ارتفاع الدهون تغذية النموذج لليرقات اسماك الزرد: التغذية، يعيش التصوير، والكمي لتناول الطعام

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الآليات التي الأمعاء وينظم معالجة الدهون الغذائية، يتحكم الكبد معقد تركيب الدهون والبروتين الدهني التمثيل الغذائي، وكيف تعمل هذه الأجهزة مع الجهاز العصبي المركزي للسيطرة على استهلاك المواد الغذائية غير مفهومة تماما. ومن المثير للاهتمام الطبية الحيوية لتوضيح هذه الأحياء في ضوء الأوبئة الحالية من السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري، وغير الكحولية مرض الكبد الدهني. وقد وفرت دراسات في زراعة الخلايا والفئران غالبية فهمنا للعلاقات الآلية بين الدهون الغذائية والمرض، والزرد (دانيو rerio) والناشئة باعتبارها نموذجا مثاليا لتكمل هذا العمل.

الزرد يكون الجهاز الهضمي مماثل (GI) أجهزة، التمثيل الغذائي للدهون، ونقل البروتين الدهني إلى الفقاريات العليا 1،2، تتطور بسرعة، وولين العريكة وراثيا. وضوح البصرية من الزرد اليرقات يسهل الدراسات المجراة، وparticulaميزة ص لدراسة نظام GI كما محيطها خارج الخلية (أي الصفراء، والجراثيم، والغدد الصماء الإشارات) يكاد يكون من المستحيل لنموذج خارج الحي. وفقا، مجموعة من البحوث التي تجمع بين قابلية الإستطراق الجيني والسببية للعيش التصوير من يرقات الزرد مع مجموعة متنوعة من التلاعب الغذائية (نسبة عالية من الدهون 3،4، -cholesterol والوجبات الغذائية -carbohydrate 6،7)، ونماذج من مرض القلب والأوعية الدموية مرض السكري 9،10، الكبد تنكس دهني 11-13، والسمنة 14-16، والناشئة لتقديم مجموعة من الأفكار التمثيل الغذائي.

جانبا أساسيا من الانتقال الزرد اليرقات في أبحاث الأيض هو تعظيم الاستفادة من التقنيات المتقدمة في الحيوانات نموذج الأخرى في الزرد وتطوير فحوصات جديدة التي تستغل نقاط القوة الفريدة من الزرد. ويعرض هذا البروتوكول التقنيات المتقدمة والأمثل لتغذية اليرقات الزرد في معهد العلوم الإندونيسيد غنية وجبة، تصور معالجة الدهون الغذائية من الجسم كله لقرار التحت خلوية، وقياس الاستهلاك الغذائي. وقد تم اختيار الدجاج وصفار البيض لتكوين وجبة غنية بالدهون لأنها تحتوي على مستويات عالية من الدهون والكوليسترول (الدهون يؤلف ~ 58٪ من صفار البيض والدجاج، منها ~ 5٪ هي نسبة الكوليسترول، و 60٪ من الدهون الثلاثية، و 35٪ من الدهون الفوسفاتية ). ويقدم الدجاج صفار البيض المزيد من الدهون من الأطعمة التقليدية التجارية الزرد micropellet (~ 15٪ نسبة الدهون) وميزة أنه تغذية موحدة مع النسب المعروفة أنواع معينة من الأحماض الدهنية، والحمية الغذائية الزرد وأفواج التغذية لم موحدة عبر مختبرات (17). وعلاوة على ذلك، النظير الدهون الفلورسنت المنصوص عليها في صفار البيض تصور النقل وتراكم الدهون الغذائية 18، والمكونات الخلوية الصور بما في ذلك قطرات الدهون من خلال العمل على حد سواء الأصباغ كما الحيوية 3 ومن خلال دمج التساهمية إلى الدهون المعقدة، والتحقيق في عملية التمثيل الغذائي من خلال رقيقة اللوني طبقة (TLC) 19 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل معهد كارنيجي للعلوم المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (بروتوكول رقم 139).

1. إعداد الحيوان

  1. الحفاظ على البالغين واليرقات عند 28 درجة مئوية في ساعة 14: 10 ساعة ضوء: دورة الظلام. تغذية الكبار مرتين يوميا مع شركة شل الأرتيميا مجانا (الأرتيميا decapsulated وعدم الفقس، ابتداء من الساعة 14 DPF) وmicropellets التجارية.
  2. هي الأمثل هذه البروتوكولات لاستخدام 6-7 يرقات DPF التي جمعتها التفريخ الطبيعي للخلفية AB. بروتوكولات يمكن تعديلها ليرقات الأعمار والخلفيات الأخرى. لا توفر الغذاء خارجي قبل 6 DPF.
  3. تخدير اليرقات مع تريكين في وسائل الإعلام الجنين (EM) (4.2 مل من 4 ملغ / مل تريكين لكل 100 م مل) في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. إعداد غنية بالدهون صفار البيض تغذية

