Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

MS is een menselijke ziekte gekenmerkt door chronische ontsteking en neurodegeneratie van het CZS die wordt gedacht te worden veroorzaakt door een auto-immuunreactie gericht myeline. Het verlies van myeline en axonen na verloop van tijd leiden tot een geleidelijke afname van de cognitieve en motorische functie 1. "Experimentele auto-immune Encefalomyelitis" is een overkoepelende term voor diermodellen van auto-immuunziekten gericht CNS myeline. Als menselijke MS, EAE wordt doorgaans gekenmerkt door infiltratie van immuuncellen van het centrale zenuwstelsel en in sommige gevallen, demyelinisatie 2. De mate waarin een bepaalde EAE model lijkt op menselijke MS mede afhankelijk van de soort of stam gebruikt en de complexiteit van het onderliggende anti-myeline auto-immuunreactie.

Anti-myeline autoimmuniteit kan experimenteel worden geïnduceerd op verschillende manieren, maar de meest gebruikte methode tegenwoordig gebruikt om muizen te immuniseren met een korte peptide van aminozuren nabootsen van de immunodominante CD4 35-55), die wordt gebruikt om EAE te induceren in C57BL / 6 muizen 3. Voor sommige experimentele doeleinden wenselijk of zelfs noodzakelijk om immuniseren met grotere eiwitantigenen en inderdaad zijn er verschillende voordelen aan deze via immunisatie met korte peptide. Ten eerste omdat MHC beperking korte peptiden gewoonlijk alleen effectief in een zeer beperkt aantal stammen, terwijl grotere eiwitantigenen die ofwel het gehele eiwit of een specifiek domein kan normaal worden voor de presentatie in verschillende soorten verwerkt meerdere inteelt muizenstammen of 4. Ten tweede, een groter eiwit antigeen kan induceren een meer complexe immuunrespons waarin meer soorten lymfocyten in antigenherkenning, plaats limiting antigeenherkenning aan CD4 + T-cellen. Bijvoorbeeld, B-cellen via hun B-cel receptor (BCR) communiceren rechtstreeks met geheel in plaats van verwerkte dierlijke eiwitten. Wij en anderen hebben aangetoond dat B-cellen geactiveerd door MOG 35-55 immunisatie niet herkent MOG eiwitten 5. Aangezien B-cellen werden onlangs aangetoond dat een pathogene rol spelen bij menselijke MS 6, EAE modellen die B-cellen bevatten bij auto pathologie steeds belangrijker.

Ondanks de voordelen van grotere eiwitantigenen EAE te induceren, blijven er enkele commercieel beschikbare bronnen voor dergelijke eiwitten. Inderdaad, terwijl korte peptiden zoals MOG 35-55 snel en tegen relatief lage kosten kunnen worden gesynthetiseerd, de commerciële mogelijkheden MOG eiwitten zijn beperkt en de kosten aanzienlijk te schaffen. Toch zijn er een aantal expressievectoren beschikbaar voor onderzoeksgroepen om MOG extracellulair domein te genereren (MOG 1-125) zelf. however, alle expressiesystemen die we hebben geïdentificeerd in de literatuur zijn gebaseerd op oudere technologie die sindsdien zijn vervangen door efficiëntere expressiesystemen 7. Daarnaast bieden de meeste zijn gebaseerd op ratten of mensen MOG 8. Voor sommige onderzoeken van auto-immuniteit bij muizen, een antigeen op basis van de muis MOG autoantigeen voorkeur. Tenslotte alle MOG-gebaseerde eiwitten die we hebben geïdentificeerd, commerciële of als expressievectoren, zijn fusie-eiwitten die additionele aminozuren aan de MOG 1-125 base. Deze omvatten een tag voor zuivering en meestal andere sequenties ook, waarvan vele een functie we konden identificeren.

Om deze beperkingen te pakken, genereerden wij een nieuwe fusie-eiwit op basis van de muis MOG extracellulaire domein gefuseerd aan een label met thioredoxine de bekende onoplosbaarheid van MOG eiwit 5 bestrijden. De tag sequentie bevat ook een 6xHis sequentie voor zuivering en een TEV protease kelAvage plaats dat zorgt voor de volledige verwijdering van tagsequenties, indien gewenst. Dit is de enige methode die we ons bewust van de zuivere MOG 1-125-eiwit te genereren. Om de productie van grote hoeveelheden eiwit te vergemakkelijken, de MOG 1-125 sequentie is codon-geoptimaliseerd voor bacteriële expressie en MOG tag fusie-eiwit werd in de pET-32 expressiesysteem ingebracht. Hier beschrijven we in detail het protocol te produceren en te zuiveren MOG tag eiwit en pure MOG 1-125, met behulp van niet-gespecialiseerde apparatuur beschikbaar voor de meeste immunologie laboratoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eiwit Inductie

OPMERKING: In de volgende stappen, BL21 Escherichia coli bacteriën die zijn getransformeerd met een PET-32 vector die de sequentie voor het MOG tag fusie-eiwit (zie referentie 5 en Figuur 1) worden gekweekt tot hoge dichtheden en worden vervolgens geïnduceerd om de MOG tag eiwit tot expressie brengen . Zie figuur 2 voor de algemene tijdlijn - er rekening mee dat de dagen zijn bij benadering en de plaatsvervangende stoppunten worden vermeld in het protocol. Als ab gezuiverde pET-32 MOG tag vector DNA, is het nodig om chemisch omzetten in competente BL21 E. coli bacteriën gebruikt ampicillineselectie, zoals goed beschreven 9. Succesvolle transformatie worden bevestigd door het zuiveren van DNA uit geselecteerde bacteriën onder toepassing van een standaard commerciële kit, gevolgd door digestie met de restrictie-enzymen AGE1 Sac1 en een 424 bp band produceren op een agarosegel 10.

    tag glycerol en incubeer deze overnacht bij 37 ° C, 200 rpm.
  1. Plaats twee 1 L Erlenmeyer kolven die 500 ml steriele LB kweekvloeistof in een 37 ° C incubator in voorbereiding op de volgende dag.
  2. Voeg 500 ul van 100 mg / ml ampicilline aan elk van de kolven met 500 ml LB uit stap 1,2 (eindconcentratie 0,1 mg / ml ampicilline). Transfer 1 ml van de overnacht kweek van stap 1,1 tot elk van de twee kolven van LB bouillon. Incubeer bij 37 ° C en 200 rpm gedurende 5 uur of tot een optische dichtheid van 0,6.
  3. Neem een ​​1 ml portie van een van de kolven en breng deze in een afzonderlijke 1,5 ml centrifugebuis. Pellet de cellen bij 16.000 xg gedurende 1 min en de bovenstaande vloeistof. Label de buis T 0 (pre-inductie) en vervolgens de bacteriële pellet in een -20 ° C vriezer voor toekomstige natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse (zie paragraaf 8 en Figuur 3).
  4. Voeg 0,5 ml van 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) aan elke kolf. Incubeer de kolven bij 37 ° C, 200 rpm gedurende 4 uur, vervolgens bij kamertemperatuur bij 75 rpm overnacht.

