流失导致认知和运动功能1逐渐下降。 “实验性自身免疫性脑脊髓炎”是用于针对CNS髓磷脂自身免疫性疾病的动物模型的总称。像人类的MS,EAE特征通常为CNS的免疫细胞浸润,并且在某些情况下,脱髓鞘2。然而,向其中任何给定的EAE模型类似于人的MS部分的程度取决于所使用的种或菌株和在底层的抗髓鞘自身免疫反应的复杂性。

抗髓鞘自身免疫可以通过实验诱导几种方式,但是目前使用的最常见的方法是将免疫小鼠用氨基酸模仿免疫的CD4的短肽35-55)衍生的21氨基酸肽,它用于以诱导EAE在C57BL / 6小鼠3。然而,对于一些实验目的,希望或甚至必需的具有较大蛋白抗原和确实有一些优点这个过短肽免疫来免疫。第一,因为MHC限制的,短肽通常只有在菌株的一个非常有限的范围内有效,而代表任一整蛋白或特定域较大蛋白抗原可在不同的物种中正常处理以便呈现在多个近交小鼠品系或甚4。第二,较大的蛋白抗原能够诱导结合多种类型的淋巴细胞的抗原识别,更复杂的免疫反应,而不是limitin的15μg抗原识别到CD4 + T细胞。例如,通过其B细胞受体(BCR)的B细胞与整体,而不是处理的蛋白直接相互作用。我们和其他人已经表明由MOG 35-55免疫激活不承认MOG蛋白5 B细胞。由于B细胞最近证明在人MS 6发挥致病作用,即结合B细胞在自身免疫性病理学的EAE模型是越来越重要。

尽管使用较大的蛋白抗原以诱导EAE的优点,仍存在这样的蛋白质的一些可商购的来源。实际上,虽然短肽像MOG 35-55可以非常快速地并以相对低的成本来合成MOG蛋白的商业选择是有限的,成本基本上更购买。然而,存在可用于研究团体产生MOG胞外结构域的几个表达载体(MOG 1-125)本身。 HoweveR,所有我们在文献中已经确定了表达系统是基于至今已换成更高效表达系统7的旧技术。此外,大多数是基于大鼠或人MOG 8。用于在小鼠中自身免疫的一些调查,根据鼠标MOG自身抗原的抗原是优选的。最后,商业或作为表达载体,我们已经确定了所有基于MOG蛋白,是含有额外的氨基酸的MOG 1-125基的融合蛋白。这些措施包括净化,通常其他序列标签为好,这有很多的功能,我们无法辨认。

为了解决这些局限性,我们产生基于稠合到含有硫氧还蛋白打击MOG蛋白5的已知的不溶性的标记的小鼠MOG胞外结构域的新型融合蛋白。标签序列还包含用于净化和TEV蛋白酶CLE一个序列的6xHisavage站点,允许完全去除所有的标签序列的,如果需要的话。这是我们都知道的,生成纯MOG 1-125蛋白质的唯一方法。为了便于生产大量蛋白质的MOG 1-125序列用于细菌表达密码子优化和MOG 标签融合蛋白插入的pET-32表达系统。在这里,我们详细描述了该协议生产和净化MOG 标记蛋白,而纯MOG-125,使用现有的大多数实验室免疫学非专用设备。

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Protocol

1.蛋白质感应

注意:在以下步骤,BL21 大肠杆菌细菌转化含用于MOG 标签融合蛋白的序列的的pET-32载体(见参考图5图1)中生长到高密度,然后被诱导表达的MOG 标记蛋白。 图2所示为整体时间表-注意,天都是近似值和备用停机点在协议中注明。如果与纯化的pET-32 MOG 标签载体DNA开始,这将是必要的,以化学它转变成感受态BL21 大肠杆菌杆菌细菌用氨苄青霉素选择,如已经充分描述9。成功的转化可以通过使用标准的商业试剂盒,接着用限制性消化纯化选自细菌DNA中证实酶AGE1和SAC1到琼脂糖凝胶上10产生一个424 bp的条带。

    标签甘油中,并在37℃,200rpm下过夜孵育它。
  1. 放置含有500毫升无菌LB肉汤的在37℃培养箱中为第二天制备两个1升锥形烧瓶中。
  2. 加入500微升100毫克/毫升氨苄青霉素的每个从步骤1.2(终浓度0.1mg / ml的氨苄青霉素)含有500毫升的LB烧瓶。从步骤1.1到每个LB肉汤的两个烧瓶的转移将1ml过夜培养物。孵育在37℃和200rpm下5小时或最多为0.6的光密度。
  3. 从烧瓶中的一个取一取1 mL,并转移到一个单独的1.5毫升离心管中。沉淀细胞以16,000 xg离心1分钟,并除去上清液。标记管为T 0(预诱导),然后把细菌沉淀成-20℃冷冻以供将来十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分析(见第8和图3)。
  4. 加入0.5毫升的1M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)到每个培养瓶中。孵育烧瓶在37℃,200rpm下进行4小时,然后在室温下以75rpm过夜。

2.收获MOG 标记蛋白

注:在这个阶段,细菌会产生了大量MOG 标记蛋白质。收获MOG 标签 ,细菌首先在曲通X-100缓冲液,随后通过超声处理裂解。 MOG 标签 ,然后从包涵体释放和变性与咪唑和胍,导致在含有MOG 标记蛋白的粗蛋白溶液。

  1. 取一条1毫升一份从过夜培养物中的一个来自步骤1.5,并将其转移到一个1.5ml微量管中。沉淀细胞以16,000 xg离心1分钟,并除去上清液。标签浴缸(E T)O / N(诱导后),然后把细菌沉淀到-20℃的冰箱以备将来SDS-PAGE分析( 图3)。
  2. 分布均匀的文化之中250毫升瓶高速离心兼容,并保持这些冰从这个角度向前发展。沉淀细菌细胞22,000 xg离心在4℃下15分钟。
  3. 弃去上清液。存储细菌沉淀于-20℃或继续到步骤2.4。
  4. 制备裂解缓冲液(0.1毫克/毫升鸡卵溶菌酶,0.1%的Triton-X(V / V)的磷酸盐缓冲盐水(PBS))加入的Triton X-100的60微升和120微升50毫克/毫升鸡卵溶菌酶储备溶液至60毫升PBS中。
  5. 重悬并在总共30毫升的裂解缓冲液将所有细菌粒料从步骤2.3。转让本卷圆底50ml管中能够进行高速离心。将此管在30℃水浴30分钟。在培养时间,摇管两次以悬浮细胞。
  6. 培养后,在20千赫兹,振幅70%,脉冲管转移到冰和超声处理的溶液3秒,脉关3秒,并且每一轮五个脉冲。声波处理总数六轮的溶液,并使溶液在冰上冷却轮在两者之间。
  7. 离心在4℃下为24,000 xg离心该溶液15分钟。弃上清,重复步骤2.5-2.7一次。存储颗粒在-20℃或继续到步骤2.8。
  8. 准备加入0.8766克的NaCl,0.09456克的Tris-HCl,并且0.01021克咪唑到100毫升烧杯中缓冲液A(500mM的氯化钠,20mM的Tris-盐酸,5mM咪唑,pH值7.9)。加入H 2Ø,直到量达到28毫升然后调节溶液的pH值到7.9。然后,将溶液转移到100ml的量筒和添加H. 2 O直到体积为30毫升
  9. 重悬从步骤2.7将沉淀在30ml缓冲液A和孵育在4℃下该溶液3小时。在这段时间掂量出17.2克盐酸胍的。
  10. 超声处理使用相同的设置在冰上的溶液,作为在步骤2.6。然后17.2克盐酸胍的添加到该溶液中。孵育此在冰上1小时以溶解MOG 标记蛋白。
  11. 离心在4℃下为24,000 xg离心该溶液30分钟。收集上清,上清在4℃保存,直至蛋白纯化。

3.蛋白纯化

注意:在下面的步骤中的MOG 标记蛋白质将通过4轮吸收(通过His标签)和洗脱纯化到充电镍树脂。

  1. 进行以下缓冲区:
    1. 制备缓冲液B(500mM的氯化钠,20mM的Tris-盐酸,5mM咪唑,6M的盐酸胍,pH值7.9)。 5.844克的NaCl,0.6304克的Tris-HCl的,0.0681克咪唑,114.64克胍-HCl添加到500ml烧杯中。然后添加H. 2 O,直到它到达190毫升和将pH调节至7.9。转移溶胶ution到250ml量筒和添加H. 2 O直到体积为200毫升
    2. 制备洗脱缓冲液(500 mM氯化钠,的20mM Tris盐酸,0.5M咪唑,6M的盐酸胍,pH值7.9)。 5.844克的NaCl,0.6304克的Tris-HCl的,6.808克咪唑,114.64克胍-HCl添加到500mL烧杯中。添加H. 2 O,直到它到达190毫升和将pH调节至7.9。转移溶液至250毫升的量筒和添加H. 2 O直到体积为200毫升
    3. 准备带缓冲器(500毫米氯化钠,20毫米的Tris-HCl,100毫米EDTA,pH值7.9)。 5.844克的NaCl,0.6304克的Tris-HCl的加入40ml的500mM的EDTA添加到500mL烧杯中。添加H. 2 O,直到达到190毫升,并调整pH至7.9。转移溶液至250毫升的量筒和添加H. 2 O直到体积为200毫升
    4. 制备电荷缓冲液(0.1M硫酸镍)。添加5.257克硫酸镍,以500毫升的烧杯中,加入H 2Ø,直到达到190毫升(注意,不处理镍硫酸盐通风柜直到硫酸镍之外已被溶解于H 2 O)。一旦硫酸镍溶解,将溶液转移到250ml量筒和添加H. 2 O直至体积达到200毫升
  2. 拆分10毫升镍树脂的两个锥形50ml离心能够超过4500 XG(5毫升每管)承受离心力的管之间。
  3. 充电和平衡镍树脂:
    1. 通过加入40毫升水2 O含有树脂各管洗涤树脂。水平放置管子到一个摇杆,让他们在4℃下搅拌5分钟。一旦完成后,离心管在4500×g离心在4℃下8分钟。
    2. 通过移液弃去上清液,以避免干扰颗粒。加40毫升电荷退避到每个管中。传送管到一个摇杆,并让他们在4℃下搅拌15分钟。一旦完成后,离心管在4500×g离心在4℃下8分钟。
  4. 可选:取150微升在步骤2.11中收集的溶解蛋白质的,并将其传输到1.5ml微量离心管中。标记管作为预温育,并在-20℃下以供将来SDS PAGE分析冻结这个( 图3,粗MOG 标记 )。
  5. 净化MOG 标记蛋白质:
    1. 转移溶解蛋白质的整个体积从步骤2.11(〜40毫升,减去小样本,在步骤3.4中删除),以从步骤3.3含镍树脂在第一管( 图2,管1),混合,并水平放置在摇臂在4℃下1小时。
    2. 离心管在4500 XG在4℃,8分钟。一旦完成,将上清转移到第二镍树脂的管( 图2,管2)和在先前步骤中所述孵育。在此期间,继续执行步骤3到6以下与管1。
    3. 悬浮在管1的镍树脂在40ml洗脱缓冲液和管水平地放置在摇臂4℃5分钟。然后,离心反应管以4,500 xg离心在4℃下8分钟。
    4. 含转移洗脱MOG 标签蛋白的上清液进入标有“纯MOG 标记蛋白”的250毫升一瓶,并保持这瓶在4℃。每次洗脱步骤,集中在这瓶所得上清液。
    5. 添加40毫升条缓冲器的与镍树脂和水平放置在一个摇杆在4℃5分钟。
    6. 离心管在4500 XG在4℃,8分钟。弃去上清液,然后如在步骤3.3中列出充电镍树脂。
    7. 一旦完成后,前进与第二管按步骤3.5中列出。一共有4轮溶解蛋白质的吸收期从步骤2.11到充电镍树脂和洗脱将回收大部分蛋白质虽然,如果需要的话,另外的蛋白质可以在吸收和洗脱的额外轮次回收。
  6. 一旦四个(或更多)轮的吸收和洗脱完成后,存储所述合并纯化的蛋白质在4℃下过夜。镍树脂可在4℃下直到它被再次需要被存储在40毫升20%的乙醇溶液。