  1. إعداد وتخزين صفار بيضة الدجاج. فصل صفار وبياض 12 بيض الدجاج. تجميع صفار، قسامة 1 مل إلى 1.5أنابيب مل، ومخزن في -80 درجة مئوية تصل إلى 1 سنة (و12 صفار جعل ~ 80 قسامات). تجميع البيض، وتخزين، واستخدام ذلك، والأعلاف الغنية بالبروتين الفقيرة الدهون.
  2. إعداد الفلورسنت التناظرية الدهون (ق) التي يمكن ان تضاف الى علف صفار البيض إذا رغبت في ذلك.
    1. تعليق شراؤها، مسحوق التناظرية الدهون الفلورسنت في الإيثانول بنسبة 100٪ أو 100٪ الكلوروفورم عند 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر (انظر التالية مذكرة مناقشة المذيبات)، قسامة في أنابيب زجاجية غير شفافة، وختم مع parafilm، وتخزينها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بسبب التبخر السريع للمذيبات العضوية لا تستخدم كميات أقل من قسامة ~ 400 ميكرولتر للتخزين على المدى الطويل.
      ملاحظة: إذا تم تعليق التناظرية الدهون في الإيثانول، كميات كبيرة من الدهون التناظرية سيتم استخدامها لأنه يجف بسرعة تحت N 2 من الكلوروفورم. إذا علقت التناظرية الدهون في الإيثانول أنه ليس من الضروري أن تكون جافة ومعلق قبل إضافتها إلى الأعلاف الحويصلية في الخطوة 2.2.4، ولكن ينبغي تركيز الإيثانول إجمالي لا يتجاوز 0.1٪ في تغذية الحويصلية لتجنب الآثار الفسيولوجية يحتمل أن تكون مربكة للإيثانول.
    2. لالنظير الأحماض الدهنية الفلورسنت: إعداد إجمالي حجم 20 مل 5٪ مستحلب صفار البيض في الأسواق الناشئة. من أن إعداد 5 مل قسامات مع تركيز النهائي من 6.4 ميكرومتر 4،4-difluoro-4-بورا-3A، 4A-diaza-ق-indacene (BODIPY C 16) ليعيش التصوير متحد البؤر وتناول الطعام فحوصات أو 1 ميكروغرام / مل BODIPY C 12 للتصوير مجهر تشريحي. تحويل المبلغ المطلوب من الدهون التناظرية الفلورسنت إلى 1.5 مل أنبوب بلاستيكي. تجفيف الدهون تحت تيار من N مع الحرص على عدم تفجير الدهون من الأنبوب.
    3. على الفور، resuspend في 5 ميكرولتر 100 الإيثانول٪ من قبل pipetting تيار أسفل جانبي الأنبوب، إضافة 95 ميكرولتر EM، وتخلط جيدا.
      ملاحظة: خليط يجب أن تظهر متجانسة. إذا بقي الدهن الملونة على جانبي الأنبوب أو يظهر السائل ملتف، والدهون لا بالفاعلات تماما ويتطلب المزيد من الايثانول. حماية أنبوب جيئة وذهاباضوء م ومتجر على الجليد.
    4. لالفلورسنت الكولسترول التناظرية: إعداد تركيز النهائي من 2.4 ميكروغرام / مل الكولسترول في 5 مل 0،5-5٪ مستحلب صفار البيض للدراسات التصوير الحية. تحويل المبلغ المطلوب من الكولسترول في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل. تجفيف الدهون تحت تيار من N مع الحرص على عدم تفجير الدهون من الأنبوب.
    5. على الفور، resuspend في 15 ميكرولتر من RT الإيثانول بنسبة 100٪ من قبل pipetting تيار أسفل جانبي الأنبوب وتخلط مع 85 ميكرولتر من RT 1٪ الدهنية BSA خالية من الحمض الموجود في H 2 O. تنقية حماية أنبوب من الضوء وتخزينها على الجليد.
  3. إعداد صفار البيض الحويصلية الأعلاف.
    1. إضافة قسامة إذابة صفار البيض إلى EM في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. دوامة المخفف صفار البيض الخليط لمدة 1-2 دقيقة. يجب أن تظهر الخليط أن يكون مستحلب متجانسة.
    2. يصب الخليط من خلال مصفاة شبكة غرامة لإزالة التكتلات البروتين وجمع في وجديدة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
    3. نبض SONICAالشركة المصرية للاتصالات خليط البيض مع microtip مدبب واحد الرابعة بوصة (5 مرات (5 × 1 ثانية على، 1 ثانية إيقاف) التوقف 5-10 ثانية بين كل مجموعة، كثافة الانتاج: 6 W) في RT لخلق الجسيمات الشحمية. إعدادات الطاقة Sonicator هي أداة تعتمد، وبالتالي تتطلب الأمثل لكل أداة وmicrotip.
      ملاحظة: مستمر صخرة خليط الحويصلية في RT للحفاظ على التجانس حتى الاستخدام.
  4. إضافة الدهون التناظرية الفلورسنت إلى الجسيمات الشحمية صفار البيض، إذا رغبت في ذلك. مباشرة بعد صوتنة، الماصة الدهون مستعدة في خليط الحويصلية ودوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية على أن تدرج في الجسيمات الشحمية. حماية خليط من الضوء من خلال التفاف أنبوب في احباط ومواصلة هزاز في RT.

3. تغذية النموذج

  1. إعداد اليرقات لتغذية.
    1. قبل البدء في تغذية، يرقات الشاشة لعيوب شكلية الواضحة التي قد تعوق التغذية. نقل اليرقات إلى 60 ملم × 15 ملم أطباق بتري أو 6- أو 12-جيدا جيش التحرير الشعبى الصينىقسم التدريب والامتحانات، والحد من EM إلى أدنى حد ممكن، واستبدالها مع 5 مل من محلول الحويصلية استعداد.
    2. إذا لزم الأمر، ونقل unfed اليرقات السيطرة إلى 5 مل م و / أو 5 مل 5٪ بياض البيض في الأسواق الناشئة وعلاج في نفس الوقت.
  2. صخرة بلطف اليرقات في الروك المحتضنة (29-31 درجة مئوية في 30 دورة في الدقيقة) في جميع أنحاء تغذية لتشجيع تناول الطعام مع الاستمرار في حماية من الضوء إذا النظير الدهون الفلورسنت موجودة. وإذا دعت الحاجة اليرقات أن تتعرض للضوء، والتقليل من التعرض مع غطاء زجاجي ملون حاضنة.
  3. في نهاية فترة الرضاعة، وشطف اليرقات السباحة بحرية في EM 3 مرات.
    ملاحظة: يرقات قد تبدأ المستهلكة الجسيمات الشحمية في أي نقطة خلال تغذية. إذا فمن الأهمية بمكان أن يرقات تبدأ تغذية في نفس الوقت، وشاشة لتناول الطعام (انظر 3.4) بعد 1 ساعة من التغذية والعودة اليرقات الوحيدة التي بدأت تغذية إلى مستحلب صفار البيض لاستكمال تغذية.
  4. كشف اليرقات في هذه المرحلة لتناول الطعام وعدد صغير لا يجوز عصامر (عموما ~ 0-5٪). فحص الأمعاء من اليرقات التي تم تخدير أو قليلا يبرد على كتلة معدنية على الجليد لتحديد ما إذا كانت قد غذت: سوف اليرقات التي قد استهلكت الجسيمات الشحمية لديهم الأمعاء مظلمة (الشكل 1).
  5. صورة أو عملية يرقات لتناول الطعام مباشرة. بالتناوب، مكان اليرقات في EM الطازجة واحتضان عند 28 درجة مئوية للسماح للمعالجة التمثيل الغذائي للتحدث.

4. تصاعد اليرقات للتصوير لايف

  1. إعداد وسائل الإعلام تركيب.
    1. لمدة 3٪ السليلوز الميثيل: إضافة 0.75 ز ميثيل السليلوز إلى 25 مل من القريب الغليان EM، دوامة، الروك في RT 2-3 أيام حتى يذوب تماما، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة سنة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. سوف دورات متكررة من تجميد والذوبان في 4 درجات مئوية إزالة فقاعات الهواء. تخزين 3٪ السليلوز الميثيل على الجليد في حين تصاعد اليرقات.
    2. 1.2٪ انخفاض جبل الاغاروز: إضافة 0.3 غرام من الاسعار المنخفضة تذوب الاغاروز إلى 25 مل م وحل من خلال جلب ليغلي، وقسامة في 2 مل رubes، والحفاظ على 26-28 درجة مئوية في كتلة الحرارة. ويمكن تخزين قسامات غير المستخدمة في RT أو -20 درجة مئوية، ويغلى مرة أخرى في وقت الاستخدام. مما لا شك فيه أن الاغاروز باردا بما فيه الكفاية للتعامل مع قبل تعريض يرقات أو قد يكون الإفراط في تسخين.
  2. لانخفاض التكبير، متوسطة الإنتاجية التصوير الحي، ووضع شريحة زجاجية على الأنسجة على كتلة معدنية على الجليد وانتظر الشريحة لتبرد. ضع كمية سخية من 3٪ ميثيل السليلوز (الذي تم الحفاظ على 4 درجات مئوية على الجليد) على الشريحة، ونقل اليرقة على السليلوز الميثيل 3٪، وذلك باستخدام لعبة البوكر خط الصيد (0.41 ملم خط الصيد قطر لصقها على نهاية أنبوب الزجاج الشعرية) خلق وعد لتصريف فائض م (حتى لا تضعف أن السليلوز الميثيل) ووضع اليرقات كما تريد.
  3. على المدى القصير (<20 دقيقة)، وارتفاع التكبير التصوير الحي مع هدف انبثاق النفط تستقيم، جبل اليرقات مع ساترة الهزيل إلى الأسلوب.
    1. استخدام الغراء cyanoacrylate على أساس (Superglue) لإرفاق أأ 22 ملم × 30 ملم ساترة لأحد طرفي شريحة زجاجية. استخدام لعبة البوكر لوضع خط رفيع من 3٪ السليلوز الميثيل على الشريحة المجاورة لساترة ونقل اليرقات إلى الشريحة مع تحمل اسعة باستور الماصة. إزالة EM الزائد لذلك لن يخفف من السليلوز الميثيل.
    2. باستخدام لعبة البوكر، ضع بلطف اليرقات في السليلوز الميثيل على جنوبهم (الجانب الأيسر تصل إلى صورة أكثر من الكبد، والجانب الأيمن حتى صورة المرارة) ورؤوسهم بجانب ساترة.
    3. بقعة superglue في زوايا ساترة الثانية وبلطف وضع حافة واحدة من ساترة على ساترة شنت والآخر على الشريحة، سد اليرقات. الحرص على عدم الضغط الزائد خلال هذه الخطوة أو مع هدف خلال التصوير بحيث اليرقات تبقى يصب بأذى.
  4. على المدى الطويل، وارتفاع التكبير التصوير مع هدف الغمر تستقيم، جبل اليرقات في الاغاروز. إضافة يرقة إلى قسامة صغيرة من 1.2٪ ذوبان منخفضة الاغاروز ثم نقليرقة في كمية صغيرة من الاغاروز إلى طبق بتري.
    1. وضع بسرعة اليرقات مع لعبة البوكر قبل يتصلب الاغاروز. السماح للالاغاروز لتجف لمدة 2-3 دقيقة وتغطي الاغاروز تماما مع EM جديدة لمنعها من الجفاف.
  5. على المدى الطويل، وارتفاع التكبير التصوير مع هدف مقلوب، جبل اليرقات على طبق من الزجاج السفلي في الاغاروز.
    1. تبريد كتلة معدنية على الجليد. وضع الطبق على كتلة معدنية مفصولة الأنسجة لمنع التبريد المفرط وتجميد اليرقات. نقل اليرقة إلى الطبق وإزالة EM بواسطة فتل بمنديل ورقي.
    2. ضع قطرة من 28 درجة مئوية منخفضة ذوبان الاغاروز (1.2٪) على رأس اليرقة ووضع على الفور مع لعبة البوكر (الجانب الأيسر وصولا الى أفضل صورة الكبد، والجانب الأيمن أسفل إلى صورة المرارة). إزالة طبق من كتلة الباردة، والسماح ليجف لمدة 2-3 دقائق، وإضافة كمية كافية من EM جديدة لتغطية الاغاروز (~ 2-5 مل).

تناول 5. الغذاءفحص

  1. في نهاية آر الحويصلية صفار البيض يحتوي على 6.4 ميكرومتر BODIPY C 16، تجمع ما لا يقل عن 10 يرقات غسلها في أنبوب 1.5 أو 2 مل من البلاستيك، وإزالة EM، والمفاجئة التجميد. قد يتم تخزين العينات في -80 درجة مئوية محمية من الضوء لعدة أشهر.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، وجمع مكررات متعددة. ومن المهم لجمع اليرقات unfed في هذه الخطوة لتطبيع مضان الخلفية الدهون (مثالي اليرقات من نفس القابض تستخدم).
  2. إجراء تعديل بلي-داير استخراج الدهون 3،21.
    1. إضافة 100 العازلة التجانس ميكرولتر (20 ملي تريس الكلورين، 1 ملم EDTA) لعينة على الجليد (المنقى بدلا من H 2 O يمكن استخدامها). التجانس على الجليد مع sonicator microtip (5 ثانية مجموعه: 1 ثانية على 1 ثانية إيقاف). تأكد من أن اليرقات تكون متجانسة تماما. إن لم يكن، وتكرار. نقل إلى أنبوب ثقافة الزجاج القابل للتصرف مل 13 (يمكن استخدام أنابيب زجاجية أخرى).
      ملاحظة: الكلوروفورم خطرة. أداء جميع السابق الدهون لاحقاخطوات الجر في RT في غطاء الكيميائية.
    2. لكل 100 ميكرولتر من العازلة التجانس المستخدمة، إضافة 375 ميكرولتر من 1: 2 (كلوروفورم: الميثانول). دوامة 30-60 ثانية، واحتضان 10 دقيقة، إضافة 125 ميكرولتر من كلوروفورم لكل 100 عازلة التجانس ميكرولتر المستخدمة، ودوامة 30 ثانية.
    3. إضافة 125 ميكرولتر من 200 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 لكل 100 عازلة التجانس ميكرولتر المستخدمة، دوامة 30 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي (2000 ز س، 5 دقائق، RT، محمية من الضوء). إزالة بعناية عينات من أجهزة الطرد المركزي. وسيتم تقسيمها إلى مرحلتين: مرحلة العليا هي المائية، واجهة الحطام اليرقات، ومرحلة العضوية الدنيا (يحتوي على الدهون).
    4. مع ماصة زجاجية نظيفة جمع القاع، والمرحلة العضوية وتحويلها إلى أنبوب زجاجي 13 مل نظيفة.
      ملاحظة: احرص على تفادي المرحلة المائية والحطام اليرقات في واجهة. في حالة حدوث تلوث، كرر الخطوة الطرد المركزي ويتذكر. تجاهل، المرحلة المائية العليا. قد يكون من المفيد لإزالة والتخلص من هذاالمرحلة قبل جمع المرحلة العضوية. ويمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
    5. تجفيف المرحلة العضوية تحت فراغ (0.12 ضغط جوي) مع حماية من ضوء. عدم الاستمرار في تجفيف العينات بعد ذلك يتبخر السائل كما أنه سيقلل الذوبان في الدهون. Resuspend والدهون في 2: 1 (كلوروفورم: الميثانول) ومتجر على الجليد. حجم الأمثل للالكلوروفورم: حل الميثانول يعتمد على طريقة الكشف المستخدمة؛ تبدأ منخفضة والاستمرار في تمييع حسب الحاجة. والمبدأ التوجيهي العام هو استخدام 10 ميكرولتر لمدة 10 اليرقات المجمعة.
  3. بقعة أحجام العينة كلها في فترات متباعدة بشكل متساو على طبق من ذهب TLC توجيه والمسح الضوئي لوحة مع ماسح ليزر تستخدم بشكل روتيني للتصوير الجزيئي البيولوجي (على سبيل المثال، قارئ لوحة الفلورسنت). لالنظير الدهون الفلورسنت المدرجة في قائمة المواد التي لها ماكسيما الإثارة 500-650 ماكسيما نانومتر، والانبعاثات 510-665 نانومتر، واستخدام الليزر 488 نانومتر، ومع جمع الانبعاثات في 520 نانومتر.
    1. قياس مضان الإجمالي لكل بقعة مع برامج التصوير.
      ملاحظة: صحيح لتحدث بشكل طبيعي خلفية الدهون مضان من خلال طرح مضان من الاقتران، وعينات اليرقات unfed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما يتغذى على الكرسي الهزاز في 29-31 درجة مئوية، فإن الغالبية العظمى من اليرقات صحية (≥95٪) تناول الطعام داخل 1 ساعة. على استهلاك مستحلب صفار البيض، وتضعف الأمعاء اليرقات في اللون. جدا الأمعاء المظلمة يمكن ملاحظتها في 2 ساعة (الشكل 1). إذا اليرقات unfed أو تفشل في إطعام، لا يزال الأمعاء واضح. اليرقات تتغذى البيض المعرض الأبيض لمعة الأمعاء منتفخة لا تلقي بظلالها في اللون.

شكل 1
الشكل 1: فحص يرقات لتناول الطعام نوع البرية يرقات 6 DPF غذيت 5٪ صفار البيض في EM لمدة 2 ساعة أو معالجتها بشكل متواز في EM للحصول على الضوابط unfed. اليرقات Unfed لها أمعاء واضحة في حين اليرقات التي تتغذى التي تستهلك صفار البيض لها الأمعاء المظلمة عند تصويرها في 10X على المجسام. تمثل الحانات مقياس 0.1 مم.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تغذية مع النظير الدهون الفلورسنت يسمح التصور النقل النظامية وتراكم التحت خلوية من الدهون الغذائية. إشارة الفلورسنت موجودة في جميع أنحاء الجهاز الهضمي (الأمعاء والكبد والبنكرياس) من اليرقات تغذية 5٪ صفار البيض مع 6.4 ميكرومتر الفلورسنت C 16 التناظرية لمدة 8 ساعة شنت مع ساترة الهزيل إلى أسلوب وتصويرها مع الهدف تستقيم (الشكل 2) 3.

الشكل 2
تغذية نيون الدهن النظير تصور الغذائية الدهن نقل صورة مركبة التمثيلية لليرقة DPF-6 (رأس يواجه اليمين) 5٪ صفار البيض في EM مع 6.4 ميكرومتر BODIPY FL C 16 لمدة 8 ساعة: الرقم 2. وقد شنت اليرقات في 3٪ السليلوز الميثيل بحلول ساترة-تتكئ على طريقة وتصوير مع تستقيم 63X الهدف غمر النفط على الفوتون المجهر متحد البؤر واحد مع ليزر الأرجون. تمثل الحانات نطاق 20 ميكرون. الكبد، L، الأمعاء، الأول؛ البنكرياس، P، المرارة، GB، أعيد طبعها بإذن من ديف بيو 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مختلف النظير الدهون تسمح التصور من مجموعات فريدة من الهياكل الخلوية لأنها استقلاب تفاضلي في الدهون المعقدة (أي، الدهون الثلاثية، استرات الكوليسترول في الدم، الدهون الفوسفاتية). يغذي 8 ساعة، فلوري C 16 و C 12 النظير علامة مميزة قطرات الدهون، فلوري FL C 5 بطاقات قطرات الدهون، والقنوات الكبدية والبنكرياس، والأغشية الخلوية، وشبكات الشرايين، والفلورسنت C 2 التناظرية تسميات الكبد والقنوات البنكرياسية والخلوية - فيما يلي 4 الأغشية (الشكل 3) 3.

ove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (3)
الشكل (3): مختلفة نيون الدهن النظير تسمية فريد الخلوية هيئات صور مركبة التمثيلية لليرقات تغذية 5٪ صفار البيض في EM مع 6.4 ميكرومتر BODIPY FL C 16، C 12، C 5 أو C 2 لمدة 4-8 ساعة (6 DPF) . لوحظ C 16 التناظرية في قطرات الدهون (LD) من المعوية، C 12 و C 5 النظير في LD خلية معوية وتجويف الأمعاء، وC 2 التناظرية في لمعة الأمعاء. وقد شنت اليرقات في 3٪ السليلوز الميثيل بحلول ساترة-تتكئ على طريقة وتصويرها مع 63X الهدف غمر النفط تستقيم على الفوتون المجهر متحد البؤر واحد مع ليزر الأرجون. تمثل الحانات نطاق 20 ميكرون. أعيد طبعها بإذن من نماذج المخدرات Discov اليوم ديس 22. _blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تطوير اليرقات تناول الطعام فحص للتحقيق طفرات كيف الوراثية، overexpression الجينات المعدلة وراثيا، و / أو العلاج خارجية تؤثر على الاستهلاك الغذائي اليرقات. ويتم تغذية اليرقات وجبة غنية بالدهون ارتفعت مع الدهن التناظرية الفلورية للدلالة على كمية من المواد الغذائية المستهلكة. يتم جمع اليرقات Unfed بالتوازي مع تطبيع للمبلغ مضان الخلفية موجودة في اليرقات، وزيادة الحساسية التي يمكن أن يتم الكشف عن الدهون التناظرية الفلورسنت. وقد استخدم هذا الاختبار لإثبات أن overexpression من ئي A-IVb.1 (برنامج عمل ألماتي-IVb.1) يقلل من تناول الطعام. سابقا unfed تيراغرام (HSP70: برنامج عمل ألماتي-IVb.1: mCherry) اليرقات تغذية 10٪ صفار البيض مع 6.4 ميكرومتر الفلورسنت C 16 التناظرية لمدة 4 ساعة على 7 DPF استهلاك الدهون حوالي 30٪ أقل من نوع اليرقات البرية (الشكل 4) 20.

جنرال الكتريك = "1"> الشكل (4)
الرقم 4: التمثيلية تناول الطعام الفحص نوع البرية (WT) وتيراغرام (HSP70: برنامج عمل ألماتي-IVb.1: mCherry) تم تغذيتها (تيراغرام) يرقات 10٪ الدجاج والبيض صفار البيض مع 6.4 ميكرومتر BODIPY FL C16 لمدة 4 ساعة (البنك المركزي الامريكي) أو المعالجة بالتوازي في EM (Unfed). وكان يتم تجميع (A) اليرقات (ن = 10)، تم استخراج الدهون، ورصدت مقتطفات على لوحة TLC. (ب) وكان كميا مجموع مضان، أعرب في وحدات التعسفي فلوري (AFU) بمعادلتها لمضان الخلفية مع الأشقاء unfed من الطرح، وأعربوا عن النسبي في WT. TG اليرقات overexpressing برنامج عمل ألماتي-IVb.1 استيعاب أقل النظير الدهون fluorescently المسمى كما يتضح من مقارنة WT (إقران اختبار t الطالب، ف <0.001، ن = 9، 20 اليرقات في التجربة). يمثل مربع المئوية ال 25-75، ويشار إلى متوسط. وتظهر شعيرات من المئين الخامس 10-90. طبعبإذن من ديس نموذج الميكانيكية 20. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المذكورة هنا تسمح للباحثين لعلاج الزرد اليرقات مع تغذية غنية بالدهون، تصور معالجة الدهون الغذائية في اليرقات الحية، وتحديد حجم الاستهلاك الغذائي اليرقات. لضمان النجاح، ينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى العديد من الخطوات الهامة. بيض الدجاج التجارية تختلف. للحد من التقلبات المحتملة نحن أداء جميع المقايسات على البيض العضوي من الدجاج الخالية من قفص التي لم يتم المخصب لأحماض أوميغا 3 الدهنية. يمكن ملاحظة معدلات التغذية أقل في السمك الذين تقل أعمارهم عن 6 DPF مع ما تبقى من إمدادات الذاتية صفار الطاقة والأسماك غير صحية، أو السمك مع الطفرات التنموية التي تعيق الاستهلاك الغذائي (أي الفك أو تشوه الأمعاء، وعدم القدرة على السباحة بشكل صحيح). المختبر فاربر يؤدي عموما دراسات التغذية في 6-7 أيام بعد الإخصاب (DPF) ليرقات لا تتطلب الغذاء خارجي حتى يتم استنفاد بها مخازن صفار الداخلية واستنزاف صفار يسمح لرؤية أفضل من الجهاز الهضمي. تغذيةفي RT أيضا يقلل بدرجة كبيرة من عدد من اليرقات التي تتغذى. الفشل في اليرقات الشاشة لتناول الطعام وإدراج غير مقصود من اليرقات unfed في تجارب لاحقة قد اربكت النتائج. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم لحماية النظير الدهون الفلورسنت، وجميع عينات اليرقات التي تتغذى على النظير، من ضوء عندما يكون ذلك ممكنا للحفاظ على الحد الأقصى مضان، والحساسية وبالتالي الفحص. وأخيرا، إذا كان سيتم قياس كمية الطعام، لا تسمح للتغذية ومطاردة (بعد تغذية فترة الأيض) ليتجاوز ما مجموعه 4 ساعات، منذ وجبة ستبدأ في أن تفرز. حاليا، فإن المعدل الذي يتم تفرز جبة وما يرتبط بها من النظير الفلورسنت الدهون غير معروف، ولكن مضان يمكن أن تستمر في جميع أنحاء الجسم اليرقات لا يقل عن 2 أيام آخر تغذية (الموظفين الفنيين المبتدئين والقوات المسلحة السودانية بيانات غير منشورة).

هناك عدة طرق لتعديل وإصلاحها بروتوكولات للإجابة على الأسئلة التجريبية من الفائدة. تغذية غنية بالدهون يمكن القيام بها لفترات مختلفة من رIME: وسوف 1 ساعة تقديم وجبة صغيرة، في حين أن 4 ساعة وملء الأمعاء مع كمية كبيرة من الدهون. ومع ذلك، وإطعام اليرقات أطول من 6 ساعات ليست على النحو الموصى به صفار البيض ولم يتم إعدادها EM في ظروف معقمة وفرط نمو جرثومي في صفار البيض / مستحلب الأبيض قد اربكت النتائج (أي زيادة الالتهاب، وتتغير الشخصي الجراثيم المعوية). يرقات يمكن فحصها مباشرة بعد التغذية للتحقيق في الآثار الحادة للتغذية اليرقات يجمد بواسطة التبريد وجيزة أو التخدير تبدأ بسرعة لتغذية مرة أخرى بعد إعادة التدفئة، ولكن التبريد هو الأسلوب الأفضل لتجميد كما اليرقات قد يحمل التقيؤ على التخدير (SAF المراقبة غير منشورة). بدلا من ذلك، يمكن أن يتم فترات مطاردة من بعد علف للسماح للنقل والتمثيل الغذائي للدهون الغذائية السابقة للدراسة. على الرغم من أن تتم يغذي عادة في 5 مل من محلول الحويصلية، أجريت يغذي بنجاح في أحجام تتراوح بين 1 و 20 مل. تركيز مختلفالصورة من صفار البيض ويمكن أن تستخدم لتغذية اليرقات. المختبر فاربر يقوم بشكل روتيني تجارب مع 5٪ صفار البيض (أضيف 1 مل صفار البيض إلى 19 مل EM)، و 0.5٪ صفار البيض، و 10٪ صفار البيض.

هناك قيود محتملة النظير الدهون الفلورسنت التي يجب أخذها بعين الاعتبار. عند اختيار الدهون التناظرية الفلورسنت من المهم النظر في كيفية معالجة الدهون من الناحية الفسيولوجية وحيث شاردة الفلورسنت على التركيبة الكيميائية للدهن عند تفسير النتائج. على سبيل المثال، يتم تقسيم الدهون الثلاثية وصولا إلى الأحماض الدهنية الحرة والجلسرين، واسترات الكوليسترول إلى أحماض الكولسترول والدهنية الحرة، في لمعة الأمعاء قبل الامتصاص. لذلك، إذا تم توفير الفلورسنت الدهون الثلاثية أو الكوليسترول استر التناظرية في النظام الغذائي مضان لوحظ في الجسم سوف تتبع الأحماض الدهنية والكوليسترول مجانا، أو الجلسرين التي تعلق شاردة الفلورسنت ل، وليس الدهون الثلاثية أو الكوليسترول الأصلي استر. fluorescen مختلفةالنظير ر الدهون علامة مميزة الهياكل الخلوية فريدة من نوعها، وينبغي النظر إلى هذه الحقيقة خلال اختيار 3. أيضا من ملاحظة، مقارنة مع استقلاب الأحماض الدهنية الأم، إضافة شاردة BODIPY ما يعادل تقريبا مضيفا ~ 2-3 الكربون لطول سلسلة الأحماض الدهنية (SAF بيانات غير منشورة).

التقنيات الموضحة هنا تمثل أوجه التقدم الكبير على فحوصات السابقة وصفها في هذا المجال. دراسات سابقة للتطور من هذا الدجاج والبيض تغذية صفار البيض، واثنين من المخطوطات التفصيلية التي تم تغذية يرقات بالطاقة البيض المسلوق صفار 4،23. تقنية الموضحة هنا تقدم ميزة أن صفار البيض لا تحتاج إلى أن تكون مسلوقة ومسحوق قبل استخدامها وأن صفار البيض المجفف لديه قصيرة جدا نصف العمر بسبب التأكسد السريع. ويمكن أيضا أن السائل صفار البيض يكون مستعدا كما الجسيمات الشحمية التي تقبل بسهولة النظير الدهون الفلورية للتسليم الغذائية كفاءة. بدلا من ذلك، والدهون رديولبلد يمكن استخدامها لالتحرياتtigate الغذائية التمثيل الغذائي للدهون وقياس كمية الطعام، ولكن البديل الدهون الفلورسنت لا تمثل مخاطر السلامة المرتبطة النشاط الإشعاعي. ولكن إذا كان يرغب الباحثون إلى استخدام الدهون رديولبلد، كان أداء المختبر فاربر الدراسات للتحقق من الدهون رديولبلد يمكن دمجها، وتغذى بنجاح مع، الجسيمات الشحمية 19. وقد تم اختيار النظير الدهون الفلورسنت وصفها هنا لأنها تظهر الأيض مشابه إلى حد كبير لنسبة الدهون الذاتية ورديولبلد، وكان مشرق بما فيه الكفاية لالمنخفضة والتصوير عالية الطاقة.

التي سبقت تطوير هذه التقنية لتغذية النظير الدهون الفلورسنت إلى يرقات، لم تكن هناك وسائل أخرى متاحة لتصور نقل الدهون في النظام الغذائي وتراكم في الجسم الحي. رؤية مباشرة النظير الدهون الفلورسنت يمكن أن توفر ميزة على استخدام التدابير غير المباشرة لعلم وظائف الأعضاء، مثل نسبة الدهون في الدم. كان القياس الدقيق لتناول الطعام الزرد اليرقات أيضا ستا الطويلالاكتشاف التحدي في هذا المجال. وكان البديل الوحيد لمتناعلات الثقافة، تسمية لهم مع التتبع الفلورسنت محبة للدهون 4- (4- (didecylamino) styryl) - N يوديد -methylpyridinium (4-دي-10-ASP)، يسمح اليرقات لإطعام، وقياس مضان في منطقة داخل البطن مع قارئ لوحة 24. وأخيرا، هذه التقنيات لديها ميزة كونها تنطبق على كلا شاشة متوسطة الإنتاجية (أي شاشات الوراثية إلى الأمام من معالجة الدهون الغذائية)، وكذلك دراسات التصوير ركز عالية التكبير (أي عكس الوراثية والدراسات فرضية مدفوعة). في المستقبل، يمكن تطبيق هذه التقنيات إلى النمط الظاهري وفحص نماذج متنوعة من التمثيل الغذائي وGI المرض في الزرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4, (4), 501 (2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30, (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360, (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232, (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111, (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8, (12), 81485 (2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121, (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132, (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), 36474 (2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53, (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292, (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7, (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8, (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10, (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44, (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7, (12), 52549 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics