Enkel og effektiv produksjon og rensing av Mouse Myelin oligodendrocyte glykoprotein for eksperimentell autoimmun encefalomyelitt Studier

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

MS er en sykdom hos mennesker, karakterisert ved kronisk inflammasjon og nevrodegenerasjon i CNS som antas å være drevet av en autoimmunrespons rettet mot myelin. Tapet av myelin og aksoner over tid føre til en gradvis nedgang av kognitiv og motorisk funksjon 1. "Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt" er en samlebetegnelse for dyremodeller av autoimmun sykdom rettet mot CNS myelin. Som humane MS, blir EAE vanligvis preget av immuncelleinfiltrasjon i CNS og i noen tilfeller, demyelinering 2. Imidlertid, i hvilken grad en hvilken som helst gitt EAE modellen ligner human MS delvis avhengig av arten eller belastning som benyttes og av kompleksiteten av det underliggende anti-myelin autoimmun respons.

Anti-myelin autoimmunitet kan eksperimentelt indusert på flere måter, men den mest vanlige metoden som brukes i dag, er å immunisere mus med et kort peptid av aminosyrer etterligne den immundominante CD4 35-55), som brukes til å indusere EAE i C57BL / 6 mus tre. Imidlertid, for noen eksperimentelle formål er det ønskelig eller endog nødvendig å immunisere med større proteinantigener og faktisk det er flere fordeler med denne enn immunisering med kort peptid. Først på grunn av MHC-restriksjons, korte peptider er vanligvis bare effektiv i et meget begrenset utvalg av stammer, mens større proteinantigener som representerer enten hele proteinet eller et spesifikt domene kan bli behandlet på vanlig måte for presentasjon i flere innavlet musestammer eller også i forskjellige arter 4. For det andre, er et større protein antigen er i stand til å indusere en mer kompleks immunrespons som omfatter flere typer av lymfocytter i antigen gjenkjennelse, snarere enn limiting antigen gjenkjennelse til CD4 + T-celler. For eksempel, B-celler via deres B-celle reseptor (BCR) kommuniserer direkte med hele stedet for bearbeidet protein. Vi og andre har vist at B-celler aktiveres av MOG 35-55 immunisering ikke gjenkjenner MOG protein fem. Siden B-celler ble nylig vist å spille en sykdomsfremkallende rolle i menneskelig MS 6, EAE modeller som inkluderer B-celler i autoimmune patologi blir stadig viktigere.

Til tross for fordelene ved å bruke større proteinantigener for å indusere EAE, er det fortsatt noen kommersielt tilgjengelige kilder for slike proteiner. Faktisk, mens korte peptider som MOG 35-55 kan syntetiseres meget raskt og til en relativt lav pris, de kommersielle muligheter for MOG protein er begrenset, og kostnadene vesentlig mer å kjøpe. Likevel er det flere ekspresjonsvektorer tilgjengelige for forskningsgrupper for å generere MOG ekstracellulært domene (MOG 1-125) selv. However, alle ekspresjonssystemer som vi har identifisert i litteraturen, er basert på eldre teknologi som siden er blitt erstattet med mer effektive ekspresjonssystemer 7. Videre er de fleste basert på rotte eller menneske MOG 8. For noen undersøkelser av autoimmunitet hos mus, et antigen basert på musen MOG autoantigen er å foretrekke. Til slutt, alle MOG-baserte proteiner som vi har identifisert, enten kommersielt eller for eksempel ekspresjonsvektorer, er fusjonsproteiner som inneholder ytterligere aminosyrer til den MOG 1-125 basen. Disse inkluderer en kode for rensing og vanligvis andre sekvenser også, mange av dem med en funksjon vi ikke var i stand til å identifisere.

For å møte disse begrensningene, vi generert en ny fusjonsprotein basert på musen MOG ekstracellulære domene smeltet til en kode som inneholder thioredoxin å bekjempe den kjente insolubility av MOG protein fem. Koden sekvensen inneholder også en 6xHis sekvens for rensing og en TEV protease cleAvage nettsted som gir mulighet for fullstendig fjerning av alle tag sekvenser, om ønskelig. Dette er den eneste metoden som vi er klar over å generere ren MOG 1-125 protein. For å lette produksjon av store mengder protein, det MOG 1-125 sekvensen er kodonoptimaliserte for bakteriell ekspresjon og MOG-tag-fusjonsprotein ble satt inn i pET-32 ekspresjonssystem. Her beskriver vi i detalj protokollen til å produsere og rense MOG tag protein, og ren MOG 1-125, bruk av ikke-spesialisert utstyr tilgjengelig for de fleste immunologi laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein Induksjon

MERK: I de følgende trinnene, BL21 Escherichia coli bakterier transformert med en PET-32 vektor som inneholder sekvensen for MOG tag fusjonsprotein (se referanse 5 og figur 1) dyrkes til høye tettheter og blir deretter overtalt til å uttrykke MOG tag protein . Se figur 2 for generelle tidslinje - merk at dagene er omtrentlige og alternative stoppunkter noteres i protokollen. Hvis du starter med renset Dyre 32 MOG tag vektor-DNA, vil det være nødvendig å kjemisk forvandle det til kompetente BL21 E. coli-bakterier ved hjelp av ampicillin valg, slik det er vel beskrevne ni. Vellykket transformasjon kan bekreftes ved å rense DNA fra utvalgte bakterier ved hjelp av et standard kommersielt sett, etterfulgt av fordøyelse med restriksjonsenzymene alder1 og Sac1 for å frembringe et 424 bp bånd på en agarosegel 10.

    tag glycerol lager og inkuber det over natten ved 37 ° C, 200 rpm.
  1. Plassere to 1 l Erlenmeyerkolber inneholdende 500 ml steril LB-næringsløsning i en 37 ° C inkubator i forberedelse for den neste dag.
  2. Legg 500 mL av 100 mg / ml ampicillin til hver av kolbene inneholdende 500 ml LB fra trinn 1,2 (sluttkonsentrasjon 0,1 mg / ml ampicillin). Overføre 1 ml av over natten-kulturen fra trinn 1,1 til hver av de to kolber av LB-næringsløsning. Inkuber ved 37 ° C og 200 rpm i 5 timer, eller inntil en optisk tetthet på 0,6.
  3. Ta en 1 ml alikvot fra en av kolbene og overføre den til et separat 1,5 ml sentrifugerør. Pellet cellene ved 16 000 xg i 1 min og fjern supernatanten. Etiketten røret som T 0 (pre-induksjon), og deretter sette den bakterielle pellet inn i en -20 ° C fryser for fremtidig natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse (se avsnitt 8 og figur 3).
  4. Tilsett 0,5 ml av 1 M Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid, isopropyl β-D-tiogalaktosid (IPTG) til hver kulturflaske. Inkuber kolber ved 37 ° C, 200 rpm i 4 timer, deretter ved romtemperatur ved 75 rpm over natten.