4.测量蛋白质浓度

注意:有必要进一步处理之前,量化在第3节中产生纯化MOG 标记蛋白量,该值将被用于确定最终量的蛋白质集中在协议的结尾。在这里,我们描述了一个标准的Bradford法。纯化MOG 标记蛋白的浓度是通过比较连续dilut的光谱吸光度测定编MOG 标记蛋白在已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线。

  1. 使10倍乙酸盐缓冲液通过在3升烧杯中加入23毫升冰醋酸至8.2克醋酸钠,然后添加1.9升氧化氢以溶解乙酸钠。转移该溶液到2L量筒和添加H. 2 O直至体积达到2 L。然后将其存储在一个2升瓶在室温下。使1毫升1×醋酸缓冲液中加入100微升的10×醋酸缓冲液900微升的H 2 O
  2. 通过加入30微升1×醋酸缓冲液至孔中G2-8和60微升至G9设定为稀释的96孔板中。添加48微升1×醋酸缓冲液至H2和H3。
  3. 设立在G行的BSA标准如下初始连续稀释:添加1X醋酸盐缓冲液216微升和54微升井G1市售的2毫克/毫升BSA标准调匀。从井G1到G2以及210添加微升,调匀,然后添加180微升以及G2的很好G3。加入150μL以及G3很好的G4,调匀,并继续添加30微升至少以后每次很好,直到以及八国集团的这一趋势。 (请参阅相当于稀释因子的列表表1)。
  4. 通过转移10微升以及G1至孔A1,B1和C1,和10μl以及G2的各孔A2,B2,C2中,等建立每种稀释液一式三份样品。使用多道移液器。
  5. 要设置MOG 标签的稀释,从步骤3.6很好H1增加60微升纯化MOG 标记蛋白质。从添加H1井12微升很好H2,调匀,再加入12微升以及H2的很好H3,调匀(这将产生在上半年1倍稀释,稀释1/5在H2和1/25稀释H3) 。
  6. 通过转移阱10微升H1-H3的行D,E和F设置一式三份样品的MOG 标签稀释,如在步骤4.4中描述。
  7. 将混合料2 ml蛋白质测定染料试剂浓缩物用8ml的H 2 O加入200μl该混合物到在排A,B,C,D,E和F的所有预加载的井,用多道移液器,如果有的话。看完蛋白浓度之前在弹出用针井任何气泡。
  8. 内加入染料试剂的10分钟,测量行的A,B,C,D,E和F.所有孔的595nm处吸光度
  9. 使用行A,B和C建立标准曲线,其中1-9位置对应于0.4,0.35,0.3,0.25,0.2,0.15,0.1,0.05,和0毫克/毫升BSA。根据这一曲线,计算使用MOG 标签的稀释最适合的标准曲线MOG 标记蛋白的浓度。通常,将有MOG 标签蛋白的200至250毫克,从1升使用这里描述的协议的细菌培养物。
    注:为了使MOG 1-125从这里着手在协议末尾列出了可选的第7节。否则,继续第5节。

注:透析被执行以从含有纯化,变性MOG 标签 ,以允许蛋白质再折叠溶液逐渐除去胍。必须注意在此步骤作为MOG本身是非常不可溶的,并且在这是通过硫氧还蛋白标签的存在改善,但仍容易出现出来的溶液作出。因此,重折叠应逐步进行,并在相对低的MOG 标记浓度。

  1. 开始透析前,稀释用缓冲液B(缓冲液B如在步骤3.1中列出可制成)纯化MOG 标记蛋白,直至浓度为0.5毫克/毫升或更少,基于MOG 标签的第4计算出的数量。
  2. 切约为30厘米SnakeSkin透析管,并通过折叠蛇皮三倍以上的端部和夹紧用止血钳的折叠端固定一端与锁定止血。填充用稀释的蛇皮MOG 标记蛋白然后通过迫使它们从开口端从蛇皮去除气泡(60至90毫升,每管MOG 标记蛋白的之间)。最后,密封件使用第二锁定止血所述管的另一端。
  3. 重复步骤5.2填补透析管的附加部分,直到所有MOG 标记蛋白已转入蛇皮透析管。确保没有任何泄漏。
  4. 通过称出382.12克盐酸胍和加入100毫升10×乙酸盐缓冲液在步骤4.1作出一个2L烧杯使1倍乙酸用4M胍。加0.5升的H 2 O操作烧杯中,并允许胍-HCl溶解。一旦溶解后,将溶液转移到一个1升的量筒和添加H. 2 O直至体积达到1L。重复此配方是要求每个2蛇皮。
  5. 如下进行透析:填一个大水桶(最小10 L)与步骤5.4的4M胍1升1X醋酸盐缓冲液。放上ŧ含O MOG 标签放入桶中透析管,留有余地磁力搅拌棒的2段旋转在底部无人之境。把水桶在4℃的室温在磁力搅拌板并打开一个缓慢的旋转速度( 不高,刚够移动液体):
    注:执行以下步骤,以逐渐减少在缓冲胍的量。搅拌时间给定为最小值,而是可以放置过夜。透析将至少需要3天,但是这可以根据需要延长。定期检查,以确保管道完好无损,并在两端紧。
    1. 让斗坐,搅拌4-5小时。
    2. 1升1×醋酸缓冲液(100毫升10倍乙酸盐缓冲液和900毫升水2 O的)添加到每个桶。
    3. 重复步骤5.5.1和5.5.2中所述桶共4升缓冲液,共3次。
    4. 丢弃一半的缓冲桶中,并用1L 1X醋酸缓冲液再填充(100毫升10X乙酸盐缓冲液和900毫升H 2 O,NO胍),并成立了管和搅拌棒。
    5. 重复步骤5.5.1和5.5.2一次( ,直到有一个总的在桶4升缓冲液中)。
    6. 最后,替换用4升新鲜的1X乙酸盐缓冲液的桶全部4升容积,让搅拌4-5小时。对于最好的效果,对蛋白质浓度的一天,这个步骤。
    7. 小心地取出复性与MOG 标签透析管,弃去斗缓冲区。

6.集中MOG 标记蛋白

注:在最后的步骤中,重折叠MOG 标签蛋白浓缩至用于存储的工作稀释度。由于MOG 标签是非常不溶性的,它不应该超过5毫克/毫升。此浓度是0.4毫克/毫升MOG 35-55肽,其通常用于诱导EAE小鼠中(混合1近似等摩尔:1与弗氏完全adjuv蚁(CFA))。在浓缩过程中,它是不寻常的蛋白质少量出来的溶液中的白色沉淀物的形式。过度沉淀是一个问题,但是。

  1. 计算最终所需体积达到5毫克/毫升的MOG 标记浓度的基础上,在第4计算的值。
  2. 线用铝箔盘中并覆盖用聚乙二醇(PEG)3350和PEG 8000在1铝箔:1的比例。将PEG 3350掺入这种混合物,因为它可以帮助防止浓缩过程中的蛋白聚集,是一种有效cyropreservative 11。
  3. 把蛇皮管(带内MOG 标签蛋白)在铝箔的顶部和用PEG 8000覆盖让此仰卧在室温和定期检查音量直到体积等于或低于估计最终体积(在步骤计算6.1),实际量将在下一步骤进行测量。如果油锅变得在浓缩过程与水过饱和,设置与铝箔和PEG 3350和PEG 8000新鲜锅。
  4. 洗蛇皮的外侧用H 2 O和使用血清吸管的MOG 标签蛋白质转移到一个独立的玻璃瓶中。保持量的轨道作为蛋白质被转移到确保的体积是正确的。
    1. 如果卷已经降低所估计的最终体积下,直至达到所需的体积添加1倍乙酸盐缓冲液。如果卷是估计的最终体积以上,转移MOG 标签蛋白质放回透析管并继续浓度(步骤6.2-6.3)。
    2. 分发MOG 标记蛋白之间1.5毫升管(0.5毫升,每管),直到需要管在-80℃保存。为了诱导EAE,混合此卷1:1 CFA。
  5. 运行的SDS PAGE凝胶上,以确认使用第1步骤取得的样本中的MOG 标记蛋白的表达。4,2.1,3.4,以及来自步骤6.4的纯化MOG蛋白。

7.生成MOG 1-125从MOG 标签中使用TEV蛋白酶(可选)

注意:此可选步骤从步骤4.如果MOG 1-125没有任何额外的标签序列是必需的,该标记序列可以使用TEV蛋白酶被移除( 图4)的端部延续。据我们所知,有能够产生纯MOG 1-125的任何其他表达系统。然而,应该指出的是,无硫氧还蛋白标签,MOG 1-125是高度不溶性的和纯化和处理过程中,这可能引起问题,因为这个原因删除标记如果绝对必要的实验的原因。需要几个步骤生成纯MOG 1-125。 MOG 标签第一透析到TEV蛋白酶裂解缓冲。以下用TEV蛋白酶消化,体积减小与后来纯化ST以有助于EPS,然后透析至缓冲液B,然后将含有His标签的标签序列是使用镍树脂除去。最后,蛋白进行定量和纯MOG 1-125浓缩至最终浓度。

  1. 通过加入1.861克EDTA 44.4克亚磷酸三盐酸,和26.5克亚磷酸三到2L烧杯中让1升10×TEV切割缓冲液(500mM的Tris-盐酸,5毫摩尔EDTA)的。添加H. 2 O直至体积达到990毫升然后将pH调节至8以溶解EDTA中。转移溶液至1L的量筒,并使用H 2 O使体积达1升
  2. 从步骤3.6稀释MOG 标记蛋白质到0.5毫克/毫升使用缓冲液B(在步骤3.1中所述的相同的缓冲液中)的基础上,如所描述4.转移120毫升稀释MOG 标记蛋白与蛇皮透析管中部分所计算蛋白质的量步骤5.2至5.3。体积可以按比例放大然而TEV蛋白酶的裂解所有MOG 标记蛋白的所需要的量将分电站微分方程边值问题的。
  3. 按照步骤5.5中列出的透析协议,除非在步骤7.1 10X做出乳沟TEV缓冲器取代10X乙酸盐缓冲液。
  4. 转移MOG 标签 ,现在在TEV切割缓冲液中,以一个新的250ml玻璃瓶和监测透析量的增加。加入1μlβ巯基乙醇,每向瓶中加入每MOG2.85毫升的标记蛋白。 (5毫克/毫升的库存TEV溶液)每50毫克的MOG 标记蛋白的至少添加1毫克TEV蛋白酶的(TEV蛋白酶可以被添加到1:10 TEV:MOG蛋白比),在室温下孵育,避光至少72小时。
    注:在TEV蛋白酶孵育结束时,白色沉淀应在玻璃瓶的底部可以看到。
  5. 蛋白质转移到透析管之前,添加盐酸胍到该溶液,直到蛋白溶解,以防止蛋白质粘附到玻璃瓶沉淀。转移150微升该溶液到1.5ml微量离心管中,并贴上标签管作为“MOG与TEV”。储存在-20℃以备将来SDS-PAGE分析该溶液中。
  6. 传输所有流体从步骤7.5到透析管如步骤5.2至5.3列出。填充一个大斗2升的H 2 O和透析管放入桶中。在4℃下与光搅拌过夜孵育此。这个步骤是重要的,以稀释出胍,以允许快速地发生的蛋白质浓度,并开始从将与蛋白质纯化干扰溶液中除去EDTA。
  7. 浓缩蛋白质在透析管中的步骤列出6.2至6.3(除仅使用PEG 8000),使得该溶液的最终体积是〜40毫升洗用H 2 O透析管并除去任何残留的PEG 8000仍附着到管。这种减少的体积使得能够以适合所有消化蛋白质的入含有镍重新50ml管罪恶,如步骤3.5所述。
  8. 透析消化蛋白质缓冲液B:
    1. 填充一个大水桶,用1L缓冲液B(29.22克氯化钠,3.152克的Tris-HCl,0.3405克咪唑,573.18克盐酸胍的,pH值7.9)。
    2. 放置装有消化蛋白质从步骤7.7在桶与搅拌磁体沿(如在步骤5.5中更详细地描述)的蛇皮。把水桶到4℃冷室上的轰动板设置为慢速搅拌,让蛇皮来透析的5个或更多小时。
    3. 清空桶和另一个1升缓冲液B的补充,并让这个坐在4℃冷室上的轰动板设置为慢速搅拌,让蛇皮来透析的5个或更多小时。
  9. 如在第3节详述,与该解理标签序列将由镍树脂的束缚,留下MOG 1-125在溶液中的重要区别执行MOG 1-125蛋白质的纯化。再次,4轮纯化的将同一卷上进行的,但在这种情况下,目标是提高纯度,而不是恢复尽可能多的蛋白质可能。参见图4。
    1. 制作步骤3.1中列出的蛋白质纯化缓冲区
    2. 充电镍树脂的两个管如在步骤3.3中描述。
    3. 通过在步骤3.5详述的基本不同的是从含标签的镍树脂洗脱液被丢弃的协议净化MOG 1-125(保持150微升,以备将来SDS-PAGE分析1.5 ml离心管洗脱物),而含有MOG 1-125的溶液保留作为最终产品。
  10. 测量1-125 MOG蛋白浓度在第4节:
    1. 如步骤4.2和4.4的描述设置BSA标准曲线稀释。
    2. 如步骤4.5和4.6的说明设置MOG 1-125的稀释液。另外,也可以是有价值的,以产生更大的范围的稀释液(1×,1/2,1/4和1/8,例如)。调整1X乙酸盐缓冲液和MOG 1-125相应的卷。
    3. 如步骤4.7至4.9执行Bradford测定和计算产生的MOG 1-125的数量。预期的收率是约4毫克或更多的蛋白质。
  11. 通过透析通过逐步取消胍复性MOG-125,在第5节。
  12. 浓缩MOG 1-125蛋白质如在部分6的终浓度描述应该2.24毫克/毫升,这是等摩尔至5毫克/毫升MOG 标记

8. SDS-PAGE凝胶来确认MOG 标签生产和纯度

从步骤1.4,2.1,3.4取的样品,和6.4通过标准SDS-PAGE分析,确认MOG 标签生产和纯度:注。此步骤要么MOG 标签或MOG 1-125的最后纯化之后进行。

    <利>通过加入1.576克的Tris-HCl的制作2×SDS-PAGE上样缓冲液以2毫升H 2 O和将pH设定为6.8。添加0.4克SDS到的Tris-HCl溶液,然后加入H 2Ø,直到量达到7毫升。
  1. 添加0.2克溴酚蓝至10毫升 H 2的O再加入1毫升这对在步骤8.1所作的溶液。最后,加2ml甘油以完成2×SDS-PAGE上样缓冲液。当存储该溶液,保持在4℃下并避光长达3个月。
  2. 从步骤1.4和2.1以及来自步骤3.4和6.4在室温下将溶解的MOG 标签蛋白解冻细菌的冷冻等分试样。
  3. 通过加入60微升的每个的蛋白质脱盐柱去除在步骤3.4和6.4中收集的溶液中的盐。净化下列制造商的说明蛋白质。
  4. 添加β巯基乙醇的20微升至1ml,在步骤8.2的溶液。加入40微升这两个BACterial从步骤8.3粒料和60微升至脱盐蛋白质从步骤8.4和孵育这些在95℃下进行10分钟。
  5. 通过称重超过了5克三,28.8克甘氨酸和1g SDS使1×SDS PAGE电泳缓冲液。这些添加到1升烧杯中,加入500毫升H 2 O操作溶解一切。一旦溶解,将溶液转移到一个1升量筒并用H 2 O充满直至体积达到1L。
  6. 设置了12%聚丙烯酰胺凝胶中的凝胶装置然后1倍的SDS-PAGE电泳缓冲液添加到凝胶装置以使得运行缓冲液是刚好在上面的凝胶孔的顶部。吹打50微升缓冲液至孔中每五次的洗涤凝胶的孔中。
  7. 放入10微升蛋白质梯进第一口井,然后从步骤8.5分离井加10微升煮解决方案。运行在115伏凝胶60分钟。
  8. 从该装置中取出凝胶,并转移到一个小容器中。填写CONTA用100ml纯 H 2的O INER和容器转移到缓慢旋转平台8分钟。 8分钟后,倾倒水,并用H 2 O洗凝胶两次以上
  9. 转储从容器轰2 O和100毫升快速染色试剂添加到该容器中。这让坐在一个缓慢旋转平台上过夜,用铝箔覆盖。
  10. 转储快速染色试剂并加入约100毫升 H 2 O操作的容器。允许该坐一个旋转平台上为8分钟。转储H 2 O和重复轰2 O洗两次。
  11. 图像使用考马斯蓝染色的成像器的凝胶。寻找一个带围绕31.86 kDa的(MOG 标记蛋白)和63.72 kDa的(MOG 标签二聚体)一个微弱带。

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Representative Results

一旦纯化完成后,收集在步骤1.4,2.1,3.4的样品,并从步骤6.4最终产物应在蛋白凝胶( 图3A)中运行。 MOG 标签应首先出现当T O / N样品中的31.86 kDa带,但不是T 0,并应在最终纯产物的唯一频带。为了测试MOG 标记蛋白是否已经正确折叠时,MOG 标签蛋白可用于通过FACS标记MOG蛋白特异性B细胞。通过用1标记小鼠淋巴细胞:MOG 标签 1000稀释用针对His标签和荧光标记的第三抗IgG1抗体的第二抗体一起MOG特异性B细胞可以识别( 图3B)。可替代地,MOG 标签可直接缀合到荧光团以降低背景染色(从B细胞结合到二级和三级抗体产生)在参考5中所述,以确定特定MOG-B细胞。试图确定在野生型小鼠MOG结合B细胞时,因为这些细胞通常非常罕见5,这是必要的。的IgH MOG小鼠具有的重链敲入,当与适当的κ轻链配对,赋予特异性MOG。由于MOG 标签的结合是室内运动场MOG B细胞之间增强,这证实了这个协议产生正确折叠的抗原。重要的是,的IgH MOG B细胞向自身免疫病理学中MOG定向的EAE 12的模型中,确认了MOG 标签诱导T和B细胞自身免疫。

开始透析如第5说明再折叠蛋白质之前,有必要使用Bradford测定法来测量蛋白质浓度,如表1第4所述Bradford测定法的代表性结果示图5中。

纯MOG 1-125的产生通过加入TEV蛋白酶的对MOG 标签蛋白最终导致了MOG 标记蛋白的裂解成MOG 1-125和标签序列, 如图6完成。随后镍树脂纯化除去MOG 标签 ,标签序列,和TEV蛋白酶杂质最终导致纯MOG 1-125, 如图6。

图1
图1:MOG 标记蛋白 (经许可这里重复的从Dang 5。)。直链结构,以及氨基酸和MOG 标签融合蛋白的DNA序列。小鼠MOG的胞外域的DNA序列(MOG1-125,在蓝色下序列)用于在细菌中表达(黑色密码子优化)。该序列的合成和插入载体来创建的N末端融合到包含硫氧还蛋白和S-标签以抵消MOG蛋白13,14的已知的不溶性的标记,以及6倍他对纯化15标记。一个TEV蛋白酶裂解位点从标签序列分离MOG 1-125。使用替代共识TEV裂解位点16的结果清除所有非MOG氨基酸TEV介导谷氨酰胺-164和甘氨酸-165之间的分裂。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:以生产纯MOG 标记蛋白质所需的步骤概述生成MOG 标签蛋白质,表达MOG 标签蛋白的细菌生长到高密度,然后诱导表达使用IPTG MOG 代码作为第1所列的过夜培养后,将细菌裂解,并通过一系列造粒的步骤包含蛋白质级分包涵体,其中包含MOG 标签 ,提取为第2节中MOG 标签上市,然后从粗蛋白组分纯化通过吸收的四个周期到充电镍树脂和MOG 标签蛋白洗脱在第3节的部分上市的汇集洗脱液然后采取Bradford测定法来确定MOG 标记蛋白质的产率和洗出液的其余部分被透析入乙酸盐缓冲液在数天的过程中如在第4列和5.最后,将蛋白质浓缩使用PEG 3350和PEG 8000至5毫克的最终浓度/ ml的根据MOG 标签的在B所确定的产量莱福法在第6节中列出的整个过程需要至少10天,开始每天在括号中的每个步骤。然而,另一种停止和启动点在协议中列出,并且步骤可以遍布的如果需要的时间量更大。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
3: 在MOG 标签蛋白质和其活性的评估的纯化 (A)中所示的是来自不同点收集跨越蛋白质纯化过程,并在SDS-PAGE凝胶上运行的蛋白质样品。 T 0的=前蛋白诱导(步骤1.4收集)BL21细菌,TØ蛋白表达/ N = BL21菌诱导后(收集在步骤2.1),原油MOG 标签 =溶解的MOG 标记蛋白之前,蛋白质纯化(步骤3.4收集),纯MOG 标签 = MOG 标记蛋白质纯化(步骤6.4收集后)。 (B)从野生型C57BL / 6小鼠或表达特异于MOG蛋白7,17免疫球蛋白重链的IgH MOG小鼠MOG 标签蛋白质从淋巴结CD19 POS CD4 幼稚B细胞的结合用流式细胞术评估。 MOG 标签特异性的B细胞被染色的淋巴结细胞用MOG 标签后跟一个第二抗his标签抗体和荧光叔抗IgG1抗体识别。从C57BL / 6或IgH基因小鼠MOG细胞的染色与MOG的IgH细胞的MOG 标签荧光减一(FMO)控制染色一同显示。 请Ç舔此处查看该图的放大版本。

图4
图4:步骤概述,生成MOG 1-125 从MOG 标签 的蛋白质。如在该协议的步骤3.5中所述收集MOG 标签洗脱液后,MOG 标签蛋白质透析到TEV蛋白酶裂解缓冲液中。一旦透析完成后,TEV蛋白酶加入到导致MOG 标签的裂解成MOG 1-125蛋白质的MOG 标记溶液。然后将裂解的溶液的体积减少,并透析到前蛋白质纯化缓冲液B。从裂解溶液中的杂质,通过四个连续几轮吸收到充电镍树脂和最终导致纯MOG的溶液中的杂质溶出萃取<子> 1-125。在MOG 1-125蛋白的浓度通过Bradford测定法确定,并且该蛋白被折叠在数天通过透析的过程中。一旦透析完成后,MOG-125蛋白浓缩至2.24毫克/毫升使用PEG 3350和PEG 8000。该协议部分中,详细讨论7. 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5: 用于确定MOG 标记的浓度的Bradford测定标准曲线的实施例 蛋白。从表1中所采取的BSA标准读数作图,得到的线性回归公式计算基于在595nm处的光密度的MOG 标记浓度。F =“https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

图6
6:MOG 标记 蛋白 的TEV切割 和MOG 1-125 的后续纯化所示的是蛋白质样品上MOG 1-125的SDS-PAGE凝胶示范纯化运行纯MOG 标记 =到TEV切割之前(收集MOG 标记蛋白在步骤6.4),MOG 标签瓦特/ TEV =蛋白组分被后TEV蛋白酶MOG 标签培养72小时收集(收集在该MOG 1中保持绑定到镍树脂步7.5)=洗脱蛋白组分125纯化方案(步骤7.9收集),纯MOG 1-125 = MOG净化(收集步骤7.12)之后1-125蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。

BSA(毫克/毫升) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1.079 0.998 0.948 0.853 0.769 0.699 0.583 0.493 0.373
1.071 1.014 0.95 0.854 0.777 0.681 0.579 0.484 0.375
1.069 1.017 0.944 0.848 0.781 0.592 0.494 0.374
MOG 标签稀释 1 1/5 1/25
1.327 1.013 0.493
1.332 1.063 0.491
1.367 1.088 0.488

表1:从Bradford测定代表值确定MOG 标记 蛋白 的浓度的BSA DILU。在已知浓度的系统蒸发散被用于确定在图5所示的标准曲线MOG 标签蛋白质交纯化的稀释液被用于确定最终MOG 标签蛋白质浓度。行包含在595nm测量的光密度和每行代表每一指明浓度共3个重复中的一个复制。

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Discussion

这里,我们已经描述了协议用于生产MOG 标记蛋白以及如何产生来自MOG 标签蛋白质纯MOG 1-125的。这个协议是基于两个标准His标签的蛋白质的纯化方法,以及用于一个较旧的基于MOG蛋白15的产生先前描述的方案。虽然没有在这里描述的,MOG 标签蛋白的主要用途是通过与蛋白质抗原免疫以诱导EAE。描述的EAE是如何在小鼠,这是与MOG 标签蛋白兼容诱导的协议,可以在参考3中找到。我们以前表明,免疫与MOG 标签衍生MOG 标签或MOG 1-125不仅诱导的CNS以更大的脊髓炎症和脱髓鞘自身免疫疾病的标准相比,MOG 35-55肽,也表明致病的IgH MOG B细胞塔吨认识MOG蛋白被激活,以产生响应于MOG 标签或MOG 1-125一个生发中心反应,但不MOG 35-55 5。因此,免疫接种MOG 标签确实诱导适当的抗MOG B细胞的反应。

MOG 标记蛋白是通过吸收到充电镍树脂(通过His标签)和洗脱纯化。因为在前面的步骤中生成的蛋白质的大量的,需要的吸收和洗脱的多轮收集大部分的蛋白质。我们已经发现,至少4个轮次都需要,如果使用的树脂的合适体积为50ml试管以分离出大多数蛋白质。如果需要的话,该协议可以扩展到使用更多或更大的管,更镍树脂来降低轮吸收的数量。可替代地,高效液相色谱(HPLC)与镍柱可有效地净化His-标记蛋白18 </ SUP>而事实上我们发现,HPLC能够有效地净化MOG 标记蛋白(未发表意见)。通过HPLC不是许多标准免疫学实验室访问,这里列出的协议被设计为使用共同的实验室设备中进行。除了his-标签纯化后,MOG 标签蛋白确实含有一个S标签,如果优选的14,它与S-tag纯化协议兼容。

基于MOG(主要是人或大鼠)的重组蛋白之前已经8所述。这些是基于已自被取代由能够在大肠杆菌细菌产生较大量的蛋白质的强转录启动子驱动的系统较旧的表达系统。我们MOG 标签表达系统用于PET-32A(+)载体,它是显著比可用于内部生产MOG蛋白19的系统的效率高效T7启动子。然而,它那HOULD应当注意,这里所描述的MOG 标记蛋白是基于小鼠MOG。免疫与人MOG蛋白已经显示出诱导EAE中相比,使用鼠MOG 8引起的疾病具有不同的特征的小鼠。此外,鼠MOG可以比小鼠在某些情况下20小鼠MOG免疫原性更强。因此,对于一些基于小鼠实验目的MOG 标签可能不是很理想。我们是在产生几个不同版本的MOG 标签蛋白的比可能适合某些用途较好的方法中,并且这里所描述的纯化方案将所有的这些工作。在此期间,有可能的是,这里所描述的纯化方案可以针对其他MOG表达系统,或甚至其他蛋白质工作,只要它们掺入6×His标签吸收到镍树脂。然而,如果没有硫氧还蛋白标签,在较高浓度的MOG蛋白的溶解度可能是一个问题,当然就不可能戈 nerate纯MOG 1-125,因为这是唯一的MOG 标签系统。

测定蛋白质折叠之前通过透析MOG 标记蛋白浓度是该净化协议的成功是至关重要的。如果浓度过高,则蛋白质可以聚集和脱落的溶液代替折叠成单独的蛋白质。这可以在透析协议,为白色沉淀物在透析管的底部成形时可以看到。如果这发生,用6M胍再次溶解MOG 标签蛋白质和测量蛋白质浓度。稀释蛋白质到0.5毫克/毫升,然后再次启动透析如任何沉淀物应该形成于0.5毫克/毫升。对MOG 1-125,沉淀物可以预期,以形成作为所述蛋白质是高度不溶性的。我们已发现,这不会影响只要该蛋白前充分透析稀释MOG 1-125的折叠。

NT“>对于TEV蛋白酶有效地切割MOG 标记蛋白进入纯MOG-125是使用TEV蛋白酶足够量的重要。TEV蛋白酶的旧版本是通过自我切割失活不过21更现代的版本患不溶性发出22因此重要的是要加入足够的TEV蛋白酶实现TEV蛋白酶失活前的MOG 标签蛋白质的足够的切割。由于市售TEV蛋白酶可能是昂贵的,我们建议生产和纯化TEV蛋白酶如在参照图22说明。当使用纯小鼠MOG 1-125蛋白质进行实验,要注意的是该蛋白是高度不溶性的,并且可以从溶液沉淀出来,因此必须进行广泛混合使用之前是重要的。

总之,在这里我们描述了一个简单协议,用于生产和提纯大量MOG 标记蛋白质。 Furtherm矿石,增加了一个TEV蛋白酶切割位点提供了MOG 标签蛋白提供了机会,如果需要的话,以产生纯MOG 1-125。 MOG 标签蛋白被抗自身免疫性的髓鞘B细胞和MOG诱导的标签采用EAE B细胞介导的病理5识别和结合。因此,MOG 标签蛋白克服的主要障碍限制了广泛使用的蛋白质抗原来诱导EAE。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

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References

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