Metod för Direct segment Intra-lever Delivery hjälp av en råttlever hilar Clamp Modell

Medicine
 

Summary

En unik råttlever hilar klämma modell utvecklades för att studera effekterna av farmakologiska molekyler vid lindring av ischemi-reperfusionsskada. Denna modell inkluderar direkt kanylering av portalen tillförseln till ischemisk leversegmentet via en gren av portalvenen, vilket möjliggör direkt leverleverans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Mumtaz, K., Hayes Jr., D., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model. J. Vis. Exp. (122), e54729, doi:10.3791/54729 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Större hepatisk kirurgi med inflödes ocklusion, och levertransplantation, nödvändiggör en period av varm ischemi, och en period av reperfusion leder till ischemi / reperfusion (I / R) skada med otaliga negativa konsekvenser. Potential l / R skada i marginella organ avsedda för levertransplantation bidrar till den nuvarande donatorbrist sekundärt till en minskad organutnyttjandegrad. En betydande behov föreligger att undersöka lever I / R skada i syfte att förmedla dess inverkan på transplantatfunktion vid transplantation. Råttlever hilar kläm modeller används för att undersöka effekterna av olika molekyler på hepatisk l / R skada. Beroende på modell, har dessa molekyler levererats med användning av inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injektion, intravenös administrering eller injektion in i den perifera mesenterica superior ven. En råttlever hilar klämmodell har utvecklats för att användas för att studera effekterna av farmakologiska molekyler i lindring I / R-skada. den described modell för råttlever hilar klämman inkluderar direkt kanylering av portalen tillförseln till ischemisk lever segmentet via en sidogren av portvenen, vilket möjliggör direkt segmentell leverleverans. Vår strategi är att framkalla ischemi i vänstra sido och median lober i 60 minuter, under vilken tid ämnet som studeras infunderas. I detta fall, pegylerat superoxiddismutas (PEG-SOD), en fri radikal-elimineringsmedel, infunderas direkt in i ischemisk segmentet. Denna serie experiment visar att infusion av PEG-SOD är skyddande mot hepatisk l / R skada. Fördelarna med detta tillvägagångssätt innefattar direkt injektion av molekylen till den ischemiska segment med åtföljande minskning av distributionsvolymen och minskning av systemiska biverkningar.

Introduction

Större hepatisk kirurgi med inflödes ocklusion, och levertransplantation, nödvändiggör en period av varm ischemi, och en period av reperfusion leder till ischemi / reperfusion (I / R) skada 1. Konsekvenserna av l / R skada i levern har varit detaljerade utför 1, 2, 3. Konsekvenserna av I / R-skada i detalj i litteraturen innefattar: generering av reaktiva syretyper, initiering av den inflammatoriska kaskaden inklusive aktivering av neutrofiler, Kupffer-celler och endotelceller, aktivering av heme oxygenas systemet och aktivering av toll-liknande receptorer, en obalans mellan endotelin och kväveoxid, aktivering av nukleär faktor-kB, och främjande av proinflammatorisk cytokin och adhesionsmolekyl syntes 1, 2, 3. Dessa proinflammatoriska händelser kan lead till apoptos, nekros, organdysfunktion och slutligen organsvikt 3.

I / R-skada i organ avsedda för levertransplantation kan leda till tidig förlust transplantat och bidrar till den nuvarande donatorbrist som marginella organ är mer mottagliga för skada 3. Det finns för närvarande 15,226 potentiella mottagare på väntelista för levertransplantation i USA fyra och bara 5950 levertransplantationer utfördes 2015 5. På grund av denna extrema begränsning i tillgången på organ, forskning undersöker lever I / R skada behövs för att optimera transplantat funktion och organ utnyttjande.

Djurmodeller används för att studera lever l / R skada inkluderar rått hilar klämmodeller och råttlever transplantationsmodeller. Det finns en mängd olika råtta hilar klämmodeller för närvarande är i bruk. Det vanligaste är ett där portådern, leverartären och galla duct föra de vänstra laterala och median loberna kläms med hjälp av mikrokirurgiska klämmor 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 30 till 60 min 6, 7, 10, 13, 14, och sedan en period av reperfusion från 60 min till 24 h 7, 9, 10, 13, är 14 tillåtet. De vänstra laterala och median lober av råttlever innefattar ca 70% av den hepatiska parenkym 9. Vissa protokoll är utformade för att studera ischemisk prekonditionering inkluderar intermittent fastspänning av hilar kärleneller den bakre-lemmen före en längre period av ischemi inducerad genom fastklämning av hilar kärlen 9, 13. Det finns också flera modifieringar som beskrivs i litteraturen. Den första är att klämma portvenen och arteria hepatica föra de vänstra laterala och median lober, men exkluderar gallgången 15. En andra modifikation är att inducera total leverischemi genom att klämma portvenen, leverartären och gallgång före deras division 16, 17, 18, 19, 20. En tredje modifiering inkluderar klämning av de hilar fartyg till höger lob under 30 till 60 min 8. En ytterligare modifiering innebär att klämma den vaskulära bunt i en bakbenet för att framkalla skador i levern 13, 21 Figur 1A-D.

Råttlever hilar kläm modeller har använts för att studera effekterna av olika molekyler och föreningar på hepatisk l / R. Beroende på den modell som användes dessa molekyler har levererats med hjälp av inhalering 11, epidural infusion 12, intraperitoneal injektion 17, 18, 21, 22, intravenös administrering 10, 14, 15, 19, 23, 24 eller injektion in i den perifera mesenterica superior ven 8 .

Modellen för råttlever hilar klämma beskrivs i denna rapport includes direkt kanylering av portalen tillförseln till den ischemiska segmentet via en sidogren av portvenen (Figur 2), som möjliggör direkt segmentell hepatisk tillförsel av den farmakologiska substansen som studeras. Vårt tillvägagångssätt är att inducera ischemi i de vänstra laterala och median lober för 60 min, under vilken tid en infusion av substansen som studeras, i detta fall, pegylerat superoxiddismutas, en fri radikal-elimineringsmedel 25, infunderas direkt in i ischemisk segmentet . Blodprover tas före induktion av ischemi och vid 120 min efter reperfusion. Vid denna punkt, är råttan offras och prover tas från vänster, och median lober. Dessutom tas prover från höger lob för att tjäna som en intern kontroll.

Det finns många fördelar med detta tillvägagångssätt. Först och främst, när den farmakologiska substansen som studeras kan direkt injiceras i ischemiska segment volym of fördelningen är ganska låg i jämförelse med volymen av fördelningen av injektion i den systemiska cirkulationen eller den peritoneala håligheten. Dessutom denna metod minskar, men inte eliminera, risken för systemiska biverkningar.

Protocol

Alla förfaranden utfördes enligt riktlinjerna i Institutional Animal Care och National Research Council Handbok för human vård och användning av försöksdjur (IACUC) och har genomgått godkännande av Ohio State University IACUC kommitté.

1. Första Set-up

  1. Ställt upp det kirurgiska mikroskopet och operationssalen (figur 3, figur 4). Slå på all utrustning, inklusive det för att upprätthålla anestesi och övervakning vitala. Slå på elektro enheten och värmedyna. Placera infusionspump nära operationsbordet.
    1. Upprätta 10 ml av flytande isofluran för inhalation (molekylvikt 184,5) i anestesi spruta och placera den i anestesienheten.
    2. Ställa upp en 200 ml behållare med flytande kväve nära operationsbordet och en annan nära centrifugen där blodprov kommer att bearbetas.
    3. Position de kirurgiska instrument, 4-0 och 7-0 flätad silkessutur, sterila bomullspinnar, 4x4 ovävda svampar, 5 ml sprutor, och 27 gauge insulinsprutor nära operationsbordet.
  2. Förbereda isofluran kammaren och säkerställa att tillräcklig isofluran instilleras i anestesiinduktion leveranssystemet.

2. Induktion av Anestesi

  1. Före hantering råttan ut på följande personlig skyddsutrustning (PPE): kirurgisk mask, operationshandskar och engångs klänning.
  2. Väg råttan och notera vikten.
    OBS: Sprague Dawley bör användas.
  3. Placera råttan i anestesi kammaren och slå på isofluran och syre. Inducera anestesi med användning av isofluran kammaren.
  4. Klipp djurets abdominala hår med användning av en elektrisk hårklippare att möjliggöra renare exponering (figur 5).
  5. Placera djuret tillbaka i isofluran kammare för en Additional en minut. Utför en tå nypa att kontrollera anestesidjupet.

3. Förfarande

  1. Placera råttan med djurets nos i noskonen och fyra extremiteterna immobiliserade med begränsningar eller tejp på uppvärmningen pad.
  2. Fortsätta anestesi med användning av anestesi leveranssystemet, noskonen och isofluran med anestesi vid 3,6% för djur som vägde mellan 200 och 250 g och 4% för djur som väger mer än 250 g. Bekräfta djupet av anestesi genom att utföra en tå nypa och en hud nypa.
  3. Göra en mittlinje buksnitt från pubis till xifoid genom huden med hjälp av vass sax (Figur 6).
  4. Gör ett snitt i bukhinnan längs linea alba från pubis till xiphoid och ange buken noga med att inte skada blåsan eller tarmen. Eftersom levern pinnar även till bukhinnan framåt nära xiphoid processen, se till att den släpper före incising bukväggen i denna area.
  5. Gör en tvärgående snitt genom huden och bukhinnan i nivå med den nedre kanten av den högra loben av levern.
  6. Vrid anestesi ner till 1,6% för djur som vägde mellan 200 och 250 g och 2% för djur som väger mer än 250 g.
  7. Dra tillbaka xiphoid process med användning av en krökt mygga klämma.
  8. Plats ribb sårhakar drar ribborna så långt från varandra som möjligt från mittlinjen (Figur 7). Skär falciform, phrenic och gastric ligament. Vänd levern upp med fuktad sterila bomullspinnar.
  9. Skär ytterligare ligament som behövs för att få tillgång till porta. Utföra visceral rotation med saltlösning fuktad gasväv (Figur 7).
  10. Avlägsna lös bindväv som ligger över portalen hilum använder skarp eller trubbig dissektion. Avlägsna lös bindväv som ligger över längden på portådern.
  11. Använd pincett för att driva igenom den lösa bind tFrågan bakre till vänster portådern, artär och gallgången göra ett fönster och placera 4-0 Potts sutur men inte cinch ner (Figur 8).
  12. Rensa bort lös bindväv som ligger över den bakre grenen till portalen ven som kommer in på ungefär samma nivå som den högra njuren. Detta ven kommer att användas för kanyle.
  13. Rita 0,5 ml av blod ut ur den nedre vena cava (IVC) med en insulinspruta (Figur 9). Placera 0,5 ml av blod i en liten flaska, centrifugera vid 135 xg under 12 min. Försök att dra bort serum.
    1. Om en distinkt linje inte kan uppskattas mellan röda blodkroppar och serum, försök att centrifugera under ytterligare med 2 - 3 min vid 135 x g. Rita av serum och lägg i en ampull för alanin-aminotransferas (ALT). Snap frysa detta prov genom att placera det direkt i flytande kväve.
  14. Klipp två bitar av 7-0 sutur och plats nära venen som kommer att användas för kanyltion. Placera första 7-0 slinga runt denna anda så långt medial som möjligt. Knyta denna slinga och använda den för att dra tillbaka med hjälp av en krökt mygga klämma (fig 10). Placera en andra 7-0 slinga på venen som kommer att användas för kanyle nära dess skärning med portådern och placera en slips, men inte cinch ner.
  15. Förbereda infusionspump med en 5 ml spruta med 3 ml av reagens. Prime slangen.
  16. Kläm distal portal ven med hjälp av en mikroklämma.
    OBS: Detta kommer att minska blödning när venen snittas för kanyle.
  17. Skära ett 0,5 mm hål i venen i mellan 7-0 vistelse suturen och dess skärning med den portala venen med hjälp av små mikrokirurgiska saxar. Använda 27-0 kateter för att kanylera vänster portalen venösa systemet (Figur 11, Figur 12). Sätt katetern förbi förgreningen av den vänstra och högra portal ådror.
  18. Kontrollera placering av kanylen genom Infusing 1 ml normal saltlösning och titta på för de vänstra laterala och median lober av levern att blekna. bekräfta manuellt att katetern är förbi take-off av den högra portalen ven, men inte längre än starten av portalen ven mata median lob.
  19. Cinch ner Potts sutur och börja ischemi tiden. Dra 7-0 sutur runt ven och 27-0 kateter för att hålla den på plats och ta bort klämman från den distala portvenen.
  20. Starta infusionen av polyetylenglykol-superoxiddismutas (PEG-SOD, 0.00067 g / ml) med användning av infusionspumpen. Starta infusion så nära som möjligt till början av den ischemiska tiden.

4. Övervakning

  1. Fortsätta att övervaka djurets vitala hela infusionen. Leverera 2 ml av 0,9% normal saltlösning eller 2 ml av PEG-SOD (0.00067 g / ml) upplöst i 0,9% normal saltlösning under en period av 15 min.

5. Reperfusion

  1. Låt en timme att gå från början av ischemic tid. Detta är ett-h varm ischemi tid.
  2. Avlägsna Potts sutur. Avlägsna 27-0 kateter. Cinch ner 7-0 sutur runt venen. Notera tiden. Detta markerar tiden för reperfusion.

6. Fortsatt Provtagning

  1. Rita 0,5 ml av blod ut ur IVC vid 120 min efter reperfusion. Rita blodet långsamt för att undvika lysering av röda blodkroppar. Sakta droppa blod i en flaska. Säkerställa att blödning från IVC styrs efter varje bloddragningen.
    1. Om det fortsätter att blöda tryck lätt med en steril bomullspinne eller en liten 1 cm x 1 cm sektion skurna ur gasväv.
  2. Centrifugera vid 135 xg under 12 min. Om tillräcklig separationen inte erhålls, prova ytterligare med 2 - 3 min vid 135 x g.
  3. Placera hälften av serum i en flaska för senare bearbetning för ALT. Snap frysa dessa prover.

7. Eutanasi

  1. Medan råttan är fortfarande under narkos klippa IVC och superior vena cava (SVC) och övervaka tills blodflödet, andning och hjärtslag upphör.
  2. Incisionsfilm membranet och utföra en kort hepatektomi genom öppning membranet i en cirkel och skärande ytterligare bindväv som förblir ansluter levern till peritonealhålan. Ta levern från bukhålan.
  3. Ta fyra prover från vänster, och median lober i levern och fyra prover från höger lob i levern. Proverna ska vara så stor som möjligt och deras storlek kommer att begränsas endast av mängden tillgängligt levervävnad. Placera dessa i små, märkta ampuller, och snäpp frysning i flytande kväve. Använda dessa för senare bearbetning för vävnads adenosintrifosfat (ADP), malondialdehyd (MDA) och glutation (GSH).

8. Post-experiment Analys

  1. Bestämma glutation (GSH), malondialdehyd (MDA) och alaninaminotransferas (ALT) aktiviteter i levervävnad och serumprover med användning av diagnostiska kitenligt tillverkarens anvisningar.
  2. Homogenisera levervävnad med lysbuffert och kvantifiera med användning av en Bradford-analys. Analysera vävnads lysat genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektrofores och immunoblot med användning av antikroppar mot klyvda Capase-3 och aktin. Kvantifiera western blöts utförda med allmänt tillgänglig programvara.

Representative Results

Detta experiment genomfördes med 2 grupper av n = 3 råttor vardera. Tre råttlevrar injicerades med 2 ml normal saltlösning (NS) med infusionspump under en period av 15 min. Tre råttlevrar injicerades med 2 ml normal saltlösning (NS) blandat med pegylerat superoxiddismutas (PEG-SOD, 0.00067 g / ml) med infusionspump under en period av 15 min. Såsom beskrivits i protokollet ovan, togs blodprover före hilar klämma och vid 120-min efter reperfusion. Dessutom, efter fullbordan av 120-min av reperfusion fyra levervävnadsprover togs från den vänstra och median lober och fyra leverprover togs från den högra loben av råttlever.

Serum alaninaminotransferas (ALT) mättes före hilar klämma och vid 120-min efter reperfusion i kontroll (NS) och experimentell (PEG-SOD) djur. Det fanns en signifikant skillnad mellan ALT kontrollnivån (NS)djur förväg hilar kläm och vid 120-min post-reperfusion. Det fanns en signifikant skillnad mellan ALT nivå av kontroll (NS) och försöksdjur (PEG-SOD) vid 120-min (Figur 13A). Vävnads malonaldehyd (MDA) mättes för kontroll (NS) och experimentell (PEG-SOD) djur i både höger och vänster lober i levern. Vävnad MDA i höger lob (icke-hilar klämma) med kontrollinjektion (NS) och experimentell injektion (PEG-SOD) visar ingen signifikant skillnad. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) vävnad MDA med kontrollinjektion (NS) är signifikant annorlunda än högra loben (icke-hilar klämma) p <0,001. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) har signifikant olika nivåer av vävnad MDA med kontrollinjektion (NS) kontra experimentella injektion (PEG-SOD) p <0,005 (figur 13B). Vävnads glutation (GSH) mättes och vävnads glutation i höger lob (icke-hilar klämma) med kontrollinjektion (NS) ennd experimentell injektion (PEG-SOD) visar ingen signifikant skillnad. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) vävnad GSH med kontrollinjektion (NS) är signifikant annorlunda än högra loben (icke-hilar klämma) med kontrollinjektion (NS) p <0,05. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) har signifikant olika nivåer av vävnads glutation med kontrollinjektion (NS) kontra experimentella injektion (PEG-SOD) p <0,005 (figur 13C). Western-blot utfördes jämförelse av högra och vänstra loben av kontrolldjur och visar ökat klyvs kaspas-3 i den vänstra loben efter hilar klämma och reperfusion (Figur 13D). En andra western blöt utfördes jämföra de vänstra loberna hos djur behandlade med kontroll och med PEG-SOD (fig 13E). Detta visar minskade kluvna kaspas-3 i levervävnad hos djur som behandlats med PEG-SOD. Densitometri utfördes också demonstting att nivån av klyvs kaspas-3 i levervävnad är signifikant förhöjd i vänster kontra höger lob av kontrolldjur (Figur 13F). I jämförelse av den vänstra loben levervävnad hos försöksdjur, infunderas med PEG-SOD, och vänstra loben levervävnad hos kontrolldjur, infunderas med normal saltlösning, demonstrerar densitometri minskade signifikant klyvda kaspas-3 i djur behandlade med PEG-SOD i jämförelse med djur behandlades med kontroll (figur 13G).

Figur 1
Figur 1: Anatomiska Illustrationer. A. Anatomisk illustration av råttlever. B. Anatomical illustration av råttlever. Portalen BLOMSTJÄLK till vänster och median lober i levern är fastklämd. Vänster och median lober är ischemisk. C. Anatomiskaillustration av råttlever. Portalen BLOMSTJÄLK till vänster lob är fastklämd. Den vänstra lob är ischemisk. D. Anatomisk illustration av råttlever. Portalen BLOMSTJÄLK till höger lob kläms och den högra lob är ischemisk.

figur 2
Figur 2: Anatomiska Illustrationer. Anatomical illustration av råttlever med portalvenen kanyler via en sidogren. Portalen pedicle till de vänstra och median lober i levern är omgiven av en sutur och en mikrokärls klämma har använts för att dra åt runt kärlknippet. Vänster och median lober är ischemisk.

figur 3
Figur 3: Instrument Set-up. Denna figur visar th e instrument set-up.

figur 4
Figur 4: Operating Room Set-up. Denna siffra visar operationssalen set-up. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Beskärnings av Abdominal Hair. Denna siffra visar trimning av buken hår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

belastning / 54729 / 54729fig6.jpg"/>
Figur 6: Immobilisering och hudsnitt. Denna siffra visar immobilisering av råtta och snittet huden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7: Rib Retractor Placering och Urtagning. Denna siffra visar ribb upprullningsdon placering och urtagning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8: Place ning av Suture. Denna siffra visar placeringen av suturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 9
Figur 9: Blod Draw från den nedre Vena Cava. Denna siffra visar bloddragning från nedre vena cava. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 10
Figur 10: Vein Branch bundna av och dras tillbaka. Denna siffra visar ven gren bundna av och dras tillbaka. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 11
Figur 11: Process av Kanyle. Denna figur visar processen för kanylering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 12
Figur 12: Kanyle. Denna siffra visar kanyle. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

innehåll" fo: keep-together.within-page = "1"> figur 13
Figur 13: Representativa resultat: Direkt Segmentell Intrahepatisk Leverans av pegylerat-superoxiddismutas med hjälp av en råtta hilar Clamp Modell. NS = normal saltlösning. PEG-SOD = pegylerat superoxiddismutas, ALT = alaninaminotransferas, MDA = malondialdehyd. A. Serum alaninaminotransferas (ALT, mU / ml) jämfördes mellan pre-hilar klämma och 120-min efter reperfusion. Det finns en signifikant skillnad mellan kontroll (NS) för-hilar klämma och kontroll (NS) vid 120-min efter reperfusion (p <0,001). Det finns också en signifikant skillnad mellan kontroll (NS) och experimentella grupper (PEG-SOD) vid 120-min efter reperfusion (p <0,05). En t-test användes. Felstaplar representerar standardavvikelse. B. Vävnads malondialdehyd i höger lob (icke-hilar klämma) med kontrollinjektion (NS) end experimentell injektion (PEG-SOD) visar ingen signifikant skillnad. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) vävnad malondialdehyd med kontrollinjektion (NS) är signifikant annorlunda än högra loben (icke-hilar klämma) p <0,001. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) har signifikant olika nivåer av vävnads malonaldehyd med kontrollinjektion (NS) kontra experimentella injektion (PEG-SOD) p <0,005. En t-test användes. Felstaplar representerar standardavvikelse. C. Vävnads glutation i höger lob (icke-hilar klämma) med kontrollinjektion (NS) och experimentell injektion (PEG-SOD) visar ingen signifikant skillnad. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) vävnad glutation med kontrollinjektion (NS) är signifikant annorlunda än högra loben (icke-hilar klämma) med kontrollinjektion (NS) p <0,05. Vänster lob (post-hilar klämma och reperfusion) har signifikant olika nivåer av vävnads glutation med styr injection (NS) kontra experimentella injektion (PEG-SOD) p <0,005. En t-test användes. Felstaplar representerar standardavvikelse. D. Western blöt som demonstrerar ökad kluvna kaspas-3 i levervävnad av den vänstra loben (post-hilar klämma och reperfusion) mot den högra loben (icke-hilar klämman) av kontrolldjur (Normal Saline). E. Western blöt demonstrera minskade kluvna kaspas-3 i levervävnad hos djur som behandlats med PEG-SOD i jämförelse med djur som behandlats med kontroll (normal saltlösning). F. Nivå kluvna kaspas-3 i levervävnad är signifikant ökad i post-hilar kläm och reperfusion djur (p <0,05). En t-test användes. Felstaplar representerar standardavvikelse. G. Vid jämförelse vänstra loben levervävnad hos försöksdjur (infunderas med PEG-SOD) och vänster lob levervävnad hos kontrolldjur (infunderas med normal saltlösning), det är signifikant minskat kluvna kaspas-3 i enDJUR behandlade med PEG-SOD i jämförelse med djur som behandlats med kontroll (normal saltlösning). En t-test användes. Felstaplar representerar standardavvikelse.

Discussion

Denna serie av experiment visade att injektion av PEG-SOD i vänster och median lober ledde till signifikanta minskningar i frisättning av ALT, lipidperoxidation av cellmembran (MDA), och underhåll av glutation (GSH) i jämförelse med kontroller (normal saltlösning ). Levervävnadsnaser inklusive alaninaminotransferas (ALT) är etablerade markörer för hepatocellulär skada. Minskningen i ALT när den vänstra loben injiceras med PEG-SOD antyder en skyddande effekt av PEG-SOD. Ökad vävnad MDA indikerar ökad lipidperoxidation och anses vara en markör för oxidativ stress och vävnadsskada. Överproduktion av reaktiva syreradikaler orsakar en ökning i produktionen av MDA 26. Den betydande minskningen i vävnad MDA i djurets vänstra och median lober när de injiceras med PEG-SOD visar en skyddande effekt av PEG-SOD. Detta överensstämmer med den aktuella förståelsen att PEG-SOD skyddar cellerna från skadororsakas av partiellt reducerade reaktiva syrespecies 27. Dessutom, i närvaro av reaktiva syrespecies, är glutationdisulfid reduceras till glutation (GSH) 28. Upprätthållande i GSH i de vänstra och median lober i levern injicerades med PEG-SOD förstärker ytterligare den skyddande effekten av PEG-SOD. Dessutom det visas att det finns en ökad kluvna kaspas-3, en produkt av apoptos, i vävnad exponerad för ischemi-reperfusionsskada. Minskningen i kluvna kaspas-3 i den vänstra loben vid behandling med PEG-SOD antyder att PEG-SOD leder till en minskning i apoptos.

Superoxiddismutas (SOD) är en kritisk enzym i avgiftning av reaktiva syrespecies. Enzymet katalyserar omvandlingen av två superoxidanjoner till väteperoxid och vatten. Enzymet katalas omvandlar sedan väteperoxid till vatten och syre, slutför processen 25. Halveringstiden förnativt SOD begränsat dess användning i experimentella modeller fram till utvecklingen av konjugerad polyetylenglykol-superoxiddismutas (PEG-SOD). Konjugering av SOD till polyetylenglykol ökar dess halveringstid från 6 min till 14 h. Nguyen et al. visat sin förmåga att lindra lipidperoxidation i leverischemi i en råttmodell, med användning av systemisk avgivning 29.

Det finns en mängd potentiella modifieringar av tekniken beskrivs här och en del har tidigare beskrivits i litteraturen. Beroende på vilken modell som används molekylerna har levererats med hjälp av inhalering 11, epidural infusion 12, intraperitoneal injektion 17, 18, 21, 22, intravenös administrering 10, 14, 15 19, 23, 24 eller injektion in i den perifera mesenterica superior ven 8.

Det finns flera viktiga steg i detta protokoll. Det viktigaste är kanyle av portalen ven. Man måste vara försiktig att hålet skär i venen inte är för stor. Vävnaden är mycket elastisk och hålet kommer att förstora på egen hand. Vi rekommenderar att du börjar genom att skära ett hål som är 0,5 mm med mikro sax. Kanylen kan matas genom hålet med användning av ett instrument, som möjliggör större smidighet än om försöker utföra denna del av förfarandet för hand. Dessutom, medan en början matar kanylen, det bör riktas direkt mot förgreningen av den vänstra och högra portal vener för att undvika att peta ett hål genom den bakre väggen i venen. När kanylspetsen når bifurkationen, kan det sedan matas in i den vänstra ven specifikaalliera. Snart kanylen matas in i den vänstra portvenen, som levererar både vänster och median lober, kan dess position bekräftas manuellt genom att känna det inuti venen. Dess läge kan även bekräftas genom att injicera en liten mängd kall saltlösning och ser blanche effekt på den medföljande segmenten i levern.

Levern hilar klämma modell i råtta åstadkommer en reproducerbar och stabil plattform för att demonstrera hepatisk ischemisk-reperfusionsskada. Variabla hilar kläm modeller har använts av forskare för att studera de skyddande effekterna av anti-oxidanter och andra små molekyler 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Platser av variation inkluderar vilka fartyg är klämman ed, vilket segment är gjorda ischemisk, huruvida eller inte gallgången ingår och längden av perioden för reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Dessutom, är också när denna modell används för att studera effekterna av administrering av en molekyl administreringsväg heterogena 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, Det finns flera fördelar med att den beskrivna metoden. Först direkt kanylering av portalen tillförseln till den ischemiska segmentet möjliggör direkt segmentell hepatisk tillförsel av 24. den farmakologiska substansen som studeras. Detta möjliggör utnyttjande av de andra loberna i levern som en inre kontroll. för det andra, möjliggör segmentell leverkanylering för en reducerad volym av distribution i molekylen som studeras. Detta tillvägagångssätt minskar därigenom risken för systemiska biverkningar som ämnet injiceras direkt i levern segment av intresse. direkt kanyle av lever segment möjliggör för ämnet som ska levereras före ischemi, Intra-ischemi eller efter ischemi. Detta gör det möjligt för studier av molekylens effekt vid någon punkt i ischemi-reperfusionsskada cykel. Med ökad längd av ischemisk tid och ökad nivå av skada ytterligare en möjlighet att studera leverregenerering skulle vara tillgängliga.

Det finns också vissa begränsningar med denna metod. Den första är startkostnad. Köpet av ett kirurgiskt mikroskop kan vara en betydande uppstartskostnader för ett labb som inte redan har ett. Denna teknik kan vara svårt eller omöjligt utan ett mikroskop. Den andra är att lära kurva tid. Även om detta förfarande är relativt enkelt det kräver lite övning och det är troligt att en nybörjare kommer att kräva ett stort antal förfaranden för att bli en expert.

Sammanfattningsvis möjliggör en reproducerbar, enkel och kostnadseffektiv plattform för att studera lever ischemi-reperfusionsskada denna modell. Även om i det protokoll som beskrivs här polyeten glycol-superoxiddismutas, en fri radikal-elimineringsmedel 25, infuserades, kunde denna modell användas för att infundera ett flertal olika farmakologiska ämnen för att utvärdera deras effekter på l / R skada i levern.

Disclosures

Alla författare rapporterar att de inte har några upplysningar.

Acknowledgments

Vi vill tacka för Dennis Mathias för hans belysande arbete. Detta arbete stöddes av NIH T32AI 106704-01A1 och T. Flesch fonden för organtransplantation, Perfusion, Engineering and Regeneration vid Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley Rat  Harlan Sprague Dawley Inc.  200- 250 grams 
Surgical Microscope  Leica  M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5  Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe   Valco Instruments Co, Inc.  SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan  MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific  HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific  SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific  PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber  Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen  Praxair 98015
27-0 Micro-Cannula Braintree Scientific  MC-28
Rib retractors  Kent Scientific  INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) Sigma Aldrich  S9549 SIGMA
GenieTouch Kent Scientific
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges  Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5 mL Syringe BD  REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical  REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific  1418-7410
Microsurgical Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Scissors  Roboz  RS-5610
Large Scissors S&T  SAA-15
Forceps - Large Angled S&T  JFCL-7
Forceps - Small Angled  S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip  S&T  FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Other Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Mosquito Clamps Generic 
Analysis 
Name Company  Catalog Number Comments
Alannine aminotransferase (ALT) assay  Biovision K752-100
Malondialdehye (MDA) assay  Abcam  ab118970
Glutathione (GSH) assay Cayman Chemical 7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin  Cell Signaling Tecnology Antibody 9661
ImageJ Software  National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer  Millipore 10-188

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
  2. Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
  3. Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
  4. OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  5. OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  6. Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
  7. Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
  8. Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
  9. Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
  10. Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
  11. Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
  12. Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
  13. Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
  14. Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
  15. Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
  16. Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
  17. Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
  18. Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. 601-607 (2015).
  19. Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. 3196431 (2016).
  20. Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
  21. Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. (2015).
  22. Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
  23. Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
  24. Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
  25. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
  26. Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
  27. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
  28. Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
  29. Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics