सापेक्ष कोशिका की सतह और संयोजक आयन चैनलों के कुल अभिव्यक्ति से फ्लो का उपयोग का निर्धारण

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Biology

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Summary

विरासत में मिला कार्डियक arrhythmias अक्सर परिवर्तन है कि एक या एक से अधिक आयन चैनल की सतह वितरण में परिवर्तन के कारण होता है। यहाँ, हम टीएसए-201 कोशिकाओं में व्यक्त पुनः संयोजक आयन चैनल के सापेक्ष कुल और कोशिका की सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक मात्रा का ठहराव प्रदान करने के लिए assays के प्रवाह cytometry लिए अनुकूल है।

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Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

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Abstract

Introduction

इस पत्र में इस तरह के मौजूदा प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी का उपयोग कर पुनः संयोजक कोशिकाओं में व्यक्त आयन चैनल के रूप में झिल्ली प्रोटीन के रिश्तेदार कोशिका की सतह अभिव्यक्ति रिपोर्ट करने के लिए एक विश्वसनीय परख प्रदान करता है। आयन चैनलों ताकना के गठन झिल्ली प्रोटीन है कि कोशिका झिल्ली भर आयनों के प्रवाह gating द्वारा विद्युत संकेतों को नियंत्रित करने के लिए जिम्मेदार हैं। वे सक्रियण तंत्र, प्रकृति, और ध्यान में लीन होना है, जहां वे स्थानीय कर रहे हैं के माध्यम से गुजर आयन प्रजातियों के चयनात्मकता द्वारा वर्गीकृत कर रहे हैं। सेलुलर और ऊतक के स्तर पर, आयन चैनलों के माध्यम से स्थूल आयन अपशिष्टों biophysical (gating और पारगमन), जैव रासायनिक (फोस्फोराइलेशन), और जीवजनन (संश्लेषण, ग्लाइकोसिलेशन, तस्करी, और गिरावट) गुण 1 के उत्पाद हैं। इन प्रक्रियाओं में से प्रत्येक के आयन चैनल के हर प्रकार के लिए अद्वितीय है और आयन चैनल के शारीरिक भूमिका को पूरा करने के लिए अनुकूलित है। नतीजतन, एक के माध्यम से इन ठीक-देखते प्रक्रियाओं में से किसी में परिवर्तनविरासत में मिला है या एक आनुवंशिक संशोधन, अक्सर "channelopathy" के रूप में भेजा, सेल homeostasis के लिए हानिकारक हो सकता है। यह तनाव है कि कोशिका की सतह पर आयन चैनल के "सही" राशि पहुंचाने सेल homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है महत्वपूर्ण है। यहां तक ​​कि छोटे बढ़ जाती है (लाभ के समारोह) और छोटे कम हो जाती है (हानि के समारोह) आयन चैनल गतिविधि में एक जीवनकाल में एक गंभीर विकृति पैदा करने की क्षमता है। परिपक्व आयन चैनल की कोशिका की सतह वितरण में दोष ऐसे सिस्टिक फाइब्रोसिस (CFTR आयन चैनल) 2 और लंबे क्यूटी सिंड्रोम फॉर्म (हृदय पोटेशियम चैनल) 3 के कार्डियक arrhythmias के रूप में कई channelopathies, में एक महत्वपूर्ण निर्धारक है।

Channelopathies हृदय अचानक मौत 4 के साथ जुड़े रहे हैं। सभी हृदय channelopathies की वर्तमान दुनिया भर में प्रसार कम से कम 1 माना जाता है: 2,000-1: अलग-अलग 5 प्रति 3000 और अचानक arrhythmic हृदय की मौत सीए के बारे में आधे के लिए जिम्मेदार हैंसत्र 6। हृदय वोल्टेज gated sodium-, potassium- में शिथिलता, और कैल्शियम आयन चैनल चयनात्मक इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। एल प्रकार सीए वी 1.2 वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल सिंक्रनाइज़ हृदय की मांसपेशी संकुचन आरंभ करने के लिए आवश्यक है। हृदय एल प्रकार सीए वी 1.2 चैनल एक बहु सबयूनिट प्रोटीन सहायक सब यूनिटों 7-12 α2δ1 मुख्य ताकना बनाने सीए वी α1 सबयूनिट और सीए वी एस एस और सीए वी की रचना की जटिल है। ध्यान दें कि सहायक सब यूनिटों की पूर्ण पूरक प्लाज्मा झिल्ली में कार्यात्मक सीए वी 1.2 चैनलों और गतिशील बातचीत उत्पादन की आवश्यकता है इन सब यूनिटों के बीच 13 दिल के सामान्य बिजली समारोह का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं। सीए वी एसएस सीए वी की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति एक गैर सहसंयोजक nanomolar हाइड्रोफोबिक बातचीत 14 के माध्यम से 1.2 चैनलों को बढ़ावा देता है। सीए वी α2δ1 सबयूनिट वाई के सह अभिव्यक्तिवें सीए वी एस एस बाध्य सीए वी α1 शिखर वर्तमान अभिव्यक्ति (5 से 10 गुना करने के लिए) को बढ़ावा देने और अधिक नकारात्मक वोल्टेज पर चैनल सक्रियण को बढ़ावा देता है। लाभ के समारोह ताकना बनाने सबयूनिट सीए वी 1.2 लंबे क्यूटी सिंड्रोम 15 के तीन मुख्य यूनिटों एल प्रकार सीए वी 1.2 चैनल के गठन में बिंदु उत्परिवर्तन के एक मेजबान जबकि कहा जाता वेंट्रिकुलर अतालता के एक फार्म के साथ संबद्ध किया गया है का म्यूटेशन लघु क्यूटी सिंड्रोम प्रपत्र 16,17 के arrhythmias से पीड़ित विषयों में पहचान की गई है। आयन चैनलों झिल्ली प्रोटीन है कि एक जैव रासायनिक परिप्रेक्ष्य (प्रोटीन रसायन विज्ञान) से जांच की जा सकती है या electrophysiological उपकरण (वर्तमान पैदा मशीनों) और अक्सर इन पूरक दृष्टिकोण का उपयोग कर का उपयोग कर रहे हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, विशेष रूप से पूरे सेल पैच clamping में, एक उपयुक्त दृष्टिकोण आयन चैनल 15 के समारोह को स्पष्ट करने के लिए है लेकिन उनके biophysical में परिवर्तन से प्रोटीन की तस्करी में संशोधनों को हल नहीं कर सकतेगुण। प्रोटीन रसायन विज्ञान, हालांकि, कई बार उपयोग छोटे घुलनशील प्रोटीन के सापेक्ष बड़ी झिल्ली प्रोटीन की अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति के कारण सीमित है। मजबूत उच्च throughput प्रतिदीप्ति readout का उपयोग तरीकों आदेश विशेष आयन चैनल की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन के कारण प्रोटीन biogenesis में दोष को संबोधित करने में विकसित किए जाने की जरूरत है।

प्रवाह cytometry एक biophysical सेल गिनती, छंटाई, बायोमार्कर का पता लगाने, और प्रोटीन इंजीनियरिंग 18 में कार्यरत तकनीक है। जीवित कोशिकाओं या कणों का एक नमूना समाधान कोशिकामापी एक प्रवाह में इंजेक्ट किया जाता है, कोशिकाओं एक धारा है कि मशीन का पता लगाने प्रणाली (चित्रा 1) द्वारा जांच की जा सकती में आदेश दिए हैं। 1956 19 में उत्पादित साधन कोशिकामापी पहले प्रवाह केवल एक पैरामीटर का पता चला, लेकिन आधुनिक प्रवाह cytometers कई लेजर और प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों कि अधिक से अधिक 30 फ्लोरोसेंट मानकों को 20,21 का पता लगाने की अनुमति है।फिल्टर और दर्पण (उत्सर्जन प्रकाशिकी) एक इलेक्ट्रॉनिक नेटवर्क (photodiode और डिटेक्टरों) कि इसकी तीव्रता को आनुपातिक प्रकाश में परिवर्तित करने के लिए प्रकाश बिखराव या कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट प्रकाश प्रत्यक्ष। डिजिटल डेटा विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं और प्राथमिक उत्पादन एक डॉट साजिश 21 के रूप में प्रदर्शित किया जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रवाह की biophysical सिद्धांतों cytometry छँटाई एकल कक्षों म्यान तरल पदार्थ की एक धारा है जो उन्हें एक या एक से अधिक लेजर पूछताछ अंक के पार ले जाता है के भीतर उच्च दबाव के तहत एक नोजल के माध्यम से धकेल रहे हैं। प्रकाश किरण गुजर कोशिकाओं द्वारा हटाया हुआ है और आगे की दिशा (आगे तितर बितर, एफसीएस) में एकत्र प्रकाश एक photodiode है कि एक संकेत कोशिका के आकार के लिए आनुपातिक में प्रकाश धर्मान्तरित के लिए भेजा है। प्रकाश भी लेजर पथ के लिए एक 90 डिग्री के कोण पर एकत्र की है और डिटेक्टरों (भी बुलाया photomultipliers (पीएमटी)) के लिए भेजा है।यह प्रकाश dichroic दर्पण उस तरफ बिखराव के संकेत (एसएससी) है, जो कोशिकाओं के भीतर विघटन को दर्शाता है का पता लगाने की अनुमति, और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के माध्यम से कराई जाती है, तो उत्साहित fluorochromes सेल में मौजूद हैं। तीन डिटेक्टरों (हरे, पीले और लाल) विभिन्न fluorochromes के एक साथ पता लगाने के लिए अनुमति देता अलग तरंग दैर्ध्य bandpass फिल्टर के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। विभिन्न संकेतों एक बाहरी कंप्यूटर द्वारा डिजीटल और डेटा है कि कोशिकाओं की विशेषताओं यों तो विश्लेषण किया जाएगा में परिवर्तित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रवाह cytometers के उच्च throughput क्षमता पुनः संयोजक जंगली प्रकार और तस्करी की कमी वोल्टेज gated एल प्रकार सीए वी 1.2 चैनलों और जीवित कोशिकाओं में जुड़े सब यूनिटों के रिश्तेदार झिल्ली अभिव्यक्ति यों तो शोषण किया गया था। सीडीएनए सह constructsप्रोटीन के लिए डिंग दोगुना एक साथ एक बाह्य गैर फ्लोरोसेंट मिलान कि एक अभेद्य फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी और एक intracellular fluorophore कि अनिवार्यता से फ्लोरोसेंट है से पता लगाया जा सकता है ले जाने के लिए टैग किया गया। दोनों बाह्य मिलान, प्रोटीन की एक बाह्य पाश में डाला, और intracellular fluorophore, सी टर्मिनस के बाद डाला, प्रोटीन के साथ अनुवाद कर रहे हैं। प्रयोगों की इस श्रृंखला में, सीए वी α2δ1 प्रोटीन एक बाह्य hemagglutinin (हेक्टेयर) मिलान (YPYDVPDYA) एक अभेद्य FITC (Fluorescein आइसोथियोसाइनेट) द्वारा पता लगाया व्यक्त करने के लिए इंजीनियर था आंतरिक intracellular fluorophore के रूप में विरोधी हा और mCherry संयुग्मित। MCherry-सीए वी α2δ1 हा टैग प्रोटीन के रिश्तेदार कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए, पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद काटा गया, और FITC संयुग्मित माउस मोनोक्लोनल विरोधी हा मिलान टैग antibod के साथ दागवाई (चित्रा 2)। FITC एक कार्बनिक यौगिक है कि फ्लोरोसेंट एंजाइम संवाददाताओं की तुलना में काफी छोटे रूप में जैविक समारोह के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना नहीं है और इसलिए है। mCherry- सीए वी α2δ1-हा-टीएसए 201cells में overexpressed, दो आयामी भूखंडों 22 पर FITC प्रतिदीप्ति और mCherry प्रतिदीप्ति में एक महत्वपूर्ण 3-लॉग वृद्धि पैदा करता है। कि हा मिलान प्रोटीन के बाह्य भाग में स्थित है को देखते हुए, FITC के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता बरकरार कोशिकाओं की उपस्थिति में प्राप्त हा टैग प्रोटीन की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के रिश्तेदार सूचकांक दर्शाते हैं। निर्माणों में हा मिलान की पहुंच व्यवस्थित सेल permeabilization के बाद FITC संकेत को मापने के द्वारा मान्य है। इस उपाय से भी सामान्यीकृत कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए कार्य करता है के बाद से FITC के लिए रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता permeabilized कोशिकाओं में अनुमानित गुणात्मक रिश्तेदार प्रतिदीप्ति मूल्यों के लिए करने के लिए तुलना कर रहे हैंआर mCherry permeabilized और गैर-permeabilized की स्थिति 22,23 के तहत मापा जाता है। यह ध्यान रखें कि आंतरिक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम permeabilization के बाद उच्च मूल्यों की ओर स्थानांतरित कर दिया है, लेकिन है कि केवल मूल्य सूचित किया जा रहा प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन नियंत्रण निर्माण की तुलना में महत्वपूर्ण है। परीक्षण निर्माणों के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में रिश्तेदार परिवर्तन ΔMean प्रतिदीप्ति तीव्रता (ΔMFI) प्रत्येक fluorophore (mCherry या FITC) के लिए मूल्यों का उपयोग कर रहे हैं अनुमान। प्रयोगों fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के आंतरिक प्रतिदीप्ति में प्रयोगात्मक रूपों को सीमित करने का नियंत्रण का निर्माण एक ही परिस्थितियों में व्यक्त की प्रतिदीप्ति तीव्रता के परीक्षण के निर्माण के रिश्तेदार की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए तैयार कर रहे हैं। दो झिल्ली प्रोटीन सफलतापूर्वक इस परख का उपयोग कर अध्ययन किया गया: एल प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल सीए वी 1.2 14,22 की और एक अलग श्रृंखला में ताकना बनाने सबयूनिटप्रयोगों, बाह्य सहायक सीए वी α2δ1 सबयूनिट 22,23। निम्नलिखित प्रोटोकॉल नियंत्रण की शर्तों के तहत और आयन चैनल के posttranslational संशोधन को प्रभावित करने म्यूटेशन के बाद 1.2 चैनल हृदय एल प्रकार सीए वी के वी सीए α2δ1 सबयूनिट की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मानकीकृत प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, FITC की कोशिका की सतह प्रतिदीप्ति mCherry-सीए वी α2δ1 हा प्रोटीन (चित्रा 5 संदर्भ 22 से) के लिए कोडिंग सीडीएनए की अभिव्यक्ति के साथ बढ़ जाती है अर्ध रैखिक।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry में कुल और झिल्ली लेबलिंग की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व योजना आवश्यक मुख्य कदम से कुछ फ्लोरिडा द्वारा पुनः संयोजक आयन चैनल के सापेक्ष कुल और कोशिका की सतह अभिव्यक्ति यों की रूपरेखाओउ cytometry। प्रकोष्ठों टीएसए-201 कोशिकाओं (1) में डबल टैग निर्माण mCherry-सीए वी α2δ1 हा के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और पहले या बाद permeabilization दाग रहे हैं (2)। Multiparameter डेटा एक प्रवाह में अर्जित कर रहे हैं कोशिकामापी (3) बहुभिन्नरूपी विश्लेषण के लिए (4)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Protocol

1. दोगुना गईं डीएनए निर्माणों

  1. साइट निर्देशित mutagenesis (चित्रा 3 बी), 20 से D676 और R677 के बीच सीए वी α2δ1 के बाह्य लिंकर में हा मिलान (YPYDVPDYA) डालें। आगे प्राइमर gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC का प्रयोग करें और प्राइमर acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC उल्टा।
  2. प्रोटीन SACI और साली साइटों (चित्रा 3 बी) के बीच 20 mCherry के एन टर्मिनस से जुड़े हुए व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया स्तनधारी pmCherry-एन 1 अभिव्यक्ति वेक्टर में टैग किए गए हा सीए वी α2δ1 की सीडीएनए अनुक्रम subclone।
    नोट: उपयुक्त चैनल समारोह नियंत्रण मानक electrophysiological तरीकों का उपयोग कर 24 निर्माण के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए।

2. Liposome की मध्यस्थता क्षणिक अभिकर्मक (30 मिनट, सभी कदम लामिना का प्रवाह हुड के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं)

  1. दिन 1: प्लेट टीएसए-201 कोशिकाओं (या HEKT) में से आधे से एक लाख2 Dulbecco के एमएल उच्च ग्लूकोज न्यूनतम आवश्यक मध्यम (DMEM-पारा) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी एस) संस्कृति के माध्यम के साथ पूरक के साथ 35 मिमी संस्कृति व्यंजन। एक मानक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। Trypan नीले रंग का उपयोग सेल नमूने के एक अंश से सेल व्यवहार्यता का आकलन करें। प्लेट पर्याप्त कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में 90% संगम तक पहुंचने के लिए।
  2. दिन 2: बिना पीएस ताजा पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें।
  3. प्रत्येक अभिकर्मक नमूना के लिए, दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार करते हैं। ट्यूब में 1, कम सीरम माध्यम के 250 μl में डीएनए के 4 माइक्रोग्राम पतला। ट्यूब में 2, 250 μl सीरम कम हो संस्कृति के माध्यम से liposome की मध्यस्थता अभिकर्मक अभिकर्मक के 10 μl मिश्रण। उपयोग करने से पहले धीरे अभिकर्मक अभिकर्मक मिक्स।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. ट्यूब 1 और 2 ट्यूब की सामग्री का मिश्रण है, धीरे मिश्रण और सेते कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट।
  6. liposomes जोड़ें / डी.एन.संवर्धित कोशिकाओं के लिए एक परिसरों और धीरे मिश्रण करने के लिए संस्कृति डिश रॉक।
  7. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

3. से फ्लो के लिए कोशिकाओं का धुंधला (3 घंटा)

  1. सेल के नमूने तैयारी
    1. दिन 3: संस्कृति पकवान से मध्यम ध्यान से निकालें और पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 0.05% trypsin 1x EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड) के 400 μl के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. Trypsin-EDTA के 400 μl जोड़ें और 5% सीओ 2 के वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते 5 मिनट कोशिकाओं पकवान से अलग करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    3. बिना पीएस ठंड संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइम पाचन बंद करो और धीरे pipetting 4-5 बार से सतह से सभी कोशिकाओं को बाहर धो लें। आवश्यकता से अधिक पाचन और अधिक pipetting कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए।
    4. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा और बर्फ पर तुरंत जगह है। बर्फ के ठंडे समाधान का प्रयोग करें और internalization को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखने केके एंटीजन सतह। प्रकाश घटाएँ फ्लोरोसेंट संकेत की photobleaching सीमा।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। ध्यान aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. पुनः निलंबित फॉस्फेट बफर खारा 1x के 1 मिलीलीटर में गोली (पीबीएस) एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करने के लिए।
    7. संक्षेप में बहुत धीरे ट्यूबों भंवर और दोहराने कदम 3.1.5 और 3.1.6 पूरी तरह से संस्कृति के माध्यम से दूर करने के लिए।
    8. 1x पीबीएस के 600 μl में गोली पुनः निलंबित और 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक न्यूनतम करने के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें।
    9. बाह्य और intracellular धुंधला के लिए दो नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को विभाजित करते हैं। गैर विशिष्ट धुंधला से विशिष्ट धुंधला भेदभाव करने के लिए उचित नियंत्रण शामिल हैं।
      ध्यान दें: निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी पृष्ठभूमि धुंधला के स्तर का आकलन करने में मदद करता है और आदर्श प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी जो यह प्रजाति, निर्धारण और fluorophore मेल खाना चाहिए। उसी में निर्धारण नियंत्रण और संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करेंप्रोटीन एकाग्रता।

तालिका एक
तालिका 1: प्रवाह cytometry के लिए प्रयोग नियंत्रण नमूने गैर permeabilized और permeabilized कोशिकाओं प्रत्येक प्रयोग निम्न नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने की जरूरत है:। (एंटीबॉडी के बिना, निर्धारण के साथ या संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ) (1) Nontransfected कोशिकाओं। (2) ब्याज की प्रोटीन विधान फ्लोरोसेंट intracellular fluorochrome बिना एक प्लाज्मिड में subcloned साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (pCMV- सीए वी α2δ1-हा) या दोगुना टैग निर्माण (pmCherry-सीए वी α2δ1 साथ और एंटीबॉडी के बिना incubated, निर्धारण के साथ या के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी)। एकल रंग नियंत्रण fluorochrome उत्सर्जन ओवरलैप के मुआवजे के लिए उपयोग किया जाता है। एक ही नियंत्रण गैर permeabilized के लिए चलाने के लिए और प्रयोगों के प्रत्येक श्रृंखला में स्थिति permeabilized रहे हैं।

  1. बरकरार की कोशिका की सतह धुंधलाजीवित कोशिकाओं
    1. अशेष 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 100 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में μl।
    2. 5 माइक्रोग्राम पर FITC संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी हा जोड़ें / मिलीग्राम और 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एक घुमाव मंच (200 आरपीएम) पर कोशिकाओं incubating से पहले भंवर।
      नोट: (चित्रा 4) प्रतिरक्षी के इष्टतम एकाग्रता प्रारंभिक अनुमापन प्रयोगों में निर्धारित किया गया था।
    3. अंधेरे से कोशिकाओं को हटाने और 1x पीबीएस / ट्यूब के 900 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर 1x पीबीएस, भंवर और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend।
    5. धोने (कदम 3.2.4) दोहराएँ दो बार किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने के लिए। एक unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है, तो उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
    6. अंतिम धोने के बाद, 1x पीबीएस के 500 μl में कोशिकाओं resuspend और 5 में एकल कक्ष निलंबन हस्तांतरण मिलीलीटर cytometry ट्यूबों के प्रवाह। सेल रखेंनमूना चल रहा है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में है।
    7. एक प्रवाह कोशिकामापी पर नमूने चलाएँ। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, जितनी जल्दी हो सके और कोई बाद के बाद 24 घंटे से प्रवाह पर कोशिकाओं का विश्लेषण।
  2. Intracellular धुंधला: फिक्सेशन, Permeabilization, और धुंधला
    1. अशेष 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 100 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर μl और सेंट्रीफ्यूज।
    2. शेयर से सीधे निर्धारण-permeabilization समाधान के 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागें।
    3. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं।
    4. हौसले से तैयार 1x permeabilization धोने बफर के 100 μl (आसुत एच 2 ओ में 10x permeabilization धोने बफर पतला) जोड़ें। भंवर और तलछट कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर एक मेज सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर।
    5. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. दोहराएँ 3.3.4 और 3.3.5 कदम।
    7. 5 में FITC संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी हा जोड़ेमाइक्रोग्राम / एमएल 1x permeabilization धोने बफर के 100 μl और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कोशिकाओं incubating से पहले भंवर में।
      नोट: intracellular धुंधला कोशिका की सतह धुंधला के लिए इस्तेमाल एक के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन किया जाता है। सैपोनिन की मध्यस्थता सेल permeabilization हालांकि, एक जल्दी से प्रतिवर्ती प्रक्रिया है, इसलिए यह 1x पेर्म / धो बफर के साथ 1x पीबीएस को बदलने के लिए intracellular धुंधला दौरान सैपोनिन की निरंतर उपस्थिति में कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    8. अंधेरे से कोशिकाओं को हटाने और 100 μl permeabilization धोने बफर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    9. महाप्राण ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर 100 μl permeabilization धोने बफर, भंवर और अपकेंद्रित्र में गोली resuspend।
    10. धोने (कदम 3.3.9) एक बार और दोहराएँ किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने के लिए।
    11. अंतिम धोने के बाद, 1x पीबीएस के 500 μl में कोशिकाओं resuspend और पाप का स्थानांतरणनलियों cytometry 5 एमएल प्रवाह करने के लिए gle सेल निलंबन। प्रवाह में नमूना इंजेक्शन लगाने के लिए जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कोशिकाओं रखें।
    12. एक प्रवाह कोशिकामापी पर नमूने चलाएँ। जितनी जल्दी हो सके, लेकिन बाद में कोई 1 सप्ताह से भी धुंधला के बाद कोशिकामापी पर तय नमूने चलाएँ। एक ही दिन में गैर permeabilized और permeabilized कोशिकाओं चलाएँ।

4. से फ्लो

  1. कोशिकामापी सेल सॉर्टर डेली सेटअप प्रवाह
    1. फ्लो का सॉफ्टवेयर चालू करें। प्रयोग इष्टतम साधन प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए जांचना और सेटअप सेल सॉर्टर प्रवाह करने से पहले साधन सेटअप मोतियों का उपयोग करके (यानी लेजर और प्रकाशिकी विनिर्देश को प्रदर्शन कर रहे हैं, लेजर और सेल प्रवाह ठीक से गठबंधन कर रहे हैं)।
    2. 20 साई म्यान दबाव के साथ 100 माइक्रोन नोक का प्रयोग करें।
      नोट: नोक नहीं है एक बेंच पर परिवर्तित करने की कोशिकामापी प्रवाह।
    3. विनिर्माण के अनुसार कोशिकामापी के प्रवाह की दर निर्धारितएर विनिर्देश। बेहद उच्च प्रवाह दरों प्रतिदीप्ति में बदलाव का पता लगाने में संवेदनशीलता कम हो जाएगा।
    4. और पीले, हरे लेजर (mCherry उत्तेजित करने के लिए 561 एनएम) (Fluorescein Isothiocayanate या FITC उत्तेजित करने के लिए 488 एनएम) नीले रंग का चयन करें। एक 530/30 एनएम के साथ और क्रमश: एक 610/20 एनएम bandpass फिल्टर के साथ FITC और mCherry प्रतिदीप्ति स्तरों लीजिए।
    5. आगे तितर बितर (एफसीएस) बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) रैखिक पैमाने का उपयोग बेदाग कोशिकाओं के लिए डॉट साजिश मोल। डॉट साजिश के निचले बाएँ चक्र में कोशिकाओं कल्पना करने के लिए प्रत्येक डिटेक्टर प्रवर्धन समायोजित करें।
  2. बरकरार गैर permeabilized कोशिकाओं का नमूना पढ़ना
    1. एक नि: शुल्क फार्म की रूपरेखा के आसपास की कोशिकाओं सेल मलबे और सेल समुच्चय को छोड़कर विश्लेषण किया है, इस प्रकार बरकरार कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति संकेत सीमित द्वारा लाइव गैर permeabilized कोशिकाओं के लिए P1gate सेट करें।
      नोट: लाइव / मृत बहिष्कार रंगों जीवित कोशिकाओं पर फाटक प्लेसमेंट की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रिकॉर्ड करने के लिए 10,000 घटनाओं सेटरोक गेट P1 में। घटनाओं की एक उच्च संख्या पर सेट अगर जरूरत हो।
    2. बनाम FITC दो पैरामीटर समोच्च साजिश mCherry मोल बेदाग कोशिकाओं के आधारभूत autofluorescence पता लगाने के लिए। द्वि-लघुगणक पैमाने का उपयोग नकारात्मक मूल्यों को दिखाने के और आबादी के बीच 25 संकल्प में सुधार करने के लिए। लॉग प्रतिदीप्ति तीव्रता भूखंडों के पहले दस इकाइयों के निचले भाग में बेदाग नकारात्मक कोशिकाओं सेट करने के लिए प्रत्येक डिटेक्टर वोल्टेज समायोजित करें।
    3. 4.1.5 और 4.1.6 में स्थापित सेटिंग्स का उपयोग कर सभी बरकरार गैर permeabilized नमूने मोल और प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों में एफएससी, एसएससी और संकेत इकट्ठा।
    4. निर्यात और सहेजें * .fcs फ़ाइलों विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. Permeabilized कोशिकाओं का नमूना पढ़ना
    1. permeabilized नमूनों में जीवित कोशिकाओं का चयन करें और के रूप में 4.1.5 और 4.1.6 में दिखाया गया FSC और एसएससी वोल्टेज समायोजित करने के लिए P1 गेट ले जाएँ।
    2. सभी permeabilized नमूने मोल और एफएससी, एसएससी एक इकट्ठाप्रतिदीप्ति डिटेक्टरों में एन डी का संकेत है।
    3. निर्यात और सहेजें * .fcs फ़ाइलों विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. डेटा विश्लेषण
    1. cytometry 4.2.4 और 4.3.3 में बचाया विश्लेषण सॉफ्टवेयर और आयात * .fcs फ़ाइलों प्रवाह लॉन्च।
    2. कार्यक्षेत्र विंडो में सूचीबद्ध पहला नमूना पर क्लिक करें। ट्यूब आईडी नंबर के नाम पर रखा एक नई विंडो स्वचालित रूप से खुलता है। एफएससी बनाम एसएससी की साजिश में gating प्रक्रिया शुरू करें। एक गेट (P1) जीवित कोशिकाओं के चारों ओर अंडाकार चिह्न का उपयोग ड्रा और किसी भी मलबे, मृत कोशिकाओं, या समुच्चय है जो अलग आगे तितर बितर और जीवित कोशिकाओं की तुलना में बिखराव की ओर है खत्म करने
    3. mCherry (शाफ़्ट) FITC (एक्स अक्ष) जीवित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम के दो पैरामीटर समोच्च साजिश आकर्षित करने के लिए, एक्स-अक्ष पर क्लिक करके FITC-एक चैनल को चुनते हैं और फिर y पर क्लिक करें धुरी और पीई-mCherry-एक चैनल चुनें। एक के किनारे पर चतुर्थ भाग मार्कर की स्थिति के लिए "ट्रैक्टर" आइकन पर क्लिक करेंप्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में utofluorescent कोशिकाओं।
      नोट: गेट FITC और mCherry पॉजिटिव कोशिकाओं के आसपास सेट p2 के द्वार है। प्रतिदीप्ति नकारात्मक सेल की आबादी पी 3 गेट के रूप में जाना जाता है। इस लेख में इस्तेमाल प्रतिनिधि gating विधि के लिए चित्रा 5 देखें।
    4. P2 और पी 3 फाटकों का चयन करें और मूल कार्यक्षेत्र विंडो में "सांख्यिकी जोड़ें" आइकन पर क्लिक करें। "गणना" (सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या) पर क्लिक करें और "मीन" (मतलब प्रतिदीप्ति प्रत्येक fluorochrome की तीव्रता) या "माध्य" (प्रत्येक fluorochrome के माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता) विकल्प की सूची में आँकड़ों पर क्लिक करें। फिर "सांख्यिकी जोड़े" आइकन पर क्लिक करें। इन सभी मूल्यों को स्वचालित रूप से मूल कार्यक्षेत्र खिड़की करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं।
      नोट: यदि प्रतिदीप्ति तीव्रता एक सामान्य वितरण इस प्रकार है "का मतलब" केवल प्रयोग किया जाता है। हर दूसरे मामले में, "माध्य" टैब पर क्लिक करें। एमएफआई इस प्रकार प्रतिदीप्ति Intensit मतलब का उल्लेख सकता हैवाई या माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता।
      ध्यान दें: अगले कदम कोशिकामापी द्वारा जांच की सभी नमूनों के लिए द्वार 'मापदंडों और सांख्यिकी लागू करने के लिए है।
    5. कार्यक्षेत्र विंडो में, खींचें और ड्रॉप फाटकों और आँकड़ों के मापदंडों पर लाइन सभी नमूनों में चिह्नित करने के लिए माउस का उपयोग करें।
    6. दो आयामी समोच्च भूखंडों (mCherry बनाम FITC) और histograms (सेल बनाम प्रतिदीप्ति तीव्रता गिनती) गैर permeabilized और permeabilized कोशिकाओं (- बी आंकड़े 6A) के लिए के एक बैच की रिपोर्ट उत्पन्न करता है।
    7. कदम 4.4.4 में उत्पन्न आँकड़ों से, दाग कोशिकाओं के लिए प्रत्येक fluorochrome के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) की गणना। इस मूल्य से, सतह और ब्याज की प्रोटीन की कुल अभिव्यक्ति यों तो बेदाग कोशिकाओं से प्राप्त एमएफआई मूल्य घटाना।
    8. प्रत्येक fluorophore (mCherry और FITC) (- डी चित्रा 6C) के लिए ΔMFI मूल्यों की रिपोर्ट। ΔMFI सीए के लिए मापा को सामान्य नोट: प्रतिदीप्ति तीव्रता के निरपेक्ष मूल्य तेजी से एंटीबॉडी और प्रत्येक प्रयोगशाला कार्यकर्ता की तकनीकी क्षमताओं के बैच के आधार पर इसलिए उत्परिवर्ती निर्माण गुम्मट निर्माण का उपयोग के प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करने की जरूरत भिन्न हो सकता है।

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Representative Results

यह लेख परख cytometry एक दो रंग प्रवाह से टीएसए-201cells में व्यक्त पुनः संयोजक आयन चैनल के कुल और कोशिका की सतह यों के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक उदाहरण के रूप में, रिश्तेदार कोशिका की सतह और कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति सीए वी α2δ1subunit के लिए मात्रा निर्धारित किया गया था। आदेश परख cytometry दो रंग प्रवाह करने के लिए, सीए वी α2δ1 दोगुना एक बाह्य गैर फ्लोरोसेंट मिलान हा कि एक एंटी-हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी और एक विधान फ्लोरोसेंट intracellular mCherry fluorophore से पता लगाया जा सकता है व्यक्त करने के लिए टैग किया गया। FITC और mCherry के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा चलता है कि FITC 488 एनएम लेजर द्वारा 88% दक्षता के साथ उत्साहित है लेकिन क्षमता 561 एनएम लेजर के साथ 0% तक कम हो जाती है। जब 561 एनएम लेजर लेकिन 488 एनएम लेजर के साथ केवल 7.6% (चित्रा 3) के साथ उत्साहित mCherry इसकी अधिकतम प्रतिदीप्ति की 63.9% से पता चलता। उत्तेजना और उत्सर्जन speCtra दोनों fluorophores के लिए अलग लेज़रों और चयनित फिल्टर के साथ इष्टतम प्रकाश संग्रह और कम से कम ओवरलैप दिखा रहे हैं। दिए गए fluorochrome के लिए एमएफआई के रूप में प्रवाह cytometry assays एक बड़ी सेल की आबादी से झिल्ली प्रोटीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है जब तक सीधे प्रोटीन के बजाय फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक कोशिका पर सीए वी α2δ1 की अभिव्यक्ति के लिए आनुपातिक है। यह संतृप्ति परे प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी की एकाग्रता का उपयोग शामिल है। विरोधी हा FITC संयुग्मित (चित्रा 4) एंटीबॉडी सीए वी α2δ1 करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमापन वक्र तीन चरणों से पता चलता है। कोई प्रतिदीप्ति पहले चरण में पाया गया था, वहीं प्रतिदीप्ति तीव्रता दूसरे चरण में एंटीबॉडी एकाग्रता में वृद्धि के साथ तेजी से वृद्धि हुई है। संतृप्ति (तीसरे चरण) के बिंदु के बाद, एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इरादे पर कोई प्रभाव नहीं हैचर्चाएं FITC की (RFI)। विरोधी हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी संतृप्ति बिंदु 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में स्थापित किया गया था, इस प्रकार यह सुनिश्चित करना कि संयुग्मित एंटीबॉडी की एकाग्रता प्रयोगों के दौरान एमएफआई सीमित नहीं है।

टैग किए गए सीए वी टीएसए-201cells में व्यक्त α2δ1was और फ्लो का assays गैर permeabilized कोशिकाओं (चित्रा 5) में FITC संयुग्मित विरोधी हा की उपस्थिति में किए गए। उचित नियंत्रण (तालिका 1) प्रवाह कोशिकामापी कि प्रत्येक कोशिका लेजर बीम से गुजर XY मूल्यों विशेषताओं पर विश्लेषण किया गया। सेल वितरण डॉट भूखंडों (चित्रा 5 ए) पर कल्पना की है। एफसीएस / एसएससी डॉट भूखंडों पुष्टि करते हैं कि सेल के नमूने की तैयारी उच्च व्यवहार्यता (चित्रा 5BA) के साथ एक एकल कक्ष निलंबन प्रदान करता है। जीवित कोशिकाओं (P1) के लिए चुने गए गेट का विश्लेषण किया कोशिकाओं की कुल संख्या का 75% का प्रतिनिधित्व करता है। कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति ओटीएसए-201 कोशिकाओं में च सीए वी α2δ1 mCherry प्रतिदीप्ति के लिए आनुपातिक माना जाता था। जैसा कि mCherry FITC बनाम समोच्च भूखंडों और histograms में देखा (चित्रा 5BB - ईसा पूर्व), 47 2% टीएसए-201 कोशिकाओं pmCherry-सीए वी α2δ1 हा के साथ ट्रांसफ़ेक्ट काफी mCherry प्रतिदीप्ति को व्यक्त करने के साथ ही कारण के लिए महत्वपूर्ण FITC प्रतिदीप्ति दिखा पाए गए गैर permeabilized कोशिकाओं में सीए वी α2δ1 के बाहरी हा टैग के लिए बाध्य। नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों एंटीबॉडी के बिना या निर्धारण के साथ किए गए संकेत मिलता है कि FITC सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को केवल या ज्यादातर बांधता है।

इस प्रोटोकॉल टीएसए-201cells 23 में सीए वी α2δ1 की कुल और कोशिका की सतह अभिव्यक्ति पर एन-ग्लाइकोसिलेशन की भूमिका को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रयोगों कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए गैर permeabilized कोशिकाओं में बाहर किए गएऔर permeabilized कोशिकाओं में कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति हा मिलान की पहुंच की पुष्टि के साथ ही मूल्यांकन करने के लिए। सीए वी α2δ1 के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के आधार पर गणना की गई एमएफआई प्रत्येक fluorophore (mCherry या FITC) के लिए अनुमान है। म्यूटेंट के लिए ΔMFI मूल्यों mCherry-सीए वी α2δ1 हा गुम्मट के लिए एक ही दिन में मापा अधिकतम मूल्य के लिए सामान्यीकृत थे ही परिस्थितियों में व्यक्त किया। यह विरोधी हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी का पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता में समय के साथ बदलाव के लिए खाते में करने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि चित्र में देखा 6A, गैर permeabilized कोशिकाओं में FITC के लिए ΔMFI मजबूत था और गुम्मट 4xNQ के लिए निर्माण लेकिन 16xNQ निर्माण के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर के करीब यह दर्शाता है कि प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली से लगभग अनुपस्थित है। Assays सेल permeabilization के बाद आयोजित किया, पता चला कि 16xNQ निर्माण के कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति भी काफी यह है कि क्या कम थाpermeabilized कोशिकाओं में या विधान mCherry प्रतिदीप्ति में गैर permeabilized मापा से और permeabilized कोशिकाओं में (- डी चित्रा 6C) FITC प्रतिदीप्ति से अनुमान लगाया गया था। जैसा कि चित्र 6B में देखा, सेलुलर autofluorescence स्तरों सेल permeabilization, जो बरकरार गैर permeabilized और permeabilized कोशिकाओं के बीच पूर्ण प्रतिदीप्ति मूल्यों की तुलना रोकता के बाद वृद्धि हुई है। ΔMFI प्रतिदीप्ति mCherry के लिए मापा दोनों गैर permeabilized और permeabilized वाचक कि permeabilization समाधान mCherry के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति संकेत में परिवर्तन नहीं करता कोशिकाओं के लिए इसी तरह की थी। एन ग्लाइकोसिलेशन साइटों के उत्परिवर्तन mCherry के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी प्रकाशित अवलोकन है कि प्रोटीन जीवजनन / स्थिरता 23 कम हो गया था के समर्थन के साथ जुड़े थे। प्रयोगों की इस श्रृंखला में, FITC के लिए रिश्तेदार प्रतिदीप्ति संकेत permeabilized कोशिकाओं में मापा निकला खई सुझाव है कि प्रोटीन के एन-प्रकार ग्लाइकोसिलेशन स्थिति प्रतिदीप्ति तीव्रता बाह्य डोमेन FITC संयुग्मित विरोधी हा एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया को प्रभावित कर सकता mCherry के लिए रिश्तेदार संकेत से भी छोटे। कुल मिलाकर पहले सेल permeabilization के बाद FITC के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति में परिवर्तन प्रोटीन अभिव्यक्ति यों के लिए एक विश्वसनीय मीट्रिक प्रदान करते हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3: FITC और mCherry दो रंग cytometry assays के लिए fluorochromes का एक उपयुक्त जोड़ी के रूप में उत्तेजना (खाली घटता) और FITC के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (भरा घटता) और 488 एनएम नीले लेजर (एए) के साथ उत्साहित mCherry साथ 561 एनएम पीले उत्साहित हैं। हरे रंग की लेजर (एबी)। FITC और mCherry प्रतिदीप्ति एक 530/30 एनएम और एक 610/20 एनएम bandpas साथ एकत्र किए गए थेएस क्रमश फिल्टर। अलग अलग लेजर (रंगीन खड़ी रेखा) और फिल्टर (रंग आयतों) की तरंग दैर्ध्य इष्टतम प्रकाश संग्रह और कम से कम ओवरलैप के लिए चुना जाता है। (बी) mCherry-सीए वी α2δ1 हा प्रोटीन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सीए वी α2δ1 दोगुना एक बाह्य गैर फ्लोरोसेंट मिलान हा कि एक एंटी-हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी और एक विधान फ्लोरोसेंट intracellular mCherry fluorochrome से पता लगाया जा सकता है व्यक्त करने के लिए टैग किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। विरोधी हा FITC संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीए वी α2δ1 के लिए बाध्य का अनुमापन टीएसए-201 कोशिकाओं क्षणिक pmCherry-सीए वी और साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे # 945; 2δ1-हा और विरोधी हा FITC संयुग्मित या निर्धारण एंटीबॉडी की एक सीमा के साथ incubated। केवल FITC संकेत इस पैनल में विश्लेषण किया जा रहा है। (ए) के एकल पैरामीटर histograms y अक्ष पर कोशिकाओं के रिश्तेदार संख्या और सांद्रता के विरोधी हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी रेंज (0.01-20 / एमएल माइक्रोग्राम) के लिए एक्स-अक्ष पर FITC प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित करते हैं। (बी) FITC की एमएफआई के एक समारोह के रूप में विरोधी हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए अर्द्ध लॉग ग्राफ। अनुमापन वक्र एक साइट एक ट्रेंडलाइन मूल्य आर 2 = 0.99561 के साथ समीकरण बाइंडिंग का उपयोग कर लगाया गया था। निर्धारण एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन किया अनुमापन की उम्मीद के रूप में कोई प्रतिदीप्ति दिखाया। 0.001 0.01 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से सांद्रता पृष्ठभूमि शोर से पृथक कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 "> चित्रा 5
चित्रा 5:। गैर permeabilized टीएसए-201cells pmCherry-सीए वी α2δ1-हा (ए) gating विश्लेषण नमूना प्रवाह cytometry में इस्तेमाल किया रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की cytometry विश्लेषण प्रतिनिधि प्रवाह। डेटा उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहण के बाद विश्लेषण किया गया। पहले gating रणनीति एक आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) एक गेट (P1) जीवित कोशिकाओं के आसपास प्रदर्शित करने और किसी भी मलबे, मृत कोशिकाओं, या समुच्चय है जो अलग आगे तितर बितर और जीवित कोशिकाओं की तुलना में बिखराव की ओर है समाप्त करने के लिए डॉट साजिश कारनामे । MCherry (शाफ़्ट) FITC बनाम (एक्स अक्ष) प्रतिदीप्ति तीव्रता के दो पैरामीटर समोच्च भूखंडों P1 आबादी के लिए प्रदर्शित किए गए। आयताकार फाटक कोशिकाओं के autofluorescence के किनारे पर रखा गया था सकारात्मक आबादी P2 (FITC और mCherry) और नकारात्मक जनसंख्या पी 3 का चयन करें। टी के लिए प्रतिदीप्ति का स्तरवह क्षेत्र के p2 के भीतर कोशिकाओं और पी 3 बाद सेल बनाम FITC या mCherry प्रतिदीप्ति तीव्रता एकल पैरामीटर histograms गिनती का उपयोग कर कल्पना थे। Y- और एक्स अक्ष पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक पारी में क्रमश: सीए वी α2δ1 की कुल झिल्ली और अभिव्यक्ति की एक विश्वसनीय सूचकांक प्रदान करता है। प्रतिदीप्ति संकेत की तीव्रता fluorochrome अणुओं की संख्या के एक समारोह के रूप में बढ़ जाती है। (बा) प्रतिनिधि एफसीएस / प्रत्येक शर्त के रूप में कहा गया है के लिए एसएससी डॉट भूखंडों। 10,000 घटनाओं की कुल विश्लेषण के लिए हासिल किया गया। अंडाकार गेट (P1) कम एफएससी (मृत कोशिकाओं) या उच्च एसएससी (समुच्चय) के साथ घटनाओं को छोड़कर जीवित कोशिकाओं के चारों ओर आँख द्वारा तैयार की है। (बी बी) प्रतिनिधि दो पैरामीटर समोच्च बनाम FITC (एक्स अक्ष) प्रतिदीप्ति तीव्रता। गेट्स mCherry (शाफ़्ट) के भूखंडों कोशिकाओं FITC-mCherry सकारात्मक कोशिकाओं की आबादी को अलग करने के autofluorescence के किनारे (p2 गेट पर रखा गया ) और नकारात्मक फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (पी 3)। (BC) एकल-देहातरिश्तेदार गिनती (या अधिकतम%) बनाम प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं (FITC या mCherry) के histograms rameter। प्रतिदीप्ति तीव्रता p2 के गेट (प्रतिदीप्ति पॉजिटिव कोशिकाओं) के भीतर कोशिकाओं के लिए मापा का वितरण भूरे रंग में दिखाया जाता है, और पी 3 गेट (प्रतिदीप्ति नकारात्मक कोशिकाओं) में मौजूद कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का वितरण एक में आच्छादन के रूप में प्रदर्शित किया जाता है पारदर्शी ग्रे साजिश है। के रूप में देखा, प्रतिदीप्ति तीव्रता मजबूत दोनों mCherry और FITC यह दर्शाता है कि सीए वी α2δ1 अच्छी तरह से व्यक्त किया है और कोशिका झिल्ली में स्पष्ट रूप से मौजूद है। था कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: एन -glycosylation साइटों का एक साथ म्यूटेशन बाधित कोशिका की सतह पूर्वसीए वी α2δ1 की अभिव्यक्ति। स्थिर टीएसए-201 सीए वी β3 कोशिकाओं क्षणिक pCMV-सीए वी 1.2 WT और pmCherry-सीए वी α2δ1 हा गुम्मट या म्यूटेंट के साथ एक साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। गैर-permeabilized (ए) और permeabilized कोशिकाओं (बी) के रूप में ऊपर वर्णित विरोधी हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। विरोधी हा FITC संयुग्मित एंटीबॉडी धुंधला (सही पैनल) के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के वितरण के mCherry बनाम FITC प्रतिदीप्ति (बाएं पैनल) और हिस्टोग्राम भूखंडों के प्रतिनिधि दो पैरामीटर समोच्च भूखंडों एन -glycosylation म्यूटेंट (NQ) के बाद लिए दिखाए जाते हैं चार साइटों के विघटन (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) और 16 साइटों (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / बरकरार गैर permeabilized या एनपी कोशिकाओं (ए) में और permeabilized या पी कोशिकाओं (बी) में N986Q)। distribप्रतिदीप्ति तीव्रता p2 के गेट (प्रतिदीप्ति पॉजिटिव कोशिकाओं) के भीतर कोशिकाओं के लिए मापा का संविधान भूरे रंग में दिखाया जाता है, और पी 3 गेट (प्रतिदीप्ति नकारात्मक कोशिकाओं) में मौजूद कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का वितरण एक पारदर्शी में आच्छादन के रूप में प्रदर्शित किया जाता है ग्रे साजिश है। (ख) में देखा, autofluorescence स्तरों सेल permeabilization के बाद वृद्धि हुई है। FITC के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ सब ट्रांसफ़ेक्ट permeabilized कोशिकाओं के लिए मापा (एक्स अक्ष पर एक सही बदलाव के रूप में देखा जाता है) यह दर्शाता है कि सभी ट्रांसफ़ेक्ट हा टैग सीए वी α2δ1 प्रोटीन दाग और विरोधी हा FITC एंटीबॉडी से पता चला रहे थे। (सी) बार ग्राफ सामान्यीकृत एमएफआई बरकरार गैर permeabilized (सतह अभिव्यक्ति) में FITC की उपस्थिति में मापा जाता है या permeabilized कोशिकाओं (कुल अभिव्यक्ति) से पता चलता है। रिश्तेदार प्रतिदीप्ति घनत्व हर हालत के लिए triplicates में मापा गया था (30,000 कोशिकाओं) और कोशिकाओं के तीन अलग-अलग बैचों में transfec1 महीने की अवधि में टेड इसलिए डेटा हर हालत के लिए 90,000 कोशिकाओं के लिए ± SEM के मतलब के रूप में दिखाया गया है। शिखर प्रतिदीप्ति तीव्रता अभिकर्मक के बाद 24 और 36 घंटा के बीच पहुँच गया था। FITC के लिए ΔMFI मूल्यों बरकरार गैर permeabilized कोशिकाओं में मापा सीए वी α2δ1-हा की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और FITC के लिए ΔMFI मूल्यों permeabilized कोशिकाओं में मापा कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति (कोशिका की सतह और intracellular प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रतिबिंबित )। FITC के लिए ΔMFI FITC सकारात्मक कोशिकाओं (P2) के प्रतिदीप्ति तीव्रता से FITC नकारात्मक कोशिकाओं (पी 3) के FITC प्रतिदीप्ति तीव्रता घटाकर द्वारा गणना की गई। एक ही विधि mCherry के लिए ΔMFI गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एमएफआई मूल्यों mCherry-सीए वी α2δ1 हा गुम्मट के लिए एक ही दिन में मापा अधिकतम मूल्य के लिए सामान्यीकृत थे। (डी) बार ग्राफ सामान्यीकृत ΔMFI mCherry गैर permeabilized या permeabilized कोशिकाओं (मुन्ना में मापा चलताअल अभिव्यक्ति)। परिणाम ± SEM मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रवाह cytometry आधारित परख सफलतापूर्वक वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल 14,22,26 के fluorescently लेबल ताकना बनाने और जुड़े सब यूनिटों के सापेक्ष कुल और कोशिका की सतह के स्तर की माप के लिए लागू किया गया था। यह सबसे अच्छा है जब आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जाता है और इस प्रकार fluorescently लेबल टैग की जंगली प्रकार के निर्माण के आंतरिक प्रतिदीप्ति तीव्रता कम से कम 10 fluorescently लेबल untagged निर्माण के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता से बड़ा 100 गुना हो कि आवश्यकता । इस विशेष उदाहरण में, mCherry-सीए वी α2δ1 हा निर्माण यहाँ बताया शोर अनुपात करने के लिए एक बड़ा संकेत है और क्या पहले प्रकाशित सीए वी 1.2-हा और सीए वी 2.3-हा निर्माणों के लिए मापा गया था की तुलना में एक बड़ा गतिशील रेंज झुकेंगे। इस के लिए कई बोधगम्य कारण हैं। यह अनुमान लगाया जा सकता है कि सीए V & बाह्य डोमेन हा मिलान के स्थानीय पर्यावरण# 945; 2δ1 प्रोटीन FITC संयुग्मित विरोधी हा एंटीबॉडी के शोर अनुपात करने के लिए संकेत अधिकतम हो।

इसके अलावा, यह ध्यान में रखना है कि इस विधि कोशिका की सतह पर प्रोटीन की संख्या में एक निरपेक्ष मूल्य प्रदान नहीं करता है महत्वपूर्ण है। टैग किए गए कार्यात्मक चैनल अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक निर्माण के रिश्तेदार अभिव्यक्ति पक्ष पैच दबाना से कंधा मिलाकर प्रदर्शन और एक ही परिस्थितियों में प्रयोगों प्रवाह cytometry के रूप में संदर्भ के 22 7 चित्र में दिखाया द्वारा फिर भी प्राप्त किया जा सकता है। इन आंकड़ों से यह अनुमान लगाया जा सकता है कि शिखर वर्तमान घनत्व, आयन चैनल गतिविधि का एक वैश्विक उपाय, आम तौर पर टैग कर सीए वी α2δ1 सबयूनिट की सतह अभिव्यक्ति का एक समारोह के रूप में बढ़ जाती है। इस वर्तमान कोशिका की सतह अभिव्यक्ति परख के प्रमुख सीमा बनी हुई है कि यह अंतर्जात आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए इस समय लागू नहीं किया जा सकता है। इस तथ्य के कारण है कि कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडीविशेष रूप से आयन चैनल की भविष्यवाणी की बाह्य डोमेन के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता है। इस प्रकार यह प्रोटीन का प्राथमिक अनुक्रम के आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए अध्ययन में इस तरह के टीएसए-201 कोशिकाओं के रूप में एक undifferentiated पुनः संयोजक सेल लाइन में व्यक्त किया जा आवश्यकता है।

परख के अनुकूलन में महत्वपूर्ण कदम: fluorophores की उचित जोड़ी की पहचान, बाहरी मिलान की पसंद है, और प्रविष्टि साइट के स्थानीयकरण इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि मिलान की प्रविष्टि के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए प्रोटीन समारोह। विभिन्न संयोजनों fluorophore परीक्षण किया गया। दो बाहरी epitopes: hemagglutinin (हेक्टेयर) मिलान (YPYDVPDYA) और bungarotoxin बाध्यकारी साइट मिलान (WRYYESSLEPYPD), 27 और तीन अभेद्य फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी का मूल्यांकन किया गया है, अर्थात् FITC (Fluorescein आइसोथियोसाइनेट) -, आर phycoerythrin -, और पीई Cy7- संयुग्मित-एंटीबॉडी। इसके अलावा, 10 से अधिक विभिन्न प्रविष्टिबाहरी हा मिलान के लिए साइटों सीए वी α2δ1 भीतर परीक्षण किया गया। मिलान की प्रविष्टि है कि साइट निर्देशित mutagenesis और पुनः संयोजक डीएनए तकनीक की आवश्यकता के संबंध में, यह एक ही क्षेत्र के भीतर प्राइमरों के तीन सेट की एक न्यूनतम डिजाइन करने के लिए सलाह दी है। 9 अवशेषों के साथ, हा मिलान छोटे epitopes जिसके लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी लेकिन 27 न्यूक्लियोटाइड डालने की सफलता की दर बिंदु उत्परिवर्तन के लिए की तुलना में कम है मौजूद है में से एक है। Tetracysteine रूपांकनों (अवशेषों Cys-Cys-प्रो-Gly-Cys-Cys) हा मिलान की तुलना में 2-अवशेषों छोटे लेकिन fluorescein संखिया बाल के लिये कांटा बांधने की मशीन झिल्ली permeant और झिल्ली बाध्य प्रोटीन 28 के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। प्रारंभिक प्रयोगों दो intracellular fluorophores mCherry और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ आयोजित किया गया। fluorophores जरूरतों का 1) उत्सर्जन स्पेक्ट्रा: तीन मानदंडों सफल आयन चैनल के साथ fluorophores की जोड़ी भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया गयाओवरलैप करने के लिए नहीं (विवरण के लिए संदर्भ 20,21 देखें); 2) टैग किए गए निर्माण की अभिव्यक्ति पुनः संयोजक कोशिकाओं के रूप में मानक electrophysiological तरीकों द्वारा मान्य में कार्यात्मक आयन चैनल उत्पन्न करता है; और 3) नियंत्रण निर्माण की अभिव्यक्ति के लिए एक मजबूत फ्लोरोसेंट readout पैदा करता है। यदि इन मानदंडों में से एक उदाहरण के लिए, पूरा नहीं किया जाता है, तो टैग या fluorophore की प्रविष्टि चैनल समारोह के साथ हस्तक्षेप, एक के बाद एक वर्ग को वापस जाने के लिए और या तो बाहरी मिलान और / या प्रविष्टि साइट की प्रविष्टि की साइट को संशोधित करने के लिए है fluorophore की। प्रोटीन के सी टर्मिनल और fluorophore के बीच 5 glutamine के अवशेषों की एक लिंकर प्रोटीन समारोह में सुधार करने में मदद कर सकता है। इसके अलावा, यह बड़े छोरों कि प्रोटीन समारोह और / प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए नहीं जाना जाता है में बाहरी मिलान डालने के लिए मदद कर सकता है। एक भी मामूली तकनीकी पहलुओं के बारे में पता करने की जरूरत है।

liposome की मध्यस्थता स्ि्न्ंतरर की सफलता की दरटीएसए-201 कोशिकाओं में ection सीए वी α2δ1 के भीतर दो epitopes की प्रविष्टि के बाद कम किया जा सकता है। इसलिए यह उपन्यास डीएनए निर्माणों के साथ अभिकर्मक दक्षता recalibrate करने के लिए सुझाव दिया है। यह इसलिए होता है क्योंकि एक 30 केडीए प्रोटीन की प्रविष्टि के डीएनए की आणविक वजन बदलता है। यदि आवश्यक हो तो 3 या समय की एक लंबी अवधि (24-72 घंटा) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं: एक करने के लिए 1 liposomes अनुपात करने के लिए डीएनए को संशोधित कर सकता है: 2 1 करने के लिए। यह कोशिकाओं permeabilizing लिए सही सूत्रीकरण चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। अधिकांश घर का बना इस परियोजना के लिए उनका आकलन समाधान निकला कोशिकाओं समग्र और प्रवाह रोकना करने के लिए प्रेरित करने के लिए।

प्रकाश जोखिम को रोकने जबकि fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ सेल धुंधला photobleaching और संकेत के नुकसान को सीमित करने के लिए आवश्यक है। फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, यह उपयोग करने से पहले संयुग्मित एंटीबॉडी से अधिक अपकेंद्रित्र के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, यह टी का विश्लेषण करने के लिए संपूर्ण महत्व का हैवह जितनी जल्दी हो सके और कोई बाद के बाद 24 घंटे की तुलना में प्रवाह पर कोशिकाओं। दाग कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखते हुए संभावना संकेत को कम करने और सेल अस्तित्व ख़राब होगा। बैच बैच से fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के आंतरिक प्रतिदीप्ति में बदलाव हुक्म है कि परीक्षण के निर्माण के प्रतिदीप्ति तीव्रता को सूचित किया जाना रूप में नियंत्रण निर्माण के प्रतिदीप्ति तीव्रता के एक समारोह के समान प्रयोगात्मक शर्तों के तहत व्यक्त की जरूरत है।

शोर अनुपात करने के लिए एक समग्र अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए, यह सेल pipetting कम से कम कोशिका मृत्यु को कम करने और धीरे ऐसे कोशिकामापी है कि एक 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल प्रवाह में इंजेक्ट कर रहे कोशिकाओं resuspend करने के लिए सिफारिश की है। खबरदार है कि एक उच्च सेल एकाग्रता सेल प्रवाह कम हो जाएगा और प्रवाह रोकना सकता। दूसरी ओर, एक कम सेल एकाग्रता एक लंबी प्रसंस्करण समय की आवश्यकता होगी। एक इस प्रकार Ty के आधार पर एकाग्रता को समायोजित करने के लिए हो सकता हैकोशिकाओं के पीई विश्लेषण किया जा सके।

वैकल्पिक assays: अतिरिक्त तरीके चार बड़े श्रेणियों में कोशिका की सतह प्लाज्मा झिल्ली गिरावट पर आयन चैनल की उपस्थिति दस्तावेज़ करने के लिए तैनात किया: 1) Confocal इमेजिंग तरीकों fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी और लक्ष्य प्रोटीन के बीच उच्च आत्मीयता बातचीत का शोषण; 2) प्रोटीन रसायन विज्ञान तकनीक biotinylation अभिकर्मकों द्वारा लक्ष्य प्रोटीन के सहसंयोजक संशोधन पर आराम कर; 3) गैर स्थिर शोर विश्लेषण के electrophysiological उपायों; और 4) रेडियोधर्मी जांच के साथ लक्ष्य प्रोटीन की Photoaffinity लेबलिंग। वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल, tritiated (±) के साथ photoaffinity लेबलिंग के मामले में - [3 एच] पी.एन. 200-100, dihydropyridine परिवार के एक उच्च आत्मीयता ligand बड़े पैमाने पर 1980 के दशक के 31 में इस्तेमाल किया गया था। यह एक बेहद संवेदनशील परख बनी हुई है लेकिन रेडियोधर्मी सामग्री 31 है, जो फैशन से बाहर गिर गया है आगमन के बाद के हेरफेर शामिलविशेष रूप से युवा जांचकर्ताओं के साथ की अत्यधिक संवेदनशील प्रतिदीप्ति और luminescence जांच। इसके अलावा, यह प्रतिपक्षी, कि इस तरह की सतह अभिव्यक्ति और समारोह के बीच संबंध इस दृष्टिकोण के दायरे से परे है की उपस्थिति में आयन चैनल गतिविधि को मापने के लिए असंभव है। प्रयोगात्मक सातत्य के दूसरे छोर पर, आयन चैनल का गैर स्थिर शोर विश्लेषण मिनट लंबी रिकॉर्डिंग के लिए स्थिर आधारभूत के साथ उच्च गुणवत्ता gigaseal पैच दबाना रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है। इस दृष्टिकोण के साथ एक ग्राफिक औसत वर्तमान में किसी भी संभावित 32-34 पर मापा के एक समारोह के रूप में शोर विचरण की साजिश रचने के ढलान से एक ही सेल में खुला आयन चैनलों की संख्या निकाल सकते हैं। यह मानक electrophysiological दृष्टिकोण का एक ही साज-सामान को प्रदर्शित करता है। यह एक श्रम प्रधान और कम throughput विधि कि इसके अलावा में वर्णक्रम विश्लेषण 32-34, नहीं कोशिका जीव का एक प्रधान के साथ एक अच्छा परिचय की आवश्यकता है। इसके अलावा, विश्लेषण करने के इस प्रकार केसक्रिय आयन चैनल (खुला राज्य में) जो झिल्ली पर कुल प्रोटीन की संख्या की तुलना में अलग हो सकता है की संख्या को पहचानती है। बायोटिन अभिकर्मकों के साथ कोशिका की सतह प्रोटीन की लेबलिंग प्लाज्मा झिल्ली में मौजूद प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक अपेक्षाकृत कुशल उपकरण है। इस विधि बायोटिन और आगे उच्च आत्मीयता और उच्च विशिष्टता न सहसंयोजक झिल्ली impermeant streptavidin या avidin अणुओं को बायोटिन के बंधन से झिल्ली प्रोटीन के सहसंयोजक संशोधन का लाभ उठाते। यह दृष्टिकोण गुणात्मक विश्वसनीय है लेकिन बाधा उत्पन्न या मात्रा का ठहराव मुद्दों को नियमित रूप से पश्चिमी धब्बा तकनीक का उपयोग प्रोटीन खुलासा साथ जुड़े द्वारा सीमित है। Confocal इमेजिंग और उसके डेरिवेटिव व्यापक रूप से कोशिका की सतह 35 के साथ झिल्ली प्रोटीन की सह स्थानीयकरण दस्तावेज़ करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। गुणात्मक प्लाज्मा झिल्ली अलगाव के साथ या सूक्रोज ढाल 36 बिना अंतर centrifugation तकनीक का उपयोग संभव बना रहता है। ऊपर वर्णित से फ्लो Assa में के रूप मेंवाई, यह लक्ष्य प्रोटीन और एक fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के बीच अति विशिष्ट बातचीत पर निर्भर करता है। विशेष रूप से कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति इमेजिंग, एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि झिल्ली सतह 37,38 पर वितरण और एकल आयन चैनल की आणविक व्यवहार रिपोर्ट सकता है। readout निश्चित रूप से आंख को पकड़ने है, लेकिन एक कम throughput छोटे मात्रा दृष्टिकोण रहता है। उन परीक्षणों की सभी उनके वैज्ञानिक योग्यता है। उच्च throughput प्रवाह cytometry आधारित परख readout reproducibility और मात्रात्मक मैट्रिक्स के मामले में बेहतर है, लेकिन सेल sorters कि बड़े संस्थानों में कोर सुविधाओं का हिस्सा हैं cytometry बहु लेजर प्रवाह के लिए आसान पहुँच की आवश्यकता है। प्रतिदीप्ति आधारित प्लेट पाठकों सस्ता और अधिक सुलभ हैं, लेकिन शोर अनुपात करने के लिए संकेत ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत एक ही निर्माणों के साथ मापा प्राप्त एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के बड़े हिस्से में होने के कारण काफी कम थी। fluorophore संयुग्मित एक की लागतtibodies भी उचित नियंत्रण प्रयोगों है कि परीक्षण के निर्माणों के साथ कार्रवाई की जा करने के लिए की संख्या के लिए विशेष रूप से कारण में सकारात्मक असर हो सकता है। एक ही विषय पर बदलाव फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित एंटीबॉडी लागत प्रभावी करने के लिए घोड़े की मूली peroxidase या alkaline फॉस्फेट एंजाइम संवाददाता एंटीबॉडी जो एंजाइम गतिविधि chemiluminescence 29,30 से यत्न किया जा सकता बदलते शामिल हैं।

निष्कर्ष: दो रंग प्रतिदीप्ति assays के प्रवाह cytometers का उपयोग कर संवर्धित कोशिकाओं में व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन के रिश्तेदार कोशिका की सतह अभिव्यक्ति अनुमान लगाने के लिए विकसित किए गए। हालांकि केवल दो फ्लोरोसेंट मापदंडों के इस वर्तमान परख में इस्तेमाल किया गया, प्रवाह cytometry एक एकल कोशिका पर 30 से अधिक फ्लोरोसेंट जांच के एक साथ पता लगाने के लिए उत्तरदायी है, इस दृष्टिकोण के उच्च लचीलापन का प्रदर्शन है। यह उच्च throughput ultrasensitive परख आनुवंशिक परिवर्तन 22,26 या posttranslational modificati के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकताons 23, के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली प्रोटीन तकनीकों 39 की सतह की तस्करी के लिए chaperones के औषधीय प्रोफ़ाइल का अध्ययन कर के रूप में। इस प्रोटोकॉल के पीछे की प्रेरणा अलगाव में पुनः संयोजक कोशिकाओं में आयन चैनल की झिल्ली अभिव्यक्ति पर आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए जरूरत से पैदा हुई। यह ध्यान रखें कि मॉडल सेल लाइनों में उत्परिवर्ती चैनल रोग की गंभीरता को हमेशा हिस्से में उत्परिवर्तन वाहक 5 में नैदानिक लक्षणों की गंभीरता के साथ संबंध स्थापित नहीं है क्योंकि अलग अलग alleles में परिवर्तन का एक संयोजन अचानक हृदय की मौत 40 को गति प्रदान करने के लिए आवश्यक हो सकता है लेकिन यह महत्वपूर्ण है 41। इस संदर्भ में, इस परख एक भी नुकसान के समारोह म्यूटेशन 22 के साथ जुड़े जीन में एक या कई उत्परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से पहला कदम सन्निकटन प्रदान करने के रूप में देखा जा सकता है। यह cardiomyocy की विभेदित कोशिकाओं में एक ही निर्माणों के वायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति भविष्य में कल्पना करने के लिए हालांकि प्रशंसनीय हैते वंश। कुल मिलाकर, अन्य इमेजिंग या luminescent तकनीकों के साथ तुलना में, प्रवाह कोशिकामापी Sorters एक सजातीय सेल की आबादी के निलंबन और रिपोर्ट प्रतिदीप्ति तीव्रता में जीवित कोशिकाओं को संभाल। यह प्रक्रिया, paraformaldehyde, एक प्रक्रिया है कि स्थानीय प्लाज्मा झिल्ली permeabilization लाती साथ निर्धारण के लिए आवश्यकता के बिना किया जाता है यहां तक कि हल्के शर्तों के तहत 42। परख, तेजी से विशिष्ट, और काम कर प्रति दिन कई सौ नमूनों को विश्लेषण के साथ सुविधाजनक है। विश्लेषण के अलावा, कोशिकाओं अंततः एक ही झिल्ली प्रोटीन की अधिक या कम स्तर व्यक्त कोशिकाओं के कार्यात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा हल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

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