유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

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Biology

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Summary

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

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Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

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Abstract

Introduction

이 문서는 기존의 유동 세포 계측법 기술을 사용하여 재조합 세포에서 발현 이온 통로와 같은 막 단백질의 상대적인 세포 표면 발현을보고 신뢰성 분석을 제공한다. 이온 채널은 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 게이팅함으로써 전기 신호를 제어 할 책임이 조공 막 단백질이다. 그들은 활성화 메커니즘, 자연, 그들이 지역화 된 구멍을 통해 환승 이온 종의 선택에 의해 분류된다. 세포 및 조직 수준에서 이온 채널을 통해 거시적 인 이온 플럭스는 생물 물리학 (게이팅 및 침투), 생화학 (인산화) 및 생합성 (합성, 글리코 실화, 인신 매매 및 저하) 특성 (1)의 제품이다. 이러한 프로세스 각각은 이온 채널의 모든 유형에 고유 한 이온 채널의 생리적 역할을 수행하도록 최적화된다. 결과적으로,을 통해 이러한 미세 조정 과정 중 어느 하나의 변경상속 또는 종종 "channelopathy"이라 유전 적 변형은 세포 항상성에 해로울 수있다. 이는 세포 표면에서 이온 채널의 "오른쪽"양을 전달하는 것은 세포의 항상성에 중요한 것을 강조하는 것이 중요하다. 심지어 작은 증가 (기능 획득) 및 이온 채널 활성의 저하가 적은 (기능 상실) 일생 심각한 병리를 유발할 수있다. 성숙한 이온 채널의 세포 표면 전달의 결함은 낭포 성 섬유증 (CFTR 이온 채널) 2 긴 QT 증후군 양식 (심장 칼륨 채널) (3) 심장 부정맥 등 수많은 channelopathies에서 결정하는 중요한 요소이다.

Channelopathies은 심장 돌연사 (4)와 연결되어 있습니다. 2,000-1 : 개인 5 당 3,000 갑작스런 부정맥 심장 죽음 캘리포니아의 약 절반에 대한 책임이 있습니다 모든 심장 channelopathies의 현재 전 세계적으로 유병률은 적어도 한 것으로 생각된다SES 6. 심장 전압 게이트 된 나트륨, 칼륨 -에 장애, 및 칼슘 - 선택적인 이온 채널은이 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. L 자 형 칼슘 1.2 V 전압 게이트 된 칼슘 채널 동기화 심장 근육의 수축을 개시해야한다. 심장 L 형 칼슘 채널 1.2 V 보조 소단위 7-12 α2δ1 주 조공 칼슘 V의 α1 서브 유닛 및 CA V의 ß 및 CA V 이루어지는 다중 서브 유니트 단백질 복합체이다. 이들 서브 유닛은 심장 (13)의 통상의 전기 기능을 지원하는 데 필수적인 보조 서브 유닛 사이의 완전한 보완은 세포막에 작용 칼슘 V 1.2 채널의 동적 상호 작용을 생성 할 필요가 있습니다. 칼슘 V의 ß는 칼슘 V의 세포 표면 발현을 비공유 나노 몰 소수성 상호 작용 (14)를 통해 1.2 채널을 촉진한다. 칼슘의 V α2δ1 서브 유닛 위스콘신의 공동 발현일 칼슘 V의 ß-결합 된 칼슘 V의 α1은 피크 전류 식 (5 ~ 10 배까지)를 자극하고 더 음의 전압에서 채널 활성화를 촉진한다. 기능 획득 칼슘 V 1.2은 L 형 칼슘 V 1.2 채널을 형성하는 세 개의 주요 소단위에서 점 돌연변이의 호스트 반면 긴 QT 증후군 15라는 심실 부정맥의 형태와 연관되어있는 조공 단위체의 돌연변이 짧은 QT 증후군 양식 (16, 17)의 부정맥을 앓고있는 환자에서 확인되었다. 이온 채널은 생화학 적 관점 (단백질 화학)에서 조사 또는 이러한 보완적인 접근 방식을 사용하여 자주 전기 생리 도구 (전류 생성 기계) 등을 사용 할 수 막 단백질이다. 전기 생리학, 특히 전체 셀 패치 클램프에, 이온 채널 (15)의 기능을 규명하는 적합한 방법이지만, 자신의 생물 물리학 적 변화에서 단백질 인신 매매에 수정 사항을 해결할 수속성. 단백질 화학 그러나 인해 종종 작은 가용성 단백질에 비해 큰 막 단백질의 상대적으로 낮은 발현에 사용을 제한하고있다. 형광 판독을 사용하여 강력한 높은 처리량 방법은 특별히 이온 채널의 세포 표면 발현의 변화를 유발 단백질 생합성에서의 결함을 해결하기 위해 개발 될 필요가있다.

유동 세포 계측법은 셀 카운팅 정렬 바이오 마커 검출, 단백질 공학 (18)에 이용되는 생물 물리학 적 기술이다. 생균 또는 입자의 샘플 용액을 플로우 사이토 미터에 주입하는 경우, 셀은 시스템의 감지 장치 (도 1)로 탐색 할 수있는 단일 스트림으로 순서화된다. 1956 (19)에서 생산 기기 사이토 제 1 유로는 단지 하나의 파라미터를 감지하지만 현대 유동 세포 계측기 여러 레이저와 30 개 이상의 형광 파라미터 (20, 21)의 검출을 허용 형광 검출기를 갖는다.필터 및 거울 (발광 광학)의 강도에 비례하여 빛을 변환하는 전자 네트워크 (포토 다이오드 및 감지기)에 세포의 빛 산란이나 형광등을 직접. 디지털 데이터는 특수한 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 기본 출력 도트 플롯 (21)로 표시된다.

그림 1
그림 1. 유동 세포 계측법 생물 물리학 원리 정렬이 단일 세포가 하나 이상의 레이저 질의 포인트를 가로 질러 이동 시스 유체 스트림 내의 고압 노즐을 통해 가압된다. 광 빔이 통과하는 세포에 의해 편향되고, 순방향 (순방향 산란 FCS)에 수집 된 광은 셀의 크기에 비례 한 신호로 변환하는 광 다이오드로 전송된다. 빛은 레이저 경로에 90 ° 각도로 수집 감지기 (또한 광전자 증 배관 (PMT))로 전송됩니다.여기 된 형광 색소는 상기 셀에 존재하는 경우,이 광은 셀 내의 입도를 반영 측면 산란 신호 (SSC)의 검출을 허용 이색 거울, 형광 방출을 통해 라우팅된다. 세 검출기 (녹색, 황색, 및 빨강)은 상이한 형광 색소를 동시에 검출 할 수 있도록, 서로 다른 파장 대역 통과 필터들로 표현된다. 서로 다른 신호는 외부 컴퓨터에 의해 디지털화하고 세포의 특성을 정량화 분석 할 데이터로 변환된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유동 세포 계측기의 높은 처리량은 재조합 야생형과 피킹 결핍 전압 게이트 된 L 형 칼슘 채널 및 1.2 V 생균에 연결된 소단위의 상대 세포막 발현을 정량화 시키는데 이용되었다. cDNA를 공동 구축단백질에 대한 딩은 이중으로 동시에 불 투과성 형광 접합 된 항체와 구조적으로 형광 세포 내 형광 검출 할 수있는 세포 외 비 형광 에피토프를 수행하기 위해 태그되었습니다. 모두 C 말단에 삽입 한 후, 단백질의 세포 외 루프에 삽입 된 세포 에피토프 및 형광 세포가 단백질로 번역된다. 이러한 일련의 실험에서, 칼슘 V의 α2δ1 단백질 고유 세포 형광 항 - HA 및 mCherry를 π 공역 계 세포 외 헤 마글 루티 닌 (HA) 에피토프 불 침투성 FITC (플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트)에 의해 검출 (YPYDVPDYA)을 발현하도록 설계 하였다. mCherry - 칼슘 V의 α2δ1 HA 표지 된 단백질의 상대적인 세포 표면 발현 레벨을 결정하기 위해, 융합 단백질을 발현하는 재조합 세포를 형질 전환 한 후 수확하고, FITC 접합 마우스 단일 클론 항 HA 에피토프 태그 antibod 염색 하였다Y (그림 2). FITC 따라서 생물학적 기능을 방해하는 등의 가능성이없는 효소 리포터보다 상당히 작고, 형광 유기 화합물이다. TSA-201cells에서 과발현 mCherry- 칼슘 α2δ1 V-HA는 이차원 플롯 (22)에 대한 FITC 형광 및 mCherry 형광 크게 3 로그의 증가를 생성한다. 는 HA 에피토프는 단백질의 세포 외 부분에 위치되는 것을 감안할 때, FITC에 대한 형광 강도는 손상 세포의 존재 하에서 얻어진 HA 표지 된 단백질의 세포 표면 발현의 상대적인 인덱스를 반영한다. 작 제물의 HA 에피토프의 접근성 체계적 셀 permeabilization 후 FITC 신호를 측정함으로써 확인된다. FITC 형광에 대한 상대 강도가 ​​상대적 형광 값 FO한다 질적 비교 투과성이 세포에서 예상 때문에 계수는 정규화 된 총 단백질 발현을 확증하는 역할R mCherry은 투과성이 비 투과성이 조건 22, 23에서 측정. 이는 고유의 형광 스펙트럼 permeabilization 후 높은 값 측으로 시프트되어 있지만, 상기 제어 구조에 비해보고되는 유일한 값 형광 강도의 변화가 있음을 주목하는 것이 중요하다. 테스트 구조에 대한 형광 세기의 상대적 변화는 각 형광 물질 (FITC 또는 mCherry)에 ΔMean 형광 강도 (ΔMFI) 값을 사용하여 추정된다. 실험 형광 접합 된 항체의 고유 형광 실험 변동을 제한하기 위해 동일한 조건 하에서 발현 제어 구조의 형광 강도의 테스트 구조의 상대적 형광 강도를 측정하도록 설계된다. 두 개의 막 단백질이 성공적이 분석을 이용하여 검토했다 : L 형 전압 게이트 된 칼슘 채널 칼슘 1.2 V 14, 22 및 다른 일련의 조공 소단위실험, 세포 외 보조 칼슘 V의 α2δ1 서브 유닛 22, 23. 다음 프로토콜은 1.2 채널의 제어 조건에서 이온 채널의 번역 후 변형에 영향을 미치는 돌연변이 후에 심장 L 형 칼슘 V의 칼슘 V의 α2δ1 서브 유닛의 세포 표면 발현을 측정 하였다. 표준 실험 조건하에 FITC의 세포 표면 형광은 mCherry - 칼슘 α2δ1 V-HA 단백질 (참조 (22)로부터도 5)을 코딩하는 cDNA의 발현과 유사 선형 증가한다.

그림 2
그림 2 :. 실험 프로토콜 유동 세포 계측법 총 멤브레인 라벨의 도식 표현 계획은 필요한 주요 단계 중 일부는 플로리다에 의해 재조합 이온 채널의 상대적인 총과 세포 표면 발현을 정량화 설명유동 세포 계측법. 셀 (1)은 TSA-201 세포에서 이중 태그 구조 mCherry - 칼슘 α2δ1 V-HA 형질 permeabilization과 전 또는 후에 염색 (2). (3) 다변량 분석 (4). 사이토 다중 매개 데이터 흐름에 취득 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Protocol

1. 이중 태그 DNA 구조

  1. 사이트 특이 적 변이 (그림 3B) 20 D676 및 R677 사이에 칼슘 V의 α2δ1의 세포 외 링커에서 HA 에피토프 (YPYDVPDYA)를 삽입합니다. 앞으로 프라이머 gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC를 사용하여 프라이머 acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC 역.
  2. 를 SacI 및 SalI로 위치 (도 3b) (20) 사이 mCherry의 N 말단에 융합 단백질을 발현하도록 설계 포유류 pmCherry-N1 발현 벡터로 태그 HA 칼슘 V의 α2δ1의 cDNA 서열을 서브 클로닝.
    주 : 적절한 채널 기능은 표준 전기 생리 학적 방법 (24)을 사용하여 제어 구조에서 테스트되어야한다.

2. 리포솜 매개 과도 형질 (30 분, 모든 단계 층류 후드에서 수행됩니다)

  1. 1 일 : 플레이트 TSA-201 세포 (또는 HEKT)에서의 50 만이 용액의 베코 높은 글루코스 최소 필수 배지 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PS) 배지로 보충 (DMEM-HG)를 35mm 배양 접시. 표준 hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 트리 판 블루를 이용하여 세포 샘플의 일부분에서 세포 생존 능력을 평가한다. 접시에 충분한 세포를 형질 전환시에 90 % 합류에 도달한다.
  2. 주 2 : PS없이 신선한 예열 (37 ° C) 배지 2 ㎖로 변경 배지.
  3. 각 형질 샘플의 경우, 두 개의 1.5 ml의 튜브를 준비합니다. 관 (1)에있어서, 감소 된 혈청 배지 250 μL의 DNA 4 μg의 희석. 튜브 (2)에서, 250 ㎕의 혈청 감소 배지와 리포좀 - 매개 형질 감염 시약 10 μL를 혼합한다. 사용하기 전에 부드럽게 형질 전환 시약을 섞는다.
  4. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
  5. 관 (1) 및 튜브 (2)의 내용을 결합하여, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 적어도 20 분 동안 배양한다.
  6. 리포좀 추가 / DN상기 배양 된 세포에 단지 부드럽게 믹스 할 수있는 배양 접시 바위.
  7. 24 시간 동안 CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 품어.

유동 세포 계측법에 대한 세포의 3. 염색 (3 시간)

  1. 세포 샘플을 준비
    1. 주 3 :주의 깊게 배양 접시에서 매체를 제거하고 0.05 % 트립신 1 배 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) (37 ° C를) 미리 예열 400 μL와 세포를 씻는다.
    2. 트립신 EDTA 400 μl를 추가하고 5 분 세포가 접시에서 분리 할 수 있도록하는 CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 접시를 품어.
    3. PS 않고 차가운 배양 배지 1 ㎖를 첨가하여 효소 분해를 중지하고 부드럽게 4-5 회 피펫 팅하여 표면의 모든 세포를 세척한다. 세포 사멸을 감소 소화이고 피펫 피한다.
    4. 1.5 ml의 튜브에 세포를 수집하고 얼음에 즉시 배치합니다. 차가운 얼음 솔루션을 사용하고 내재화를 방지하기 위해 4 ° C에서 세포를 유지의 항원을 표면. 형광 신호의 광표백을 제한하기 위해 조명을 낮 춥니 다.
    5. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 기음과 상층 액을 버린다.
    6. 다시 일시 인산 완충 식염수 (1X) 1 ㎖의 펠릿 (PBS) 단일 세포 현탁액을 제조 하였다.
    7. 간단히 매우 부드럽게 튜브 와동를 반복 완전히 배지를 제거 3.1.5와 3.1.6 단계를 반복합니다.
    8. 1X PBS 600 μL의 펠릿을 다시 중지하고 3 × 106 세포 / ml의 최소한으로 세포 농도를 조절한다.
    9. 세포와 세포 내 염색을위한 두 개의 새로운 1.5 ml의 튜브에 세포를 나눈다. 비특이적 염색에서 특정 얼룩을 구별하기 위해 적절한 컨트롤을 포함합니다.
      주 : 이소 제어 항체 배경 염색의 수준을 평가하는 데 도움이 이상적으로 각 차 항체의 호스트 종, 이소과 형광 일치해야합니다. 같은에서 이소 제어 및 복합 항체를 사용하여단백질 농도.

1 번 테이블
1에 대한 플로우 계측법 실험 대조 시료 세포 비는 - 투과 가능하고 투과 가능 각 실험은 다음 음성 대조군이 포함되어야 :. (이소 타입 또는 공액 항체, 항체 없음) (1) Nontransfected 세포. (2) 제정 형광 세포 내 형광 색소없이 플라스미드에 서브 클로닝 관심의 단백질로 형질 세포 (pCMV- 칼슘 V α2δ1-HA) 또는 이중 태그 공사 (pmCherry - 칼슘 V의 α2δ1와 이소 타입 또는으로, 항체없이 배양 공액 항체). 단색 제어, 형광 발광 오버랩 보상에 사용된다. 같은 컨트롤은 비 투과성이 출마 실험의 각 시리즈에 조건을 투과성이있다.

  1. 본래의 세포 표면 염색라이브 셀
    1. 나누어지는 1.5 ml의 튜브에 1 × 106 세포 / 100 μL.
    2. 5 μg의에서 FITC 접합 된 단일 클론 항-HA 항체 추가 / ㎖하고, 45 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 로커 플랫폼 (200 RPM)에서 세포를 배양하기 전에 소용돌이.
      참고 : 항체의 최적 농도는 예비 적정 실험에서 측정 하였다 (그림 4).
    3. 어둠에서 세포를 제거하고 1X PBS / 튜브 900 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
    4. 뜨는을 대기음 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 1X PBS, 소용돌이와 원심 분리기 1 ml의 펠렛을 재현 탁.
    5. 어떤 언 바운드 항체를 제거하기 위해 두 번 세척한다 (단계 3.2.4)를 반복합니다. 접합되지 차 항체가 사용되는 경우, 해당 이차 항체와 함께 배양한다.
    6. 최종 세척 후, 1X PBS 500 ㎕를 상기 세포를 재현 탁하고 유동 세포 계측법 튜브 5 ㎖ 단일 세포 현탁액을 전송. 세포 유지샘플을 실행 할 때까지 4 ℃에서 어둠 속에서의.
    7. 유동 세포 계수기에 샘플을 실행합니다. 최상의 결과를 얻으려면 가능한 한 빨리하고 늦어도 후 24 시간 이상 흐름 cytometer에 세포를 분석 할 수 있습니다.
  2. 세포 내 염색 : 고정, Permeabilization 및 염색
    1. 나누어지는 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 1 × 106 세포 / 100 1.5 ml의 튜브 μl를 원심 분리기.
    2. 재고에서 직접 고정-permeabilization 용액 100 ㎕의 상층 액과에 resuspend 세포를 폐기하십시오.
    3. 20 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에 품어.
    4. 갓 준비 1 배 permeabilization 세척 버퍼의 100 μl를 (증류수 H 2 O의 10 배 permeabilization 세척 버퍼를 희석)를 추가합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 테이블 원심 분리기를 사용하여 소용돌이과 침전물 세포.
    5. 기음과 상층 액을 버린다.
    6. 반복 3.3.4와 3.3.5 단계를 반복합니다.
    7. 5에서 FITC 접합 된 모노클로 날 항 HA 항체를 추가μg의 / ㎖ 100 배일 permeabilization 세정 완충액 μL하고, 30 분 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 세포를 배양 하였다 선회한다.
      주 : 세포 염색은 세포 표면 염색에 사용되는 것과 동일한 절차에 따라 수행된다. 사포닌 매개 세포 permeabilization 따라서는 세포 내 염색 중 사포닌의 지속적인 존재 세포를 유지하기 위해 1 배 파마 / 워시 버퍼와 1X PBS를 교체하는 것이 중요하다, 그러나 신속하게 가역 과정이다.
    8. 어둠에서 세포를 제거하고 100 μL permeabilization 세척 버퍼를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
    9. 기음 조심스럽게 상층 액을 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 100 ㎕의 permeabilization 세척 버퍼, 소용돌이와 원심 분리기에서 펠렛을 재현 탁.
    10. 어떤 언 바운드 항체를 제거하는 세척 (단계 3.3.9)를 한 번 더 반복합니다.
    11. 최종 세척 후, 1X PBS 500 μL의 세포를 재현 탁하고 죄를 전송튜브 세포 계측법 5 mL의 흐름에 GLE 세포 현탁액. 흐름 cytometer에 샘플을 주입 할 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 세포를 유지합니다.
    12. 유동 세포 계수기에 샘플을 실행합니다. 가능한 한 빨리 있지만 나중에 일주보다 염색 한 후 세포 계수기에 고정 된 샘플을 실행합니다. 같은 날에 비 투과성이와 투과성이 세포를 실행합니다.

4. 유동 세포 계측법

  1. 셀 분류기 데일리 설치 사이토 흐름
    1. 유동 세포 계측법 소프트웨어를 켭니다. 최적의 기기 성능을 보장하기 위해, 실험 셀 소터 흐름 cytometer를 보정 및 설정하기 전에 장비 설정 비즈를 사용하여 (셀 즉, 레이저 및 광학 사양을 수행, 레이저와 흐름이 제대로 정렬)을.
    2. 20 psi의 시스 압력으로 100 μm의 노즐을 사용합니다.
      참고 : 노즐이없는이 사이토 흐름 벤치에 변경 될 수 있습니다.
    3. manufactur의에 따른 사이토의 유량 설정어 사양. 과도하게 높은 유량에서 형광 변화의 검출 감도가 저하된다.
    4. 노란색 - 녹색 레이저 (mCherry을 자극하는 561 ㎚) (플루 오레 Isothiocayanate 또는 FITC를 자극하는 488 ㎚) 파란색을 선택합니다. 30분의 530의 나노와 각각 20분의 610 nm의 대역 통과 필터와 FITC와 mCherry 형광 수준을 수집합니다.
    5. 리니어 스케일을 사용하여 흠없는 셀 사이드 분산 형 (SSC) 도트 플롯 대 전방 산란 (FCS)를 취득. 도트 플롯의 왼쪽 사분면에 세포를 시각화하기 위해 각 검출기의 증폭을 조절합니다.
  2. 본래 비 투과성이 세포의 샘플 읽기
    1. 세포가 이렇게 손상 세포에 형광 신호를 제한, 세포 파편 및 세포 집합체 제외하고 분석 할 주위에 무료로 양식을 서술하여 라이브 비 투과성이 세포의 P1gate를 설정합니다.
      주의 : 라이브 / 죽은 제외 염료 생균에 게이트 위치를 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 기록하기 만 이벤트를 설정정지 게이트 P1있다. 필요가있을 경우 이벤트의 높은 숫자로 설정합니다.
    2. 염색 세포의 기본 형광도를 검출하는 FITC 개의 파라미터 등고선 플롯 대 mCherry 획득. 음수 값을 표시하고 인구 25 사이의 해상도를 개선하기 위해 이중 로그 스케일을 사용합니다. 로그 형광 강도 플롯의 처음 10 개 단위의 하부 내에 흠 음성 세포를 설정하기 위해 각각의 검출 전압을 조정한다.
    3. 4.1.5과 4.1.6에 설립 된 설정을 사용하여 모든 그대로 비 투과성이 샘플을 획득하고, 형광 검출기에 FSC, SSC 및 신호를 수집합니다.
    4. 수출 및 * 저장 .fcs 파일 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 분석을 위해 사용된다.
  3. 투과성이 세포의 샘플 읽기
    1. 투과성이 샘플에서 살아있는 세포를 선택하고 4.1.5과 4.1.6에서와 같이 FSC와 SSC 전압을 조정 P1 게이트를 이동합니다.
    2. 모든 투과성이 샘플을 획득하고 FSC, SSC a를 수집형광 검출기의 차 신호.
    3. 수출 및 * 저장 .fcs 파일 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 분석을 위해 사용된다.
  4. 데이터 분석
    1. 4.2.4과 4.3.3에 저장된 분석 소프트웨어 및 가져 오기 * .fcs 파일 유동 세포 계측법을 시작합니다.
    2. 작업 공간 창에 나열된 첫 번째 샘플을 클릭합니다. 튜브 ID 번호의 이름을 딴 새 창이 자동으로 열립니다. FSC 대 SSC의 음모에 게이팅 프로세스를 시작합니다. 살아있는 세포와 다른 앞으로 산란 및 측면 산란이 이물질, 죽은 세포, 또는 집계 게이트 (P1) 살아있는 세포 주위의 타원 아이콘을 사용하여 그리기 및 제거
    3. FITC (X 축) 생균의 형광 강도 대 mCherry (Y 축)의 2 파라미터 윤곽 플롯을 그리려면, X 축에 제 클릭하여 FITC-A 채널을 선택하고, Y 클릭 시킴으로써 행한다 및 PE-mCherry-A 채널을 선택합니다. a의 가장자리에 사분면 마커를 배치합니다 "쿼드"아이콘을 클릭합니다각각의 형광 채널에서 utofluorescent 세포.
      참고 : FITC와 mCherry 양성 세포 주변에 게이트는 P2 게이트입니다. 음극 형광 세포 집단은 P3의 게이트로 불린다. 이 문서에서 사용되는 대표적인 게이팅 방법에 대한 그림 5를 참조하십시오.
    4. P2와 P3 게이트를 선택하고 원래의 작업 공간 창에서 "추가 통계"아이콘을 클릭합니다. "백작"(양성 세포의 수)을 클릭하고 "평균"(각 형광 색소의 평균 형광 강도) 또는 "중간"(각 형광 색소의 중간 형광 강도) 옵션 목록 중 통계를 클릭합니다. 다시 "추가 통계"아이콘을 클릭합니다. 이러한 모든 값이 자동으로 원래의 작업 창으로 전송된다.
      주 : 형광 강도가 정규 분포에 따른 경우에만 사용되는 "평균". 다른 모든 경우에, "중간"탭을 클릭합니다. MFI 따라서 형광 Intensit 평균을 참조 할 수Y 또는 중간 형광 강도.
      주 :이 단계는 세포 계측기에 의해 프로브 모든 샘플에 게이츠 파라미터 및 통계를 적용하는 것이다.
    5. 작업 영역 창에서 드래그 앤 라인의 모든 샘플을 표시 위에 게이트 및 통계 매개 변수를 드롭 마우스를 사용합니다.
    6. 비 투과성이와 투과성이 세포 (- B도 6A) 두 가지 차원 형상 (FITC 대 mCherry) 플롯과 히스토그램 (세포가 형광 강도에 비해 계산)의 배치 보고서를 생성합니다.
    7. 단계 4.4.4에서 생성 된 통계에서, 염색 된 세포에 대한 각각의 형광 색소에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 계산한다. 이 값으로부터, 표면 및 관심있는 단백질의 총 발현을 정량화하는 염색 세포로부터 얻은 MFI 값을 뺀다.
    8. 각 형광 (mCherry 및 FITC) (- D 그림 6C)의 ΔMFI 값을보고합니다. 칼슘 측정 한 ΔMFI을 정상화 주 : 형광 강도의 절대 값은 따라서, 항체 및 각 실험실 작업자의 기술적 능력의 배치에 따라 급격히 WT 작 제물을 사용하여 돌연변이 구조의 형광 강도를 정규화 할 필요가 달라질 수있다.

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Representative Results

이 문서에서는 분석 세포 계측법 2 색의 흐름에 의해 TSA-201cells로 표현 재조합 이온 채널의 총 세포 표면을 정량화 할 수있는 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 예를 들어, 상대적인 세포 표면 및 총 단백질 발현은 칼슘 V의 α2δ1subunit 대해 정량 하였다. 분석 계측법 2 색 흐름을 수행하기 위해, 칼슘 V의 α2δ1은 이중 항 HA FITC 공액 된 항체 및 항시 형광 세포 mCherry의 형광에 의해 검출 될 수있는 세포 외 비 형광 에피토프 HA를 표현하는 태그로 하였다. FITC와 mCherry의 여기 및 발광 스펙트럼은 FITC는 488 nm의 레이저에 의해 88 %의 효율을 흥분하지만 효율이 561 nm의 레이저를 0 %로 감소 함을 보여줍니다. 561 nm의 레이저하지만 488 nm의 레이저 만 7.6 % (그림 3)과 흥분 때 mCherry가 최대 형광의 63.9 %를 보여줍니다. 여기 및 방출 SPECTRA 모두 형광을 위해 선택된 다른 레이저와 필터를 사용하여 최적의 빛 수집 및 최소한의 중복을 나타낸다. 주어진 형광 색소를위한 MFI만큼 분석법 큰 세포 집단으로부터 막 단백질의 상대적 발현에 대한 정량적 인 정보를 제공 할 수있는 유세포 분석기는 각각의 셀에 칼슘 V의 α2δ1의 단백질 발현보다는 형광 세포 수에 정비례한다. 이는 포화 이후 형광 접합 된 항체의 농도를 사용하는 것을 포함한다. 칼슘 V의 α2δ1 결합 방지 HA FITC - 복합 항체 (그림 4)에 대한 적정 곡선은 세 단계를 보여줍니다. 형광은 첫 단계에서 검출되지 않은 반면, 형광 강도가 두 번째 단계에서 항체 농도가 증가함에 따라 기하 급수적으로 증가 하였다. 채도 (제 3 단계) 시점 후에, 항체의 농도가 증가하면 상대적 형광 INTEN에 영향을주지SITY FITC의 (RFI). 항 HA FITC 공액 된 항체 포화 따라서 공액 항체의 농도는 실험 동안 MFI 제한되지 않도록, 5 μg의 / ㎖에 설립되었다.

태그 된 칼슘은 V-TSA 201cells 표현 α2δ1was 및 계측법 분석은 비 투과성이 세포 (도 5)의 FITC 접합 항 - HA의 존재하에 수행 하였다 흐른다. 적절한 관리 (표 1)은 상기 레이저 빔을 통과하는 각 셀의 XY 속성 값 유동 세포 측정기로 분석 하였다. 세포 분포 도트 플롯 (도 5a)에서 시각화된다. FCS / SSC 도트 플롯 세포 샘플의 제조는 높은 생존율 (도 5BA)의 단일 세포 현탁액을 제공한다는 것을 확인한다. 생균 (P1)에 대한 선택 게이트 분석 세포의 총 수의 75 %를 나타낸다. 총 단백질 발현 OTSA-201 세포에서 F 칼슘 V의 α2δ1는 mCherry 형광에 비례하는 것으로 간주되었다. mCherry FITC 등고선 플롯과 막대 그래프에서 볼 수 있듯이 - pmCherry - 칼슘 V α2δ1-HA로 형질 (그림 5Bb BC), 47 2 % TSA-201 세포 크게 mCherry 형광을 표현뿐만 아니라 인해 상당한 FITC 형광을 나타내는 것으로 밝혀졌다 비 투과성이 세포에서 칼슘 V의 α2δ1의 외부 HA 태그에 바인딩. 항체없이 또는 이소로 수행 음성 대조군 실험은 FITC가 긍정적으로 형질 감염된 세포에 전용 또는 주로 결합을 나타냅니다.

이 프로토콜은 TSA-201cells 23 칼슘 V의 α2δ1 총 세포 표면 발현에 N - 당화의 역할을 특성화하기 위해 사용되었다. 실험은 세포 표면 발현을 평가하기위한 비 투과성이 세포에서 수행 하였다및 투과성이 세포에서 HA 에피토프의 접근성을 확인뿐만 아니라 총 단백질 발현을 평가 하였다. MFI 각 형광 (mCherry 또는 FITC) 추정에 칼슘 V의 α2δ1의 상대 발현을 기준으로 계산했다. 돌연변이를위한 ΔMFI 값은 동일한 조건 하에서 발현 mCherry - 칼슘 α2δ1 V-HA WT에 대해 동일한 일 측정 된 최대 값으로 정규화되었다. 이는 항 HA FITC 공액 된 항체의 절대 형광 강도의 시간 경과 변화를 고려하는 것이 중요하다. 도 6a에 도시 된 바와 같이, WT와 4xNQ가 구성되지만 16xNQ 구조체의 배경 형광 레벨에 가까운 단백질이 세포막에서 거의 존재하지 않는 것을 나타내는 비 투과성이 세포 FITC 대한 ΔMFI는 강했다. 분석 셀 permeabilization 후 수행의 16xNQ 구조의 총 단백질의 발현이 현저하게 그 여부를 감소 된 것으로 나타났다(- D도 6C) 투과성이 셀 또는 비 투과성이 측정 된 구조적 mCherry 형광로부터 투과성이 셀에 FITC 형광로부터 추정 하였다. 도 6b에 도시 된 바와 같이, 휴대 형광도 수준은 그대로 비 투과성이 투과 가능하고 세포의 절대 형광 값의 비교를 방지 셀 permeabilization 후에 증가 하였다. mCherry에 대한 측정 ΔMFI 형광은 permeabilization 솔루션 mCherry의 상대적 형광 신호를 변경하지 않는 것을 의미 모두 비 투과성이와 투과성이 세포 유사했다. 의 N 글리코 실화 부위의 돌연변이 단백질 생합성 / 안정성 23 감소 게시 관찰지지 mCherry 대한 형광 강도의 감소와 연관되었다. 실험이 시리즈에서는, 투과성이 세포에서 측정 FITC에 대한 상대 형광 신호는 ㄱ 밝혀졌다단백질의 N 형 당화 상태가 세포 외 도메인의 FITC 접합 항 HA 항체에 의해 검출되는 형광 강도에 영향을 미칠 수 있음을 시사 mCherry 대한 상대적인 신호보다 더 작은 전자. 전부 세포 permeabilization 후 전 FITC의 상대적 형광의 변화는 단백질 발현을 정량화하는 신뢰할 수있는 통계를 제공합니다.

그림 3
그림 3 : FITC와 mCherry는 2 색 세포 계측법 분석을위한 형광 색소의 적절한 쌍을 형성 여진 (빈 곡선) 및 561 nm의 노랑으로 여기 488 nm의 청색 레이저 (AA)와 함께 흥분과 mCherry FITC에 대한 방출 스펙트럼 (충전 곡선). 그린 레이저 (AB)가. FITC 및 mCherry 형광은 30분의 530 nm의와 20분의 610 nm의 bandpas으로 수집의 각각 필터링합니다. 다른 레이저 (컬러 세로 라인) 및 필터 (컬러 사각형)의 파장은 최적의 광 수집 및 최소한의 중복을 위해 선택된다. (B) mCherry - 칼슘 V α2δ1-HA 단백질의 도식 표현. 칼슘 V의 α2δ1가 이중 항-HA FITC - 복합 항체 및 구성 적 형광 세포 내 mCherry의 형광 색소에 의해 검출 될 수있는 세포 외 비 형광 에피토프 HA를 표현하는 태그되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. 칼슘 V의 α2δ1 결합 방지-HA FITC 접합 된 단일 클론 항체의 적정 TSA-201 세포는 일시적으로 pmCherry - 칼슘 V & 형질했다 # 945; 2δ1-HA-HA, 항 FITC 공액 또는 이소 타입 항체의 범위로 배양 하였다. 만 FITC 신호는이 패널에서 분석되고있다. (A) 단일 파라미터 히스토그램은 Y 축에 대한 세포의 상대적인 수 및 농도의 항 HA FITC 공액 된 항체 범위 (/ ㎖ 0.01 μg의)에 대한 X 축에 FITC 형광 세기를 표시. (B) FITC의 MFI의 함수로서 반 HA FITC 공액 된 항체 세미 로그 그래프. 적정 곡선 추세선 값 R 2 = 0.99561로 식을 바인딩 한 사이트를 사용하여 장착 하였다. 예상대로 이소 타입 항체에 대해 수행 적정 형광 없었다. 0.001 0.01 μg의 / ㎖의 농도는 배경 잡음과 구별 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 "> 그림 5
그림 5 :. 분석 샘플 유동 세포 계측법에 사용 게이팅 전략의 pmCherry - 칼슘 V의 α2δ1-HA (A) 도식 표현 형질 비 투과성이 TSA-201cells의 세포 계측법 분석 대표적인 흐름. 데이터는 적절한 소프트웨어와 함께 획득 한 후에 분석 하였다. 첫 번째 게이팅 전략은 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 살아있는 세포와 다른 앞으로 산란 및 측면 산란이 이물질, 죽은 세포, 또는 집계를 살아있는 세포 주위에 게이트 (P1)를 표시하고 제거하는 점 플롯을 이용 . FITC mCherry (y 축) (x 축)의 형광 강도의 두 파라미터 콘타는 P1 인구 표시 하였다. 직사각 게이트는 포지티브 인구 P2 (FITC 및 mCherry) 및 음극 인구 P3을 선택 셀의자가 형광의 가장자리에 배치했다. t에 대한 형광의 수준그는 지역 P2 내에서 세포와 P3 후속 셀 FITC 또는 mCherry 형광 강도 단일 매개 변수 히스토그램 계산하여 시각화 하였다. Y- 및 X 축상의 형광 강도의 변화는 각각의 Ca의 α2δ1 V의 합계와 멤브레인 식의 신뢰성 지수를 제공한다. 형광 신호의 강도는 형광 색소 분자의 수의 함수로서 증가한다. 언급 한 바와 같이 각 조건에 대해 (바) 대표 FCS / SSC 도트 플롯. 10,000 이벤트의 총 분석을 위해 취득했다. 타원 게이트 (P1)이 낮은 FSC (죽은 세포) 또는 높은 SSC (집계) 이벤트를 제외하고 살아있는 세포 주위에 눈에 그려집니다. FITC (X 축) 형광 강도. 게이트 mCherry (Y 축)의 (BB) 주제 개의 파라미터 콘타는 FITC-mCherry 양성 세포 집단을 분리하는 세포의자가 형광의 에지 (P2 게이트에 넣었다 )과 음극 형광 세포 (P3). (BC) 단일 파상대 수 (또는 최대의 %) 형광 강도 세포 (FITC 또는 mCherry)의 히스토그램을 rameter. P2 게이트 (형광 양성 세포) 내의 셀에 대한 측정 형광 강도의 분포는 회색으로 표시되고, P3 게이트 (형광 음성 세포)에 존재하는 세포에 대한 형광 강도의 분포는에 오버레이로서 표시된다 투명 회색 줄거리. 알 수있는 바와 같이, 형광 강도는 mCherry와 FITC 모두 칼슘 V의 α2δ1 잘 표현하고 세포막에 분명히 존재 함을 나타내는. 강한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : N의 -glycosylation 사이트의 동시 돌연변이는 세포 표면 예를 중단칼슘 V의 α2δ1의 Pression의. 안정 TSA-201 칼슘 V의 β3 세포는 일시적을 pCMV-칼슘 V 1.2 WT 및 pmCherry - 칼슘 V α2δ1-HA WT 또는 돌연변이와 동시에 형질 감염시켰다. 전술 한 바와 같이 비 투과성이 (A) 및 투과성이 전지 (B)는 항 HA FITC 공액 된 항체로 염색 하였다. 항 HA FITC 공액 된 항체 염색 (오른쪽 패널)에 대한 형광 강도의 분포 mCherry 비해 FITC 형광 (좌측 패널) 및 히스토그램 플롯의 대표적인 두 파라미터 콘타은 이후 N의 -glycosylation 돌연변이 (NQ)을 위해 도시 넷 사이트의 중단 (4xNQ : N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) 16 사이트 (16xNQ : N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q 그대로 투과성이 비 또는 NP 세포 (A) 및 투과성이 또는 P 세포 (B)에서 / N986Q). DISTRIBP2 게이트 (형광 양성 세포) 내의 셀에 대한 측정 형광 강도의 ution는 회색으로 표시되고, P3 게이트 (형광 음성 세포)에 존재하는 세포에 대한 형광 강도의 분포는 투명의 오버레이로 표시되는 회색 줄거리. (B)에 도시 된 바와 같이, 형광도 수준은 세포 permeabilization 후 증가 하였다. 모든 형질 HA-태그 칼슘 V의 α2δ1 단백질이 염색 안티 - HA FITC 항체가 검출 된 것을 나타내는 (x 축에 마우스 오른쪽 시프트로 볼) 증가 모든 투과성이 형질 감염된 세포를 측정 FITC의 형광 강도. (C) 막대 그래프는 본래 비 투과성이 (표면 발현)에 FITC의 존재 하에서 측정 된 정규화 된 MFI 또는 투과성이 셀 (총 발현)을 나타낸다. 상대 형광 밀도는 각각의 조건에 대해 3 회 반복 (30,000 세포)를 측정하고 세포의 세 가지 배치로 하였다 transfec1 개월에 걸쳐 테드이 때문에 데이터는 각각의 조건에 대해 90,000 세포 평균 ± SEM으로 나타내었다. 피크 형광 강도는 형질 전환 후 24 및 36 시간 사이에 도달했습니다. 본래 비 투과성이 셀 측정 FITC의 ΔMFI 값 칼슘 V α2δ1-HA의 세포 표면 발현을 지표로하여, 투과성이 셀 측정 FITC위한 ΔMFI 값은 총 단백질 발현 (세포 표면과 세포 내 단백질 발현을 반영 ). FITC위한 ΔMFI는 FITC 양성 세포 (P2)의 형광 강도로부터 FITC 음성 세포 (P3)의 FITC 형광 세기를 뺌으로써 산출 하였다. 동일한 방법 mCherry 대한 ΔMFI을 계산하는데 사용 하였다. MFI 값 mCherry - 칼슘 α2δ1 V-HA WT에 대해 동일한 일 측정의 최대 값으로 정규화되었다. (D)의 막대 그래프는 비 투과성이 나 투과성이 셀 (TOT 측정 정규화 ΔMFI mCherry 도시알 식). SEM은 ± 결과 평균으로 표현되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 유동 세포 계측법 기반 분석은 성공적 전압 게이트 된 칼슘 채널 14,22,26의 조공 - 형광 표지와 연관된 서브 유닛의 상대적 총 세포 표면 수준의 측정에 적용했다. 이것은 유전 적 돌연변이의 영향을 조사 할 때 가장 사용함으로써 표지화 - 형광 태그 야생형 구조체의 내재적 형광 강도는 형광 표지 된 태그가없는 구조의 형광 강도보다 큰 100 배, 적어도 10 인 것이 요구되고 . 이 특정 예에서, 본원에 기재된 mCherry - 칼슘 V의 α2δ1-HA 컨스 잡음비 큰 신호와 이전에 발행 된 칼슘 V 1.2 HA 및 CA V 2.3 HA 구조에 대한 측정보다 더 큰 동적 범위를 수득 하였다. 이 많은 생각할 이유가있다. 이는 추측 할 수있는 칼슘 및 V의 세포 외 도메인의 HA 에피토프의 로컬 환경# 945; 2δ1 단백질은 FITC 접합 항 HA 항체의 신호 대 잡음비를 최대화한다.

또한,이 방법은 세포 표면에서 단백질의 수의 절대 값을 제공하지 않는다는 것을 명심하는 것이 중요하다. 기능성 채널 표현을 얻기 위해 필요한 태그 구조의 상대적 발현 측면 패치 클램프 나란히 수행하고 기준 (22)의도 7에 나타내는 바와 같은 조건으로 실험 유세포 그럼에도 얻을 수있다. 이들 데이터로부터, 피크 전류 밀도, 이온 채널 활성의 전체 계수는 일반적으로 태그의 칼슘 V α2δ1 서브 유닛의 표면 발현의 함수로서 증가시키는 것으로 추정 할 수있다. 이 전류 세포 표면 발현 분석의 주요 한계는 내인성 이온 채널에 대한 연구에 의해 적용 할 수없는 것으로 남아있다. 이 사실에 기인하는 소수의 항체 시판특히 이온 채널의 예측 외부 도메인에 결합하는 것으로 알려져있다. 또한 이와 같은 TSA-201 세포로 미분화 재조합 세포주에서 발현 연구 될 수있는 단백질의 주요 서열의 유전자 조작을 필요로한다.

분석의 최적화 중요한 단계 : 에피토프의 삽입을 방해하지 않아야하기 때문에 형광체의 해당 쌍의 식별은, 외부 에피토프 선택 및 삽입 부위의 위치 파악이 방법의 성공에 결정적 단백질 기능. 상이한 형광 물질 조합을 시험 하였다. 두 외부 에피토프 - 상기 R 피코 에리 트린 - 헤 마글 루티 닌 (HA) 에피토프 (YPYDVPDYA) 및 bungarotoxin 바인딩 사이트 에피토프 (WRYYESSLEPYPD) 27 세 투과성 형광 접합 된 항체, 즉 FITC (형광 염료)를 평가하고, 체육-Cy7- 결합 - 항체. 또한, 10 개 이상의 서로 다른 삽입외부 HA 에피토프에 대한 사이트는 칼슘 V의 α2δ1 내에서 시험 하였다. 부위 특이 적 변이 및 재조합 DNA 기술을 필요로하는 에피토프의 삽입에 관련하여, 동일한 영역 내에 프라이머 세 세트의 최소 설계를 의뢰한다. 9 잔기로, HA 에피토프 시판 형광 접합 된 항체 그러나 27 개의 뉴클레오티드의 삽입 성공률 점 돌연변이보다는 낮은 존재하는 작은 에피토프 중 하나이다. Tetracysteine 모티브 (잔류 시스테인 - 시스테인 - 프로의 Gly-시스테인 - 시스테인)은 2 잔류는 HA 에피토프하지만보다 작은 형광 비소 헤어핀 바인더 막 투과 및 막 - 결합 단백질 (28)의 분석에 적합하지 않습니다 수 있습니다. 예비 실험은 두 세포 mCherry 형광체와 녹색 형광 단백질 (GFP)을 실시 하였다. 형광 요구 1) 방출 스펙트럼 : 세 가지 기준은 성공적인 이온 채널과 형광의 쌍을 식별하는 데 사용 된겹치지 않도록 (자세한 내용은 참고 문헌 20, 21 참조) 2) 태그 구조체의 발현은 표준 전기 생리 학적 방법에 의해 유효로 재조합 세포에서 작용 성 이온 통로를 생성; 3) 상기 제어 구조체의 발현은 강력한 형광 판독 값을 생성한다. 태그 또는 형광의 삽입 채널 기능을 방해하는 경우 이러한 기준들 중 하나는 예를 들어, 충족되지 않은 경우, 하나의 원점으로 되돌아 가서, 외부 에피토프 및 / 또는 삽입 부위의 삽입 위치를 변경한다 형광의. 단백질의 C 말단과 형광 물질 사이에 5 글루타민 잔기 링커는 단백질의 기능을 개선하는 데 도움이 있었다. 또한, 단백질 기능 및 / 단백질의 글리코 실화에있어서 중요한 역할을하는 공지되지 않은 대형 루프의 외부 에피토프를 삽입하는데 도움을 줄 수있을 것이다. 하나는 약간의 기술적 인 측면을 인식 할 필요가있다.

리포좀 - 매개 TRANSF의 성공률TSA-201 세포에서 ection은 칼슘 V의 α2δ1 내에서 두 에피토프의 삽입 후 감소 될 수있다. 따라서 소설 DNA 구조와 형질 전환 효율을 재조정하는 것이 좋습니다. 30 kDa 단백질의 삽입이 DNA의 분자량을 변화 때문에 일어난다. 필요한 경우, 3 시간의 긴 기간 (24 ~ 72 시간) 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다 : 2 내지 1 : 1로 한 리포좀 비율로 DNA를 수정할 수있다. 세포를 permeabilizing에 적합한 제형을 선택하는 것이 중요합니다. 이 프로젝트에 대한 평가 대부분의 수제 솔루션은 세포가 집계 및 사이토 흐름을 방해하는 원인으로 밝혀졌다.

형광 접합 된 항체로 세포를 염색하면서 노광을 억제하는 광표백 신호의 손실을 제한하는 것이 중요하다. 형광 배경을 최소화하기 위해, 사용 전에 접합 된 항체의 과잉을 원심 분리하는 것이 중요하다. 마지막으로, t를 분석 극도 중요가능한 한 빨리하고 늦어도 후 24 시간 이상 같은 흐름 cytometer에 그 세포. 4 ℃에서 밤새 염색 된 세포를 유지하는 것으로, 신호를 감소 및 세포 생존을 저해한다. 배치에서 일괄 형광 접합 된 항체의 고유 형광의 변화는 테스트 구조체의 형광 강도가 제어 구조의 형광 세기의 함수와 동일한 실험 조건 하에서 발현으로보고 될 필요가 있다고 지시.

잡음비 전체적으로 양호한 신호를 달성하기 위하여,이 세포 사멸을 감소 셀 피펫을 최소화하고 부드럽게 같은 3 × 106 세포 / ml의 유량으로 주입되고 그 사이토 세포를 재현 탁 것을 권장한다. 높은 세포 농도 셀 흐름을 감소 및 사이토 흐름을 방해 할 수 있음을주의. 한편, 낮은 세포 농도는 더 긴 처리 시간을 필요로한다. 하나 이에 TY에 따라 농도를 조정해야세포의 흥을 분석한다.

대안 분석 : 4 개의 큰 범주로 세포 표면의 세포막 하강에서 이온 채널의 존재 여부를 기록하도록 배치 된 추가의 방법 : 1) 형광 접합 된 항체 및 표적 단백질과의 높은 친 화성 상호 작용을 이용하는 공 초점 영상 방법; 2) 비 오티 닐화 시약에 의한 목적 단백질의 공유 적 변형 쉬고 단백질 화학 기술; 3) 비 - 정상 잡음 분석 전기 생리 수단; 방사성 프로브와 표적 단백질과 4) Photoaffinity 라벨. 전압 게이트 된 칼슘 채널, 삼중 (±)와 photoaffinity 라벨의 경우 - [3 H]를 PN 200-100은 히드로 가족의 고친 화성 리간드는 1980 (31)에 광범위하게 사용되었다. 그것은 매우 민감한 분석 남아 있지만 출현 다음과 같은 패션에서 떨어진 방사성 물질 (31)의 조작을 포함특히 젊은 연구자와의 고감도 형광 및 발광 프로브. 또한, 표면 발현과 기능들 사이의 상관이 방법의 범위를 넘어 지도록 길항제의 존재하에 이온 채널 활성을 측정 할 수 없다. 실험 연속체의 다른 끝에서, 이온 채널의 비 - 정상 잡음 분석 분 동안 녹음 안정된 기준선 고품질 기가 시일 패치 클램프 기록을 요구한다. 이 방법 중 하나는 임의의 소정 전위 (32-34)에서 측정 된 평균 전력의 함수로서 잡음 분산을 그래픽 플롯의 기울기로부터 단일 셀에서 열려 이온 채널의 수를 추출 할 수있다. 그것은 표준 전기 생리 방법 같은 장식을 표시합니다. 그것은뿐만 아니라 스펙트럼 분석 32-34,하지 세포 생물학의 주식과 좋은 익숙을 필요로하는 노동 집약적 낮은 처리량 방법이다. analysi의 또한, 이러한 유형의S는 막 단백질의 총 수보다 다를 수 (개방 상태에서) 활성 이온 채널의 수를 식별한다. 비오틴 시약 세포 표면 단백질을 표지는 세포막에 존재하는 단백질을 식별하기 위해 비교적 효율적인 도구이다. 이 방법은 바이오틴과 더 높은 친 화성 막 impermeant 스트렙 트 아비딘 또는 바이오틴 분자의 결합을 높은 특이성 비공유 의해 막 단백질의 공유 적 변형을 이용한다. 이 접근법은 질적 안정하지만 방해하거나 정기적으로 웨스턴 블랏 기술을 이용하여 단백질을 정량 계시와 연관된 문제에 의해 제한된다. 공 초점 이미지 및 그 유도체 널리 세포 표면 (35)과 막 단백질의 공동 현지화를 기록하는데 사용된다. 질적 세포막 격리 또는 수크로오스 구배 36 않고 차등 원심 분리 기술을 이용하여 가능한 한 유지된다. 상기 유동 세포 계측법에 ASSA 마찬가지로Y는, 상기 표적 단백질과 형광 접합 된 항체의 매우 특이 적 상호 작용에 의존한다. 특히 전반사 형광 이미징은, 막 표면 37,38에서 단일 이온 채널의 분포 및 분자량 거동을보고 할 수있는 강력한 방법이다. 판독은 확실히 눈길을 끄는하지만 낮은 처리량 작은 볼륨 접근 남아있다. 그 분석의 모든 과학적 장점이있다. 높은 처리량 유동 세포 계측법 기반 분석은 판독 재현성 및 정량 측정면에서 우수하지만, 큰 코어 기관 시설의 일부 세포 분류기 계측법 다중 레이저 흐름에 쉽게 접근을 요구한다. 형광 기반 플레이트 판독기는 저렴하고 더 접근하지만 신호대 잡음비로 인해 높은 형광 배경으로 큰 부분 낮았다 동일한 실험 조건 하에서 동일한 구조로 측정 얻어진. 형광 - 결합 비용tibodies 또한 테스트 구조로 처리되어야하는 적절한 대조 실험의 수에 의한 특히 반영 할 수있다. 같은 주제에 유사 활동은 화학 발광 (29, 30)에 의해 분석 될 수있다 효소 말이 무 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 효소 기자 항체 효율적인 비용 할 수있는 형광 염료 복합 항체를 변경하는 것을 포함한다.

결론 : 2 색 형광 분석은 유동 세포 계측기를 사용하여 배양 된 세포에서 발현 된 재조합 단백질의 상대적인 세포 표면 발현을 측정하기 위해 개발되었다. 두 형광 파라미터가이 전류 시험에 사용되었지만, 이러한 접근법의 높은 융통성을 보여주는 하나의 셀에 30 개 이상의 형광 프로브의 동시 검출 의무가 유세포. 이것은 높은 처리량 고감도 분석은 유전자 돌연변이 22,26 또는 번역 후 modificati의 영향을 조사하기 위해 적응 될 수있다기능 (23)뿐만 아니라, 막 단백질 기술 (39)의 표면 인신 매매에 대한 보호자의 약리학 적 프로파일을 공부하고있다. 이 프로토콜 뒤에 자극이 분리되어 재조합 세포에서의 이온 채널 막 발현 유전자 돌연변이의 영향을 평가하기 위해 필요로 일어났다. 다른 대립 유전자의 돌연변이의 조합이 심장 돌연사 (40)를 실행해야 할 수도 있기 때문에 모델 세포주에서 돌연변이 채널 기능 장애의 정도는 항상 부분에 돌연변이 캐리어 (5)의 임상 증상의 정도와 상관 관계하지 않는 것을주의하는 그러나 중요하다 41. 이러한 맥락에서, 상기 분석은 기능 상실 돌연변이 (22)와 연관된 하나의 유전자에 단일 또는 다중 돌연변이 연구의 빠른 첫번째 단계 근사치를 제공하는 것으로 볼 수있다. cardiomyocy의 분화 된 세포에서 미래에 동일한 구조의 바이러스 - 매개 발현을 구상 그러나 그럴듯테 계보. 분류기는 균질 한 세포 집단의 현탁액 리포트 형광 강도 생균 처리 사이토 전체적으로 다른 이미징 또는 발광 기법에 비해, 흐름. 이 프로세스에도 온화한 조건 하에서 (42), 파라 포름 알데히드, 지방 세포막 permeabilization을 유도하는 방법으로 고정 없이도 수행된다. 분석이 작동 하루에 수백 개의 샘플까지의 분석, 신속한 특정 및 편리합니다. 분석 이외에, 세포는 결국 동일한 세포막 단백질의 더 높거나 더 낮은 수준을 발현하는 세포의 기능적 가능성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법에 의해 정렬 될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

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References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

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