2. Oogsten MOG tag Protein

Opmerking: In dit stadium zullen de bacteriën hebben grote hoeveelheden MOG tag eiwit. Om MOG tag te oogsten, zijn bacteriën eerst gelyseerd in een Triton X-100 buffer, gevolgd door sonicatie. MOG tag wordt vervolgens vrijgelaten uit inclusielichamen en gedenatureerd met guanidine en imidazool, waardoor een ruw eiwit oplossing die het eiwit MOG tag.

  1. Neem een ​​1 ml portie van een van de overnacht kweken van stap 1,5 en overbrengen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Pellet de cellen bij 16.000 xg gedurende 1 min en de bovenstaande vloeistof. Label het bade T O / N (na inductie) zet dan de bacteriële pellet in een -20 ° C vriezer voor toekomstige SDS pagina-analyse (Figuur 3).
  2. Verdeel de culturen gelijkmatig onder de 250 ml flesjes compatibel met hoge snelheid centrifugeren en houd deze op ijs vanaf dit punt naar voren. Pellet de bacteriële cellen bij 22.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  3. Verwijder het supernatant. Bewaar de bacteriële pellets bij -20 ° C of ga verder met stap 2.4.
  4. Bereid lysisbuffer (0,1 mg / ml lysozym van kippeneieren, 0,1% Triton-X (v / v) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) door toevoeging van 60 pl Triton X-100 en 120 gl 50 mg / ml lysozym van kippeneieren stockoplossing aan 60 ml PBS.
  5. Resuspendeer en combineer alle bacteriële pellets uit stap 2,3 in een totaal van 30 ml lysisbuffer. Transfer dit volume om een ​​ronde ml buis bodem 50 in staat hoge snelheid centrifugeren. Zet deze tube in een 30 ° C waterbad gedurende 30 minuten. Tijdens de incubatietijd, schud de buistwee keer om de cellen te mengen.
  6. Na de incubatie, overdracht van de buis op ijs en ultrasone trillingen de oplossing bij 20 kHz, amplitude 70%, pols op 3 sec, pulse off 3 sec, en vijf pulsen per ronde. Sonificeer de oplossing voor in totaal zes rondes en laat de oplossing afkoelen op ijs tussenin rondes.
  7. Centrifugeer de oplossing bij 24.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en herhaal de stappen 2,5-2,7 keer. Bewaar de pellet bij -20 ° C of ga verder met stap 2.8.
  8. Bereid buffer A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazool, pH 7,9) door toevoeging van 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl en 0,01021 g imidazool een 100 ml bekerglas. Voeg H2O totdat het volume 28 ml bereikt pas de pH van de oplossing 7,9. Daarna breng de oplossing een 100 ml maatcilinder en voeg H2O totdat het volume 30 ml.
  9. Resuspendeer de pellet uit stap 2.7 in 30 ml buffer A en incubeer deze oplossing bij 4 ° C gedurende 3 uur. Gedurende deze periodeWeeg 17,2 g guanidine-HCl.
  10. Ultrasone trillingen van de oplossing op het ijs met dezelfde instellingen als in stap 2.6. Voeg vervolgens 17,2 g guanidine-HCl oplossing. Incubate dit op ijs gedurende 1 uur aan de MOG tag eiwit oplosbaar te maken.
  11. Centrifugeer de oplossing bij 24.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verzamel de supernatant en bewaar het supernatant bij 4 ° C tot eiwitzuivering.

3. Protein Purification

OPMERKING: In de volgende stappen van de MOG tag eiwit door middel van 4 rondes van absorptie zal worden gezuiverd op opgeladen nikkel hars (via de His-tag) en elutie.

  1. Maak de volgende Buffers:
    1. Bereid buffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidine-HCl, pH 7,9). Voeg NaCl 5,844 g, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g imidazool en 114,64 g guanidine-HCl in een 500 ml bekerglas. Voeg vervolgens H 2 O tot het 190 ml bereikt en breng de pH op 7,9. Breng de solution aan een 250 ml maatcilinder en voeg H 2 O tot het volume is 200 ml.
    2. Bereid elutiebuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazool, 6 M guanidine-HCl, pH 7,9). Voeg NaCl 5,844 g, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazool en 114,64 g guanidine-HCl in een 500 ml bekerglas. Voeg H 2 O tot het 190 ml bereikt en breng de pH op 7,9. Breng de oplossing in een 250 ml maatcilinder en voeg H 2 O tot het volume is 200 ml.
    3. Bereid Strip buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Voeg NaCl 5,844 g, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA tot een 500 ml bekerglas. Voeg H 2 O tot het 190 ml bereikt en breng de pH op 7,9. Breng de oplossing in een 250 ml maatcilinder en voeg H 2 O tot het volume is 200 ml.
    4. Bereid Charge buffer (0,1 M nikkel sulfaat). Voeg 5,257 g nikkelsulfaat een bekerglas van 500 ml en voeg H 2 O tot het 190 ml bereikt (LET OP, niet omgaan met nikkelsulfaat buiten een zuurkast tot de nikkel sulfaat werd opgelost in H 2 O). Zodra de nikkelsulfaat is opgelost, breng de oplossing een 250 ml maatcilinder en voeg H2O totdat het volume 200 ml bereikt.
  2. Split 10 ml nikkel hars tussen twee conische 50 ml centrifugebuizen bestand tegen centrifugaalkrachten dan 4500 xg (5 ml per buisje).
  3. Laad en evenwicht de nikkel hars:
    1. Was de hars door het toevoegen van 40 ml H2O aan elke buis bevattende hars. Leg de buizen horizontaal op een rocker en laat ze ageren gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar Centrifugeer de buizen bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
    2. Verwijder het supernatant door pipetteren om te voorkomen dat verstoring van de pellet. Voeg 40 ml Betalende buffer aan elke buis. Breng de buizen op een rocker en laten roeren gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar Centrifugeer de buizen bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
  4. Optioneel: Neem 150 ul van het opgeloste eiwit verzameld in stap 2.11 en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Label de buis als voorincubatie en vries dit bij -20 ° C voor toekomstig SDS pagina-analyse (Figuur 3, ruwe MOG tag).
  5. Zuiver het MOG tag Protein:
    1. Breng de volledige hoeveelheid oplosbaar eiwit uit stap 2,11 (~ 40 ml, minus het kleine monster verwijderd in stap 3,4) aan de eerste buis (figuur 2, buis 1) die nikkel hars van stap 3,3, meng en zet horizontaal op een rocker bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    2. Centrifugeer de buis bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Eenmaal klaar, de overdracht van de bovenstaande vloeistof naar de tweedebuis (figuur 2, buis 2) nikkel hars en incubeer zoals beschreven in de vorige stap. In de tussentijd verder met stappen 3-6 hieronder buis 1.
    3. Resuspendeer de nikkel hars in buis 1 in 40 ml elutiebuffer en plaats de buis horizontaal op een rocker bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Vervolgens centrifugeer de buis bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
    4. Breng de bovenstaande met geëlueerde MOG tag eiwit in een ml fles 250 met het label 'gezuiverd MOG tag eiwit' en houd deze fles bij 4 ° C. Bij elke elutiestap, verzamel het resulterende supernatant in deze fles.
    5. Voeg 40 ml strip buffer nikkel hars en plaats horizontaal op een rocker gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    6. Centrifugeer de buis bij 4500 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, dan laadt u de nikkel hars zoals vermeld in stap 3.3.
    7. Eenmaal klaar, verder te gaan met de tweede buis zoals vermeld in stap 3.5. Een totaal van 4 rounds van absorptie van het opgeloste eiwit uit stap 2,11 op de geladen nikkel hars en elutie meeste van het eiwit alhoewel herstellen, indien gewenst, additionele eiwit kan worden teruggewonnen extra ronden van absorptie en elutie.
  6. Eenmaal vier (of meer) ronden van absorptie en elutie zijn voltooid, slaat de samengevoegde gezuiverde eiwit bij 4 ° C overnacht. Nikkel hars kan worden opgeslagen in 40 ml van een 20% ethanol oplossing bij 4 ° C totdat deze weer nodig is.

4. Meten eiwitconcentratie

Opmerking: alvorens verder te gaan is het noodzakelijk om de hoeveelheid gezuiverd eiwit MOG tag gegenereerd in punt 3. kwantificeren Deze waarde wordt gebruikt om het uiteindelijke volume op het eiwitconcentraat aan het eind van het protocol te bepalen. We beschrijven een standaard Bradford Assay hier. De concentratie van gezuiverd eiwit MOG tag wordt bepaald door de spectrale absorptie in serie diluted MOG tag eiwit aan een standaardkromme van runderserumalbumine (BSA) bij een bekende concentratie.

  1. Voeg 10x acetaatbuffer door toevoeging van 23 ml ijsazijn 8,2 g natriumacetaat in een 3 L bekerglas en voeg 1,9 L H 2 O het natriumacetaat lossen. Breng deze oplossing over een 2 L maatcilinder en voeg H 2 O totdat het volume bereikt 2 L. slaan dan in een 2 liter fles bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml van 1x acetaatbuffer door toevoeging van 100 pl 10x acetaatbuffer met 900 ui H2O
  2. Het opzetten van een 96-wells plaat verdunningen door het toevoegen van 30 ui 1 x acetaatbuffer putjes G2-8 en 60 pl G9. Voeg 48 pl 1x acetaatbuffer H2 en H3.
  3. Stel de eerste seriële verdunning van de BSA norm rij G als volgt: Voeg 216 ul van 1 x acetaat buffer en 54 pl van commercieel verkrijgbaar 2 mg / ml BSA standaard goed G1 en meng. Voeg 210 ul van goed G1 goed G2, meng,en voeg dan 180 ul van goed G2 om goed G3. Voeg 150 ul van goed G3 om goed G4, meng goed, en blijven deze trend van het toevoegen van 30 pi minder om elk volgend goed tot goed G8. (Zie tabel 1 voor lijsten equivalente verdunningsfactoren).
  4. Opgericht drievoudige monsters van elke verdunning door de overdracht van 10 pl en G1 putjes A1, B1 en C1 en 10 pl en G2 putjes A2, B2 en C2, enzovoort. Gebruik een multichannel pipet.
  5. Voor het instellen van verdunningen van MOG tag, voeg 60 ul van gezuiverd MOG tag eiwit uit stap 3,6 tot goed H1. Voeg 12 ul van goed H1 goed H2, meng goed, voeg dan 12 ul van goed H2 goed H3, meng (dit levert een 1x verdunning in H1, 1/5 verdunning in H2 en 1/25 verdunning in H3) .
  6. Opgericht drievoudige monsters voor de MOG tag verdunningen door het overdragen van 10 ul putjes H1-H3 rijen D, E en F, zoals beschreven in stap 4.4.
  7. Meng 2 ml eiwit assay kleurstofreagens concentraat met 8 ml H2O Voeg 200 ul van dit mengsel al voorgeladen putjes in rijen A, B, C, D, E en F, met een meerkanaalspipet, indien beschikbaar. Pop eventuele luchtbellen in de putjes met behulp van een naald vóór het lezen van het eiwit concentratie.
  8. Op 10 min van het toevoegen van de kleurstof reagens, meet de 595 nm absorptie van de putjes in rijen A, B, C, D, E en F.
  9. Gebruik rijen A, B en C om een ​​standaard curve waarin posities 1-9 overeen met 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 en 0 mg / ml BSA. Op basis van deze curve, het berekenen van de concentratie van MOG tag eiwit met behulp van de verdunning van MOG-tag die het beste past bij de standaard curve. Gewoonlijk zal er 200 tot 250 mg MOG tag eiwit van 1 liter bacteriekweek gebruik van het protocol beschreven.
    LET OP: Om MOG 1-125 gaan van hier naar de optionele sectie 7 die aan het eind van het protocol. Ga anders verder met deel 5.

OPMERKING: Dialyse wordt uitgevoerd geleidelijk guanidine uit de oplossing die gezuiverd, gedenatureerd MOG-tag, waardoor het eiwit opnieuw te vouwen. Zorg moet worden genomen tijdens deze stap MOG zelf is zeer onoplosbaar is, en terwijl dit wordt verbeterd door de aanwezigheid van de tag thioredoxine, is het nog steeds gevoelig uit de oplossing te komen. Daarom hervouwen moeten geleidelijk worden uitgevoerd en bij een betrekkelijk lage concentratie MOG tag.

  1. Voordat dialyse Verdun het gezuiverde eiwit MOG tag met buffer B (buffer B kan als genoemd in stap 3,1) totdat de concentratie 0,5 mg / ml of minder, gebaseerd op het berekende punt 4 hoeveelheid MOG tag.
  2. Snijd ongeveer 30 cm SnakeSkin dialyse tubing en veilig ene uiteinde een vergrendeling hemostaat door vouwen het einde van de slangenhuid drie keer en klemmende het gevouwen einde met de hemostaat. Vul het slangenleer met verdundeMOG tag eiwit (tussen de 60 tot 90 ml van MOG tag eiwit per buis) en verwijder luchtbellen uit het snakeskin door ze uit het open einde forceren. Tenslotte sluit de andere einde van de buis met een tweede vergrendelinrichting hemostaat.
  3. Herhaal stap 5.2 tot extra secties van de dialyse tubing vullen totdat alle MOG tag eiwit in slangenhuid dialyse tubing overgedragen. Zorg ervoor dat er geen lekken zijn.
  4. Maak 1x acetaat met 4 M guanidine door weging uit 382,12 g guanidine-HCl en het toevoegen van 100 ml van 10x acetaat buffer in stap 4.1 naar een 2 L beker. Voeg 0,5 L H 2 O aan de beker en laat de guanidine-HCl op te lossen. Eenmaal opgelost, breng de oplossing om een 1 L maatcilinder en voeg H 2 O totdat het volume bereikt 1 L. Herhaal dit recept voor elke 2 snakeskins die nodig zijn.
  5. Voer dialyse als volgt: Vul een grote emmer (minimaal 10 liter) met 1 liter 1x acetaat buffer met 4 M guanidine uit stap 5.4. Plaats up to 2 delen van dialyse catheter met MOG tag in de emmer, waardoor er ruimte voor een magnetische roerstaaf draaien ongehinderd in de bodem. Doe de emmer in een 4 ° C kamer op een magnetische roer bord en zet hem aan tot een trage rotatiesnelheid (dwz niet hoog, net genoeg om de vloeistof te verplaatsen):
    Opmerking: Voer de volgende stappen om de hoeveelheid guanidine in de buffer geleidelijk af. Roer tijden worden gegeven als minima, maar kan 's nachts worden overgelaten. Dialyse zal een minimum van 3 dagen in beslag nemen, maar dit kan desgewenst worden uitgebreid. Regelmatig te controleren om ervoor te zorgen dat de slang intact is en dat de uiteinden goed gesloten zijn.
    1. Laat de emmer zitten en roer gedurende 4-5 uur.
    2. Voeg 1 liter 1x acetaatbuffer (100 ml 10x acetaat buffer en 900 ml H2O) elk segment.
    3. Herhaal stap 5.5.1 en 5.5.2 in totaal 3 keer voor een totaal van 4 liter buffer in de emmer.
    4. Gooi de helft van de buffer in de emmer en vul met 1 liter 1x acetaatbuffer (100 ml 10x acetaat buffer en 900 ml H 2 O, nee guanidine) en het opzetten van de slangen en roerstaafje.
    5. Herhaal stap 5.5.1 en 5.5.2 een keer (dat wil zeggen tot er een totaal van 4 L van buffer in de emmer).
    6. Tot slot, de plaats van de gehele 4 L volume in de emmer met 4 L verse 1x acetaat buffer en laat roer gedurende 4-5 uur. Voor het beste resultaat, doe deze stap op de dag van de eiwitconcentratie.
    7. Verwijder voorzichtig de dialyse buis met opgevouwen MOG tag en gooi emmer buffer.

6. Concentreren MOG tag Protein

LET OP: In de laatste stap wordt opgevouwen MOG tag eiwit geconcentreerd tot de werkende verwatering voor opslag. Zoals MOG tag is zeer onoplosbaar is, moet het niet meer dan 5 mg / ml. Deze concentratie is ongeveer equimolair met 0,4 mg / ml MOG 35-55 peptide, die gewoonlijk wordt gebruikt om EAE te induceren bij muizen (gemengd 1: 1 met volledig Freund's adjuvant (CFA)). Tijdens het concentratieproces is het niet ongebruikelijk dat een kleine hoeveelheid eiwit uit de oplossing in de vorm van witte neerslag. Overmatige neerslag is echter een probleem.

  1. Bereken het uiteindelijke gewenste volume een MOG tag concentratie van 5 mg / ml, gebaseerd op het berekende punt 4 te bereiken.
  2. Bekleed een pan met aluminiumfolie en dek de aluminiumfolie met polyethyleenglycol (PEG) 3350 en PEG 8000 in een 1: 1 ratio. De PEG 3350 is opgenomen in dit mengsel als het kan helpen bij het concentreren voorkomen eiwit aggregatie en is een effectieve cyropreservative 11.
  3. Zet de slangenhuid buis (met MOG tag eiwit binnen) bovenop het aluminiumfolie en bedek met PEG 8000. Laat deze zitten bij kamertemperatuur en controleer het volume regelmatig tot het volume gelijk is aan of lager dan de geschatte uiteindelijke volume (berekend in stap 6,1), zal de werkelijke volume gemeten in de volgende stap. Als de pan wordtoververzadigd met water tijdens de concentratie proces, het opzetten van een nieuwe pan met aluminiumfolie en PEG 3350 en PEG 8000.
  4. Het uiteinde van de snakeskins met H2O en breng de MOG tag eiwit aan een aparte glazen fles met behulp van een serologische pipet. Houd het volume het eiwit wordt overgebracht naar zorgen volume correct is.
    1. Als het volume onder de veronderstelde eindvolume gereduceerd, voeg 1x acetaatbuffer tot het gewenste volume is bereikt. Als het volume hoger is dan de geschatte uiteindelijke volume, de overdracht van de MOG tag eiwit terug in de dialyse-buizen en blijven de concentratie (stappen 6,2-6,3).
    2. Verdeel de MOG tag eiwit bij 1,5 ml buisjes (0,5 ml per buis), de buizen bewaren bij -80 ° C totdat het nodig is. Om EAE induceren, meng dit volume 1: 1 met CFA.
  5. Run een SDS PAGE gel om de expressie van de MOG tag eiwit met behulp van de maatregelen die in 1 stappen monsters te bevestigen.4, 2.1, 3.4, en het gezuiverde MOG eiwit uit stap 6.4.

7. Het genereren van MOG 1-125 van MOG tag Met behulp van TEV Protease (optioneel)

Opmerking: Deze optionele stap verder vanaf het einde van stap 4. Als MOG 1-125 zonder extra tagsequenties nodig, kan de tag sequenties worden verwijderd met TEV protease (Figuur 4). Voor zover wij weten, is er geen ander expressiesysteem dat in staat is zuivere MOG 1-125. Er moet echter worden opgemerkt dat zonder thioredoxine tag, MOG 1-125 zeer slecht oplosbaar en kan problemen veroorzaken tijdens de zuivering en behandeling, en daarom verwijdert de tag als het absoluut noodzakelijk voor experimentele redenen. Verschillende stappen zijn nodig om pure MOG 1-125 genereren. MOG tag wordt eerst gedialyseerd in TEV protease-splitsing buffer. Na digestie met TEV protease, neemt het volume af te helpen bij latere zuivering steps, dan gedialyseerd in buffer B, en dan is de His-tag bevat tag volgorde wordt verwijderd met behulp van nikkel hars. Ten slotte wordt eiwit gekwantificeerd en zuivere MOG 1-125 geconcentreerd tot de eindconcentratie.

  1. Voeg 1 L 10x TEV splitsing buffer (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) door toevoeging van 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl en 26,5 g Tris naar een 2 L beker. Voeg H 2 O totdat het volume 990 ml bereikt vervolgens op pH 8 om de EDTA te ontbinden. Breng de oplossing een 1 L maatcilinder en breng het volume op 1 L met behulp H2O
  2. Verdun MOG tag eiwit van stap 3,6-0,5 mg / ml met behulp buffer B (dezelfde buffer in stap 3.1 beschreven), gebaseerd op de berekende hoeveelheid eiwit gedeelte 4. Breng 120 ml verdund MOG tag eiwit slangenhuid dialyseslang beschreven in stappen 5,2-5,3. Het volume kan worden opgeschaald echter het bedrag van de TEV protease nodig om alle van de MOG tag eiwit klieven zal STOFFE zijnntial.
  3. Volg de dialyse-protocol in stap 5.5 vermeld, met uitzondering van de plaats van de 10x acetaat buffer met 10x TEV decollete buffer in stap 7.1.
  4. Breng de MOG tag, nu TEV splitsing buffer, een nieuwe 250 ml glazen flesje en bewaken de toename van dialyse. Voeg 1 pl β-mercapto-ethanol per elke 2,85 ml MOG eiwit tag aan de fles toegevoegd. Voeg ten minste 1 mg TEV protease (TEV stock oplossing bij 5 mg / ml) per 50 mg eiwit MOG tag (TEV protease kan tot 01:10 TEV toegevoegd: eiwitverhouding MOG) en incubeer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht gedurende ten minste 72 uur.
    OPMERKING: Aan het einde van de TEV protease incubatie dient witte neerslagen te zien aan de onderkant van de glazen fles.
  5. Alvorens de eiwit dialyse tubing, voeg guanidine-HCl oplossing totdat de eiwitten oplossen om te voorkomen dat het eiwit precipiteert plakken aan de glazen fles. Transfer 150 pivloeistof over in een 1,5 ml microcentrifugebuis en label de buis als "MOG met TEV". Bewaar de oplossing bij -20 ° C voor toekomstig SDS-PAGE-analyse.
  6. Overdracht van al de vloeistof uit stap 7.5 in dialyseslang zoals opgesomd in stappen 5,2-5,3. Vul een grote emmer met 2 L H 2 O en plaats de dialyse buis in de emmer. Incubeer dit bij 4 ° C met licht 's nachts roeren. Deze stap is belangrijk te verdunnen de guanidine zodat de eiwitconcentratie te snel gaan en beginnen met het verwijderen van de EDTA-oplossing die stoort eiwitzuivering.
  7. Concentreer het eiwit in de dialyseslang zoals genoemd in stappen 6,2-6,3 (behalve alleen PEG 8000) zodat het eindvolume van de oplossing ~ 40 ml. Was de dialyse buis met H 2 O en verwijder eventueel resterende PEG 8000 nog aan de buis. Deze vermindering in volume maakt het mogelijk om alle gedigereerd eiwit passen in een 50 ml buis met nikkel resin, zoals beschreven in stap 3.5.
  8. Dialyseren de verteerde Protein om Buffer B:
    1. Vul een grote emmer met 1 liter buffer B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g imidazool, 573,18 g guanidine-HCl, pH 7,9).
    2. Plaats de snakeskins die gedigereerd eiwit uit stap 7.7 in de emmer samen met een roer magneet (zoals in meer detail in stap 5,5). Doe de emmer in een 4 ° C koude kamer op een roer plaat ingesteld op een langzame roer en laat de snakeskins te dialyseren voor 5 of meer uur.
    3. Leeg de emmer en vul het met een andere 1 liter buffer B en laat deze zitten in de 4 ° C koude kamer op een roer plaat ingesteld op een langzame roer en laat de snakeskins te dialyseren voor 5 of meer h.
  9. Voer zuivering van de MOG 1-125 eiwit zoals beschreven in hoofdstuk 3, met als belangrijk verschil dat het gesplitste tag sequenties gebonden zal zijn door de nikkel-hars, waardoor MOG 1-125 in oplossing. Nogmaals, 4 rondes van zuiveringuitgevoerd op hetzelfde volume, maar in dit geval is het doel om de zuiverheid te verbeteren en niet zoveel eiwit herstellen mogelijk. Zie Figuur 4.
    1. Maak de eiwitzuivering buffers in stap 3.1 genoemde
    2. Laad beide buizen nikkel hars zoals beschreven in stap 3.3.
    3. Zuiver MOG 1-125 door het protocol beschreven in stap 3,5, de essentiële uitzondering dat het eluaat van de nikkel bevattende hars tag verwijderd (houd 150 pl van het eluaat in een 1,5 ml microcentrifugebuis toekomstige SDS-PAGE-analyse), terwijl de oplossing die MOG 1-125 wordt gehandhaafd als eindproduct.
  10. Meet de concentratie van MOG 1-125 eiwit zoals beschreven in hoofdstuk 4:
    1. Het opzetten van de BSA norm curve verdunningen zoals beschreven in stap 4.2 en 4.4.
    2. Stel de verdunningen van MOG 1-125 zoals beschreven in stap 4.5 en 4.6. Alternatief kan het nuttig zijn om een ​​groter bereik te genererenverdunningen (1 x, 1/2, 1/4 en 1/8, bijvoorbeeld). Pas volumes 1x acetaatbuffer en MOG 1-125 dienovereenkomstig.
    3. Voer de Bradford assay zoals beschreven in stap 4,7-4,9 en bereken de hoeveelheid MOG 1-125 gegenereerd. De verwachte opbrengst is ongeveer 4 mg of meer eiwitten.
  11. Refold MOG 1-125 door de geleidelijke afschaffing van de guanidine via dialyse, zoals beschreven in hoofdstuk 5.
  12. Concentreer MOG 1-125 eiwit zoals beschreven in paragraaf 6. De eindconcentratie moet 2,24 mg / ml, met équimolaire hoeveelheden tot 5 mg / ml MOG tag.

8. SDS-PAGE gel te bevestigen MOG tag Productie en Zuiverheid

LET OP: Monsters genomen uit stappen 1.4, 2.1, 3.4 en 6.4 worden geanalyseerd door standaard SDS-PAGE om MOG tag productie en zuiverheid te bevestigen. Deze stap moet worden uitgevoerd na de laatste zuivering van een van beide MOG tag of MOG 1-125.

    <li> Wordt 2x SDS-PAGE laadbuffer door toevoeging van 1,576 g Tris-HCl tot 2 ml H2O en stel de pH op 6,8. Voeg 0,4 g SDS in de Tris-HCl-oplossing en voeg H2O totdat het volume 7 ml bereikt.
  1. Voeg 0,2 g broomfenolblauw tot 10 ml H2O voeg 1 ml van deze aan de oplossing in stap 8,1. Tot slot, voeg 2 ml glycerol aan de 2x SDS-PAGE laadbuffer afmaken. Bij het opslaan deze oplossing bewaren bij 4 ° C en beschermd tegen licht gedurende maximaal 3 maanden.
  2. Ontdooi de bevroren monsters van bacteriën van stap 1,4 en 2,1 en de opgeloste MOG tag eiwit van stap 3,4 en 6,4 bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de zouten uit de gegevens die in stappen 3,4 en 6,4 oplossingen door toevoeging van 60 ul van elk eiwit ontzouten kolommen. Zuiver de eiwitten volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Voeg 20 ul van β-mercapto-ethanol 1 ml van de oplossing bereid in stap 8.2. Voeg 40 ul van dit beide bacteriaal pellets uit stap 8,3 en 60 ul ontzoute de eiwitten van stap 8,4 en incubeer deze bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
  5. Maak 1x SDS pagina running buffer door weging uit 5 g Tris, 28,8 g glycine en 1 g SDS. Voeg deze aan een 1 liter beker en voeg 500 ml H 2 O om alles op te lossen. Eenmaal opgelost, breng de oplossing om een 1 L maatcilinder en vul aan met H 2 O totdat het volume 1 L. bereikt
  6. Het opzetten van een 12% polyacrylamidegel in een gelapparaat voeg de 1x SDS-PAGE running buffer om de gel inrichting zodanig dat de loopbuffer net boven de bovenzijde van de putjes in de gel. Was de putjes van de gel eveneens 50 gl loopbuffer in de putjes vijf keer per.
  7. Belasting 10 pl proteïneladder in het eerste putje en voeg 10 ul van de gekookte oplossing van stap 8,5 afzonderlijke putjes. Voer de elektroforese bij 115 V gedurende 60 minuten.
  8. Verwijder de gel uit de inrichting en overbrengen naar een kleine container. Vul het ContaIner met 100 ml zuiver H2O en de container over te brengen naar een langzaam draaiende platform 8 min. Na 8 minuten, dump het water en was de gel tweemaal met H2O
  9. Dump H 2 O uit de kolf en voeg 100 ml van snelle vlek reagens om de container. Toestaan ​​dat dit op een langzaam draaiende platform zitten 's nachts, dek af met aluminiumfolie.
  10. Dump de snelle vlek reagens en voeg ongeveer 100 ml H2O aan de houder. Toestaan ​​dat dit op een draaiend platform te zitten voor 8 min. Dump de H 2 O en herhaal de H 2 O wassen tweemaal.
  11. Beeld de gel onder gebruikmaking van een beeldvormer voor Coomassie blauwe vlekken. Kijk voor een band rond 31.86 kDa (MOG tag eiwit) en een zwakkere band bij 63,72 kDa (MOG tag dimeren).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zodra de zuivering is voltooid, afgenomen in stappen 1,4, 2,1, 3,4, en het eindproduct van stap 6.4 moeten worden uitgevoerd op een eiwitgel (Figuur 3A). MOG tag moet eerst verschijnen als een 31.86 kDa band in de T O / N monster, maar niet T 0, en moet de enige band in de finale pure product. Om te testen of de MOG tag eiwit correct heeft gevouwen, kan de MOG tag eiwit worden gebruikt om MOG-eiwit specifieke B-cellen te labelen met FACS. Etikettering muizenlymfocyten met een 1: 1000 verdunning van MOG tag samen met een secundair antilichaam gericht tegen de His-tag en een fluorescentie-gemerkt anti-tertiair IgG1 antilichaam kunnen MOG-specifieke B-cellen worden geïdentificeerd (Figuur 3B). Alternatief kan MOG tag direct worden geconjugeerd aan fluoroforen om achtergrondkleuring te verminderen (als gevolg van B-cellen binden aan de secundaire en tertiaire antilichamen) alsbeschreven onder verwijzing 5 naar MOG-specifieke B-cellen te identificeren. Dit is nodig wanneer het proberen om MOG-bindende B-cellen identificeren wildtype muizen, aangezien deze cellen normaal zeer zeldzaam 5. IgH MOG muizen hebben een zware keten knockin dat, wanneer deze is gekoppeld met een geschikte kappa lichte keten, verleent specificiteit voor MOG. Omdat de binding van MOG tag wordt versterkt tussen de IgH MOG B-cellen, dit bevestigt dat dit protocol genereert een correct gevouwen antigeen. Belangrijk is IgH MOG B-cellen bijdragen aan auto-immune pathologie in modellen van MOG-gerichte EAE 12, waarin wordt bevestigd dat MOG tag induceert zowel T-en B-cel auto-immuniteit.

Voordat dialyse aan het eiwit opnieuw te vouwen zoals beschreven in hoofdstuk 5, is het noodzakelijk om de eiwitconcentratie te meten onder toepassing van een Bradford-assay, zoals beschreven in hoofdstuk 4. Representatieve resultaten van een Bradford-assay worden weergegeven in Tabel 1 figuur 5.

Het genereren van zuivere MOG 1-125 wordt bewerkstelligd door de toevoeging van TEV protease MOG tag eiwit uiteindelijk leidt tot de splitsing van de MOG tag eiwit in MOG 1-125 en tag-sequentie zoals weergegeven in figuur 6. Daaropvolgende zuivering nikkel hars verwijdert MOG tag, tagsequentie en TEV protease verontreinigingen uiteindelijk resulterend in zuivere MOG 1-125 zoals weergegeven in figuur 6.

Figuur 1
Figuur 1: MOG tag eiwit (dubbel hier met toestemming van Dang et al 5..).. Lineaire structuur en aminozuur- en DNA sequenties van de MOG tag fusieproteïne. De DNA sequentie voor het extracellulaire domein van muizen MOG (MOG1-125, lagere sequentie in blauw) werd codon-geoptimaliseerd voor expressie in bacteriën (zwart). Deze sequentie werd gesynthetiseerd en geïnsereerd in een vector voor een N-terminale fusie aan een label met thioredoxine en een S-Tag om de bekende onoplosbaarheid van het eiwit MOG 13,14 tegengaan, evenals een 6x His tag voor zuivering 15 creëren. Een TEV protease-splitsingsplaats scheidt de MOG 1-125 uit de tag sequenties. TEV-bemiddelde splitsing tussen glutamine-164 en glycine-165 met behulp van een alternatieve consensus TEV splitsingsplaats 16 resultaten in de verwijdering van alle niet-MOG aminozuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Overzicht van de stappen die nodig zijn om pure MOG tag eiwit produceren.genereren MOG tag eiwit, bacteriën uiting van de MOG tag eiwit worden gekweekt tot hoge dichtheden dan geïnduceerd om MOG tag met behulp van IPTG uitdrukken zoals vermeld in paragraaf 1. Na een overnachting cultuur, worden de bacteriën gelyseerd en door een reeks van pelleteren stappen het eiwit fractie die insluitingslichamen, die MOG tag bevat, wordt gewonnen, zoals vermeld in paragraaf 2 MOG tag wordt vervolgens gezuiverd van het ruw eiwit-fractie door middel van vier cycli van absorptie op opgeladen nikkel hars en uitwassen van de MOG tag eiwit zoals vermeld in rubriek 3. Een deel van de samengevoegde eluaat daarna een Bradford assay wordt verstaan de opbrengst aan eiwit MOG tag en de rest van het eluaat bepaald wordt gedialyseerd in acetaatbuffer de loop van enkele dagen zoals vermeld in punten 4 en 5. Tenslotte, het eiwit geconcentreerd middels PEG 3350 en PEG 8000 tot een eindconcentratie van 5 mg / ml op basis van de opbrengst van MOG tag bepaald de BRadford assay zoals vermeld in paragraaf 6. Het hele proces kan een minimum van 10 dagen, met de start dag voor elke haakjes stap. Echter, alternatieve stop en start punten zijn opgenomen in het protocol, en stappen kunnen worden gespreid over een grotere hoeveelheid tijd, indien gewenst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Zuivering van de MOG tag eiwit en beoordeling van de activiteit (A) Getoond worden eiwit monsters die werden verzameld uit diverse locaties in de eiwitzuivering procedure en lopen op een SDS-PAGE gel. T 0 = BL21 bacteriën voorafgaand aan het eiwit inductie (verzameld in stap 1.4), T O / N = BL21 bacteriën post-inductie van eiwitexpressie (verzameldin stap 2.1), Ruwe MOG tag = Gesolubiliseerde MOG tag eiwit voorafgaand aan eiwitzuivering (verzameld in stap 3.4), Pure MOG tag = MOG tag eiwit na zuivering (verzameld in stap 6.4). (B) Binding van de MOG tag eiwit CD19 pos neg CD4 naïeve B-cellen van lymfeknopen van ofwel wildtype C57BL / 6 muizen of IgH MOG muizen die een immunoglobuline zware keten specifiek voor MOG eiwit 7,17 tot expressie werd bepaald met flowcytometrie . MOG tag-specifieke B-cellen werden geïdentificeerd door kleuring lymfeknoopcellen met MOG tag gevolgd door een secundair anti-his-label antilichaam en een fluorescerende tertiaire anti-IgG1 antilichaam. Kleuring van cellen van C57BL / 6 of IgH MOG muizen wordt getoond samen met een MOG tag fluorescentie min één (FMO) controle smet van IgH MOG cellen. Gelieve clik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Overzicht van de stappen om MOG 1-125 genereren van MOG tag eiwit. Na het verzamelen van de MOG tag eluaat zoals beschreven in stap 3.5 van het protocol, de MOG tag eiwit wordt gedialyseerd in TEV protease-splitsing buffer. Zodra de dialyse voltooid, wordt TEV protease toegevoegd aan de MOG tag oplossing resulteert in de splitsing van MOG-label in de MOG 1-125 eiwit. Het volume van de splitsingsoplossing wordt vervolgens gereduceerd en gedialyseerd in buffer B vóór eiwitzuivering. Verontreinigingen uit de splitsingsoplossing worden geëxtraheerd door middel van vier opeenvolgende ronden van absorptie op nikkel geladen hars en elutie van onzuiverheden uiteindelijk leidt tot een oplossing van zuivere MOG < sub> 1-125. De concentratie van het eiwit MOG 1-125 wordt bepaald door een Bradford-assay en het proteïne wordt gevouwen over de loop van enkele dagen tot dialyse. Nadat de dialyse voltooid is, wordt de MOG 1-125 eiwit geconcentreerd tot 2,24 mg / ml met behulp van PEG 3350 en PEG 8000. Dit protocol wordt in detail besproken in hoofdstuk 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Voorbeeld van een Bradford assay standaard curve voor het bepalen van de concentratie van MOG tag eiwit. BSA standaard waarden die in tabel 1 zijn uitgezet op een lineaire regressie formule voor het berekenen van de MOG tag concentratie op basis van de optische dichtheid bij 595 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6:. TEV splitsing van MOG tag eiwitten en daaropvolgende zuivering van MOG 1-125 Getoond worden eiwit monsters lopen op een SDS-PAGE gel aantonen zuivering van MOG 1-125 Pure MOG tag = MOG tag eiwit voorafgaand aan de splitsing TEV (verzameld. in stap 6.4), MOG tag w / TEV = Eiwit fractie die werd verzameld na 72 uur incubatie van MOG tag met TEV protease (verzameld in stap 7.5), Elutie = eiwitfractie dat tijdens de MOG 1- gebonden aan het nikkel hars gebleven 125 zuivering protocol (verzameld in stap 7,9), Pure MOG 1-125 = MOG1-125 eiwit na zuivering (verzameld in stap 7.12). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BSA (mg / ml) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1.079 0,998 0,948 0,853 0,769 0,699 0,583 0,493 0.373
1.071 1.014 0.95 0,854 0,777 0,681 0,579 0,484 0,375
1,069 1.017 0,944 0,848 0,781 0,592 0,494 0,374
MOG tag verdunning 1 1/5 1/25
1,327 1.013 0,493
1.332 1.063 0,491
1.367 1.088 0,488

Tabel 1: Representatieve waarden uit een Bradford test voor het bepalen van de concentratie van MOG tag eiwit BSA Dilu.gen met bekende concentratie worden gebruikt om de standaard van afbeelding 5. De verdunningen van MOG tag eiwit na zuivering worden gebruikt om de uiteindelijke MOG tag eiwitconcentratie te bepalen. Rijen bevatten de optische dichtheid gemeten bij 595nm en elke rij is een kopie van een totaal van 3 replicaten op elk aangegeven concentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier hebben we een protocol beschreven voor de productie van MOG tag eiwit en hoe zuiver MOG 1-125 van de MOG tag eiwit te genereren. Dit protocol is gebaseerd op zowel standaard His-tag eiwitten zuiveringswerkwijzen, en een eerder beschreven protocol voor het genereren van een oudere MOG-eiwitten 15. Hoewel het hier niet wordt beschreven, het primaire gebruik van de MOG tag eiwit is om EAE te induceren door middel van immunisatie met eiwitantigeen. Een protocol beschrijft hoe EAE wordt geïnduceerd in muizen, die verenigbaar is met de MOG tag eiwit, is beschikbaar in referentie 3. We hebben eerder aangetoond dat immunisatie met MOG tag of MOG 1-125 afgeleid van MOG tag niet alleen induceert CNS autoimmuunziekte met meer ruggemerg ontsteking en demyelinatie vergelijking met de standaard MOG 35-55 peptide, maar ook pathogene IgH MOG B-cellen thaherken MOG eiwit geactiveerd om een kiemcentrum reactie als reactie op MOG tag of MOG 1-125 produceren, maar niet MOG 35-55 5. Daarom immunisatie met MOG tag wel degelijk een geschikte anti-MOG B-cellen te induceren.

MOG tag eiwit wordt gezuiverd door absorptie op een toeslag van nikkel hars (via de His-tag) en elutie. Vanwege de grote hoeveelheid eiwit geproduceerd in de voorgaande stappen worden meerdere ronden van absorptie en elutie vereist de meeste eiwitten te verzamelen. We hebben gevonden dat ten minste 4 rondes moeten de meeste eiwitisolaat bij gebruik een geschikt volume hars voor 50 ml buizen. Indien gewenst kan het protocol worden opgeschaald naar grotere of meer buizen en nikkel hars om het aantal ronden van absorptie te verminderen. Alternatief kan sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC) met nikkelkolommen effectief zuiveren his-gelabelde eiwitten 18 </ sup> en inderdaad we hebben gevonden dat HPLC efficiënt kan zuiveren MOG tag eiwit (niet gepubliceerde waarnemingen). Aangezien HPLC is niet toegankelijk voor veel standaard immunologie laboratoria wordt de hier vermelde protocol ontworpen om te worden uitgevoerd gebruikelijke laboratoriumapparatuur. Naast zijn-tag zuivering, de MOG tag eiwit bevat wel een S-tag die compatibel is met S-tag zuivering protocollen indien gewenst 14.

Recombinante eiwitten gebaseerd op MOG (voornamelijk mens of rat) zijn eerder beschreven 8. Deze waren gebaseerd op oudere expressiesystemen die sindsdien zijn vervangen door systemen waarbij strengere transcriptionele promoters kunnen produceren grotere hoeveelheden eiwit in Escherichia coli bacteriën. Onze MOG tag expressie systeem maakt gebruik van de efficiënt T7-promotor in de pET-32a (+) vector, wat beduidend efficiënter dan systemen beschikbaar voor in-house productie van MOG eiwit 19. Echter, het should worden dat de MOG tag eiwit hier beschreven gebaseerd op muis MOG. Immunisatie met MOG humaan eiwit is aangetoond dat EAE induceren in muizen die verschillende eigenschappen heeft vergeleken met ziekte geïnduceerd met knaagdiermodellen MOG 8. Verder kan rat MOG meer immunogeen dan muizen MOG bij muizen in sommige gevallen 20 worden. Daarom is voor een aantal experimentele doeleinden muis-gebaseerde MOG tag misschien niet ideaal. We zijn in het proces van het genereren verschillende versie van de MOG tag eiwitten dan sommige doeleinden beter passen en de zuivering protocol beschreven werkt voor al deze. Ondertussen is het mogelijk dat het zuiveringsprotocol beschreven kan voor andere MOG expressiesystemen of zelfs andere eiwitten, zolang ze een 6x His tag bevatten absorptie nikkel hars. Zonder het thioredoxine tag, oplosbaarheid van eiwit MOG bij hogere concentraties kan een probleem zijn, en natuurlijk zal het niet mogelijk zijn om ge nerate pure MOG 1-125 want dit is uniek voor het MOG tag-systeem.

Meten van de MOG tag eiwitconcentratie vóór proteïne hervouwing via dialyse is essentieel voor het succes van deze zuivering protocol. Als de concentratie te hoog is, kan het proteïne aggregeren en uit de oplossing in plaats van vouwen in afzonderlijke eiwitten vallen. Dit kan worden gezien tijdens de dialyse protocol wit neerslag vormt onderin de dialysebuizen. Als dit zich voordoet, los de MOG tag eiwit opnieuw met 6 M guanidine en meet het eiwit concentratie. Verdun het eiwit 0,5 mg / ml start dialyse opnieuw als geen neerslag bij 0,5 mg moeten vormen / ml. Voor MOG 1-125, kan precipitaten worden ontledingsproducten gevormd als eiwit nauwelijks oplosbaar. Wij hebben gevonden dat dit geen invloed op de vouwing van MOG 1-125 mits het eiwit voldoende vóór dialyse werd verdund.

nt "> Voor de TEV protease effectief klieven MOG tag eiwit in pure MOG 1-125 is het belangrijk om een voldoende TEV protease gebruikt. Oudere versies van TEV protease worden geïnactiveerd door zelf-splitsing 21 echter modernere uitvoeringen lijden onoplosbaarheid geeft 22 dus is het belangrijk om voldoende TEV protease toe om voldoende splitsing van de MOG tag eiwit voor TEV protease inactivering realiseren. aangezien de handel verkrijgbaar TEV protease kostbaar zijn, bevelen wij produceren en zuiveren TEV protease zoals beschreven in referentie 22 tijdens gebruik. pure muis MOG 1-125 eiwit experimenten, is het belangrijk op te merken dat het eiwit zeer slecht oplosbaar en kan neerslaan uit de oplossing, en daarom moeten grondig worden gemengd vóór gebruik.

Kortom, hier hebben we beschreven een eenvoudig protocol voor het produceren en zuiveren van grote hoeveelheden MOG tag eiwit. Furthermerts, de toevoeging van een TEV protease splitsingsplaats onze MOG tag eiwit het mogelijk maakt zuiver MOG 1-125 genereren indien nodig. MOG tag eiwit wordt herkend en gebonden door anti-myeline auto-B-cellen en MOG tag geïnduceerde EAE bevat B-cel gemedieerde pathologie 5. Daarom MOG tag eiwit overwint de belangrijkste obstakels die de ruime verbreiding van eiwitantigeen EAE te induceren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics