Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione 1. "Encefalomielite autoimmune sperimentale" è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione 2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante.

autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante 35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l'immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l'intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie 4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell'antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell'antigene alle cellule T CD4 +. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG 35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG 5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano 6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti.

Nonostante i vantaggi dell'utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG 35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) 1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti 7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG 8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG 1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare.

Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l'insolubilità noto di MOG proteine 5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l'unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG 1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG 1-125 era codone ottimizzato per l'espressione batterica e la proteina di fusione tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine tag, e puro MOG 1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteine ​​induzione

NOTA: Nelle seguenti passaggi, BL21 Escherichia coli trasformato con un vettore pET-32 contenente la sequenza per la proteina tag MOG di fusione (vedi riferimento 5 e Figura 1) sono coltivati a densità elevate e sono quindi indotti a esprimere la proteina tag MOG . Vedere la Figura 2 per cronologia generale - di notare che i giorni sono i punti di stop approssimativi alternativi sono indicati nel protocollo. Se a partire da purificato DNA tag PET-32 MOG vettore, sarà necessario trasformare chimicamente in competente BL21 E. coli, batteri che utilizzano la selezione ampicillina, come è stato ben descritto 9. Trasformazione di successo può essere confermata purificando DNA da batteri selezionati con un kit commerciale standard, seguita da digestione con gli enzimi di restrizione AGE1 e SAC1 per produrre una banda 424 bp su un gel di agarosio 10.

    tag stock di glicerolo e incubare durante la notte a 37 ° C, 200 giri al minuto.
  1. Inserire due palloni 1 L Erlenmeyer contenenti 500 ml di brodo LB sterile in un incubatore a 37 ° in preparazione per il giorno successivo.
  2. Aggiungere 500 pl di 100 mg / ml di ampicillina a ciascuno dei flaconi contenenti 500 ml LB dal punto 1.2 (concentrazione finale 0,1 mg / ml di ampicillina). Trasferire 1 ml della coltura overnight dal punto 1.1 a ciascuno dei due palloni di brodo LB. Incubare a 37 ° C e 200 rpm per 5 ore o fino ad una densità ottica di 0,6.
  3. Prendere una 1 ml un'aliquota da uno dei flaconi e trasferirlo in un tubo separato da centrifuga da 1,5 ml. Agglomerare le cellule a 16.000 xg per 1 min e rimuovere il surnatante. Etichettare il tubo come T 0 (pre-induzione) e poi mettere il pellet batterico in un -20 ° C freezer per il futuro sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) Analisi (vedere la sezione 8 e la Figura 3).
  4. Aggiungere 0,5 ml di 1 M isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropyl β-D-tiogalattoside (IPTG) per ogni pallone di coltura. Incubare le beute a 37 ° C, 200 rpm per 4 ore, quindi a temperatura ambiente a 75 rpm durante la notte.

2. La raccolta MOG tag proteine

NOTA: In questa fase, i batteri avrà prodotto grandi quantità di proteine tag MOG. Per raccogliere tag MOG, batteri vengono prima lisate in un buffer Triton X-100 seguito da sonicazione. Tag MOG viene poi rilasciato da corpi di inclusione e denaturato con imidazolo e guanidina, risultante in una soluzione proteica grezza contenente la proteina tag MOG.

  1. Prendere un 1 ml un'aliquota da una delle culture durante la notte dal punto 1.5 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Agglomerare le cellule a 16.000 xg per 1 min e rimuovere il surnatante. Etichettare la vascae T O / N (post-induzione) poi mettere il pellet batterico in una -20 ° C per una futura analisi della pagina SDS (Figura 3).
  2. Distribuire le culture in modo uniforme tra le bottiglie da 250 ml compatibile con l'alta velocità e la centrifugazione tenerli in ghiaccio da questo punto in avanti. Agglomerare le cellule batteriche a 22.000 xg per 15 min a 4 ° C.
  3. Eliminare il surnatante. Conservare il pellet batterici a -20 ° C o continuare al punto 2.4.
  4. Preparare tampone di lisi (0,1 mg / ml di lisozima uovo di gallina, 0,1% Triton-X (v / v) in tampone fosfato (PBS)) aggiungendo 60 ml di Triton X-100 e 120 ml di 50 mg / ml uovo di gallina lisozima soluzione stock di 60 ml di PBS.
  5. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici dal punto 2.3 in un totale di 30 ml di tampone di lisi. Trasferire questo volume ad un tubo a fondo tondo da 50 ml in grado di alta centrifugazione velocità. Inserire questo tubo in un bagnomaria C 30 ° per 30 min. Durante il periodo di incubazione, agitare il tubodue volte per risospendere le cellule.
  6. Dopo l'incubazione, trasferire il tubo sul ghiaccio e sonicare la soluzione a 20 kHz, l'ampiezza del 70%, su impulso di 3 secondi, il polso fuori 3 sec, e cinque impulsi per giro. Sonicare la soluzione per sei turni totali e consentire la soluzione raffreddare sul ghiaccio in-tra un round.
  7. Centrifugare ad 24.000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e ripetere i passaggi 2,5-2,7 una volta. Conservare il pellet a -20 ° C o continuare al punto 2.8.
  8. Preparare tampone A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, pH 7,9) aggiungendo 0,8766 g di NaCl, 0,09,456 mila g di Tris-HCl e 0,01,021 mila g di imidazolo ad un becher da 100 ml. Aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 28 ml quindi regolare il pH della soluzione a 7,9. Poi, trasferire la soluzione in 100 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino al volume di 30 ml.
  9. Risospendere il pellet dal punto 2.7 in 30 ml di tampone A e incubare questa soluzione a 4 ° C per 3 ore. Durante questo periodopesare 17,2 g di guanidina-HCl.
  10. Sonicare la soluzione su ghiaccio con le stesse impostazioni come al punto 2.6. Aggiungere quindi 17,2 g di guanidina-HCl alla soluzione. Incubare questo in ghiaccio per 1 ora per solubilizzare la proteina tag MOG.
  11. Centrifugare ad 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare il surnatante a 4 ° C fino purificazione della proteina.

3. purificazione delle proteine

NOTA: Nelle seguenti fasi della proteina tag MOG sarà purificato attraverso 4 giri di assorbimento su resina nichel carica (tramite il His-tag) e eluizione.

  1. Effettuare le Buffer seguenti:
    1. Preparare tampone B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 0,0681 g di imidazolo e 114.64 g guanidina-HCl in un becher da 500 ml. Quindi aggiungere H 2 O fino a raggiungere 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire il solution ad un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume è di 200 ml.
    2. Preparare Elution Buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 6,808 g di imidazolo e 114.64 g guanidina-HCl a un becher da 500 ml. Aggiungere H 2 O fino a raggiungere 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume è di 200 ml.
    3. Preparare Striscia tampone (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA ad un becher da 500 ml. Aggiungere H 2 O fino a raggiungere 190 mL e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume è di 200 ml.
    4. Preparare carica tampone (0,1 M di nichel solfato). Aggiungere 5,257 g di nichel solfato ad un bicchiere da 500 ml ed aggiungere H 2 O, fino a raggiungere 190 ml (ATTENZIONE, non maneggiare nichelsolfato di fuori di una cappa aspirante fino al solfato di nichel è stato sciolto in H 2 O). Una volta che il solfato di nichel è dissolta, trasferire la soluzione in 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 200 ml.
  2. Split 10 ml di resina al nichel tra due provette coniche da 50 ml centrifuga capaci di resistere forze centrifughe oltre 4.500 xg (5 ml in ciascun tubo).
  3. Caricare ed equilibrare la resina al nichel:
    1. Lavare la resina con l'aggiunta di 40 ml di H 2 O per ogni provetta contenente resina. Posare i tubi in orizzontale su una sedia a dondolo e farli agitare per 5 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
    2. Eliminare il surnatante pipettando per non disturbare il pellet. Aggiungere 40 ml di tampone di carica per ogni provetta. Trasferire i tubi su una sedia a dondolo e farli agitare per 15 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
  4. Opzionale: Prendete 150 ml di proteina solubilizzato rilevati nella fase 2.11 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Etichettare il tubo come pre-incubazione e congelare questo a -20 ° C per una futura analisi della pagina SDS (Figura 3, Crude MOG tag).
  5. Purificare il tag MOG Proteine:
    1. Trasferire l'intero volume di proteine solubilizzato dal punto 2.11 (~ 40 ml, meno il piccolo campione rimosso al punto 3.4) per il primo tubo (Figura 2, il tubo 1) contenente resina nickel dal punto 3.3, mescolare e posizionare orizzontalmente su una sedia a dondolo a 4 ° C per 1 ora.
    2. Centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, trasferire il surnatante al secondotubo (Figura 2, il tubo 2) di resina nichel e incubare come descritto nel passaggio precedente. Nel frattempo, continua con i passaggi da 3 a 6 di seguito con il tubo 1.
    3. Risospendere la resina nickel in tubo 1 in 40 ml di tampone di eluizione e posizionare il tubo orizzontalmente su un bilanciere a 4 ° C per 5 min. Poi, centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
    4. Trasferire il surnatante contenente eluito proteina tag MOG in un flacone da 250 ml con l'etichetta 'purificata tag MOG proteine' e mantenere questa bottiglia a 4 ° C. Ad ogni passo di eluizione, in comune il surnatante risultante in questa bottiglia.
    5. Aggiungere 40 ml di tampone striscia alla resina nichel e posizionare orizzontalmente su un bilanciere per 5 minuti a 4 ° C.
    6. Centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante, quindi ricaricare la resina nichel come elencato nel passaggio 3.3.
    7. Una volta terminato, andare avanti con il secondo tubo come elencato nel passaggio 3.5. Un totale di 4 rotondas di assorbimento della proteina solubilizzata dal punto 2.11 sulla resina nickel carica e eluizione recupererà maggior parte della proteina, sebbene, se desiderato, proteina aggiuntiva potrebbe essere recuperato in ulteriori cicli di assorbimento e di eluizione.
  6. Dopo quattro (o più) cicli di assorbimento e eluizione sono completi, memorizzare la proteina purificata pool a 4 ° C durante la notte. resina Nichel può essere memorizzato in 40 ml di una soluzione di etanolo al 20% a 4 ° C fino al suo utilizzo nuovo.

4. misurazione della proteina Concentrazione

NOTA: Prima di procedere oltre è necessario quantificare la quantità di proteina purificata tag MOG generato nella sezione 3. Viene utilizzato questo valore per determinare il volume finale di concentrare la proteina alla fine del protocollo. Descriviamo un Bradford test standard di qui. La concentrazione di proteine tag MOG purificata è determinata confrontando l'assorbanza spettrale di serie diluted MOG etichetta proteica ad una curva standard di albumina sierica bovina (BSA) ad una concentrazione nota.

  1. Rendere 10x tampone acetato aggiungendo 23 ml di acido acetico glaciale a 8,2 g di sodio acetato in 3 L bicchiere e aggiungere 1,9 L di H 2 O per sciogliere l'acetato di sodio. Trasferire questa soluzione in un 2 L cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 2 L. Poi conservarlo in una bottiglia 2 L a temperatura ambiente. Rendere 1 ml di tampone acetato 1x aggiungendo 100 ml di 10x tampone acetato a 900 ml di H 2 O.
  2. Impostare una piastra a 96 pozzetti per diluizioni con l'aggiunta di 30 ml di tampone acetato 1x a pozzi G2-8 e 60 ml di G9. Aggiungere 48 ml di tampone acetato 1x a H2 e H3.
  3. Impostare la diluizione in serie iniziale della serie BSA in fila G come segue: Aggiungere 216 ml di tampone acetato di 1x e 54 ml di disponibile in commercio 2 mg di serie / ml di BSA in ben G1 e mescolare accuratamente. Aggiungere 210 ml da ben G1 a ben G2, mescolare accuratamente,e quindi aggiungere 180 ml di ben G2 per bene G3. Aggiungere 150 ml di ben G3 a G4 bene, mescolare accuratamente, e continuare questo trend di aggiungere 30 ml meno a ogni successivo e fino a ben G8. (Vedi Tabella 1 per le liste di fattori di diluizione equivalenti).
  4. Impostare campioni triplicato di ciascuna diluizione trasferendo 10 ml di ben G1 nei pozzetti A1, B1 e C1, e 10 ml di ben G2 per pozzi A2, B2, C2 e, e così via. Utilizzare una pipetta multicanale.
  5. Per impostare diluizioni di tag MOG, aggiungere 60 ml di proteine tag MOG purificata dal passaggio 3,6 a ben H1. Aggiungere 12 ml di ben H1 a H2 bene, mescolare accuratamente, quindi aggiungere 12 ml di ben H2 a H3 bene, mescolare accuratamente (questo produce una diluizione 1x nel 1 ° semestre, 1/5 di diluizione in H2 e H3 1/25 diluizione) .
  6. Impostare campioni triplicato per le diluizioni tag MOG trasferendo 10 ml di pozzi H1-H3 alle righe D, E e F, come descritto al punto 4.4.
  7. Mescolare 2 ml di colorante dosaggio proteineConcentrato reagente con 8 ml di H 2 O. Aggiungere 200 pl di questa miscela a tutti i pozzetti precaricati in righe A, B, C, D, E, e F, con una pipetta multicanale, se disponibile. Pop eventuali bolle nei pozzetti usando un ago prima di leggere la concentrazione di proteine.
  8. Entro 10 minuti di aggiunta del reagente colorante, misurare l'assorbanza 595 nm di tutti i pozzetti in righe A, B, C, D, E e F.
  9. Utilizzare righe A, B, e C per impostare una curva standard in cui le posizioni 1-9 corrispondono a 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 e 0 mg / ml di BSA. Sulla base di questa curva, calcolare la concentrazione di proteine tag MOG utilizzando la diluizione del tag MOG che meglio si adatta alla curva standard. Solitamente, ci saranno 200 a 250 mg di proteina tag MOG da 1 L di coltura batterica utilizzando il protocollo qui descritto.
    NOTA: per rendere MOG 1-125 procedere da qui alla sezione facoltativa 7 elencati alla fine del protocollo. In caso contrario, continuare con la sezione 5.

NOTA: dialisi viene eseguita per rimuovere gradualmente guanidina dalla soluzione contenente purificata, tag denaturato MOG per consentire la proteina a ripiegare. Si deve prestare attenzione durante questa fase come MOG è molto insolubile, e mentre questo è migliorata dalla presenza del tag tioredossina, è ancora incline a venire dalla soluzione. Pertanto, ripiegando dovrebbe essere eseguita gradualmente e ad una concentrazione relativamente bassa tag MOG.

  1. Prima di iniziare la dialisi, diluire la proteina tag MOG purificata con tampone B (tampone B può essere fatto come elencato nel passaggio 3.1) finché la concentrazione è di 0,5 mg / ml o meno, in base alla quantità di tag MOG calcolato nella sezione 4.
  2. Tagliare circa 30 cm di snakeskin tubo di dialisi e fissare una estremità con una pinza emostatica bloccaggio piegando la fine della pelle di serpente oltre tre volte e bloccaggio alla fine piegato con la pinza emostatica. Riempire il serpente con diluitoTag MOG proteine (tra 60 e 90 ml di MOG tag proteine per provetta) quindi rimuovere le bolle d'aria dalla pelle di serpente da costringendoli fuori dalla estremità aperta. Infine, sigillare l'altra estremità del tubo con una seconda pinza emostatica bloccaggio.
  3. Ripetere il passaggio 5.2 per riempire sezioni aggiuntive di tubo di dialisi fino a quando tutte le proteine tag MOG è stato trasferito in tubi di pelle di serpente di dialisi. Assicurarsi che non vi siano perdite.
  4. Fare acetato 1x con 4 M guanidina pesando 382,12 g di guanidina-HCl e l'aggiunta di 100 ml di 10x tampone acetato fatte nella fase 4.1 a 2 L bicchiere. Aggiungere 0,5 L di H 2 O nel becher e consentire la guanidina-HCl sciogliere. Una volta disciolto, trasferire la soluzione in un 1 L cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 1 L. Ripetere questa ricetta per ogni 2 pelli di serpente necessari.
  5. Eseguire la dialisi come segue: riempire un secchio di grandi dimensioni (minimo 10 L) con 1 L di tampone acetato 1x con 4 M guanidina dal punto 5.4. Mettere su to 2 sezioni di tubo di dialisi contenenti tag MOG nel secchio, lasciando spazio ad un ancoretta magnetica a girare senza ostacoli sul fondo. Mettere il secchio in una camera a 4 ° C su una piastra di agitazione magnetica e accenderlo per una velocità di rotazione lenta (cioè non elevata, quanto basta per spostare il fluido):
    NOTA: eseguire le seguenti operazioni per ridurre gradualmente la quantità di guanidina nel buffer. Mescolare volte sono dati come minimi, ma possono essere lasciati durante la notte. Dialisi avrà un minimo di 3 giorni, ma questo può essere esteso se lo si desidera. Controllare regolarmente per assicurarsi che il tubo sia intatto e che le estremità sono chiusi in modo sicuro.
    1. Lasciate che il secchio sedersi e mescolare per 4-5 ore.
    2. Aggiungere 1 L di tampone acetato 1x (100 ml 10x tampone acetato e 900 ml di H 2 O) per ciascun segmento.
    3. Ripetere i punti 5.5.1 e 5.5.2 un totale di 3 volte per un totale di 4 L di tampone nel secchio.
    4. Eliminare la metà del buffer nel secchio e riempire con 1 L di tampone acetato 1x (100 ml 10x tampone acetato e 900 ml di H 2 O, senza guanidina) e impostare la barra di tubo e mescolare.
    5. Ripetere i punti 5.5.1 e 5.5.2, una volta (cioè fino a quando c'è un totale di 4 L di tampone nel secchio).
    6. Infine, sostituire l'intero volume 4 L nel secchio con 4 L di tampone 1x acetato di fresco e lasciare mescolare per 4-5 ore. Per ottenere i migliori risultati, fare questo passo il giorno della concentrazione proteica.
    7. Rimuovere con attenzione il tubo di dialisi con tag MOG ripiegata e scartare tampone secchio.

6. Concentrare MOG tag proteine

NOTA: Nella fase finale, ripiegata proteina tag MOG è concentrata per la diluizione di lavoro per la conservazione. Come tag MOG è molto insolubile, non deve superare i 5 mg / ml. Questa concentrazione è approssimativamente equimolare con 0,4 mg / ml MOG 35-55 peptide, che è comunemente usato per indurre EAE nei topi (misti 1: 1 con assoluta adjuv di Freundformica (CFA)). Durante il processo di concentrazione non è raro che una piccola quantità di proteine ​​per uscire soluzione sotto forma di precipitato bianco. la precipitazione eccessiva è un problema, però.

  1. Calcolare il volume finale desiderato per ottenere una concentrazione variabile MOG 5 mg / ml, sulla base del valore calcolato nella sezione 4.
  2. Linea un tegame con un foglio di alluminio e coprire il foglio di alluminio con polietilenglicole (PEG) 3350 e PEG 8000 in un rapporto 1: 1. Il PEG 3350 è incorporato in questa miscela in quanto può aiutare a prevenire l'aggregazione delle proteine durante la concentrazione ed è un efficace cyropreservative 11.
  3. Mettere il tubo di serpente (con MOG tag proteine all'interno) sulla parte superiore del foglio di alluminio e coprire con PEG 8000. Che questa riposare a temperatura ambiente e verificare la quantità regolarmente finché il volume è uguale o inferiore al volume finale stimato (calcolato al passo 6.1), il volume effettivo sarà misurato nel passaggio successivo. Se la pentola diventatroppo saturi con acqua durante il processo di concentrazione, impostare una padella fresco con un foglio di alluminio e PEG 3350 e PEG 8000.
  4. Lavare l'esterno delle pelli di serpente con H 2 O e trasferire la proteina tag MOG ad una bottiglia di vetro separata con una pipetta sierologica. Tenere traccia del volume come la proteina viene trasferita per garantire il volume sia corretto.
    1. Se il volume è stato ridotto al di sotto del volume finale stimato, aggiungere 1x tampone acetato fino a raggiungere il volume desiderato. Se il volume è superiore al volume finale stimato, trasferire la proteina tag MOG indietro nel tubo di dialisi e continuare la concentrazione (passi 6,2-6,3).
    2. Distribuire la proteina tag MOG tra provette da 1,5 ml (0,5 ml per provetta), conservare le provette a -80 ° C fino al momento dell'uso. Per indurre EAE, mescolare questo volume 1: 1 con il CFA.
  5. Eseguire un gel SDS PAGE per confermare l'espressione della proteina tag MOG utilizzando i campioni prelevati nei passaggi 1.4, 2.1, 3.4, e la proteina MOG purificata dal punto 6.4.

7. Generazione MOG 1-125 da tag MOG Utilizzando TEV proteasi (opzionale)

NOTA: Questa operazione facoltativa continua a partire dalla fine del punto 4. Se è necessaria MOG 1-125 senza sequenze di tag in più, le sequenze di tag possono essere rimossi con TEV proteasi (Figura 4). Per quanto a nostra conoscenza, non c'è nessun altro sistema di espressione in grado di generare puro MOG 1-125. Tuttavia, va notato che senza il tag tioredossina, MOG 1-125 è altamente insolubile e questo può causare problemi durante la purificazione e la manipolazione, e per questo rimuovere il tag se assolutamente necessario per motivi sperimentali. Sono necessari diversi passaggi per generare puro MOG 1-125. Tag MOG viene prima dializzata in TEV buffer di proteasi scissione. Dopo digestione con proteasi TEV, il volume viene ridotto per aiutare con la purificazione dopo steps, poi dializzati in tampone B, e poi il His-tag contenenti sequenza di tag viene rimosso con resina nichel. Infine, la proteina viene quantificata e pura MOG 1-125 viene concentrata a concentrazione finale.

  1. Rendere 1 L di 10x tampone di scissione TEV (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) aggiungendo 1.861 g di EDTA, 44,4 g Tris-HCl, e 26,5 g Tris a 2 L becher. Aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 990 ml quindi regolare il pH a 8 per sciogliere l'EDTA. Trasferire la soluzione ad un 1 L cilindro graduato e portare il volume fino a 1 L con H 2 O.
  2. Diluire proteine tag MOG dalla fase 3.6 a 0.5 mg / ml utilizzando tampone B (stesso tampone descritto al punto 3.1), in base alla quantità di proteine calcolato nella sezione 4. Trasferire 120 ml di proteina tag MOG diluito a snakeskin tubo di dialisi come descritto in passi 5.2 a 5.3. Il volume può essere scalata fino tuttavia la quantità di TEV proteasi richiesto per fendere tutte le proteine tag MOG sarà SOSTANZEntial.
  3. Seguire il protocollo di dialisi elencati al punto 5.5, ad eccezione di sostituire il tampone 10x di acetato con buffer di scissione 10x TEV fatto in fase 7.1.
  4. Trasferire il tag MOG, adesso TEV buffer di scissione, in un flacone di vetro da 250 ml e monitorare l'aumento del volume della dialisi. Aggiungere 1 ml di β-mercapto-etanolo per ogni 2,85 ml di MOG tag proteine aggiunte alla bottiglia. Aggiungere almeno 1 mg di TEV proteasi (soluzione TEV a 5 mg / ml) per ogni 50 mg di proteina tag MOG (TEV proteasi può essere aggiunto fino a 1:10 TEV: rapporto proteine MOG) ed incubare a temperatura ambiente, riparo dalla luce per almeno 72 ore.
    NOTA: Al termine dell'incubazione proteasi TEV, precipitati bianchi dovrebbero essere visti nella parte inferiore della bottiglia di vetro.
  5. Prima di trasferire la proteina tubo di dialisi, aggiungere guanidina-HCl alla soluzione fino a quando le proteine ​​sciogliere per impedire la proteina precipita di attaccarsi alla bottiglia di vetro. Trasferire 150 ml diquesta soluzione in una provetta da 1,5 ml ed etichetta tubo come "MOG con TEV". Conservare la soluzione a -20 ° C per future analisi SDS-PAGE.
  6. Trasferire tutto il fluido dal passaggio 7,5 nel tubo di dialisi come elencato in passi 5.2 a 5.3. Riempire un secchio con 2 L di H 2 O e porre il tubo di dialisi nel secchio. Incubare questo a 4 ° C con luce agitazione per una notte. Questo passaggio è importante per diluire la guanidina per consentire la concentrazione proteica avvenga rapidamente e di iniziare a rimuovere l'EDTA dalla soluzione che interferirà con la purificazione della proteina.
  7. Concentrare la proteina nel tubo di dialisi come elencato in passi 6.2 al 6.3 (tranne usare solo PEG 8000) tale che il volume finale della soluzione è ~ 40 ml. Lavare il tubo di dialisi con H 2 O e rimuovere qualsiasi residuo di PEG 8000 ancora attaccato al tubo. Questa riduzione del volume permette di montare tutte le proteine ​​digerito in una provetta da 50 ml contenente nichel reil peccato, come descritto al punto 3.5.
  8. Dializzare Protein digerito a tampone B:
    1. Riempire un grande secchio con 1 L di tampone B (29,22 g di NaCl, 3.152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole, 573,18 g di guanidina-HCl, pH 7,9).
    2. Posizionare le pelli di serpente contenenti proteine ​​digerite dal punto 7.7 nel secchio insieme con un magnete stir (come descritto in maggior dettaglio nel passo 5.5). Mettere il secchio in un 4 ° C stanza fredda su un piatto mescolare impostato scalpore lento e permettono le pelli di serpente per Dializzare per 5 o più ore.
    3. Svuotare il secchio e riempirlo con un altro 1 L di tampone B e lasciare che questo sedersi nella stanza fredda C 4 ° su un piatto mescolare impostato scalpore lenta e consentire le pelli di serpente per Dializzare per 5 o più ore.
  9. Eseguire purificazione della proteina 1-125 MOG come descritto nella sezione 3, con l'importante differenza che le sequenze di tag clivati saranno vincolati dalla resina al nichel, lasciando MOG 1-125 in soluzione. Anche in questo caso, 4 giri di purificazione sarannoeseguita nello stesso volume, ma in questo caso l'obiettivo è quello di migliorare la purezza, piuttosto che di recuperare il più possibile proteine. Vedere la Figura 4.
    1. Rendere i buffer di purificazione di proteine ​​di cui al punto 3.1
    2. Caricare entrambi i tubi di resina al nichel come descritto al punto 3.3.
    3. Purificare MOG 1-125 dal protocollo in dettaglio nel passo 3.5, con l'eccezione essenziale che l'eluato dalla resina di nichel contenente tag viene scartato (tenere 150 ml di eluato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per future analisi SDS-PAGE), mentre la soluzione contenente MOG 1-125 viene mantenuta come prodotto finale.
  10. Misurare la concentrazione di MOG 1-125 proteine come descritto nella Sezione 4:
    1. Impostare le diluizioni curva standard BSA come descritto ai punti 4.2 e 4.4.
    2. Impostare le diluizioni del MOG 1-125 come descritto ai punti 4.5 e 4.6. In alternativa, può essere utile per generare un intervallo maggioredi diluizioni (1x, 1/2, 1/4, e 1/8, per esempio). Regolare volumi di tampone acetato di 1x e MOG 1-125 conseguenza.
    3. Eseguire la Bradford test come descritto nei punti 4,7-4,9 e calcolare la quantità di MOG 1-125 generato. Il rendimento atteso è di circa 4 mg o più proteine.
  11. Ripiegare MOG 1-125 da un graduale rimozione di guanidina tramite dialisi, come descritto nella sezione 5.
  12. Concentrato MOG 1-125 proteine come descritto nel paragrafo 6. La concentrazione finale dovrebbe essere 2,24 mg / ml, che è equimolare di 5 mg tag / mL MOG.

8. SDS-PAGE gel di Conferma MOG tag Produzione e Purezza

NOTA: I campioni prelevati da piazza di 1.4, 2.1, 3.4, e 6.4 vengono analizzati dalla norma SDS-PAGE per confermare la produzione di tag MOG e purezza. Questa operazione deve essere eseguita dopo la purificazione finale di una tag MOG o MOG 1-125.

    <li> Fare una tampone di caricamento 2x SDS-PAGE aggiungendo 1,576 g di Tris-HCl a 2 ml di H 2 O e impostare il pH a 6,8. Aggiungere 0,4 g SDS nella soluzione Tris-HCl e quindi aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 7 ml.
  1. Aggiungere 0,2 g di blu di bromofenolo a 10 ml di H 2 O quindi aggiungere 1 ml di questa alla soluzione fatta nel passaggio 8.1. Infine, aggiungere 2 ml di glicerolo per finire il tampone di caricamento 2x SDS-PAGE. Quando si conserva questa soluzione, mantenere a 4 ° C e proteggerlo dalla luce per un massimo di 3 mesi.
  2. Scongelare le aliquote congelate di batteri dai passi 1.4 e 2.1, nonché il solubilizzato MOG tag proteina da passi 3.4 e 6.4 a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere i sali dalle soluzioni raccolti in passi 3.4 e 6.4 con l'aggiunta di 60 ml di ogni proteina alle colonne dissalazione. Purificare le proteine ​​seguenti istruzioni del produttore.
  4. Aggiungere 20 ml di β-mercapto-etanolo per 1 ml di soluzione fatta nel passaggio 8.2. Aggiungere 40 ml di questo ai due bacriale pellet dal punto 8.3 e 60 ml di proteine ​​dissalate dal punto 8.4 e incubare questi a 95 ° C per 10 min.
  5. Fare 1x tampone esecuzione pagina SDS pesando 5 g di Tris, 28,8 g glicina, e 1 g di SDS. Aggiungere questi ad un 1 L becher da 500 ml H 2 O per sciogliere tutto. Una volta disciolto, trasferire la soluzione in un 1 L cilindro graduato e riempire con H 2 O fino a quando il volume raggiunge 1 L.
  6. Impostare un gel di poliacrilammide al 12% in un apparato gel quindi aggiungere il tampone di corsa SDS-PAGE 1x all'apparato gel tale che il tampone di corsa è appena sopra la parte superiore dei pozzetti nel gel. Lavare i pozzetti del gel pipettando 50 ml di tampone di corsa nei pozzetti cinque volte ciascuno.
  7. Carico 10 ml di scala delle proteine ​​nel primo pozzo e aggiungere 10 ml di soluzioni bollito dal punto 8.5 pozzetti. Attivare il gel a 115 V per 60 min.
  8. Rimuovere il gel dall'apparecchio e trasferirlo ad un piccolo contenitore. Riempire la container con 100 ml di puro H 2 O e trasferire il contenitore per una piattaforma rotante lentamente per 8 min. Dopo l'8 min, scaricare l'acqua e lavare il gel altre due volte con H 2 O.
  9. Cassone H 2 O dal contenitore e aggiungere 100 ml di rapido reattivo macchia al contenitore. Lasciare questo a sedersi su una piattaforma rotante lentamente durante la notte, coprire con un foglio di alluminio.
  10. Dump il reagente macchia rapida e aggiungere circa 100 ml di H 2 O al contenitore. Lasciare questo a sedersi su una piattaforma rotante per 8 min. Cassone H 2 O e ripetere il lavaggio H 2 O due volte.
  11. Immagine il gel utilizzando un imager per le macchie blu Coomassie. Cercare una fascia intorno 31.86 kDa (proteina tag MOG) e una banda debole a 63.72 kDa (MOG tag dimeri).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dopo la purificazione è completo, i campioni raccolti in passi 1.4, 2.1, 3.4, e il prodotto finale dal punto 6.4 devono essere eseguiti su un gel proteico (Figura 3A). Tag MOG deve prima apparire come un kDa banda 31.86 nel campione T O / N, ma non t 0, e dovrebbe essere l'unica band nel prodotto puro finale. Per verificare se la proteina tag MOG ha correttamente piegato, la proteina tag MOG può essere usato per etichettare le cellule B specifiche MOG-proteine da FACS. Dai linfociti etichettatura del mouse con una diluizione 1: 1.000 del tag MOG con un anticorpo secondario diretto contro il His-tag e un anticorpo anti-IgG1 terziaria fluorescenza marcata, le cellule B MOG-specifiche possono essere identificati (Figura 3B). In alternativa, tag MOG può essere direttamente coniugato a fluorofori per ridurre la colorazione di fondo (derivanti da cellule B vincolanti per gli anticorpi secondari e terziari) comedescritto con riferimento 5 per identificare le cellule B specifiche per MOG. Ciò è necessario quando deve identificare cellule B MOG-binding in topi wild type, come queste cellule sono normalmente molto rare 5. Topi IgH MOG hanno un Knockin pesante catena che, se abbinato con una catena leggera kappa del caso, conferisce specificità per MOG. Come il legame di tag MOG è rafforzata tra le cellule IgH MOG B, ciò conferma che questo protocollo genera un antigene correttamente piegato. È importante sottolineare che le cellule IgH MOG B contribuiscono alla patologia autoimmune in modelli di MOG-diretto EAE 12, confermando che tag MOG induce sia T e autoimmunità delle cellule B.

Prima di iniziare la dialisi per ripiegare la proteina come descritto nel capitolo 5, è necessario misurare la concentrazione di proteine utilizzando un saggio Bradford, come descritto nella sezione 4. Risultati rappresentativi di un saggio Bradford sono mostrati nella Tabella 1 figura 5.

La generazione di pura MOG 1-125 viene ottenuto mediante l'aggiunta di TEV proteasi di proteine tag MOG che si traduce nella scissione della proteina tag MOG in MOG 1-125 e la sequenza tag come mostrato in Figura 6. Successivamente nickel purificazione resina rimuove MOG tag, sequenza di tag, e TEV impurità della proteasi che si traduce nella pura MOG 1-125 come mostrato in Figura 6.

Figura 1
Figura 1: MOG proteina tag (duplicato qui con il permesso di Dang et al 5..).. Struttura lineare, e aminoacidi e sequenze di DNA della proteina di fusione tag MOG. La sequenza di DNA per il dominio extracellulare di MOG mouse (MOG1-125, la sequenza più basso in blu) è stato codone-ottimizzato per l'espressione nei batteri (nero). Questa sequenza è stata sintetizzata e inserito in un vettore per creare una fusione N-terminale ad una tag contenente tioredossina e un S-Tag per contrastare l'insolubilità nota della proteina MOG 13,14, così come una sua 6x Tag per la purificazione 15. Un sito proteasi scissione TEV separa la MOG 1-125 dalle sequenze di tag. Scissione tra la glutammina-164 e glicina-165 TEV-mediata utilizzando un sito di scissione consenso TEV alternativa 16 risultati in rimozione di tutti gli aminoacidi non-MOG. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Panoramica delle fasi necessarie per la produzione di proteina pura tag MOG A.generare proteine tag MOG, batteri che esprimono la proteina tag MOG sono coltivate a densità elevate quindi indotti ad esprimere tag MOG con IPTG come elencato nel paragrafo 1. Dopo una cultura durante la notte, i batteri vengono lisati e attraverso una serie di passi pellet della frazione proteica contenente corpi inclusi, che contiene tag MOG, viene estratto come elencati nel paragrafo 2. tag MOG viene poi purificato dalla frazione proteica greggio attraverso quattro cicli di assorbimento Onto resina nichel carica e eluizione della proteina tag MOG come indicato nella sezione 3. Una porzione dell'eluato aggregati vengono poi preso per un saggio Bradford per determinare la resa di proteine tag MOG e il resto del eluato viene dializzata in tampone acetato nel corso di diversi giorni come elencati nelle sezioni 4 e 5. Infine, si concentra la proteina con PEG 3350 e PEG 8000 ad una concentrazione finale di 5 mg / ml in base al rendimento del tag MOG determinato Bsaggio Radford come elencati nel paragrafo 6. L'intero processo può richiedere un minimo di 10 giorni, con il giorno di inizio per ogni passo indicato tra parentesi. Tuttavia, fermata alternativa e punti di partenza sono elencati nel protocollo, e passaggi possono essere ripartiti su una maggiore quantità di tempo se lo si desidera. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Purificazione della proteina tag MOG e la valutazione della sua attività (A) visualizzati sono campioni di proteine che sono stati raccolti da diversi punti del procedimento di purificazione di proteine e si spostano su un gel SDS-PAGE. T = 0 BL21 batteri prima dell'induzione proteine (raccolte nella fase 1.4), T O / N = batteri BL21 post-induzione di espressione della proteina (raccolteal punto 2.1), tag greggio MOG = solubilizzato MOG proteine tag prima purificazione della proteina (raccolte nella fase 3.4), tag MOG Pure = MOG proteina tag dopo la purificazione (raccolte nella fase 6.4). (B) legame della proteina tag MOG al neg cellule B naive CD19 pos CD4 da linfonodi da entrambi wild type C57BL 6 topi o topi IgH MOG che esprimono una immunoglobulina catena pesante specifica per MOG proteine 7,17 / è stata valutata utilizzando la citometria a flusso . Le cellule B specifico d'tag MOG sono stati identificati mediante colorazione cellule dei linfonodi con tag MOG seguita da una contro-il suo anticorpo secondario tag e un anticorpo anti-IgG1 terziaria fluorescente. La colorazione di cellule provenienti da C57BL / 6 o IgH MOG topi è mostrato insieme ad una fluorescenza tag MOG meno uno (FMO) macchia di controllo delle cellule IgH MOG. Si prega di cleccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Panoramica dei passi per generare MOG 1-125 da proteine tag MOG. Dopo aver raccolto il tag eluato MOG come descritto al punto 3.5 del protocollo, la proteina tag MOG è dializzata in TEV buffer di proteasi scissione. Una volta che la dialisi è completa, TEV proteasi viene aggiunto alla soluzione tag MOG conseguente scissione del tag MOG nella proteina MOG 1-125. Il volume della soluzione scissione viene quindi ridotto e dializzata in tampone B prima della purificazione della proteina. Le impurità dalla soluzione scissione sono estratti attraverso quattro cicli successivi di assorbimento Onto resina nickel carica e eluizione delle impurità in modo da tradursi in una soluzione di puro MOG < sub> 1-125. La concentrazione della proteina 1-125 MOG è determinato tramite un saggio Bradford e la proteina è ripiegato nel corso di diversi giorni tramite dialisi. Una volta che la dialisi è completa, il 1-125 proteina MOG è concentrata a 2,24 mg / ml usando PEG 3350 e PEG 8000. Questo protocollo è discusso in dettaglio nella sezione 7. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Esempio di una curva standard saggio Bradford per determinare la concentrazione di tag MOG proteine. letture standard di BSA presi dalla Tabella 1 sono state tracciate per ottenere una formula di regressione lineare per calcolare la concentrazione tag MOG base alla densità ottica a 595 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. TEV scissione di proteine tag MOG e successiva purificazione di MOG 1-125 visualizzati sono campioni di proteine eseguiti su un SDS-PAGE gel dimostrando purificazione del MOG 1-125 tag MOG Pure = proteine tag MOG prima TEV scissione (raccolte. al punto 6.4), MOG tag w TEV = frazione / proteine che è stato raccolto dopo 72 ore di incubazione di tag MOG con TEV proteasi (raccolte nella fase 7.5), eluizione = frazione proteica che è rimasto legato alla resina di nichel durante la MOG 1- 125 protocollo di purificazione (raccolte nella fase 7.9), MOG puro 1-125 = MOG1-125 proteine dopo la purificazione (raccolti nel passo 7.12). Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

BSA (mg / ml) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1.079 0,998 0,948 0,853 0,769 0,699 0,583 0.493 0,373
1.071 1.014 0.95 0,854 0,777 0,681 0,579 0,484 0.375
1.069 1.017 0,944 0,848 0,781 0,592 0,494 0,374
Tag di diluizione MOG 1 1/5 1/25
1.327 1.013 0.493
1.332 1.063 0,491
1.367 1.088 0,488

Tabella 1: Valori rappresentativi da un saggio Bradford per determinare la concentrazione di proteine tag MOG BSA diluizione.zioni a concentrazioni note vengono utilizzate per determinare la curva standard mostrato in figura 5. Le diluizioni di MOG purificazione postale proteina tag vengono utilizzati per determinare la concentrazione finale di proteine tag MOG. Righe contengono la densità ottica misurata a 595nm e ciascuna riga rappresenta una replica di un totale di 3 repliche per ogni concentrazione indicata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui, abbiamo descritto un protocollo per la produzione di MOG etichetta proteica e come generare puro MOG 1-125 dalla proteina tag MOG. Questo protocollo si basa sia sulla base metodi di purificazione delle proteine standard di His-tag, così come un protocollo precedentemente descritto per la generazione di una proteina MOG-based anziani 15. Anche se non è qui descritta, l'utilizzo primaria della proteina tag MOG è indurre EAE attraverso l'immunizzazione con l'antigene proteico. Un protocollo che descrive come EAE è indotta in topi, che è compatibile con la proteina tag MOG, può essere trovato in riferimento 3. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'immunizzazione con tag MOG o MOG 1-125 derivato da tag MOG non solo induce la malattia autoimmune del sistema nervoso centrale con una maggiore infiammazione del midollo spinale e demielinizzazione rispetto al MOG 35-55 peptide standard, ma anche che le cellule patogene IgH MOG B thaT riconoscono la proteina MOG sono attivati per produrre una risposta centro germinale in risposta a tag MOG o MOG 1-125, ma non per Mog 35-55 5. Pertanto, l'immunizzazione con tag MOG effettivamente indurre una risposta delle cellule B anti-MOG appropriata.

MOG proteina tag viene purificata attraverso l'assorbimento su resina nichel carica (tramite il His-tag) e eluizione. A causa della grande quantità di proteine ​​generato nei passaggi precedenti, più cicli di assorbimento e eluizione devono raccogliere maggior parte della proteina. Abbiamo trovato che almeno 4 giri sono necessarie per isolare la maggioranza delle proteine ​​se si utilizza un volume adeguato di resina per provette da 50 ml. Se desiderato, il protocollo potrebbe essere scalato per utilizzare più o grandi tubi ecc resina nichel per ridurre il numero di giri di assorbimento. In alternativa, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con colonne di nichel può purificare efficacemente i suoi-targhette proteine 18 </ sup> e in effetti abbiamo trovato che HPLC può purificare efficacemente proteine tag MOG (osservazioni non pubblicate). Come HPLC non è accessibile a molti laboratori immunologia standard, il protocollo elencati qui è stato progettato per essere eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio comune. Oltre alla purificazione His-tag, la proteina tag MOG contiene un S-tag che è compatibile con i protocolli di purificazione S-tag se si preferisce 14.

Proteine ricombinanti a base di MOG (per lo più umano o ratto) sono state descritte in precedenza 8. Questi erano basate su sistemi di espressione più anziani che sono stati nel frattempo sostituito da sistemi guidati da promotori di trascrizione più forti in grado di produrre grandi quantità di proteina in Escherichia coli. Il nostro sistema di MOG tag espressione utilizza l'efficiente promotore T7 nel vettore PET-32a (+), che è molto più efficiente rispetto ai sistemi disponibili per la produzione in-house di MOG proteine 19. Tuttavia, should osservato che la proteina tag MOG qui descritto si basa su MOG mouse. L'immunizzazione con la proteina MOG umano è stato dimostrato di indurre EAE nei topi che ha caratteristiche diverse rispetto alla malattia indotta utilizzando murino MOG 8. Inoltre, ratto MOG può essere più immunogeniche rispetto MOG topo in topi in alcuni casi 20. Pertanto, per alcuni tag MOG-mouse basato scopi sperimentali non può essere l'ideale. Siamo nel processo di generazione di molti differenti versioni della proteina tag MOG che può soddisfare alcuni scopi meglio, e il protocollo di purificazione descritto qui lavoreremo per tutti questi. Nel frattempo, è possibile che il protocollo di purificazione qui descritto può funzionare per altri sistemi di espressione MOG, o anche altre proteine, purché incorporano una 6x sua Tag per l'assorbimento di resina nichel. Tuttavia, senza il cartellino tioredossina, solubilità delle proteine ​​MOG a concentrazioni più elevate può essere un problema, e, naturalmente, non sarà possibile ge nerate puro MOG 1-125 come questo è unico per il sistema di tag MOG.

Misurare la concentrazione proteica tag MOG prima ripiegamento proteico mediante dialisi è essenziale per il successo di questo protocollo di purificazione. Se la concentrazione è troppo elevata, la proteina può aggregare e cadere dalla soluzione invece di piegare in singole proteine. Questo può essere visto durante il protocollo di dialisi bianco precipitato formano nella parte inferiore del tubo di dialisi. Se questo si verifica, sciogliere la proteina tag MOG nuovo con 6 M guanidina e misurare la concentrazione di proteine. Diluire la proteina a 0,5 mg / ml poi ricominciare dialisi non precipitati dovrebbero costituire a 0.5 mg / ml. Per MOG 1-125, precipitati possono essere tenuti a formare la proteina è altamente insolubile. Abbiamo trovato che questo non influenzerà la piegatura del MOG 1-125 condizione che la proteina è stata adeguatamente diluito prima dialisi.

nt "> Per la proteasi TEV per fendere efficacemente la proteina tag MOG in pura MOG 1-125 è importante utilizzare una quantità sufficiente di TEV proteasi. Le vecchie versioni di proteasi TEV vengono inattivati attraverso l'auto-scissione 21 versioni comunque più moderni soffrono insolubilità emette 22 quindi è importante aggiungere abbastanza proteasi TEV per ottenere sufficienti scissione della proteina tag MOG prima TEV proteasi inattivazione. Dal momento disponibile in commercio TEV proteasi può essere costoso, si consiglia di producendo e purificante proteasi TEV, come descritto nel riferimento 22. Quando si usa puro topo MOG 1-125 proteine per gli esperimenti, è importante notare che la proteina è altamente insolubile e può precipitare dalla soluzione, e quindi deve essere miscelato ampiamente prima dell'uso.

In sintesi, qui abbiamo descritto un protocollo semplice per produrre e purificare grandi quantità di proteine tag MOG. Furthermminerale, l'aggiunta di un sito di scissione della proteasi TEV alla nostra proteine tag MOG offre la possibilità di generare puro MOG 1-125 se necessario. MOG proteina tag viene riconosciuto e vincolato da cellule B autoimmuni anti-mielina e tag MOG indotta EAE incorpora B cellulo-mediata patologia 5. Pertanto, la proteina tag MOG supera i principali ostacoli che limitano l'uso diffuso di antigene proteico per indurre EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics