Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

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Biology

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Summary

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

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Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

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Abstract

Introduction

Este documento proporciona um ensaio fiável para relatar a expressão na superfície celular relativa das proteínas de membrana, tais como canais de iões expressos em células recombinantes que utilizam a tecnologia de citometria de fluxo existente. canais de iões são proteínas de membrana de poros de formação que são responsáveis ​​por controlar os sinais eléctricos por gating o fluxo de iões através da membrana celular. Eles são classificados pelo mecanismo de ativação, natureza, e seletividade de espécies de íon de trânsito através do poro onde eles estão localizados. Nos níveis celulares e teciduais, os fluxos de iões macroscópicas através de canais iónicos são o produto de imóveis 1 biofísico (gating e permeação), bioquímicos (fosforilação) e biogênese (síntese, glicosilação, tráfico e degradação). Cada um destes processos é único para cada tipo de canais iónicos e é optimizado para desempenhar o papel fisiológico do canal de iões. Consequentemente, as alterações em qualquer um destes processos afinadas através de umherdada ou uma modificação genética, muitas vezes referida como "canalopatia", pode ser prejudicial para a homeostase celular. É importante salientar que entregar a quantidade "certa" dos canais de íons na superfície da célula é fundamental para a homeostase celular. Mesmo pequenos aumentos (ganho de função) e pequenas diminuições (perda de função) em actividade de canal iónico tem o potencial de causar uma patologia grave ao longo da vida. Os defeitos na superfície da célula de entrega dos canais de iões maduros é um determinante importante em numerosos canalopatias, tais como a fibrose cística (CFTR canal de iões) 2 e arritmias cardíacas de forma a síndrome de QT longo (canais de potássio cardíacos) 3.

Canalopatias estão associadas à morte súbita cardíaca 4. A prevalência mundial atual de todos os canalopatias cardíacas é pensado para ser, pelo menos, 1: 2,000-1: 3.000 por pessoa 5 e são responsáveis por cerca de metade da súbita por arritmia ca morte cardíacases 6. Disfunção cardíaca na voltagem-sódio, potássio, cálcio e canais iônicos seletivos são conhecidos por desempenhar um papel fundamental neste processo. O 1.2 canais de cálcio voltagem-L-type Ca V é necessária para iniciar a contração do músculo do coração sincronizados. A cardíaca L-type Ca V 1.2 canal é um complexo de proteínas multi-subunidade composta de o principal formador de poros Ca subunidade V α1 e Ca V ß e Ca V α2δ1 subunidades auxiliares 7-12. Note-se que o complemento total de subunidades auxiliares é necessário para produzir funcionais Ca V 1.2 canais na membrana plasmática e interacções dinâmicas entre as subunidades são essenciais para suportar a função eléctrica normal do coração 13. Ca V SS promove a expressão na superfície celular de Ca V 1.2 canais através de um não-covalente nanomolar de interacção hidrófoba 14. A co-expressão do Ca V Wi subunidade α2δ1th Ca V ß-bound Ca V α1 estimula a expressão corrente de pico (de 5 a 10 vezes) e promove a ativação do canal em voltagens mais negativas. Ganho de função mutações da subunidade formadora de poros Ca V 1.2 têm sido associados com uma forma de arritmias ventriculares chamado síndroma do QT longo de 15 enquanto que uma série de mutações pontuais nas três subunidades principais que formam o tipo L-Ca V canal 1.2 foram identificados em indivíduos que sofrem de arritmias de forma a síndroma QT curto 16,17. canais iônicos são proteínas de membrana que podem ser investigados a partir de um ponto de vista bioquímico (química de proteínas), ou usando ferramentas eletrofisiológicos (máquinas geradoras de corrente) e muitas vezes usando estas abordagens complementares. Eletrofisiologia, em particular de células inteiras patch-fixação, é uma abordagem adequada para elucidar a função de canais iônicos 15, mas não pode resolver modificações no tráfego de proteínas a partir de mudanças em seu biofísicopropriedades. Protein Chemistry tem, no entanto, muitas vezes limitado uso, devido à relativamente baixa expressão de proteínas de membrana grande em relação às proteínas solúveis menores. métodos de alto rendimento robustos usando leitura de fluorescência precisam ser desenvolvidos, a fim de abordar especificamente defeitos de biogênese de proteínas que causam alterações na expressão na superfície celular de canais iônicos.

A citometria de fluxo é uma tecnologia biofísica empregada na contagem de células, a triagem, detecção de biomarcadores e engenharia de proteínas 18. Quando uma solução de amostra de células vivas ou em partículas é injectado num citómetro de fluxo, as células são ordenados numa única corrente que pode ser sondado por sistema de detecção da máquina (Figura 1). O primeiro instrumento de citometria de fluxo produzido em 1956 19 detectada apenas um parâmetro, mas citómetros de fluxo modernos têm múltiplos lasers e detectores de fluorescência que permitem a detecção de mais do que 30 parâmetros fluorescentes 20,21.Filtros e espelhos (óptica de emissão) dirigir a difusão da luz ou luz fluorescente de células a uma rede electrónica (fotodiodo e detectores) que convertem a luz proporcionalmente à sua intensidade. Os dados digitais são analisados usando software especializado e a saída primária é exibido como um gráfico de pontos 21.

figura 1
Figura 1:. Biophysical princípios de citometria de fluxo de triagem células individuais são empurradas através de um bico sob alta pressão dentro de um fluxo de fluido de revestimento que as move entre um ou mais pontos de interrogação laser. O feixe de luz é desviada por as células que passam e a luz recolhida na direcção para a frente (Forward Scatter, FCS) é enviada para um fotodíodo que converte a luz em um sinal proporcional ao tamanho da célula. A luz também é recolhida em um ângulo de 90 ° para o caminho do laser e enviado para detectores (também chamados de fotomultiplicadores (PMT)).Esta luz é encaminhado através de espelhos dicróicos que permitem a detecção do sinal de dispersão lateral (SSC), que reflecte a granularidade dentro das células, e as emissões fluorescentes excitadas se fluorocromos estão presentes na célula. Três detectores (verde, amarelo e vermelho) são representados com diferentes filtros de banda de comprimento de onda, permitindo a detecção simultânea de diferentes fluorocromos. Os diferentes sinais são digitalizados por um computador externo e convertidos em dados que serão analisados para quantificar as características das células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A capacidade de alto rendimento de citómetros de fluxo foi explorada para quantificar a expressão relativa de membrana do tipo selvagem recombinante e do tipo L dependentes da voltagem tráfico deficiente em Ca V 1.2 canais e subunidades associadas em células vivas. co construções de ADNcDing para as proteínas foram duplamente marcado para realizar simultaneamente um epitopo extracelular não fluorescente que pode ser detectado por um anticorpo conjugado fluorescente impermeável e um fluoróforo intracelular que é constitutivamente fluorescente. Tanto o epitopo extracelular, inserido num loop extracelular da proteína, e o fluoróforo intracelular, inserido depois do terminal C, são convertidas com a proteína. Nesta série de experiências, a proteína V α2δ1 Ca foi manipulada para expressar um epitopo extracelular de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA) detectado por um revestimento impermeável com FITC (isotiocianato de fluoresceína) -conjugated anti-HA e mCherry como o fluororo intracelular intrínseca. Para determinar o nível de expressão na superfície celular relativa do mCherry-Ca V α2δ1 proteína marcada com HA, as células recombinantes que expressam a proteína de fusão foram colhidas após a transfecção, e coradas com FITC-conjugado monoclonal de murganho anti-HA tag de epitopo AntibodY (Figura 2). FITC é um composto fluorescente orgânico que é consideravelmente menor do que os repórteres de enzimas e, portanto, não como susceptível de interferir com a função biológica. mCherry- Ca V α2δ1-HA sobre-expresso em TSA-201cells, produz um aumento de 3 log significativa na fluorescência FITC e mCherry fluorescência em parcelas bidimensionais 22. Uma vez que o epitopo de HA situa-se na porção extracelular da proteína, a intensidade de fluorescência obtida para FITC na presença de células intactas reflectir o índice relativo da expressão na superfície celular de proteína marcada com HA. A acessibilidade do epitopo de HA nas construções é sistematicamente validada medindo o sinal de FITC após permeabilização celular. Esta medida serve também para confirmar a expressão de proteína total normalizado desde as intensidades de fluorescência relativas para FITC estimado em células permeabilizadas são qualitativamente comparáveis ​​com os valores de fluorescência relativa for mCherry medidos sob condições permeabilizadas e não permeabilizadas 22,23. É importante notar que o espectro de fluorescência intrínseca é deslocada para valores mais elevados após permeabilização, mas que o único valor a ser reportada é a alteração na intensidade de fluorescência em comparação com a construção de controlo. mudanças relativas na intensidade de fluorescência para as construções de teste são estimadas utilizando a intensidade de fluorescência ΔMean (ΔMFI) valores para cada fluoróforo (mCherry ou FITC). As experiências são concebidos para medir a intensidade de fluorescência do construto de teste em relação à intensidade de fluorescência da construção de controlo expresso sob as mesmas condições experimentais para limitar as variações na fluorescência intrínseca do anticorpo fluoróforos. Duas proteínas de membrana foram estudados com êxito com este ensaio: a subunidade formadora de poros do tipo L, canal de cálcio dependentes da voltagem V Ca 1,2 e 14,22 de uma série diferente deexperimentos, o auxiliar extracelular Ca V α2δ1 subunidade 22,23. O protocolo seguinte foi utilizado para determinar a expressão na superfície celular do Ca V α2δ1 subunidade do tipo L cardíaca Ca V 1.2 canal sob condições de controlo e após a mutações que afectam a modificação pós-tradução do canal de iões. Sob condições experimentais padronizadas, a fluorescência da superfície celular de FITC aumenta quase linearmente com a expressão de ADNc que codifica para os mCherry-Ca V proteínas α2δ1-HA (Figura 5 de referência 22).

Figura 2
Figura 2:. Representação esquemática da rotulagem total e membrana na citometria de fluxo protocolo experimental O esquema descreve algumas das principais medidas necessárias para quantificar a expressão total e da superfície celular relativa de canais de iões recombinantes por flow citometria. As células são transfectadas com a construção de marcação dupla mCherry-Ca V α2δ1-HA em células (1) TSA-201 e coradas antes ou após permeabilização (2). Dados multiparâmetros são adquiridos em um citômetro de fluxo (3) para a análise multivariada (4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. construções Duplamente Tagged DNA

  1. Inserir o epitopo de HA (YPYDVPDYA) no ligante extracelular de Ca V α2δ1 entre D676 e R677 por mutagénese dirigida ao local (Figura 3B) 20. Use gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Atacante primer e Reverso acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer.
  2. Subclone da sequência de ADNc da HA etiquetado Ca V α2δ1 no vector de expressão de mamífero pmCherry-N1 concebido para expressar a proteína fundida com o terminal N de mCherry entre os locais SacI e SalI (Figura 3B) 20.
    NOTA: A função de canal apropriado precisa ser testado com a construção controle usando métodos eletrofisiológicos padrão 24.

2. mediada por lipossomas transfecção transiente (30 min, todas as etapas são realizadas sob Fluxo Laminar Hood)

  1. Dia 1: Placa de meio milhão de células TSA-201 (ou Hekt) emPlacas de cultura de 35 mm com meio essencial 2 mL de Dulbecco de alta glucose mínimo (DMEM-HG), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e médio (PS) cultura de penicilina-estreptomicina a 1%. Contagem de células utilizando um hemacitómetro padrão. Avaliar a viabilidade celular de uma fracção da amostra de células utilizando azul de tripano. Placa células suficientes para alcançar 90% de confluência no momento da transfecção.
  2. Dia 2: Mudança de meio de cultura com 2 ml de meio de cultura fresco pré-aquecido (37 ° C) sem PS.
  3. Para cada amostra de transfeco, preparar dois tubos de 1,5 ml. No tubo 1, dilui-se 4 mg de DNA em 250 ul de meio de soro reduzido. No tubo 2, misturar 10 mL de reagente de transfecção mediada por lipossomas com 250 de meio de cultura em soro reduzido ul. Misture suavemente o reagente de transfecção antes do uso.
  4. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Combinar o conteúdo de um tubo e o tubo 2, misturar suavemente e incuba-se, pelo menos, 20 min à temperatura ambiente.
  6. Adicione os lipossomas / DNA complexos para as células cultivadas e agite levemente o prato de cultura para misturar.
  7. Incubar a 37 ° C sob 5% de atmosfera de CO2 durante 24 h.

3. Coloração de células para citometria de fluxo (3 h)

  1. Preparando amostras de células
    1. Dia 3: Remover o meio a partir do prato de cultura com cuidado e lavar as células com 400 ul de pré-aquecido (37 ° C) de 0,05% de tripsina-EDTA 1x (ácido etilenodiaminotetracético).
    2. Adicionar 400 ul de tripsina-EDTA e incubar o prato a 37 ° C sob 5% de CO2 durante 5 min para permitir que as células a separar a partir do prato.
    3. Parar a digestão enzimática por adição de 1 ml de meio de cultura frio sem PS e lavar todas as células da superfície pipetando suavemente 4-5 vezes. Evitar o excesso de digestão e excesso de pipetagem para reduzir a morte celular.
    4. Recolher as células em tubos de 1,5 ml e coloque imediatamente em gelo. Utilizar soluções gelada e manter as células a 4 ° C para evitar a internalizaçãode antígenos de superfície. Diminuir iluminação para limitar o fotobranqueamento do sinal fluorescente.
    5. tubos de centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
    6. Re-suspender o sedimento em 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) para preparar uma suspensão de célula única.
    7. Resumidamente vortex os tubos muito suavemente e repita os passos 3.1.5 e 3.1.6 para remover completamente o meio de cultura.
    8. Re-suspender o sedimento em 600 ul de 1x PBS e ajustar a concentração de células a um mínimo de 3 X 10 6 células / ml.
    9. Dividir as células em dois novos tubos de 1,5 ml para coloração intracelular e extracelular. Incluir controlos adequados para discriminar coloração específica de coloração não específica.
      NOTA: O anticorpo de controlo de isotipo ajuda a avaliar o nível de coloração de fundo e idealmente deve corresponder de cada anticorpo primário espécies hospedeiras, isótipo e fluoróforo. Use de controlo de isotipo e o anticorpo conjugado ao mesmoconcentração de proteína.

tabela 1
Tabela 1: citometria de fluxo amostras de controlo experimento para não-permeabilizadas e permeabilizadas células Cada experiência deve incluir os seguintes controlos negativos:. (1) células não transfectadas (sem anticorpo, com o isotipo ou com o anticorpo conjugado). (2) As células transf ectadas com a proteína de interesse subclonado num plasmídeo sem constitutiva fluorocromo intracelular fluorescente (pCMV- Ca V α2δ1-HA) ou com a construção duplamente etiquetado (pmCherry-Ca V α2δ1 e incubados sem anticorpo, com o isotipo ou com o anticorpo conjugado). controles de cores individuais são usados ​​para a compensação de sobreposição de emissão de fluorocromo. Os mesmos controles são executados por não permeabilizadas e permeabilizadas condições em cada série de experimentos.

  1. A coloração da superfície celular da IntactAs células vivas
    1. Alíquota 1 X 10 6 células / 100 uL em tubos de 1,5 ml.
    2. Adicionar o anticorpo monoclonal conjugado com FITC anti-HA a 5 ug / ml e, de vórtice antes da incubação das células sobre uma plataforma oscilante (200 rpm) no escuro a 4 ° C durante 45 min.
      NOTA: A concentração óptima de anticorpo foi determinada em experiências preliminares de titulação (Figura 4).
    3. Remover as células a partir do escuro e adicionar 900 ul de 1x PBS / tubo. Centrifuga-se a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS 1x, vortex e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    5. Repetir a lavagem (passo 3.2.4) duas vezes para remover qualquer anticorpo não ligado. Se for utilizado um anticorpo primário não conjugado, incubar com o anticorpo secundário adequado.
    6. Após a última lavagem, ressuspender as células em 500 ul de 1x PBS e transferir a suspensão de célula única em 5 ml de tubos de citometria de fluxo. Mantenha o celulars no escuro a 4 ° C até à execução da amostra.
    7. Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Para melhores resultados, analisar as células no citômetro de fluxo, logo que possível eo mais tardar 24 horas depois.
  2. A coloração intracelular: Fixação, permeabilização, e coloração
    1. Alíquota 1 X 10 6 células / 100 uL em tubos de 1,5 ml e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    2. Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 100 ul de solução de fixação-permeabilização diretamente do estoque.
    3. Incubar no escuro a 4 ° C durante 20 min.
    4. Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização de lavagem 1x preparado de fresco (diluído 10x tampão de permeabilização de lavagem em H2O destilada). células de vórtice e de sedimentos, utilizando uma centrífuga de mesa a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    5. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
    6. Repita os passos 3.3.4 e 3.3.5.
    7. Adicionar anticorpos anti-HA monoclonal conjugado com FITC em 5ug / ml em 100 ul de 1x tampão de permeabilização de lavagem e, de vórtice antes de incubar as células no escuro a 4 ° C durante 30 min.
      NOTA: A coloração intracelular é realizado seguindo o mesmo procedimento que o utilizado para a coloração da superfície celular. permeabilização celular mediada por A saponina é, no entanto, um processo rapidamente reversíveis, por isso, é importante substituir 1x PBS com tampão 1x Perm / Wash para manter as células na presença constante de saponina durante a coloração intracelular.
    8. Remover as células a partir do escuro e adiciona-se 100 ul de tampão de permeabilização de lavagem. Centrifuga-se a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    9. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão de permeabilização de lavagem, vortex e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    10. Repetir a lavagem (passo 3.3.9) mais uma vez para remover qualquer anticorpo não ligado.
    11. Após a última lavagem, ressuspender as células em 500 ul de 1x PBS e transferir o pecadosuspensão de células para GLE 5 mL fluxo citometria de tubos. Manter as células no escuro a 4 ° C até à injecção de amostra num citómetro de fluxo.
    12. Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Execute as amostras fixadas no citômetro o mais rapidamente possível, mas o mais tardar uma semana após a coloração. Executar as células não-permeabilizadas e permeabilizadas no mesmo dia.

4. Citometria de Fluxo

  1. Citômetro de fluxo celular Sorter diário Setup
    1. Ligue o software citometria de fluxo. Antes de experimentar, calibrar e configurar o citômetro de fluxo classificador de células para garantir o melhor desempenho do instrumento (ou seja, laser e óptica estão realizando a especificação, o laser e célula de fluxo estão bem alinhados) usando esferas de configuração do instrumento.
    2. Utilizar o bocal 100 um com bainha pressão de 20 psi.
      NOTA: O bico não tem de ser alterada em um banco de citometria de fluxo.
    3. Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de acordo com o FABRICAÇÃOespecificação er. Excessivamente altas taxas de fluxo vai diminuir a sensibilidade na detecção de variações na fluorescência.
    4. Escolha azul (488 nm para excitar Fluoresceína Isothiocayanate ou FITC) e amarelo-verde (561 nm para excitar mCherry) lasers. Recolhe níveis de fluorescência FITC e com uma mCherry 530/30 nm e 610/20 nm com um filtro de passagem de banda, respectivamente.
    5. Adquirir a dispersão para a frente (FCS) versus dispersão lateral (SSC) gráfico de pontos para as células não coradas utilizando escala linear. Ajustar a amplificação de cada detector para visualizar as células no quadrante inferior esquerdo do gráfico de pontos.
  2. Reading amostra de células intactas não-permeabilizadas
    1. Definir a P1gate para células não-permeabilizadas vivo delineando uma forma livre em torno das células a serem analisados ​​excluindo os detritos celulares e agregados de células, limitando assim o sinal de fluorescência para células intactas.
      NOTA: Live / corantes de exclusão mortos pode ser usado para facilitar a colocação portão em células vivas. Definir 10.000 eventos para gravarna P1 portão de parada. Defina esta opção para um maior número de eventos se for necessário.
    2. Adquirir mCherry contra o traçado de contorno de dois parâmetros FITC para detectar autofluorescência de linha de base de células não coradas. Use escala bi-logarítmica para mostrar valores negativos e melhorar a resolução entre as populações 25. Ajustar a tensão de cada detector para definir as células não coradas negativas dentro da porção inferior das primeiras dez unidades de log as parcelas de intensidade de fluorescência.
    3. Adquirir todas as amostras não permeabilizadas intactas usando as configurações estabelecidas em 4.1.5 e 4.1.6 e recolher FSC, SSC e sinais nos detectores de fluorescência.
    4. Exportação e salvar arquivos * .fcs a ser utilizado para análise de citometria de fluxo de software de análise.
  3. Reading amostra de células permeabilizadas
    1. Mova o portão P1 para selecionar células vivas nas amostras permeabilizadas e ajustar FSC e tensão SSC como mostrado na 4.1.5 e 4.1.6.
    2. Adquirir todas as amostras permeabilizadas e recolher FSC, SSC and sinais em detectores de fluorescência.
    3. Exportação e salvar arquivos * .fcs a ser utilizado para análise de citometria de fluxo de software de análise.
  4. Análise de dados
    1. Lançar a citometria de fluxo arquivos de software de análise e importação * .fcs salvos em 4.2.4 e 4.3.3.
    2. Clique no primeiro exemplo listado na janela do espaço de trabalho. Uma nova janela com o nome do tubo número ID é aberto automaticamente. Inicie o processo gating na trama de SSC contra FSC. Desenhe um portão (P1), utilizando o ícone Elipse em torno de células vivas e eliminar quaisquer detritos, células mortas, ou agregados que têm dispersão para a frente diferente e dispersão lateral do que as células vivas
    3. Para desenhar o gráfico de contorno de dois parâmetros do mCherry (eixo y) versus FITC (eixo-x) a intensidade de fluorescência das células vivas, clique primeiro no eixo-x e escolher o FITC-A do canal e, em seguida, clique no y -axis e escolher o PE-mCherry-a do canal. Clique no ícone "Quad" para posicionar o marcador quadrante na extremidade de umcélulas utofluorescent em cada canal de fluorescência.
      NOTA: A porta definido em torno das células FITC e mCherry positivos é a porta P2. A população de células negativa fluorescência é referido como o portão P3. Ver Figura 5 para o método de propagação representativa usada neste artigo.
    4. Selecione P2 e P3 portões e clique no ícone "Adicionar Estatísticas" na janela área de trabalho original. Clique em "Conde" (número de células positivas) e clique em "média" (Média de Fluorescência intensidade de cada fluorocromo) ou "Median" (mediana da intensidade da fluorescência de cada fluorocromo) estatísticas entre a lista de opções. Clique no ícone "Adicionar Statistics" novamente. Todos estes valores são automaticamente transferidos para a janela área de trabalho original.
      NOTA: O "significam" só é usado se a intensidade de fluorescência segue uma distribuição normal. Em qualquer outro caso, clique na aba "Median". MFI, portanto, poderia referir-se a média de fluorescência IntensitY ou mediana da intensidade de fluorescência.
      NOTA: O próximo passo é a aplicação de parâmetros e estatísticas dos portões para todas as amostras testados pelo citômetro.
    5. Na janela do espaço de trabalho, use o mouse para arrastar e soltar os parâmetros portões e estatísticas sobre a linha marcada todas as amostras.
    6. Gerar um relatório lote de lotes bidimensionais de contorno (mCherry vs FITC) e histogramas (contagem de células versus intensidade de fluorescência) para células não permeabilizadas e permeabilizadas (Figuras 6A - B).
    7. A partir das estatísticas geradas no passo 4.4.4, calcular a intensidade de fluorescência média (IFM) de cada fluorocromo para as células coradas. A partir deste valor, subtrair o valor MFI obtido a partir de células não coradas para quantificar a expressão de superfície e total da proteína de interesse.
    8. Informar os valores ΔMFI para cada fluoróforo (mCherry e ITCF) (Figura 6C - D). Normalizar o ΔMFI medido para o Ca NOTA: O valor absoluto da intensidade de fluorescência pode variar acentuadamente dependendo do lote de anticorpos e as capacidades técnicas de cada técnico de laboratório, pelo que é necessário para normalizar a intensidade de fluorescência da construção mutante utilizando a construção WT.

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Representative Results

Este artigo descreve um protocolo fiável de quantificar a superfície total e células de canais de iões recombinantes expressas em TSA-201cells por um fluxo de duas cores ensaio de citometria. Como um exemplo, a superfície de célula relativa e expressão de proteína total foi quantificada para o V α2δ1subunit Ca. A fim de executar o fluxo de duas cores citometria de ensaio, Ca V α2δ1 foi duplamente marcado para expressar um epitopo de HA não fluorescente extracelular que pode ser detectada por um anticorpo anti-HA conjugado a FITC e uma fluorescente fluoróforo mCherry intracelular constitutiva. A excitação e emissão espectros para FITC e mCherry mostram que FITC está animado com eficiência de 88% pelo laser de 488 nm, mas a eficiência cai para 0% com o laser 561 nm. O mCherry mostra 63,9% do seu máximo de fluorescência quando excitada com o laser de 561 nm, mas apenas 7,6% com o laser de 488 nm (Figura 3). A spe excitação e emissãoctra para ambos os fluoróforos exibem coleta de luz ideal e um mínimo de sobreposição com as diferentes lasers e filtros selecionados. A citometria de fluxo ensaios poderiam fornecer informação quantitativa sobre a expressão relativa de proteínas de membrana a partir de uma população de grandes células, desde que o MFI para o fluorocromo dado é directamente proporcional à expressão da proteína de Ca V α2δ1 em cada célula em vez do número de células fluorescentes. Isto envolve o uso de uma concentração de anticorpo de fluorescência conjugado além saturação. A curva de titulação do anticorpo anti-HA conjugado a FITC ligação a Ca α2δ1 V (Figura 4) mostra três fases. Embora nenhuma fluorescência foi detectada na primeira fase, a intensidade de fluorescência aumentou exponencialmente com o aumento da concentração de anticorpo na segunda fase. Após o ponto de saturação (terceira fase), o aumento da concentração do anticorpo não tem efeito sobre a fluorescência relativa Intensidade (RFI) de FITC. O ponto de saturação de anticorpo anti-HA conjugado a FITC foi estabelecida em 5 ug / ml, assegurando assim que a concentração do anticorpo conjugado não se limitando a IMF durante os experimentos.

O etiquetado Ca V α2δ1was expressa em TSA-201cells e citometria de fluxo ensaios foram realizados na presença do conjugado com FITC anti-HA em células não-permeabilizadas (Figura 5). Controlos apropriados (Tabela 1) foram analisadas no citómetro de fluxo, que atribui valores a cada célula xy que passa através do feixe de laser. A distribuição das células é visualizada em gráficos de pontos (Figura 5A). FCS / SSC gráficos de pontos confirmar que a preparação de amostras de células fornece uma suspensão de célula única com alta viabilidade (Figura 5Ba). O portão seleccionado para células vivas (P1) representa 75% do número total de células analisadas. O total de expressão da proteína Sf Ca V α2δ1 em células TSA-201 foi considerado como sendo proporcional à fluorescência mCherry. Como visto nos mCherry contra FITC gráficos de contorno e histogramas (Figura 5Bb - aC), 47 2% TSA-201 células transfectadas com pmCherry-Ca V α2δ1-HA foram encontrados para expressar significativamente mCherry de fluorescência, bem como mostrando significativa de fluorescência FITC devido à a ligação à tag HA externa de Ca V α2δ1 em células não-permeabilizadas. experiências de controlo negativo realizados sem anticorpo ou com o isotipo indicam que a FITC se liga apenas ou principalmente para as células transf ectadas de forma positiva.

Este protocolo foi usada para caracterizar a função da N-glicosilação sobre a expressão da superfície celular total e de Ca V α2δ1 em TSA-201cells 23. As experiências foram realizadas em células não-permeabilizadas para avaliar a expressão na superfície celulare em células permeabilizadas para avaliar a expressão de proteína total bem como confirmando a acessibilidade do epitopo HA. A expressão relativa de Ca V α2δ1 foi calculada com base na IMF estimado para cada fluoróforo (mCherry ou FITC). ΔMFI valores para os mutantes foram normalizados para o valor máximo medido no mesmo dia para mCherry-Ca α2δ1 V-WT HA expresso sob as mesmas condições. Isto é importante para ter em conta as variações ao longo do tempo na intensidade de fluorescência absoluta do anticorpo conjugado com FITC anti-HA. Como observado na Figura 6A, o ΔMFI para FITC em células não-permeabilizadas era forte para o WT e o 4xNQ construir, mas perto do nível de fluorescência de fundo para a construção 16xNQ indicando que a proteína é quase ausente da membrana plasmática. Os ensaios realizados após permeabilização celular, mostraram que a expressão da proteína total da construção foi 16xNQ também diminuiu significativamente quer se tratefoi inferida a partir da fluorescência FITC em células permeabilizadas ou a partir da fluorescência mCherry constitutiva medido no não-permeabilizadas e em células permeabilizadas (Figura 6C - D). Como observado na Figura 6B, os níveis de autofluorescência celular aumentada após permeabilização celular, o que impede a comparação dos valores de fluorescência absolutas entre as células não-permeabilizadas e permeabilizadas intactas. A fluorescência ΔMFI medido para mCherry foi semelhante para ambas as células não permeabilizadas e permeabilizadas significando que a solução de permeabilização não altera o sinal de fluorescência relativa de mCherry. As mutações dos locais de N-glicosilação foi associada com uma diminuição na intensidade de fluorescência para mCherry suportando a observação de que a biogénese publicada proteína / estabilidade foi reduzido 23. Nesta série de experiências, o sinal de fluorescência relativa para FITC medida em células permeabilizadas acabou abe ainda menor do que o sinal relativo para mCherry sugerindo que o estado de glicosilação do tipo N da proteína poderia influenciar a intensidade de fluorescência detectada pelo anticorpo conjugado com FITC anti-HA no domínio extracelular. No total, as alterações na fluorescência relativa de FITC antes após permeabilização celular fornecer uma métrica confiável para quantificar a expressão da proteína.

Figura 3
Figura 3: FITC e mCherry formar um par adequado de fluorocromos por ensaios de citometria de duas cores de excitação (curvas de vazios) e os espectros de emissão (curvas a cheio) para FITC animado com laser azul 488 nm (AA) e mCherry animado com 561 nm amarelo-. laser verde (Ab). FITC e mCherry fluorescência foram recolhidos com um 530/30 nm e uma 610/20 nm bandpass filtra respectivamente. O comprimento de onda das diferentes lasers (linhas verticais coloridas) e os filtros (rectângulos coloridos) são escolhidos para a recolha de luz óptima e um mínimo de sobreposição. (B) Representação esquemática de proteína α2δ1-HA mCherry-Ca V. Ca V α2δ1 foi duplamente marcado para expressar uma HA epitopo não fluorescente extracelular que pode ser detectado por um anticorpo anti-HA conjugado com FITC e uma fluorescente fluorocromo mCherry intracelular constitutiva. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. A titulação de anticorpos anti-HA conjugado a FITC anticorpo monoclonal de ligação a Ca V α2δ1 células TSA-201 foram transientemente transfectadas com pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA e incubadas com uma gama de anticorpos anti-HA conjugados com FITC ou isotipo. Somente o sinal de FITC está a ser analisada neste painel. (A) histogramas de parâmetro único exibir o número relativo de células no eixo Y e a intensidade de fluorescência de FITC no eixo-x para a gama de anticorpos anti-HA conjugado a FITC de concentrações (0,01-20 ug / mL). (B) gráfico semi-log para o anticorpo anti-HA conjugado a FITC como uma função do MFI de FITC. A curva de titulação foi ajustada utilizando Uma Ligação do Site equação com um valor de linha de tendência R 2 = 0,99561. Titulação realizada para o anticorpo isotipo não apresentaram fluorescência como esperado. As concentrações de 0,001 a 0,01 mg / ml são indistinguíveis a partir do ruído de fundo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1 "> Figura 5
Figura 5: fluxo Representante análise de citometria de não permeabilizadas TSA-201cells transfectadas com pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Representação esquemática da estratégia gating usado em citometria de fluxo amostra de análise.. Os dados foram analisados ​​após a aquisição com o software apropriado. A primeira estratégia gating explora uma dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) gráfico de pontos para exibir um portão (P1) em torno de células vivas e eliminar quaisquer detritos, células mortas, ou agregados que têm dispersão para a frente diferente e dispersão lateral do que as células vivas . Dois parâmetros gráficos de contorno da mCherry (eixo y) versus FITC (eixo-X) da intensidade de fluorescência foram apresentados para a população P1. portas rectangulares foram colocados na borda da autofluorescência das células para seleccionar a população positiva P2 (FITC e mCherry) e P3 população negativa. O nível de fluorescência para o tele células dentro do P2 região e P3 foram visualizadas utilizando contar celular subsequente versus intensidade de fluorescência histogramas de parâmetro único FITC ou mCherry. Uma mudança na intensidade de fluorescência no eixo dos x e y fornece um índice fiável da expressão total e membrana de Ca V α2δ1 respectivamente. A intensidade do sinal de fluorescência aumenta como uma função do número de moléculas de fluorocromo. (Ba) Representante FCS / gráficos de pontos SSC para cada condição como indicado. Um total de 10.000 eventos foram obtidas para a análise. O portão elipse (P1) é tirado pelo olho ao redor de células vivas excluindo eventos com baixa FSC (células mortas) ou alto SSC (agregados). (BB) representativos de dois parâmetros gráficos de contorno do (eixo y) mCherry contra FITC (eixo-X) da intensidade de fluorescência. Portões foram colocados na borda da autofluorescência das células para segregar as populações de células positivas para FITC-mCherry (porta P2 ) e células fluorescentes negativos (P3). (BC) Single-parâmetro histogramas de células versus intensidade de fluorescência (FITC ou mCherry) contagem relativa (ou% do máximo). A distribuição da intensidade de fluorescência medido para as células dentro da porta P2 (células de fluorescência positiva) são mostradas a cinzento, e a distribuição da intensidade de fluorescência para células presentes no portão P3 (células de fluorescência-negativa) é apresentado como uma sobreposição numa plot cinza transparente. Como visto, a intensidade de fluorescência era forte tanto para mCherry e FITC indicando que Ca V α2δ1 é bem expressa e claramente presente na membrana celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Simultânea mutações de sites -glycosylation N interrompido superfície celular expression de Ca V α2δ1 células V P3 TSA-201 Ca estável. foram transitoriamente transfectadas simultaneamente com pCMV-Ca V 1.2 WT e pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT ou mutantes. Não-permeabilizadas (A) e células permeabilizadas (B) foram coradas com anticorpo anti-HA conjugado com FITC, como descrito acima. Gráficos de contorno de dois parâmetros representativos de mCherry contra FITC (painéis esquerdos) e o histograma de parcelas a distribuição da intensidade de fluorescência para a coloração com anticorpo conjugado com FITC anti-HA (painéis da direita) são mostradas para os mutantes N -glycosylation (NQ), após o rompimento de quatro locais (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) e 16 locais (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) em células não-permeabilizadas ou NP intactos (a) e em células permeabilizadas ou p (B). o distribbuição da intensidade de fluorescência medido para as células dentro da porta P2 (células de fluorescência positiva) são mostradas a cinzento, e a distribuição da intensidade de fluorescência para células presentes no portão P3 (células de fluorescência-negativa) é apresentado como uma sobreposição de forma transparente plot cinza. Como pode ser visto em (B), os níveis de autofluorescência aumentou após permeabilização celular. A intensidade de fluorescência de FITC medida para todas as células transfectadas permeabilizadas aumento (visto como uma mudança com o botão direito sobre o eixo-x), indicando que todas as proteínas V α2δ1 Ca HA-tag transfectadas foram coradas e detectadas pelo anticorpo anti-HA FITC. Gráfico (C) mostra a barra de MFI normalizada medida na presença de FITC (expressão de superfície) não-permeabilizadas intactas ou células permeabilizadas (expressão total). A densidade relativa de fluorescência foi medida em triplicado para cada condição (30.000 células) e em três lotes diferentes de células transfecTed ao longo de um período de um mês, por conseguinte, os dados são apresentados como a média ± SEM para 90.000 células para cada condição. O pico de intensidade de fluorescência foi alcançado entre 24 e 36 horas após a transfecção. Os valores ΔMFI para FITC medidos em células não-permeabilizadas intactos foi utilizada como um índice da expressão na superfície celular de Ca V α2δ1-HA, e valores ΔMFI para FITC medidos em células permeabilizadas reflectir a expressão da proteína total (superfície da célula e a expressão da proteína intracelular ). ΔMFI para FITC foi calculada subtraindo-se a intensidade de fluorescência do FITC FITC células negativas (P3) a partir da intensidade de fluorescência das células positivas para FITC (P2). O mesmo método foi usado para calcular a ΔMFI para mCherry. Os valores de MFI foram normalizados para o valor máximo medido no mesmo dia para mCherry-Ca α2δ1 V-WT HA. (D) Gráfico de barras mostra o normalizado ΔMFI mCherry medido em não-permeabilizadas ou células permeabilizadas (totexpressão ai). Os resultados são expressos como média ± SEM Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

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