2. Høsting MOG tag Protein

MERK: På dette stadiet, vil bakteriene har produsert store mengder MOG tag protein. Å høste MOG tag, er bakterier først lysert i en Triton X-100 buffer etterfulgt av ultralydbehandling. MOG merkelappen frigjøres deretter fra inklusjonslegemer og denaturert med imidazol og guanidin, noe som resulterer i en råprotein oppløsning inneholdende den MOG taggen protein.

  1. Ta en 1 ml alikvot fra en av de natt kulturer fra trinn 1.5 og overføre den til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pellet cellene ved 16 000 xg i 1 min og fjern supernatanten. Merk karete T O / N (post-induksjon) og deretter sette den bakterielle pellet inn i en -20 ° C fryser for fremtidig SDS PAGE-analyse (figur 3).
  2. Fordel kulturer jevnt blant 250 ml flasker som er kompatible med høy hastighet sentrifugering og holde disse på is fra dette tidspunktet. Pellet bakteriecellene ved 22 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
  3. Kast supernatanten. Oppbevar bakteriepelletene ved -20 ° C eller fortsette til trinn 2.4.
  4. Forbered lyseringsbuffer (0,1 mg / ml hønse-eggehvite lysozym, 0,1% Triton-X (volum / volum) i fosfat-bufret saltvann (PBS)) ved å tilsette 60 ul av Triton X-100 og 120 ul 50 mg / ml hønse-eggehvite lysozym stamløsning til 60 mL PBS.
  5. Resuspender og kombinere alle de bakterielle pellets fra trinn 2,3 i totalt 30 ml lyseringsbuffer. Overfør dette volumet til en rundbunnet 50 ml tube i stand til høyhastighetssentrifugering. Plasser dette rør i et 30 ° C vannbad i 30 min. I løpet av inkubasjonstiden, riste røretto ganger for å resuspendere cellene.
  6. Etter inkuberingen overføre røret på is og sonikere oppløsningen ved 20 kHz, amplitude 70%, puls på 3 sek, puls av 3 sekunder, og fem pulser per runde. Sonicate løsningen for seks totalt runder og la løsningen avkjøles på is i mellom rundene.
  7. Sentrifuger løsningen ved 24 000 xg i 15 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og gjenta trinn 2,5-2,7 gang. Oppbevar pellet ved -20 ° C eller fortsette til trinn 2.8.
  8. Forbered buffer A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, pH 7,9) ved tilsetning av 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl, og 0,01021 g imidazol i et 100 ml begerglass. Legg H2O inntil volumet har nådd 28 ml og deretter justering av pH i løsningen til 7,9. Deretter overføre løsningen til en 100 ml målesylinder og legge til H 2 O til volumet er 30 ml.
  9. Resuspender pelleten fra trinn 2.7 i 30 ml buffer A og inkuber denne oppløsningen ved 4 ° C i 3 timer. I løpet av denne tidenveie ut 17,2 g av guanidin-HCl.
  10. Sonikere oppløsningen på is ved hjelp av de samme innstillinger som i trinn 2.6. Deretter legger 17,2 g guanidin-HCl til oppløsningen. Inkuber denne på is i 1 time for å oppløse MOG taggen protein.
  11. Sentrifuger løsningen ved 24 000 xg i 30 min ved 4 ° C. Samle supernatanten og lagres supernatanten ved 4 ° C inntil proteinrensing.

3. Protein Purification

MERK: I de følgende trinnene MOG tag protein vil bli renset gjennom 4 runder absorpsjon på ladet nikkel harpiks (via His-tag) og eluering.

  1. Foreta følgende buffere:
    1. Forbered buffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidin-HCl, pH 7,9). Legg 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g imidazol, og 114,64 g guanidin-HCl til et 500 ml begerglass. Deretter legger H2O inntil den når 190 ml og justere pH til 7,9. Overfør solution til en 250 ml målesylinder og legge til H 2 O til volumet er 200 ml.
    2. Forbered elueringsbuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazol, 6 M guanidin-HCl, pH 7,9). Legg 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazol, og 114,64 g guanidin-HCl til et 500 ml begerglass. Legg H2O inntil den når 190 ml og justere pH til 7,9. Overfør løsningen til en 250 ml målesylinder og tilsett H 2 O inntil volumet er 200 ml.
    3. Forbered Strip-buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Legg 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA til et 500 ml begerglass. Legg H2O inntil den når 190 ml og justere pH til 7,9. Overfør løsningen til en 250 ml målesylinder og tilsett H 2 O inntil volumet er 200 ml.
    4. Forbered Charge buffer (0,1 M nikkelsulfat). Legg 5,257 g nikkelsulfat til et 500 ml begerglass og tilsett H 2 O til den når 190 ml (OBS, ikke håndterer nikkelsulfat utsiden av en avtrekkshette inntil nikkelsulfat er blitt oppløst i H2O). Når nikkelsulfat er oppløst, overføres oppløsningen til en 250 ml målesylinder og tilsett H 2 O inntil volumet har nådd 200 ml.
  2. Split 10 ml nikkel harpiks mellom to koniske 50 ml sentrifugerør som tåler sentrifugalkrefter i løpet av 4500 xg (5 ml i hver tube).
  3. Lad og likevekt nikkel harpiks:
    1. Vask harpiksen ved tilsetning av 40 ml H2O til hvert rør inneholdende harpiks. Lå rørene horisontalt på en rocker og la dem agitere for 5 min ved 4 ° C. Når ferdig, sentrifugeres rørene ved 4500 x g i 8 minutter ved 4 ° C.
    2. Kast supernatanten ved pipettering å unngå å forstyrre pelleten. Legg 40 ml ladning buffer til hvert rør. Overfør rørene på en rocker og la dem agitere for 15 min ved 4 ° C. Når ferdig, sentrifugeres rørene ved 4500 x g i 8 minutter ved 4 ° C.
  4. Valgfritt: ta 150 ul av det solubiliserte proteinet oppsamlet i trinn 2,11 og overføre den til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Merk røret som pre-inkubasjon og fryse dette ved -20 ° C for fremtidig SDS side analyse (Figur 3, Crude MOG tag).
  5. Rense MOG tag Protein:
    1. Overfør hele volumet av solubiliserte protein fra trinn 2,11 (~ 40 ml, minus den lille prøven ble fjernet i trinn 3.4) til det første rør (figur 2, rør 1) inneholdende nikkel harpiks fra trinn 3.3, blande og plassere horisontalt på en vippe ved 4 ° C i 1 time.
    2. Sentrifuger røret ved 4500 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Når ferdig, overføres supernatanten til den annenrøret (figur 2, rør 2) av nikkel harpiks og inkuberes som beskrevet i det foregående trinn. I mellomtiden fortsetter med trinn 3 til 6 nedenfor med rør 1.
    3. Resuspender nikkel harpiksen i røret 1 i 40 ml av elueringsbufferen og plassere røret horisontalt på en vippe ved 4 ° C i 5 minutter. Deretter, sentrifuger røret ved 4500 x g i 8 minutter ved 4 ° C.
    4. Overfør supernatanten inneholdende eluerte MOG tag protein inn i en 250 ml flaske merket "rensede MOG tag-protein" og beholde denne flasken ved 4 ° C. Med hvert elueringstrinn, basseng den resulterende supernatant i denne flasken.
    5. Legg 40 ml strimmel buffer til nikkel harpiksen og plassere horisontalt på en vippe i 5 min ved 4 ° C.
    6. Sentrifuger røret ved 4500 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten, deretter lade nikkel harpiks som er oppført i trinn 3.3.
    7. Når ferdig, gå videre med andre rør som er oppført i trinn 3.5. Totalt fire rundes av absorpsjon av det solubiliserte proteinet fra trinn 2,11 på den ladede nikkel harpiks og eluering vil gjenvinne mesteparten av proteinet selv, om ønsket, ytterligere protein kunne utvinnes i ytterligere runder med absorpsjon og eluering.
  6. Når fire (eller flere) runder av absorpsjon og eluering er fullført, lagre den samlede renset protein ved 4 ° C over natten. Nikkel harpiks kan lagres i 40 ml av en 20% etanolløsning ved 4 ° C før det er nødvendig på nytt.

4. Måling Protein Konsentrasjon

MERK: Før man går videre er det nødvendig å kvantifisere mengden av renset MOG tag protein som genereres under punkt 3. Denne verdien vil bli brukt til å bestemme det endelige volum for å konsentrere proteinet til ved slutten av protokollen. Vi beskriver en standard Bradford-analysen her. Konsentrasjonen av renset MOG merkelappen protein blir bestemt ved å sammenligne den spektrale absorbansen serielt diluted MOG tag-protein med en standardkurve av bovint serumalbumin (BSA) ved en kjent konsentrasjon.

  1. Gjøre 10x acetatbuffer ved tilsetning av 23 ml iseddik og 8,2 g natriumacetat i en 3 liter begerglass og tilsett 1,9 L fra H2O for å oppløse natriumacetat. Overfør denne løsningen til en 2 liters målesylinder og legge til H 2 O til volumet når to L. deretter lagre den i en 2 L flaske ved romtemperatur. Lage 1 ml 1x acetatbuffer ved tilsetning av 100 pl 10x acetat-buffer til 900 ul H2O
  2. Sett opp en 96-brønns plate for fortynninger ved å tilsette 30 mL av 1x acetat buffer til brønner G2-8 og 60 mL til G9. Legg 48 mL av 1x acetat buffer til H2 og H3.
  3. Sett opp den første serie fortynning av BSA standard i rad G som følger: Legg 216 mL av 1x acetat buffer og 54 mL av kommersielt tilgjengelige 2 mg / ml BSA standard i tillegg G1 og bland godt. Legg 210 mL fra vel G1 til godt G2, bland godt,og deretter legge 180 mL av godt G2 til godt G3. Legg 150 mL av godt G3 til godt G4, bland godt, og fortsetter denne trenden med å legge 30 mL færre for hvert påfølgende godt til godt G8. (Se tabell 1 for lister over tilsvarende fortynning faktorer).
  4. Sett opp triplikate prøver av hver fortynning ved å overføre 10 ul vel G1 til brønner A1, B1 og C1, og 10 ul vel G2 til brønner A2, B2 og C2, og så videre. Bruk en flerkanals pipette.
  5. Slik setter du opp fortynninger av MOG tag, tilsett 60 mL av renset MOG tag protein fra trinn 3,6 til vel H1. Tilsett 12 pl fra vel H1 til vel H2, bland godt, og deretter legge 12 pl vel H2 til vel H3, bland godt (dette gir en 1x fortynning i H1, 1/5 fortynning i H2, og 1/25 fortynning i H3) .
  6. Sett opp triplikate prøver for de MOG tag-fortynninger ved å overføre 10 ul fra brønner H1-H3 til radene D, E, og F, som beskrevet i trinn 4.4.
  7. Bland 2 ml proteinanalyse fargestoffreagens konsentrat med 8 ml H2O Tilsett 200 ul av denne blandingen til alle forhåndslastede brønnene i radene A, B, C, D, E, og F, ved hjelp av en multikanal pipette, hvis tilgjengelig. Pop eventuelle bobler i brønnene ved hjelp av en nål før lesing av proteinkonsentrasjonen.
  8. Innen 10 min for tilsetning av fargereagens, måler 595 nm absorbansen til alle brønnene i radene A, B, C, D, E og F.
  9. Bruk Rader A, B og C for å sette opp en standardkurve hvor posisjonerer 1-9 tilsvarer 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 og 0 mg / ml BSA. Basert på denne kurven, beregne konsentrasjonen av MOG tag protein ved hjelp av fortynning av MOG tag som passer best standardkurven. Vanligvis vil det være 200 til 250 mg av MOG tag protein fra 1 liter bakteriekultur ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her.
    MERK: For å gjøre MOG 1-125 går herfra til den valgfrie delen syv oppført på slutten av protokollen. Ellers fortsetter i kapittel 5.

MERK: Dialyse utføres gradvis å fjerne guanidinet fra oppløsningen inneholdende renset, denaturert MOG kode for å tillate proteinet å refolde. Hensyn må tas i løpet av dette trinnet så MOG i seg selv er meget uoppløselig, og mens denne er forbedret ved nærværet av tioredoksin-koden, er det fortsatt er utsatt for å komme ut av løsningen. Derfor refolding skal utføres gradvis og ved en forholdsvis lav MOG tag konsentrasjon.

  1. Før start dialyse, fortynne den rensede MOG tag protein med buffer B (buffer B kan fremstilles som angitt i trinn 3.1) inntil konsentrasjonen er 0,5 mg / ml eller mindre, basert på mengden av MOG tag beregnet i punkt 4.
  2. Skjær ca. 30 cm av slange dialyserør og sikre den ene ende med en låse hemostat ved å brette den ende av slangen huden over tre ganger og klem den foldede ende med pinsetten. Fyll slangeskinn med fortynnetMOG tag protein (mellom 60 til 90 ml MOG tag protein per rør) deretter fjerne luftbobler fra slangeskinn ved å tvinge dem ut av den åpne enden. Til slutt, forsegle den andre enden av røret ved hjelp av en andre låse hemostat.
  3. Gjenta trinn 5.2 for å fylle flere deler av dialyserøret inntil alt MOG tag-proteinet har blitt overført inn i slange dialyserør. Pass på at det ikke er noen lekkasjer.
  4. Gjør 1x acetat med 4 M guanidin ved å veie ut 382,12 g av guanidin-HCl og tilsetning av 100 ml 10x acetat-buffer som er gjort i trinn 4,1 i et 2 liters begerglass. Tilsett 0,5 liter H2O til begerglasset og tillate den guanidin-HCl for å oppløse. Når oppløst, overføres løsningen til en 1-liters gradert sylinder og tilsett H 2 O inntil volumet har nådd en L. Gjenta denne oppskriften for hver 2 snakeskins som kreves.
  5. Utføre dialyse som følger: fyll en stor bøtte (minimum 10 liter) med 1 liter 1x acetatbuffer med 4 M guanidin fra trinn 5.4. Sett opp to 2 deler av dialyseslangen inneholder MOG tag inn i bøtte, og det er plass for en magnetisk rørestav å spinne uhindret i bunnen. Sett bøtte i en 4 ° C rom på en magnetisk røreplate og slå den på en langsom rotasjon rate (dvs. ikke høy, akkurat nok til å flytte væske):
    MERK: Utfør følgende trinn for å gradvis redusere mengden av guanidin i bufferen. Stir tider er gitt som minimumskrav, men kan stå natten over. Dialyse vil ta minimum 3 dager, men dette kan utvides hvis ønskelig. Regelmessig sjekk for å være sikker på at slangen er intakt og at endene er lukket og låst.
    1. La den sitte bøtte og omrør i 4-5 timer.
    2. Tilsett 1 L av 1x acetat-buffer (100 ml 10x acetat-buffer og 900 ml H2O) i hver bøtte.
    3. Gjenta trinn 5.5.1 og 5.5.2 totalt 3 ganger for totalt 4 L buffer i bøtta.
    4. Kast halvparten av bufferen i bøtte og fyll med 1 liter 1x acetat buffer (100 ml 10x acetat buffer og 900 ml H 2 O, ingen guanidin) og sette opp slangen og rør bar.
    5. Gjenta trinn 5.5.1 og 5.5.2 gang (dvs. før det er totalt 4 L buffer i bøtte).
    6. Endelig erstatte hele 4 L volum i bøtte med fire liter fersk 1x acetat buffer og la oppsikt for 4-5 timer. For best resultat, gjør dette trinnet på dagen av proteinkonsentrasjonen.
    7. Fjern forsiktig dialyserøret med refolded MOG tag og kast bøtte buffer.

6. Konsentrasjon MOG tag Protein

MERK: I det siste trinnet, er foldet på nytt MOG tag protein konsentrert til arbeids fortynning for lagring. Som MOG merkelappen er meget uoppløselig, bør den ikke overstige 5 mg / ml. Denne konsentrasjonen er omtrent ekvimolar med 0,4 mg / ml MOG 35-55 peptidet, som er vanlig anvendt for å indusere EAE i mus (blandet 1: 1 med Freunds fullstendige adjuvmaur (CFA)). I løpet av konsentrasjonsprosessen er det ikke uvanlig at en liten mengde protein for å komme ut av oppløsningen i form av et hvitt bunnfall. Overdreven nedbør er et problem, men.

  1. Beregn den endelige ønsket volum for å oppnå en MOG tag konsentrasjon på 5 mg / ml, basert på verdien beregnet i kapittel 4.
  2. Linje en panne med aluminiumsfolie og å dekke den aluminiumsfolie med polyetylenglykol (PEG) 3350 og PEG 8000 ved et 1: 1 forhold. PEG 3350 er inkorporert i denne blandingen som det kan bidra til å forhindre proteinaggregering løpet av konsentreringen og er en effektiv cyropreservative 11.
  3. Sett slangeskinn slangen (med MOG tag protein inne) på toppen av aluminiumsfolie og dekk med PEG 8000. La dette sitte i romtemperatur og kontroller volumet regelmessig til volumet er lik eller lavere enn forventet sluttvolumet (beregnet i trinn 6,1), vil det faktiske volum måles i neste trinn. Hvis pannen blireksponert med vann i løpet av konsentrasjonsprosessen, sette opp en ny panne med aluminiumsfolie og PEG 3350 og PEG 8000.
  4. Vask utsiden av snakeskins med H2O og overføre MOG taggen protein til et separat glassflaske ved hjelp av en serologisk pipette. Hold styr på volumet som proteinet er overført for å sikre volumet er riktig.
    1. Hvis volumet er redusert under forventet sluttvolum, legge 1x acetat buffer inntil ønsket volum er nådd. Hvis volumet er over den beregnede sluttvolumet, overføres MOG taggen proteinet tilbake i dialyserøret og fortsette den konsentrasjon (trinn 6.2 til 6.3).
    2. Fordel MOG taggen proteinet blant 1,5 ml rør (0,5 ml per rør), lagre rørene ved -80 ° C inntil behov. For å indusere EAE, bland dette volumet 1: 1 med CFA.
  5. Kjøre en SDS-PAGE-gel for å bekrefte ekspresjon av MOG tag-proteinet ved hjelp av de prøver som er tatt i ett trinn.4, 2,1, 3,4, og det rensede MOG-proteinet fra trinn 6.4.

7. Generering MOG 1-125 fra MOG tag Bruke TEV protease (valgfritt)

MERK: Dette valgfrie trinn fortsetter fra slutten av trinn 4. Hvis MOG 1-125 uten noen ekstra kodesekvenser er nødvendig, kan kodesekvenser fjernes ved hjelp av TEV protease (figur 4). Så vidt vi vet, er det ingen andre uttrykk system stand til å generere ren MOG 1-125. Imidlertid bør det bemerkes at uten tioredoksin-koden, MOG 1-125 er meget uoppløselig, og dette kan føre til problemer under rensing og behandling, og av denne grunn fjerne merket hvis det er absolutt nødvendig for eksperimentelle grunner. Flere trinn er nødvendig for å generere ren MOG 1-125. MOG tag først dialysert i TEV protease cleavage buffer. Etter fordøyelse med TEV protease, blir volumet reduseres for å hjelpe til med senere rensning steps, deretter dialysert inn i buffer B, og deretter His-tag inneholdende tag sekvensen er fjernet ved hjelp av nikkel-harpiks. Til slutt blir protein kvantifiseres og ren MOG 1-125 konsentreres til sluttkonsentrasjonen.

  1. Gjør 1 liter 10x TEV spaltingsbuffer (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) ved å tilsette 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl, og 26,5 g tris til en 2 liters begerglass. Legg H2O inntil volumet har nådd 990 ml og deretter justere pH til 8 for å oppløse EDTA. Overfør løsningen til en 1-liters gradert sylinder og bringe volumet opp til 1 liter ved hjelp av H-2 O.
  2. Fortynn MOG tag protein fra trinn 3,6 til 0,5 mg / ml ved bruk av buffer B (samme buffer som er beskrevet i trinn 3.1), basert på mengden av protein beregnet i avsnitt 4. Overfør 120 ml fortynnet MOG tag protein til slange dialyserør som beskrevet i trinn 5.2 til 5.3. Volumet kan skaleres opp men mengden av TEV protease som kreves for å kløyve alle MOG tag protein vil være substantial.
  3. Flg dialyse protokollen angitt i trinn 5.5, bortsett fra å erstatte den 10x acetat-buffer med 10x TEV spaltingsbuffer laget i trinn 7,1.
  4. Overfør MOG tag, nå i TEV spaltingsbuffer, til en ny 250 ml glassflaske og overvåke det økte volumet fra dialyse. Tilsett 1 pl β-merkapto-etanol per hver 2,85 ml av MOG tag-protein tilsatt til flasken. Tilsett minst 1 mg TEV protease (TEV lagerløsning ved 5 mg / ml) for hver 50 mg av MOG tag protein (TEV protease kan tilsettes opp til en 01:10 TEV: MOG protein-forhold) og inkuber ved romtemperatur beskyttet mot lys i minst 72 timer.
    MERK: Ved slutten av den TEV protease inkubasjonen bør hvite utfellinger sees på bunnen av glassflaske.
  5. Før overføring av proteinet til dialyserøret, tilsett guanidin-HCl til løsningen inntil proteinene oppløses for å forhindre proteinet utfelles fester seg til glassflaske. Overfør 150 uldenne oppløsning til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og merke røret som "MOG med TEV". Oppbevar løsningen ved -20 ° C for fremtidig SDS-PAGE-analyse.
  6. Overfør all væsken fra trinn 7,5 til dialyserør som angitt i trinn 5.2 til 5.3. Fyll en stor bøtte med 2 liter H 2 O og plassere dialyse rør inn i bøtte. Inkuber dette ved 4 ° C med lett omrøring over natten. Dette trinn er viktig for å fortynne ut guanidin slik at proteinkonsentrasjonen til å skje raskt og for å begynne å fjerne EDTA fra den løsning som vil interferere med proteinrensing.
  7. Konsentrere proteinet i dialyserøret som er oppført i trinn 6.2 til 6.3 (med unntak av bare bruke PEG 8000), slik at det endelige volum av oppløsningen er ~ 40 ml. Vask dialyserøret med H2O og fjerne eventuelt resterende PEG 8000 fremdeles er festet til slangen. Denne reduksjon i volum gjør det mulig å dekke hele det spaltede protein inn i et 50 ml rør inneholdende nikkel resynd, slik det er beskrevet i trinn 3,5.
  8. Dialyser fordøyd protein til Buffer B:
    1. Fyll en stor bøtte med en liter buffer B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole, 573,18 g guanidin-HCl, pH 7,9).
    2. Plasser snakeskins inneholdende spaltet protein fra trinn 7,7 i bøtten sammen med en røremagnet (som beskrevet i nærmere detalj i trinn 5.5). Sett bøtte inn i en 4 ° C kaldt rom på oppsikt plate satt til en langsom røre og la snakeskins å dialyser for fem eller flere timer.
    3. Tøm bøtte og fyll den med en annen en liter buffer B og la dette sitte i 4 ° C kaldt rom på oppsikt plate satt til en langsom røre og la snakeskins å dialyser for fem eller flere timer.
  9. Utfør rensing av MOG 1-125 protein som beskrevet i kapittel 3, med den viktige forskjellen at de spaltede tag sekvenser vil være bundet av nikkel harpiks, forlater MOG 1-125 i løsning. Igjen, vil 4 runder med rensing væreutført på det samme volum, men i dette tilfellet er målet å forbedre renhet, i stedet for å gjenvinne så mye protein som mulig. Se figur 4.
    1. Gjør protein rensing buffere oppført i trinn 3.1
    2. Lade begge rør av nikkel harpiks som beskrevet i trinn 3.3.
    3. Rens MOG 1-125 ved protokollen beskrevet i trinn 3.5, med den vesentlige forskjell at eluatet fra nikkel harpiks inneholdende merkelappen blir forkastet (beholde 150 ul av eluatet i et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør for fremtidig SDS-PAGE-analyse), mens oppløsningen som inneholder MOG 1-125 er beholdt som det endelige produkt.
  10. Måle konsentrasjonen av MOG 1-125 Protein som beskrevet i punkt 4:
    1. Sett opp BSA standardkurve fortynninger som beskrevet i trinn 4.2 og 4.4.
    2. Sett opp fortynninger av MOG 1-125 som beskrevet i trinn 4.5 og 4.6. Alternativt kan det være verdifullt for å generere et større utvalgav fortynninger (1 x, 1/2, 1/4 og 1/8, for eksempel). Juster volumer 1x acetat buffer og MOG 1-125 tilsvarende.
    3. Utfør Bradford-analysen som beskrevet i trinn 4.7 til 4.9 og beregne mengden av MOG 1-125 generert. Forventet utbytte er omtrent 4 mg eller mer protein.
  11. Brett MOG 1-125 ved gradvis fjerning av guanidin via dialyse, som beskrevet i kapittel 5.
  12. Konsentrer MOG 1-125 protein som beskrevet i avsnitt 6. Sluttkonsentrasjonen bør være 2,24 mg / ml, som er ekvimolar til 5 mg / ml MOG tag.

8. SDS-PAGE gel for å bekrefte MOG tag Produksjon og Purity

MERK: Prøver tatt fra trinn 1.4, 2.1, 3.4, og 6.4 blir analysert ved standard SDS-PAGE for å bekrefte MOG tag produksjon og renhet. Dette trinnet skal utføres etter den endelige rensing av enten MOG tag eller MOG 1-125.

    <li> Lag 2x SDS-PAGE lasting buffer ved å legge til 1,576 g Tris-HCl til 2 ml H 2 O og sette pH til 6,8. Legg 0,4 g SDS inn i Tris-HCl-løsning og deretter legge H2O inntil volumet har nådd 7 ml.
  1. Legg 0,2 g bromfenolblått til 10 ml H2O og deretter tilsett 1 ml av denne til oppløsningen gjort i trinn 8.1. Til slutt, tilsett 2 ml glyserol for å fullføre 2x SDS-PAGE lasting buffer. Når du oppbevarer denne løsningen, holde ved 4 ° C og beskytte den mot lys i inntil 3 måneder.
  2. Tines de frosne porsjoner av bakterier fra trinn 1.4 og 2.1 så vel som det solubiliserte MOG taggen protein fra trinn 3.4 og 6.4 ved romtemperatur.
  3. Fjerne saltene fra de løsninger som er samlet i trinn 3,4 og 6,4 ved tilsetning av 60 ul av hver til protein avsaltings kolonner. Rense proteiner følgende produsentens instruksjoner.
  4. Tilsett 20 mL av β-merkapto-etanol, 1 ml av løsningen tatt opp i trinn 8.2. Legg 40 mL av dette til to bacnelt pellets fra trinn 8.3 og 60 ul til avsaltes proteiner fra steg 8.4 og inkuber disse ved 95 ° C i 10 min.
  5. Gjør 1x SDS side kjører buffer ved å veie ut 5 g Tris, 28,8 g glysin, og en g SDS. Legge disse til en 1-liters begerglass og tilsett 500 ml H2O for å oppløse alt. Når oppløst, overføres løsningen til en 1 L målesylinder og fyll med H 2 O til volumet når en L.
  6. Sett opp en 12% polyakrylamidgel i en gel apparatur og tilsett 1 x SDS-PAGE rennende buffer til gelen anordningen slik at den rennende buffer er like over toppen av brønnene i gelen. Vask brønnene i gelen ved å pipettere 50 pl rennende buffer i brønnene fem ganger hver.
  7. Load 10 mL av protein stige i den første brønnen og legge til 10 mL av kokte løsninger fra trinn 8,5 til separate brønner. Kjør gelen ved 115 V i 60 min.
  8. Fjerne gelen fra apparatet og overføre den til en liten beholder. Fyll Container med 100 ml ren H2O og overføre beholderen til en langsomt roterende plattform i 8 min. Etter 8 min, dumpe vann og vask gelen to ganger mer med H2O
  9. Dumpe H 2 O fra beholderen og tilsett 100 ml rask flekken reagens til beholderen. Tillate at dette skal sitte på en sakte roterende plattform over natten, dekk med aluminiumsfolie.
  10. Dumpe rask flekk reagenset og legge til omtrent 100 ml H2O til beholderen. Tillate at dette skal sitte på en roterende plattform for 8 min. Dumpe H 2 O og gjenta H 2 O vask to ganger.
  11. Bilde gelen ved hjelp av en imager for Coomassieblå flekker. Se etter et bånd rundt 31.86 kDa (MOG tag protein) og en svakere bånd på 63,72 kDa (MOG tag dimer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når rensingen er ferdig, prøver oppsamlet i trinn 1.4, 2.1, 3.4, og sluttproduktet fra trinn 6.4 skal kjøres på et protein-gel (figur 3A). MOG taggen skal først vises som en 31,86 kDa band i T O / N prøven, men ikke t 0, og bør være det eneste bandet i slutt rent produkt. For å teste om MOG tag protein har riktig foldet, kan MOG tag protein brukes til å merke MOG-protein spesifikke B-celler ved FACS. Ved merking mus lymfocytter med en 1: 1000 fortynning av MOG signal sammen med et sekundært antistoff rettet mot His-tag og en fluorescent-merket tertiær anti-lgG1-antistoff, kan MOG-spesifikke B-celler bli identifisert (figur 3B). Alternativt kan MOG merkelappen bli direkte konjugert til fluoroforer for å redusere bakgrunnsfarging (som følge av B-celler som binder til de sekundære og tertiære antistoffer) sombeskrevet under henvisning 5 til å identifisere MOG-spesifikke B-celler. Dette er nødvendig ved forsøk på å identifisere MOG-bindende B-celler i villtype-mus, ettersom disse cellene normalt er svært sjeldne 5. AvIgH MOG mus har en tung kjede Knockin at da sammen med en passende kappa lett kjede, overfører spesifisitet for MOG. Som binding av MOG tag forsterkes blant Igh MOG B-celler, bekrefter dette at denne protokollen genererer en brettet skikkelig antigen. Viktigere, avIgH MOG B-celler bidrar til autoimmun patologi i modeller av MOG-rettet EAE 12, bekrefter at koden MOG induserer både T- og B-celle-autoimmunitet.

Før dialyse for å refolde proteiner som er beskrevet i avsnitt 5, er det nødvendig å måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford-analyse, som beskrevet i seksjon 4. Representative resultater av en Bradford-analysen er vist i tabell 1 figur 5.

Generering av ren MOG 1-125 oppnås ved tilsetning av protease til TEV MOG tag protein som til slutt resulterer i spaltningen av MOG tag proteinet inn i MOG 1-125 og tag sekvensen som vist i figur 6. Etterfølgende nikkel harpiks rensing fjerner MOG tag, tag sekvens, og TEV protease urenheter til slutt resulterer i ren MOG 1-125 som vist i figur 6.

Figur 1
Figur 1: MOG tag protein (Duplisert her med tillatelse fra Dang et al fem..).. Lineær struktur, og aminosyre- og DNA-sekvenser av MOG taggen fusjonsprotein. DNA-sekvensen for det ekstracellulære domene av muse-MOG (MOG1-125, lavere sekvens i blått) ble kodon-optimalisert for uttrykk i bakterier (svart). Denne sekvensen ble syntetisert og satt inn i en vektor for å skape en N-terminal fusjon til en kode som inneholder tioredoksin og en S-tag for å motvirke den kjente uoppløseligheten av MOG proteinet 13,14, så vel som et 6x His Tag for rensning 15. En TEV proteasespaltningsstillingen skiller MOG 1-125 fra tag sekvenser. TEV-mediert spalting mellom glutamin-164 og glysin-165 ved hjelp av en alternativ konsensus TEV cleavage for 16. resultater i fjerning av alle ikke-MOG aminosyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Oversikt over trinnene som kreves for å produsere ren MOG tag protein til.generere MOG tag protein, er bakterier som uttrykker MOG tag protein vokst til høye tettheter så indusert til å uttrykke MOG tag bruker IPTG som nevnt i § 1. Etter en overnatting kultur, bakterier lysert og gjennom en serie av pelle skritt proteinfraksjon som inneholder inklusjonslegemer, som inneholder MOG tag, er hentet som nevnt i § 2. MOG lappen blir deretter renset fra råprotein brøkdel gjennom fire sykluser av absorpsjon ut mot belastet nikkel harpiks og eluering av MOG tag protein som er oppført i kapittel 3. En del av den samlede eluat tas deretter for en Bradford-analyse for å bestemme utbyttet av MOG tag protein og resten av eluatet dialyseres til acetat-buffer i løpet av flere dager som er oppført i seksjoner 4 og 5. Endelig er proteinet konsentreres ved hjelp av PEG 3350 og PEG 8000 til en endelig konsentrasjon på 5 mg / ml, basert på utbyttet av MOG signal bestemmes i BRadford analysen som er oppført i avsnitt 6. Hele prosessen kan ta minimum 10 dager, med start dag for hvert trinn i parentes. Imidlertid er alternative stoppe og starte punkter oppført i protokollen, og tiltak kan være spredt over et større mengde tid hvis ønskelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Rensing av MOG tag protein og vurdering av sin virksomhet (A) Vist er proteinprøver som ble samlet inn fra ulike steder over hele protein rensing prosedyre og kjøres på en SDS-PAGE gel. T 0 = BL21 bakterier før protein induksjon (samlet i trinn 1.4), T O / N = BL21 bakterier etter induksjon av protein uttrykk (samleti trinn 2.1), Crude MOG tag = løselig MOG tag protein før protein rensing (samlet i trinn 3.4), Pure MOG tag = MOG tag protein etter rensing (samlet i trinn 6.4). (B) Binding av MOG tag protein til CD19 pos CD4 neg naive B-celler fra lymfeknuter fra enten villtype C57BL / 6 mus eller avIgH MOG mus som uttrykker et immunoglobulin tung kjede spesifikk for MOG protein 7,17 ble vurdert ved hjelp av flowcytometri . MOG tag-spesifikke B-celler, ble identifisert ved farging av lymfeknuteceller med MOG signal etterfulgt av en sekundær anti-his-tag antistoff og et fluorescerende tertiær anti-lgG1-antistoff. Farging av celler fra C57BL / 6 eller avIgH MOG mus er vist sammen med en MOG tag fluorescens minus én (FMO) kontroll flekk av avIgH MOG celler. Vennligst cslikke her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Oversikt over trinnene for å generere MOG 1-125 fra MOG tag protein. Etter oppsamling av MOG taggen eluatet som beskrevet i trinn 3.5 i protokollen, er det MOG taggen proteinet dialysert inn i TEV protease spaltingsbuffer. Når dialysen var fullstendig, TEV protease tilsettes til MOG taggen oppløsningen som resulterer i spalting av MOG kode i MOG 1-125 protein. Volumet av spaltingen Oppløsningen blir så redusert og dialysert inn i buffer B forut for proteinrensing. Urenheter fra spaltingen oppløsningen blir ekstrahert gjennom fire suksessive runder med absorpsjon ut mot ladet nikkel harpiks og eluering av urenhetene til slutt resulterer i en oppløsning av ren MOG < sub> 1-125. Konsentrasjonen av MOG 1-125 proteinet bestemmes ved en Bradford-analyse og protein er foldet i løpet av flere dager ved dialyse. Når dialyse er fullført, er MOG 1-125 protein konsentrert til 2,24 mg / ml ved hjelp av PEG 3350 og PEG 8000. Denne protokollen er nærmere omtalt i kapittel 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Eksempel på en Bradford assay standardkurve for bestemmelse av konsentrasjonen av MOG tag protein. BSA standard målinger tatt fra tabell 1 ble plottet for å oppnå en lineær regresjon formelen for beregning av MOG tag-konsentrasjonen, basert på den optiske tetthet ved 595 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6:. TEV spalting av MOG tag protein og påfølgende rensing av MOG 1-125 Vist er proteinprøver kjøres på en SDS-PAGE gel demonstrere rensing av MOG 1-125 Pure MOG tag = MOG tag protein før TEV cleavage (samlet. i trinn 6.4), MOG tag w / TEV = Protein fraksjon som ble samlet etter 72 timers inkubasjon av MOG tag med TEV protease (oppsamlet i trinn 7.5), Eluering = Protein fraksjon som forble bundet til nikkel harpiksen i løpet av MOG 1- 125 renseprotokoll (oppsamlet i trinn 7.9), Pure MOG 1-125 = MOG1-125 protein etter rensing (samlet i trinn 7.12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

BSA (mg / ml) 0.4 0,35 0.3 0,25 0.2 0,15 0.1 0,05 0
1.079 0,998 0,948 0,853 0,769 0,699 0,583 0,493 0,373
1.071 1,014 0.95 0,854 0,777 0,681 0,579 0,484 0,375
1,069 1,017 0,944 0,848 0,781 0,592 0,494 0,374
MOG tag fortynning 1 1/5 1/25
1,327 1.013 0,493
1,332 1,063 0,491
1,367 1.088 0,488

Tabell 1: Representative verdier fra en Bradford-analyse for bestemmelse av konsentrasjonen av MOG merkelappen protein BSA Dilu.sjoner ved kjente konsentrasjoner blir anvendt for å bestemme standardkurve er vist i figur 5. fortynninger av MOG tag protein etterrensing blir brukt til å bestemme den endelige MOG taggen proteinkonsentrasjon. Linjene inneholder den optiske densitet målt ved 595nm, og hver rad representerer en gjengivelse av totalt 3 replikater for hver indikerte konsentrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi beskrevet en protokoll for fremstilling av MOG tag protein og hvordan å generere ren MOG 1-125 fra MOG tag protein. Denne protokollen er basert både på standard-His-tag-baserte proteinrensemetoder, i tillegg til en tidligere beskrevet protokoll for generering av en eldre MOG-baserte protein 15. Selv om det ikke er beskrevet her, er den primære bruken av MOG tag-proteinet er å indusere EAE gjennom immunisering med protein antigen. En protokoll som beskriver hvordan EAE induseres i mus, som er kompatibel med MOG tag protein, kan finnes i referanse 3. Vi har tidligere vist at immunisering med MOG tag eller MOG 1-125 avledet fra MOG merkelappen ikke bare induserer CNS autoimmun sykdom med større ryggmarg betennelse og demyelinering i forhold til standard MOG 35-55 peptidet, men også at patogene avIgH MOG B-celler that gjenkjenne MOG protein blir aktivisert for å produsere et germinal senter respons som respons på MOG tag eller MOG 1-125, men ikke for å MOG 35-55 5. Derfor immunisering med MOG tag gjør faktisk induserer en passende anti-MOG B-celle respons.

MOG tag protein blir renset gjennom absorpsjon på ladet nikkel harpiks (via His-tag) og eluering. På grunn av den store mengden av protein som genereres i de foregående trinnene blir multiple runder med absorpsjon og eluering som kreves for å samle det meste av proteinet. Vi har funnet at minst 4 runder er nødvendig for å isolere det meste av proteinet ved bruk av et passende volum av harpiks i 50 ml rør. Hvis ønskelig, kan protokollen bli skalert opp for å bruke flere eller større rør og mer nikkel harpiks for å redusere antall runder med absorpsjon. Alternativt kan væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) med nikkel kolonner effektivt rense His-merkede proteiner 18 </ sup> og faktisk vi har funnet ut at HPLC effektivt kan rense MOG tag protein (upubliserte observasjoner). Som HPLC er ikke tilgjengelig for mange standard immunologi laboratorier, er den protokoll som er oppført her utformet for å bli utført ved hjelp av vanlige laboratorieutstyr. I tillegg til hans-tag rensing, gjør MOG tag protein inneholder en S-kode som er kompatibel med S-tag rensing protokoller hvis ønskelig 14.

Rekombinante proteiner basert på MOG (for det meste human eller rotte), er blitt beskrevet tidligere 8. Disse var basert på eldre ekspresjonssystemer som siden har blitt erstattet av systemer drevet av sterkere transkripsjonelle aktivatorer som er i stand til å produsere større mengder av protein i Escherichia coli-bakterier. Vår MOG tag uttrykk systemet bruker effektiv T7 promoter i Dyre 32a (+) vektor, som er betydelig mer effektiv enn systemer tilgjengelig for in-house produksjon av MOG protein 19. Men det erhould bemerkes at MOG taggen-proteinet er beskrevet her er basert på mus MOG. Immunisering med humant MOG-protein har vist seg å indusere EAE i mus som har forskjellige egenskaper i forhold til sykdom indusert ved hjelp av murine MOG 8. Videre kan rotte MOG være mer immunogent enn mus MOG i mus i noen tilfeller 20. Derfor, for noen eksperimentelle formål mus-basert MOG tag kan ikke være ideelt. Vi er i prosessen med å generere flere annen versjon av MOG taggen protein enn det som kan passe noen formål bedre, og det renseprotokoll som er beskrevet her vil fungere for alle disse. I mellomtiden er det mulig at renseprotokoll som er beskrevet her, kan fungere for andre MOG ekspresjonssystemer, eller til andre proteiner, så lenge de innlemme et 6x His Tag for absorpsjon til nikkel harpiks. Men uten thioredoxin tag, løseligheten av MOG protein ved høyere konsentrasjoner kan være et problem, og selvfølgelig vil det ikke være mulig å ge nerate ren MOG 1-125, da dette er unikt for MOG taggen system.

Måling av MOG tag proteinkonsentrasjonen før protein refolding via dialyse er avgjørende for å lykkes med denne renseprotokoll. Hvis konsentrasjonen er for høy, kan proteinet aggregerer og faller ut av oppløsning i stedet for å brette inn i individuelle proteiner. Dette kan sees under dialyse protokollen som hvite bunnfall som danner på bunnen av dialyserøret. Hvis dette skjer, oppløse MOG tag proteinet igjen med 6 M guanidin og måle proteinkonsentrasjonen. Fortynn proteinet til 0,5 mg / ml og deretter starte på nytt som dialyse er ingen utfellinger skulle danne seg 0,5 mg / ml. For MOG 1-125, kan utfellinger kan forventes å dannes som proteinet er meget uoppløselig. Vi har funnet at dette ikke vil påvirke den brettingen av MOG 1-125, forutsatt at proteinet var tilstrekkelig fortynnet før dialyse.

nt "> For TEV protease å effektivt spalte MOG tag protein til ren MOG 1-125 er det viktig å bruke en tilstrekkelig mengde av TEV protease. Eldre versjoner av TEV proteaser inaktiveres gjennom selv cleavage 21 men mer moderne versjoner lider uløselighet utsteder 22 det er således viktig å tilsette nok TEV protease for å oppnå tilstrekkelig spaltning av MOG taggen proteinet før TEV protease inaktivering. Ettersom kommersielt tilgjengelig TEV protease kan være kostbart, anbefaler vi fremstilling og rensing av TEV protease som beskrevet i referanse 22. Ved bruk av ren mus MOG 1-125 protein for eksperimenter, er det viktig å merke seg at proteinet er sterkt uløselig og kan felle ut av oppløsningen, og derfor må blandes grundig før bruk.

I sammendrag, her vi har beskrevet en enkel protokoll for fremstilling og rensing av store mengder av MOG tag protein. Furthermmalm, tilsetning av en TEV protease spaltningssete til vår MOG tag-protein gir mulighet til å generere rent MOG 1-125 hvis nødvendig. MOG tag protein er anerkjent og bundet av anti-myelin autoimmune B-celler og MOG tag indusert EAE inneholder B-celle-mediert patologi 5. Derfor overvinner MOG tag protein de store hindrene som begrenser utbredt bruk av protein antigen for å indusere EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics