Bestemmelse av relativ celle overflaten og Total ekspresjon av rekombinante ionekanaler ved hjelp av flowcytometri

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Arvet hjertearytmier er ofte forårsaket av mutasjoner som endrer overflate levering av én eller flere ionekanaler. Her, tilpasse vi flowcytometri analyser for å tilveiebringe en kvantifisering av den relative totale og celleoverflate-protein ekspresjon av rekombinante ionekanaler uttrykt i TSA-201-celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dette papir gir en pålitelig analyse for å rapportere relativ celleoverflate-ekspresjon av membranproteiner slik som ionekanaler uttrykt i rekombinante celler ved bruk av eksisterende teknologi flowcytometri. Ionekanaler er poredannende membranproteiner som er ansvarlig for styring av elektriske signaler ved å portstyre strømmen av ioner gjennom cellemembranen. De blir klassifisert av aktiveringsmekanismen, natur, og selektiviteten til ion-arter i transitt gjennom porene hvor de er lokalisert. På de cellulære og vev nivåer, de makroskopiske ion fluks gjennom ionekanaler er et produkt av biofysiske (gating og gjennomtrengning), biokjemisk (fosforylering), og biogenesis (syntese, glykosylering, trafficking, og nedbrytning) eiendommer 1. Hver av disse prosessene er unik for hver type av ionekanaler og er optimalisert for å oppfylle den fysiologiske rollen til ionekanal. Følgelig, endringer i noen av disse finjusterte prosesser gjennom enarvet eller en genetisk modifikasjon, ofte referert til som "ionekanalsvikt", kan være skadelig for celle homeostase. Det er viktig å understreke at levere den "riktige" mengde av ionekanaler på celleoverflaten er kritisk for celle homeostase. Selv små økninger (gain-of-funksjon) og små reduksjoner (tap-av-funksjon) i ionekanal aktivitet har potensial til å forårsake en alvorlig patologi over livsløpet. Defekter i celleoverflaten levering av modne ionekanaler er en viktig determinant i en rekke kanalopatier, som cystisk fibrose (CFTR ion kanal) 2 og hjertearytmier av lang QT-syndrom form (kardiale kaliumkanaler) 3.

Kanalopatier er assosiert med hjerte plutselig død 4. Den nåværende globale utbredelsen av alle hjerte kanalopatier antas å være minst 1: 2,000-1: 3000 per individ 5 og er ansvarlig for omtrent halvparten av plutselige arytmisk hjertedød cases 6. Dysfunksjon i hjerte de spenningsstyrte natrium, kalium- og kalsium-selektive ionekanaler er kjent for å spille en nøkkelrolle i denne prosessen. Den L-type Ca V 1.2 de spenningsstyrte kalsiumkanal er nødvendig for å initiere synkronisert hjertemuskelsammentrekning. Kardiale L-type Ca V 1.2 kanal er en multi-underenhet-protein-komplekset som består av de viktigste poredannende Ca V α1-subenheten og Ca V ß og Ca V α2δ1 tilleggs subenheter 7-12. Vær oppmerksom på at full bemanning av hjelpe subenheter er nødvendig for å produsere funksjonelle Ca V 1.2 kanaler på plasmamembranen og dynamiske samspillet mellom disse underenhetene er viktig å støtte den normale elektriske funksjon av hjertet 13. Ca V ß fremmer celleoverflate-ekspresjon av Ca V 1.2 kanaler gjennom et ikke-kovalent nanomolar hydrofob interaksjon 14. Co-uttrykk for Ca V α2δ1 subenhet with Ca V ß-bundet Ca V α1 stimulerer peak strøm uttrykk (5-10 ganger) og fremmer kanal aktivering ved flere negative spenninger. Gain-av-funksjon mutasjoner av den poredannende subenhet Ca V 1.2 har vært forbundet med en form av ventrikulære arytmier som kalles forlenget QT-syndrom 15, mens en rekke av punktmutasjoner i de tre viktigste subenheter som danner L-type Ca V 1.2 kanal det er identifisert hos personer som lider av arytmier av kort QT-syndrom skjema 16,17. Ionekanaler er membranproteiner som kan undersøkes fra et biokjemisk perspektiv (protein kjemi) eller ved bruk av elektroverktøy (strømgenererende maskiner) og ofte ved hjelp av disse komplementære tilnærminger. Elektro, spesielt hel-celle patch-fastspenning, er en passende metode for å klargjøre funksjonen av ionekanaler 15, men kan ikke løse endringer i protein handel fra endringer i deres biofysiskeegenskaper. Protein kjemi har imidlertid ofte begrenset bruk på grunn av den relativt lave ekspresjon av store membranproteiner i forhold til mindre oppløselige proteiner. Robuste high-throughput metoder ved hjelp av fluorescens avlesning må utvikles for å spesielt ta opp mangler i protein biogenesis forårsaker endringer i celleoverflaten uttrykk for ionekanaler.

Flowcytometri er en biofysisk teknologi ansatt i celle telling, sortering, biomarkør oppdagelse, og protein engineering 18. Når en prøveoppløsning av levende celler eller partikler injiseres i et flowcytometer, blir cellene organisert til en enkelt strøm som kan bli probet ved maskinens deteksjonssystem (figur 1). Den første strømningscytometer instrument fremstilt i 1956 19 detektert bare en parameter, men moderne væskestrømsfotometere har flere lasere og fluorescens-detektorer som tillater påvisning av mer enn 30 fluoriserende parametere 20,21.Filtre og speil (utslipps optikk) dirigere lysspredning eller fluorescerende lys av celler til et elektronisk nettverk (fotodiode og detektorer) som konverterer lys proporsjonalt med intensiteten. Digitale data er analysert ved hjelp av spesialisert programvare og den primære effekt vises som et prikkplott 21.

Figur 1
Fig. 1: Biofysiske prinsippene ved flowcytometri sortering Enkeltceller blir presset gjennom en dyse under høyt trykk i en strøm av skjermfluid som beveger dem på tvers av ett eller flere laserutspørrings poeng. Lysstrålen avbøyes av de passerende celler, og lyset samles i fremoverretningen (fremover diffusjon, FCS) blir sendt til en fotodiode som omdanner lys til et signal proporsjonalt med størrelsen av cellen. Lyset er også samlet i en 90 ° vinkel til laser banen og sendt til detektorene (også kalt fotomultiplikatorer (PMT)).Dette lyset ledes gjennom dikroiske speil som tillater påvisning av sidespredningssignalet (SSC), som gjenspeiler den detaljnivået i cellene, og de fluorescerende utslipp hvis eksiterte fluorokromer er til stede i cellen. Tre detektorer (grønn, gul, og rød) er representert med ulike bølgelengde båndpassfiltre, slik at den samtidig påvisning av ulike fluorokromer. De forskjellige signalene digitalisert av en ekstern datamaskin og konvertert til data som vil bli analysert for å kvantifisere egenskapene til cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den high-throughput kapasitet på flowcytometere ble utnyttet til å kvantifisere den relative membran uttrykk av rekombinant villtype og trafficking-mangelfull spennings gated L-type Ca V 1.2 kanaler og tilhørende underenhetene i levende celler. cDNA konstruerer coding for proteinene var dobbelt merket for samtidig å bære en ekstracellulær ikke-fluoriserende epitop som kan oppdages ved hjelp av en ugjennomtrengelig fluorescerende antistoff og et intracellulært fluorofor som er konstitutivt fluorescerende. Både den ekstracellulære epitop, innføres i et ekstracellulært løkke av proteinet, og den intracellulære fluorofor, innføres etter den C-terminale enden, blir omregnet med proteinet. I denne serien av forsøk ble Ca V α2δ1 proteinet konstruert for å uttrykke et ekstracellulært hemagglutinin (HA) epitop (YPYDVPDYA) som detekteres ved hjelp av en ugjennomtrengelig FITC (fluoresceinisotiocyanat) -konjugert anti-HA og mCherry som den indre intracellulære fluoroforen. For å bestemme den relative celleoverflate-ekspresjon nivået av mCherry-Ca V α2δ1 HA-kodede protein, ble rekombinante celler som uttrykker fusjonsproteinet høstet etter transfeksjon, og farget med FITC-konjugert mus monoklonalt anti-HA-epitop tag antibody (figur 2). FITC er en organisk fluorescerende stoff som er betydelig mindre enn enzym journalister og derfor ikke så sannsynlig å påvirke biologisk funksjon. mCherry- Ca V α2δ1-HA overexpressed i TSA-201cells, produserer en betydelig tre-log økning i FITC fluorescens og mCherry fluorescens på todimensjonale plott 22. Gitt at HA-epitop er lokalisert i den ekstracellulære del av proteinet, fluorescensintensiteten for FITC oppnådd i nærvær av intakte celler gjenspeiler den relative indeksen til celleoverflate-ekspresjon av HA-kodede protein. Tilgjengeligheten av HA-epitop i konstruksjonene er systematisk validert ved å måle FITC signal etter celle permeabilization. Dette tiltaket tjener også til å underbygge den normaliserte totale protein ekspresjon, siden de relative intensiteter for FITC fluorescens estimert i permeabiliserte celler er kvalitativt sammenlignbare med de relative fluorescens-verdier for mCherry målt under permeabilized og ikke-permeabilized forhold 22,23. Det er viktig å merke seg at den indre fluorescens-spekteret er forskjøvet mot høyere verdier etter permeabiliseringen men at den eneste verdi som rapporteres er endringen i fluorescens-intensitet sammenlignet med kontroll-konstruksjonen. Relative endringer i fluorescens intensitet for test konstruksjoner blir estimert ved hjelp av ΔMean fluorescensintensitet (ΔMFI) verdier for hver fluorophore (mCherry eller FITC). Eksperimenter er utformet for å måle fluorescensintensiteten av test konstruksjonen i forhold til fluorescensintensiteten av styre konstruksjonen uttrykt under de samme betingelser for å begrense eksperimentelle variasjoner i den indre fluorescens av det fluorofor-konjugert antistoff. To membranproteiner ble med hell undersøkt ved hjelp av denne analysen: den poredannende subenhet av L-typen de spenningsstyrte kalsiumkanal Ca V 1,2 14,22 og i en annen serieeksperimenter, den ekstracellulære hjelpe Ca V α2δ1 subenhet 22,23. Den følgende protokoll ble anvendt for å bestemme celleoverflate-ekspresjon av Ca V α2δ1 subenheten til hjerte L-type Ca V 1,2 kanalen under kontrollbetingelser, og etter mutasjoner som påvirker posttranslasjonell modifikasjon av ionekanal. Under standardiserte eksperimentelle betingelser, celleoverflaten fluorescensen av FITC øker kvasi-lineært med ekspresjon av cDNA som koder for de mCherry-Ca V α2δ1-HA-proteiner (figur 5 fra referanse 22).

Figur 2
Fig. 2: Skjematisk representasjon av total og membranmerking i flowcytometri forsøksprotokoll Ordningen skisserer noen av de hovedtrinn som er nødvendige for å kvantifisere den relative totale og celleoverflate-ekspresjon av rekombinante ionekanaler etter flow cytometri. Cellene transfektert med dobbel-taggede konstruksjon mCherry-Ca V α2δ1-HA i TSA-201 celler (1) og farget før eller etter permeabilization (2). Funksjoner med flere data er kjøpt i et flowcytometer (3) for multivariat analyse (4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dobbelt Tagged DNA-konstruksjoner

  1. Sett HA epitop (YPYDVPDYA) i den ekstracellulære linker av Ca V α2δ1 mellom D676 og R677 ved seterettet mutagenese (figur 3B) 20. Bruk Forward primer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC og revers primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
  2. Subklon cDNA-sekvensen av det merkede HA Ca V α2δ1 inn i pattedyr pmCherry-N1-ekspresjonsvektor konstruert for å uttrykke proteinet fusjonert til N-terminalen av mCherry mellom SacI og SalI-setene (figur 3B) 20.
    MERK: Riktig kanalfunksjon må testes med kontroll konstruksjonen ved hjelp av standard elektrofysiologiske metoder 24.

2. Liposom-mediert Transient Transfeksjon (30 min, alle trinn utføres under Laminar Flow Hood)

  1. Dag 1: Plate en halv million av TSA-201 celler (eller HEKT) i35 mm kulturskåler med 2 ml av Dulbeccos høy glukose minimum essential medium (DMEM-HG) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS) dyrkningsmedium. Telle celler ved hjelp av en standard hemacytometer. Vurdere celleviabilitet fra en fraksjon av celleprøven ved bruk av trypanblått. Plate nok celler til å nå 90% konfluens på tidspunktet for transfeksjon.
  2. Dag 2: Endring dyrkningsmedium med 2 ml fersk forvarmet (37 ° C) kulturmedium uten PS.
  3. For hver transfeksjon prøve, forberede to 1,5 ml rør. I røret 1, fortynne 4 ug DNA i 250 ul av redusert serummedium. I rør 2, bland 10 ul av den liposom-mediert transfeksjon reagens med 250 ul serum redusert kulturmedium. Bland forsiktig transfeksjon reagenser før bruk.
  4. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
  5. Kombinere innholdet i røret 1 og røret 2, bland forsiktig og inkuberes i minst 20 minutter ved romtemperatur.
  6. Legg liposomene / DNA-komplekser til de dyrkede celler og rist den forsiktig kultur tallerken å blande.
  7. Inkuber ved 37 ° C under 5% CO2 atmosfære i 24 timer.

3. Farging av celler for flowcytometrisystemer (3 timer)

  1. Forbereder celleprøver
    1. Dag 3: Fjern medium fra kulturen fatet nøye og vaske cellene med 400 ul av forvarmet (37 ° C) 0,05% trypsin-1x EDTA (etylendiamintetraeddiksyre).
    2. Legg 400 mL av trypsin-EDTA og inkuber fatet ved 37 ° C under 5% CO 2 atmosfæren i 5 min for å tillate celler til å løsne fra fatet.
    3. Stoppe den enzymbehandling ved å tilsette 1 ml kaldt kulturmedium uten PS og vaske ut alle cellene fra overflaten ved å pipettere forsiktig 4-5 ganger. Unngå over-fordøyelse og over-pipettering for å redusere celledød.
    4. Samle celler i 1,5 ml rør og plassere umiddelbart på is. Bruk iskald løsninger og holde cellene ved 4 ° C for å hindre at internaliseav overflaten antigener. Reduser belysning for å begrense fotobleking av fluorescerende signal.
    5. Sentrifugerør ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Nøye aspirer og kast supernatanten.
    6. Re-suspendere pelleten i 1 ml fosfat-bufret saltvann (1X PBS) for å fremstille en enkel cellesuspensjon.
    7. I korthet vortex rørene svært forsiktig og gjenta trinn 3.1.5 og 3.1.6 for å fjerne dyrkingsmedium.
    8. Re-suspendere pelleten i 600 mL av 1 x PBS og justere cellekonsentrasjonen til et minimum på 3 x 10 til 6 celler / ml.
    9. Del cellene i to nye 1,5 ml rør for ekstracellulær og intracellulær farging. Inkluder hensiktsmessige kontroller for å diskriminere spesifikk farging fra ikke-spesifikk farging.
      MERK: isotypekontrollantistoff hjelper vurdere nivået på bakgrunnsfarging og bør ideelt matche hver primær antistoff mange arter, isotype og fluorophore. Bruk isotype kontroll og konjugert antistoff ved sammeproteinkonsentrasjon.

Tabell 1
Tabell 1: Flow-cytometri eksperiment kontrollprøver for ikke-permeabilized og permeabilized celler Hvert eksperiment må inneholde følgende negative kontroller:. (1) Nontransfected celler (uten antistoff, med isotype eller med konjugert antistoff). (2) Transfekterte celler med protein av interesse subklonet i et plasmid uten konstitutiv fluorescerende intracellulære fluorokrom (pCMV- Ca V α2δ1-HA) eller med dobbelt kodede konstruksjon (pmCherry-Ca V α2δ1 og inkubert uten antistoff, med isotype eller med det konjugerte antistoff). Enkle fargekontroller brukes for kompensasjon av fluorokromkonjugerte utslipp overlapping. De samme kontrollene er kjørt for ikke-permeabilized og permeabilized forholdene i hver serie eksperimenter.

  1. Cell Surface Farging av IntaktLive-Cells
    1. Alikvot 1 x 10 6 celler / 100 ul i 1,5 ml rør.
    2. Tilsett FITC-konjugert monoklonalt anti-HA-antistoff ved 5 ug / ml og, vortex før inkubering av cellene på en vippeplattform (200 rpm) i mørke ved 4 ° C i 45 minutter.
      MERK: Den optimale konsentrasjonen av antistoff ble bestemt i preliminære titrering eksperimenter (figur 4).
    3. Fjerne cellene fra den mørke og tilsett 900 ul av 1 x PBS / rør. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    4. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml av 1 x PBS, Vortex og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    5. Gjenta vaskingen (trinn 3.2.4) to ganger for å fjerne eventuelt ubundet antistoff. Dersom en ukonjugert primært antistoff brukes, inkubere med det passende sekundære antistoff.
    6. Etter den siste vask, resuspender cellene i 500 mL av 1 x PBS og overfør enkelt cellesuspensjon i 5 ml flowcytometri rør. Hold cellens i mørke ved 4 ° C inntil løper prøven.
    7. Kjør prøvene på en strømningscytometer. For best resultat, analysere cellene på flowcytometeret så snart som mulig og senest innen 24 timer etter.
  2. Intracellulær Farging: Fiksering, Permeabilization, og Farging
    1. Aliquot 1 x 10 6 celler / 100 ul i 1,5 ml rør og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    2. Fjern supernatant og resuspender cellene i 100 pl fiksering-permeabiliseringen løsning direkte fra lager.
    3. Inkuber i mørke ved 4 ° C i 20 min.
    4. Tilsett 100 ul av nyfremstilt 1x permeabiliseringen-vaskebuffer (fortynne 10x permeabiliseringen-vaskebuffer i destillert H2O). Vortex og sediment celler ved hjelp av et bord sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    5. Aspirer og kast supernatanten.
    6. Gjenta trinn 3.3.4 og 3.3.5.
    7. Legg FITC-konjugert monoklonalt anti-HA antistoff ved 5ug / ml i 100 pl 1 x permeabiliseringen-vaskebuffer og, vortex før inkubering av cellene i mørke ved 4 ° C i 30 minutter.
      MERK: intracellulær farging blir utført ved å følge den samme prosedyre som den som ble anvendt for celleoverflatefarging. Saponin-mediert celle permeabiliseringen er imidlertid en hurtig reversibel prosess, og derfor er det viktig å erstatte 1 x PBS med 1x Perm / vaskebuffer for å holde cellene i kontinuerlig nærvær av saponin i løpet av intracellulær farging.
    8. Fjerne cellene fra den mørke og tilsett 100 ul permeabiliseringen-vaskebuffer. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    9. Aspirer nøye supernatanten og resuspender pelleten i 100 pl permeabiliseringen-vaskebuffer, Vortex og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    10. Gjenta vaske (trinn 3.3.9) en gang til for å fjerne ubundet antistoff.
    11. Etter den siste vask, resuspender cellene i 500 mL av 1 x PBS og overføre single cellesuspensjon til 5 ml flowcytometri rør. Holde cellene i mørke ved 4 ° C inntil injisering av prøven inn i strømningscytometer.
    12. Kjør prøvene på en strømningscytometer. Kjør de faste prøvene på cytometeret så snart som mulig, men senest en uke etter farging. Kjør ikke-permeabilized og permeabilized celler på samme dag.

4. flowcytometrisystemer

  1. Flowcytometer Cell Sortering Daily Setup
    1. Slå på flowcytometri programvare. Før eksperimentere, kalibrere og oppsett strømningscytometeret cellen sorter å sikre optimal instrumentytelse (dvs. laser og optikk utfører spesifikasjon, laser og flyt celle er riktig justert) ved hjelp av instrumentoppsett perler.
    2. Bruk 100 mikrometer dyse med 20 psi slire trykk.
      MERK: dysen trenger ikke å bli endret på en benk strømningscytometer.
    3. Sett cytometeret er strømningshastigheten i henhold til produsentenser spesifikasjonen. Svært høye strømningshastigheter vil redusere følsomheten ved påvisning av variasjoner i fluorescens.
    4. Velg blå (488 nm for å opphisse Fluorescein Isothiocayanate eller FITC) og gul-grønn (561 nm for å opphisse mCherry) lasere. Samle FITC og mCherry fluorescens nivåer med en 530/30 nm og med en 610/20 nm båndpassfilter hhv.
    5. Skaff fremover scatter (FCS) versus side scatter (SSC) prikkplott for ufargede celler ved hjelp lineær skala. Juster hver enkelt detektor forsterkning å visualisere celler i nedre venstre kvadrant av prikkplott.
  2. Eksempel Lesing av intakte ikke-permeabilized Cells
    1. Still P1gate for levende ikke-permeabiliserte celler ved opptegning en fri form rundt cellene som skal analyseres, med unntak av cellerester og celleaggregatene, og dermed begrense den fluorescens-signalet til intakte celler.
      MERK: Levende / døde eksklusjonsfargestoffer kan brukes til å lette gate plassering på levende celler. Sett 10.000 hendelser for å registrerei stoppe gate P1. Sett dette til et høyere antall hendelser ved behov.
    2. Acquire mCherry versus FITC to-parameter contour plott for å oppdage baseline autofluorescence av ufargede celler. Bruk bi-logaritmisk skala for å vise negative verdier og forbedre oppløsningen mellom populasjoner 25. Juster til hver enkelt detektor spenning for å sette de ufargede-negative celler i den nedre delen av de første ti enheter av log fluorescensintensitet plott.
    3. Erverve alle intakte ikke-permeabilized prøver ved hjelp av innstillingene som er etablert i 4.1.5 og 4.1.6 og samle FSC, SSC og signaler i fluorescens detektorer.
    4. Eksport og lagre * .fcs filer som skal brukes til analyse ved hjelp av flowcytometri analyse programvare.
  3. Eksempel Lesing av permeabilized Cells
    1. Flytt P1 gate for å velge levende celler i permeabilized prøver og justere FSC og SSC spenning som vist i 4.1.5 og 4.1.6.
    2. Erverve alle permeabilized prøver og samle FSC, SSC ennd signaler i fluorescens detektorer.
    3. Eksport og lagre * .fcs filer som skal brukes til analyse ved hjelp av flowcytometri analyse programvare.
  4. Dataanalyse
    1. Start flowcytometri analyse programvare og import * .fcs filer lagret i 4.2.4 og 4.3.3.
    2. Klikk på den første prøven oppført i arbeidsområdet vinduet. Et nytt vindu oppkalt etter røret ID-nummer åpnes automatisk. Start gating prosessen i handlingen i SSC versus FSC. Tegn en gate (P1) ved hjelp av Ellipse ikonet rundt levende celler og eliminere eventuelle rusk, døde celler, eller aggregater som har forskjellig fremover scatter og side scatter enn levende celler
    3. For å trekke to-parameter contour plott av mCherry (y-aksen) versus FITC (x-aksen) fluorescens intensitet av levende celler, klikker du først på x-aksen og velg FITC-A-kanal, og klikk deretter på y -aksen og velg PE-mCherry-A-kanal. Klikk på ikonet "Quad" for å plassere kvadrant markør på kanten av enutofluorescent cellene i hver kanal fluorescens.
      MERK: gate satt rundt FITC og mCherry positive celler er P2 gate. Fluorescensen negative cellepopulasjon er referert til som P3-porten. Se figur 5 for representanten gating metoden som brukes i denne artikkelen.
    4. Velg P2 og P3 porter og klikk på "Legg Statistikk" -ikonet i den opprinnelige arbeidsområde vinduet. Klikk på "Count" (antall positive celler) og klikk på "Mean" (Mean fluorescens intensitet av hver fluorokromkonjugerte) eller "Median" (Median fluorescensintensiteten av hver fluorokromkonjugerte) statistikk blant listen over alternativer. Klikk på "Legg til statistikk" ikonet igjen. Alle disse verdiene blir automatisk overført til den opprinnelige arbeidsområdet vinduet.
      MERK: "betyr" brukes bare hvis fluorescens intensitet følger en normalfordeling. I alle andre tilfeller, klikk på "Median" -kategorien. MFI dermed kan referere til Mean Fluorescence intensiteteny eller Median fluorescensintensitet.
      MERK: Det neste trinnet er å bruke portene "parametere og statistikk til alle prøver autosøk av cytometeret.
    5. I arbeidsområdet vinduet kan du bruke musen til å dra og slippe porter og statistikk parametere på linjen merket alle prøvene.
    6. Generere en batch rapport av to-dimensjonale contour plott (mCherry vs FITC) og histogrammer (legemer versus fluorescens intensitet) for ikke-permeabilized og permeabilized celler (figur 6A - B).
    7. Fra statistikken som genereres i trinn 4.4.4, beregne gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) for hver fluorochrome for de fargede celler. Fra denne verdi, trekker MFI-verdi som oppnås fra ufargede celler for å kvantifisere overflaten og total ekspresjon av proteinet av interesse.
    8. Rapportere ΔMFI verdiene for hver fluorophore (mCherry og FITC) (figur 6C - D). Normalisere ΔMFI målt for Ca MERK: Den absolutte verdien av fluorescens intensitet kan variere sterkt avhengig av batch av antistoffer og de tekniske evnene til hver lab arbeidstaker, derav behovet for å normalisere fluorescens intensitet mutant konstruere bruker WT konstruere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne artikkelen beskriver en pålitelig protokoll for å kvantifisere total og celleoverflaten av rekombinante ionekanaler uttrykt i TSA-201cells ved en to-farge strømningscytometri-analyse. Som et eksempel ble det relative celleoverflate og totalt protein ekspresjon kvantifisert for Ca V α2δ1subunit. For å utføre de to-farge strømningscytometri-analyse, ble Ca V α2δ1 dobbelt merket for å uttrykke en ekstracellulær ikke-fluoriserende epitop HA som kan detekteres av et anti-HA FITC-konjugert antistoff og en konstitutiv fluorescerende intracellulær mCherry fluoroforen. Eksitasjon og emisjonsspektra for FITC og mCherry viser at FITC er begeistret med 88% effektivitet ved 488 nm laser men effektiviteten synker til 0% med 561 nm laser. Den mCherry viser 63,9% av sin maksimale fluorescens når eksitert ved 561 nm laser, men bare 7,6% ved 488 nm laser (figur 3). Eksitasjon og emisjon speCtra for begge fluoroforer utvise optimal lys innsamling og minimal overlapping med de forskjellige lasere og filter valgt. Flowcytometri analyser kunne gi kvantitativ informasjon om den relative ekspresjon av membranproteiner fra en stor cellepopulasjon så lenge MFI for den gitte fluorokrom er direkte proporsjonal med protein ekspresjon av Ca V α2δ1 på hver celle i stedet for antallet fluorescerende celler. Dette innebærer å bruke en konsentrasjon av fluorescens-konjugert antistoff mer enn metning. Titreringskurven for den anti-HA FITC-konjugert antistoff-binding til Ca V α2δ1 (figur 4) viser tre faser. Mens ingen fluorescens ble påvist i den første fasen, øket fluorescens intensitet eksponentielt med økende antistoffkonsentrasjon i den andre fase. Etter at metningspunktet (tredje fase), å øke konsentrasjonen av antistoffet har ingen effekt på den relative fluorescensen Intenmangfold (RFI) av FITC. Den anti-HA FITC-konjugert antistoff metningspunktet ble etablert ved 5 ug / ml, og dermed sikre at konsentrasjonen av det konjugerte-antistoffet ikke er begrensende MFI under forsøkene.

Den merkede Ca V α2δ1was uttrykt i TSA-201cells og flowcytometri analyser ble utført i nærvær av FITC-konjugert anti-HA i ikke-permeabiliserte celler (Figur 5). Passende kontroller (tabell 1) ble analysert på strømningscytometer som attributter xy-verdier for hver celle som passerer gjennom laserstrålen. Cellen fordelingen visualiseres på prikkplott (figur 5A). FCS / SSC prikkplotter bekrefter at utarbeidelse av celleprøver gir en enkelt cellesuspensjon med høy levedyktighet (figur 5BA). Den valgte port for levende celler (P1) utgjør 75% av det totale antall celler som ble analysert. Den totale protein uttrykk of Ca V α2δ1 i TSA-201 celler ble ansett å være proporsjonal med mCherry fluorescens. Som sett på mCherry versus FITC kontur plott og histogrammer (Figur 5BB - f.Kr.), 47 2% TSA-201 celler transfektert med pmCherry-Ca V α2δ1-HA ble funnet å betydelig uttrykke mCherry fluorescens så vel som viser betydelig FITC fluorescens grunn bindingen til den eksterne HA lappen på Ca V α2δ1 i ikke-permeabilized celler. Negative kontrollforsøk utført uten antistoff eller med isotype indikerer at FITC binder bare eller for det meste til de positivt transfekterte celler.

Denne protokollen ble anvendt for å karakterisere rollen som N-glykosylering på total og celleoverflate-ekspresjon av Ca V α2δ1 i TSA-201cells 23. Forsøk ble utført i ikke-permeabiliserte celler for å vurdere celleoverflate-ekspresjonog i permeabiliserte celler for å evaluere det totale protein ekspresjon, så vel som bekrefter tilgjengeligheten av HA-epitop. Relativ ekspresjon av Ca V α2δ1 ble beregnet basert på den MFI estimert for hvert fluorofor (mCherry eller FITC). ΔMFI verdier for mutantene ble normalisert til den maksimale verdien målt på samme dag for mCherry-Ca V α2δ1-HA WT uttrykt under de samme betingelser. Dette er viktig å ta hensyn til variasjoner over tid i den absolutte fluorescensintensitet av anti-HA-FITC-konjugert antistoff. Som vist i figur 6A, den ΔMFI for FITC i ikke-permeabiliserte celler var sterk for WT og 4xNQ konstruere men i nærheten av bakgrunnsfluorescens nivået for 16xNQ konstruere noe som indikerer at proteinet er nesten fraværende fra plasmamembranen. Analyser utført etter celle permeabiliseringen, viste at totalt protein ekspresjon av 16xNQ konstruksjonen ble også signifikant redusert temaerble utledet fra den FITC fluorescens i permeabiliserte celler eller fra den konstitutive mCherry fluorescensen målt i ikke-permeabilisert og i permeabiliserte celler (figur 6C - D). Som vist i figur 6B, de cellulære autofluorescens nivåene økte etter celle permeabiliseringen, som hindrer sammenligning av de absolutte fluorescens-verdier mellom intakte ikke-permeabiliserte og permeabiliserte celler. Den ΔMFI fluorescens målt for mCherry var den samme for både ikke-permeabiliserte og permeabiliserte celler som betegner at den permeabiliseringen løsningen ikke endrer den relative fluorescens-signalet fra mCherry. Mutasjoner av N-glykosyleringsseter var assosiert med en reduksjon i fluorescens-intensitet for mCherry støtte publisert observasjon at proteinet biogenese / stabilitet ble redusert 23. I denne serie av forsøk, var den relative fluorescens-signalet for FITC målt i permeabiliserte celler viste seg å be enda mindre enn det relative signal for mCherry tyder på at N-type glykosylering status av proteinet vil kunne påvirke fluorescens-intensitet detektert av FITC-konjugert anti-HA-antistoff i det ekstracellulære domene. Helt forandringene i den relative fluorescensen av FITC før etter celle permeabiliseringen tilveiebringe en pålitelig beregning for å kvantifisere protein ekspresjon.

Figur 3
Figur 3: FITC og mCherry danne en passende par fluorokromer for to-farge Cytometry analyser av magnetisering (tom kurver) og emisjonsspekter (fylte kurver) for FITC spent med 488 nm blå laser (Aa) og mCherry spent med 561 nm gul-. grønn laser (Ab). FITC og mCherry fluorescens ble samlet inn med en 530/30 nm og en 610/20 nm bandpass filtrerer hhv. Bølgelengden av de forskjellige lasere (farget vertikale linjer) og filtre (farget rektangler) er valgt for optimal lys innsamling og minimal overlapping. (B) Skjematisk fremstilling av mCherry-Ca V α2δ1-HA protein. Ca V α2δ1 ble dobbelt merket for å uttrykke et ekstracellulært ikke-fluorescerende epitop HA som kan oppdages ved en anti-HA FITC-konjugert antistoff og et konstituerende fluorescerende intracellulær mCherry fluorokrom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Titrering av anti-HA FITC-konjugert monoklonalt antistoff binding til Ca V α2δ1 TSA-201 celler ble transient transfektert med pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA og inkubert med en rekke anti-HA FITC-konjugerte eller isotype antistoffer. Bare FITC signalet blir analysert i dette panelet. (A) med én parameter histogrammer viser det relative antall celler på y-aksen og FITC fluorescens intensitet på x-aksen for den anti-HA FITC-konjugert antistoff område av konsentrasjoner (0,01-20 pg / ml). (B) semi-log kurve som for den anti-HA FITC-konjugert antistoff som en funksjon av MFI av FITC. Titreringskurven ble montert ved hjelp av ett område Binding ligningen med en trendlinje verdi R 2 = 0,99561. Titrering utført for isotype antistoff viste ingen fluorescens som forventet. Konsentrasjonene fra 0,001 til 0,01 mikrogram / ml er umulig å skille fra bakgrunnsstøyen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1 "> Figur 5
Figur 5: Representative flowcytometri analyse av ikke-permeabiliserte TSA-201cells transfektert med pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Skjematisk representasjon av portstyringsstrategi anvendt i strømningscytometri-analyse prøven.. Data ble analysert etter oppkjøpet med riktig programvare. Den første gating strategien utnytter en fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC) prikkplott for å vise en gate (P1) rundt levende celler og eliminere eventuelle rusk, døde celler, eller aggregater som har forskjellig fremover scatter og side scatter enn levende celler . To-parameter kontur plott av mCherry (y-aksen) som funksjon av FITC (x-aksen) fluorescensintensitet ble vist for den P1 befolkningen. Rektangulære portene ble plassert på kanten av autofluorescens av celler for å velge den positive populasjon P2 (FITC og mCherry) og den negative populasjonen P3. Nivået av fluorescens for than celler i samme område P2 og P3 ble visualisert ved hjelp av etterfølgende celleantall sammenlignet med FITC eller mCherry fluorescens intensitet enkelt-parameter histogrammer. En endring i fluorescens-intensitet på y- og x-aksen gir en pålitelig indeks av den totale membranen, og ekspresjon av Ca V α2δ1 respektivt. Intensiteten av fluorescenssignalet øker som en funksjon av antall fluorokromkonjugerte molekyler. (Ba) Representant FCS / SSC prikkplotter for hver tilstand som nevnt. Totalt 10.000 hendelsene ble kjøpt for analyse. Ellipsen gate (P1) er tegnet av øyet rundt levende celler unntatt hendelser med lav FSC (døde celler) eller høy SSC (aggregater). (Bb) Representative to-parameter kontur plott av mCherry (y-aksen) i forhold til FITC (x-aksen) fluorescence intensitet. Gates ble plassert på kanten av autofluorescens av cellene for å skille populasjoner av FITC-mCherry positive celler (P2 gate ) og negative fluorescerende celler (P3). (Bc) Single-paparameter histogrammer av relativ count (eller% av maks) celler versus fluorescens intensitet (FITC eller mCherry). Fordelingen av fluorescens-intensitet målt for cellene i den P2-porten (fluorescens-positive celler) er vist i grått, og fordelingen av fluorescens-intensitet for celler som er tilstede i den P3-porten (fluorescens-negative celler) blir fremvist som et overlegg på en gjennomsiktig grå plot. Som sett, fluorescens intensitet var sterk for både mCherry og FITC indikerer at Ca V α2δ1 er godt uttrykt og tydelig til stede på cellemembranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Samtidig mutasjoner av N -glycosylation nettsider forstyrret celleoverflaten expression av Ca V α2δ1. Stabile TSA-201 Ca V P3 celler ble transient transfektert samtidig med pCMV-Ca V 1,2 WT og pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT eller mutanter. Ikke-permeabiliserte (A) og permeabiliserte celler (B) ble farget med anti-HA FITC-konjugert antistoff som beskrevet ovenfor. Representative to-parameter contour plott av mCherry versus FITC fluorescens (venstre panel) og histogram plott av fordelingen av fluorescens intensitet for anti-HA FITC konjugert antistoff farging (høyre panel) er vist for N -glycosylation mutanter (NQ) etter avbrudd av fire steder (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) og 16 sider (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) i intakte ikke-permeabiliserte eller NP-celler (A) og i permeabiliserte eller P-celler (B). den distribuertution av fluorescens intensitet målt for celler i P2 porten (fluorescens-positive celler) er vist i grått, og fordelingen av fluorescens-intensitet for celler som er tilstede i den P3-porten (fluorescens-negative celler) blir fremvist som et overlegg på en gjennomsiktig grå plot. Som det fremgår av (B), den autofluorescens nivåene økte etter celle permeabiliseringen. Fluorescens intensitet for FITC målt for alle transfekterte permeabilized celler økte (sett på som en rett-shift på x-aksen) som indikerer at alle transfektert HA-merket Ca V α2δ1 proteiner ble farget og oppdaget av anti-HA FITC antistoff. (C) Bar diagram viser den normaliserte MFI målt i nærvær av FITC i intakte ikke-permeabilisert (overflate-ekspresjon) eller permeabiliserte celler (totaluttrykket). Den relative fluorescens densitet ble målt i tre paralleller for hver tilstand (30.000 celler) og i tre forskjellige grupper av celler transfected over en periode på en måned derav data er vist som gjennomsnitt ± SEM for 90.000 celler for hver betingelse. Toppen fluorescensintensitet ble nådd mellom 24 og 36 timer etter transfeksjon. De ΔMFI verdiene for FITC målt i intakte ikke-permeabiliserte celler ble brukt som en indeks av celleoverflate-ekspresjon av Ca V α2δ1-HA, og ΔMFI verdier for FITC målt i permeabiliserte celler gjenspeiler den totale protein uttrykket (celleoverflate og intracellulært protein ekspresjon ). ΔMFI for FITC ble beregnet ved å subtrahere den FITC-fluorescens-intensiteten av FITC-negative celler (P3) fra den fluorescens intensiteten av FITC-positive celler (P2). Den samme metoden ble brukt til å beregne ΔMFI for mCherry. MFI verdier ble normalisert til den maksimale verdien måles på samme dag for mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) Bar Grafen viser normalisert ΔMFI mCherry målt i ikke-permeabilized eller permeabilized celler (total uttrykk). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette flowcytometri-baserte analysen ble med hell anvendt til måling av relativ total og celleoverflate nivåer av fluorescens-merkede poredannende og tilhørende subenheter av spenningsstyrte kalsiumkanaler 14,22,26. Det er best å bruke når undersøke virkningen av genetiske mutasjoner og således krever at den indre fluorescens intensiteten av det fluorescens-merkede merket villtype-konstruksjonen være minst 10 til 100 ganger større enn for fluorescensintensiteten av det fluorescens-merkede ukodede konstruksjonen . I dette spesielle eksempel er den mCherry-Ca V α2δ1-HA-konstruksjonen som er beskrevet her, ga en større signal til støyforhold og et større dynamisk område enn det som ble målt for de tidligere publiserte Ca V 1,2-HA og Ca V 2.3-HA konstruksjoner. Det er mange tenkelige årsaker til dette. Det kan spekuleres i det lokale miljøet av HA-epitop i det ekstracellulære domenet av den Ca v &# 945; 2δ1 protein maksimaliserer signal til støyforhold av FITC-konjugert anti-HA-antistoff.

I tillegg er det viktig å huske på at denne fremgangsmåte ikke gir en absolutt verdi i antall proteiner på celleoverflaten. Den relative ekspresjon av det merkede konstruksjon som kreves for å oppnå funksjonelle kanal ekspresjon kan oppnås likevel ved å utføre side ved side patch-clamp og flowcytometri forsøk under de samme betingelser som vist i figur 7 med referanse 22. Fra disse data, kan det anslås at toppstrømtetthet, et globalt mål på ionekanal-aktivitet, generelt øker som en funksjon av overflaten ekspresjon av den kodede Ca V α2δ1 subenhet. Den store begrensning av denne strømmen celleoverflate-ekspresjon assay fortsatt at det ikke kan anvendes på dette tidspunkt til studiet av endogene ionekanaler. Dette skyldes det faktum at noen kommersielt tilgjengelige antistofferDet er kjent for spesifikt å binde til forutsagte eksterne domener av ionekanaler. Det krever således genetisk manipulering av den primære sekvensen til proteinet som skal undersøkes uttrykkes i en udifferensiert rekombinant cellelinje som TSA-201-celler.

Kritiske trinn i optimaliseringen av analysen: Identifiseringen av passende par av fluoroforer, valg av den ytre epitop, og lokalisering av innføringsstedet er avgjørende for suksess for denne metoden fordi innsettingen av epitopen ikke skal forstyrre protein funksjon. Forskjellige fluoroforen kombinasjoner ble testet. To eksterne epitoper: hemagglutinin (HA) epitop (YPYDVPDYA) og den bungarotoxin-bindende stedet epitop (WRYYESSLEPYPD) 27 og tre tette fluorescerende konjugerte antistoffer ble evaluert, nemlig FITC (fluoresceinisotiocyanat) -, R-fykoerytrin -, og PE-Cy7- konjugert-antistoffer. I tillegg er mer enn 10 forskjellige innføringsnettsteder for den eksterne HA epitop ble testet innen Ca V α2δ1. Når det gjelder innføringen av epitopen som krever seterettet mutagenese og rekombinant DNA-teknikker, er det anbefalt å utforme et minimum på tre sett med primerne innenfor samme område. Med 9 rester, er det HA epitop en av de mindre epitoper som eksisterer kommersielt tilgjengelige fluorescerende-konjugerte antistoffer, men suksessraten for å sette inn 27 nukleotider er lavere enn for punkt mutasjon. Tetracysteine motiver (rester Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) er 2-rest mindre enn HA-epitop, men fluorescein arsen hårnål bindemiddel er membranen permeant, og ikke egnet for analyse av membranbundne proteiner 28. Innledende forsøk ble utført med to intracellulære fluorophores mCherry og grønt fluorescerende protein (GFP). Tre kriterier ble anvendt for å diskriminere den vellykkede paret av fluoroforer med ionekanaler: 1) emisjonsspektra av fluoroforer behovikke å overlappe hverandre (se referanser 20,21 for detaljer); 2) ekspresjon av den kodede konstruksjonen frembringer funksjonelle ione-kanal i rekombinante celler som validert ved hjelp av standard elektrofysiologiske metoder; og 3) ekspresjon av kontroll konstruksjonen frembringer en robust fluorescerende avlesning. Dersom ett av disse kriteriene ikke er oppfylt, for eksempel hvis innsetting av koden eller fluoroforen forstyrrer kanal funksjon, må man gå tilbake til utgangspunktet og endre enten stedet for innsetting av eksterne epitop og / eller innstikkstedet av fluoroforen. En linker av 5-glutamin-rester mellom C-terminalen av proteinet, og det fluorofor kan bidra til å forbedre proteinfunksjonen. I tillegg kan det hjelpe å sette inn den eksterne epitop i store løkker som ikke er kjent for å spille en avgjørende rolle i protein funksjon og / protein glykosylering. En må også være klar over mindre tekniske aspekter.

Suksessraten av liposom-mediert transfEL i TSA-201-celler kunne bli redusert etter innføring av de to epitoper innen Ca V α2δ1. Derfor er det foreslått å kalibrere transfeksjonseffektiviteten med nye DNA konstruksjoner. Dette skjer fordi innsettingen av et 30 kDa protein som endrer molekylvekten av DNA. Man kunne modifisere DNA til liposomer forholdet til 1: 2 til 1: 3 eller om nødvendig inkubere cellene ved 37 ° C i en lengre tid (24-72 timer). Det er viktig å velge riktig formulering for permeabilizing cellene. De fleste hjemmelagde løsninger utbygd for dette prosjektet viste seg å føre cellene til å aggregere og tette strømningscytometer.

Dempe lyseksponering mens farging cellen med fluoroforen konjugert antistoff er viktig for å begrense fotobleking og tap av signal. For å minimere fluorescerende bakgrunn, er det viktig å sentrifugere overskuddet av konjugert antistoff før bruk. Til slutt, er det av ytterste viktighet å analysere than celler på strømningscytometeret så snart som mulig så og senest 24 timer etter. Å holde de fargede cellene over natten ved 4 ° C vil sannsynligvis redusere signalet og svekke celleoverlevelse. Variasjoner i den indre fluorescensen av fluoroforen-konjugert antistoff fra sats til sats tilsier at fluorescens intensiteten av test konstruksjonen må rapporteres som en funksjon av fluorescensintensiteten av styre konstruksjonen uttrykkes under identiske eksperimentelle betingelser.

For å oppnå en generelt god signal til støy-forhold, er det anbefalt å minimalisere celle pipettering for å redusere celledød og å forsiktig resuspender cellene slik at en 3 x 10 6 celler / ml blir injisert i den flowcytometer. Vær oppmerksom på at en høyere cellekonsentrasjon vil redusere cellestrømmen og kunne tette strømningscytometer. På den annen side vil et lavere cellekonsentrasjon krever en lengre behandlingstid. Man kan således må justere konsentrasjonen avhengig av den type av celler som skal analyseres.

Alternative analyser: Andre metoder utplassert for å dokumentere nærvær av ionekanaler på celleoverflaten plasmamembran faller i fire hovedkategorier: 1) Confocal avbildningsmetoder som utnytter den høye affinitet interaksjon mellom de fluoroforen-konjugerte antistoffer og målproteinet; 2) Protein kjemi teknikker hviler på kovalent modifisering av målproteinet ved biotinylering reagenser; 3) Elektrofysiologiske målinger av ikke-stasjonær støy-analyse; og 4) Photoaffinity merking av målproteinet med radioaktive prober. I tilfelle av de spenningsstyrte kalsiumkanal, photoaffinity merking med tritiert (±) - [3H] PN 200-100, et høy-affinitet ligand av dihydropyridin-familien ble brukt i stor utstrekning i 1980-årene 31. Det er fortsatt en svært følsom analyse men innebærer manipulering av radioaktivt materiale 31, som har falt ut av moten etter adventav svært sensitive fluorescens og luminescens prober spesielt med yngre forskere. I tillegg er det umulig å måle ion kanalaktivitet i nærvær av antagonisten, slik at korrelasjonen mellom overflate-ekspresjon og funksjon er utenfor omfanget av denne tilnærmingen. I den andre enden av den eksperimentelle kontinuum, ikke-stasjonære støyanalyse av ionekanaler krever høy kvalitet gigaseal patch-clamp opptak med stabil basislinje for liten lang opptak. Med denne fremgangsmåten kan man trekke antall åpne ionekanaler i en enkelt celle fra helningen av den grafiske plotting av støyvariansen som en funksjon av den midlere strøm måles på et gitt potensiale 32-34. Det viser de samme pynt av standard elektrofysiologiske metoder. Det er en arbeidskrevende og lav gjennomstrømning metode som krever i tillegg god kjennskap til spektralanalyse 32-34, ikke et fast innslag i cellebiologer. Videre denne type måling as identifiserer antall aktive ionekanaler (i åpen tilstand) som kan være annerledes enn det totale antallet proteiner i membranen. Merking av celleoverflateproteiner med biotin reagens er et forholdsvis effektivt verktøy for å identifisere proteiner tilstede i plasmamembranen. Denne fremgangsmåte utnytter den kovalent modifikasjon av membranproteiner av biotin og ytterligere med høy affinitet og høy spesifisitet ikke-kovalent binding av biotin til membran-impermeant streptavidin eller avidin-molekyler. Denne tilnærmingen er kvalitativt pålitelig, men er hemmet eller begrenset av kvantifisering forhold regelmessig forbundet med avslørende proteiner ved å bruke Western Blot teknikken. Konfokalt avbildnings og dets derivater er mye brukt for å dokumentere den ko-lokalisering av membranproteiner med celleoverflaten 35. Kvalitativ plasma membran isolasjon fortsatt mulig å bruke differensial sentrifugeringsteknikker med eller uten sukrose gradient 36. Som i den ovenfor beskrevne flowcytometri assay, avhenger det av den meget spesifikke interaksjonen mellom målproteinet og en fluorofor-konjugert antistoff. Total intern refleksjon fluorescensavbildning i særdeleshet, er en kraftig metode som kunne rapportere fordeling og molekylær oppførsel av enkelt ionekanaler ved membranoverflaten 37,38. Avlesning er definitivt iøynefallende, men er fortsatt en lav gjennomstrømming små-volum tilnærming. Alle disse analysene har vitenskapelig kvalitet. Den høy gjennomstrømming flowcytometri-baserte analysen er overlegen når det gjelder avlesning reproduserbarhet og målbare verdier, men krever enkel tilgang til multi-laser flowcytometri celle sorterere som er en del av kjernefasiliteter i store institusjoner. Fluorescens-baserte platelesere er billigere og mer tilgjengelig, men signal-støyforholdet oppnådd målt med de samme konstruksjoner under de samme forsøksbetingelser var signifikant lavere skyldes i stor grad til en høyere fluorescens bakgrunn. Kostnad for fluoroforen-konjugert entibodies kan også være tatt spesielt på grunn av antallet av kontrolleksperimenter som må behandles med test konstruksjoner. Variasjoner over samme tema inkluderer endring av fluorescerende fargestoff antistoff til kostnadseffektive pepperrot peroksidase eller alkalisk fosfatase enzym reporter antistoffer som enzymaktivitet kan analyseres ved chemiluminescence 29,30.

Konklusjon: To-farge fluorescensanalyser ble utviklet for å estimere den relative celleoverflate-ekspresjon av rekombinante proteiner uttrykt i dyrkede celler ved hjelp av væskestrømsfotometere. Selv om bare to fluoriserende parametre ble benyttet i denne analysen strøm, strømningscytometri er mottagelig for samtidig deteksjon av mer enn 30 fluorescerende prober på en enkelt celle, og dette demonstrerer den høye fleksibiliteten av denne tilnærmingen. Denne high-throughput ultra analysen kan være innrettet til å undersøke virkningen av genetiske mutasjoner 22,26 eller posttranslational modifications 23, samt studere den farmakologiske profilen til anstand for overflaten smugling av membran proteiner teknikker 39. Drivkraften bak denne protokollen oppsto fra behovet for å evaluere isolert virkningen av genetiske mutasjoner på membranen ekspresjon av ionekanaler i rekombinante celler. Det er imidlertid viktig å merke seg at graden av mutant kanal dysfunksjon i modellcellelinjer ikke alltid korrelerer med alvorlighetsgraden av kliniske symptomer hos mutasjonsbærere 5 delvis på grunn av en kombinasjon av mutasjoner i forskjellige alleler kan være nødvendig for å utløse plutselig hjertedød 40 , 41. I denne sammenheng kan dette assay bli sett på som å tilveiebringe en hurtig første-trinns tilnærming av å studere én eller flere mutasjoner i en enkelt gen assosiert med tap-av-funksjon mutasjoner 22. Det er imidlertid rimelig å forestille seg i fremtiden virus-mediert ekspresjon av de samme konstruksjoner som i differensierte celler av cardiomyocyte avstamning. Totalt sett, sammenlignet med andre avbildningsteknikker eller selvlysende, strømningscytometer sorterere behandle levende celler i suspensjon og rapport fluorescensintensitet av en homogen cellepopulasjon. Denne prosessen utføres uten behov for fiksering med paraformaldehyd, en prosess som induserer lokal plasmamembranen permeabilization, selv under milde betingelser 42. Analysen er rask, spesifikt og praktisk med analyse av opptil flere hundre prøver per arbeidsdag. I tillegg til analyse, kan cellene etter hvert bli sortert ved strømningscytometri for å vurdere den funksjonelle potensialet til celler som uttrykker høyere eller lavere nivåer av samme membranprotein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics