高脂饮食范式斑马鱼幼体:饲养,实时成像,和食物摄入的量化

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

通过该肠调节膳食脂质加工机制,肝控制复合脂质合成和脂蛋白代谢和这些器官如何与中枢神经系统中工作,以控制食物摄取是不完全理解。它是生物医学兴趣的肥胖,心血管病,糖尿病和非酒精性脂肪肝疾病的当前流行的光来阐明这个生物学。在细胞培养研究和老鼠提供的大部分我们的膳食脂肪和疾病,和斑马鱼( 斑马鱼 )之间的机械关系的认识正在成为一种理想的模式,以配合这项工作。

斑马鱼也有类似的胃肠(GI)的器官,脂质代谢,脂蛋白运输到高等脊椎动物1,2,发展迅速,并在遗传上容易处理。幼虫斑马鱼的光学清晰度便于在体内研究中,particulař优势胃肠系统作为其胞外环境中的学习( ,胆汁,菌群,内分泌信令)几乎是不可能的模型离体进行。根据,研究相结合的遗传易处理性和有助文章的主体住斑马鱼的成像各种饮食控制高脂肪3,4, -胆固醇5和-carbohydrate饮食6,7),与心血管疾病8的模型,糖尿病9,10,肝脂肪变性11-13,和肥胖14-16正在兴起,以提供代谢见解的主机。

过渡幼虫斑马鱼成代谢研究的一个重要方面是在其他动物模型的斑马鱼和利用斑马鱼的独特优势新颖测定的发展开发的技术的最优化。该协议提出的技术开发和优化的喂养幼虫斑马鱼梨皮D-一顿丰富的,可视化的整个身体饲料脂肪处理亚细胞分辨率,并测量食物的摄入。鸡蛋黄被选择以构成富含脂质的膳食,它包含高含量的脂肪和胆固醇(脂质组合〜鸡蛋黄,其中约5%的胆固醇,60%是甘油三酯,和35%的58%为磷脂的)。鸡蛋黄提供了比典型的商业斑马鱼微丸食物(〜15%的脂质)和优点,即它是与特定的脂肪酸种类的已知百分比的标准化供给更多的脂肪,如斑马鱼的饮食和喂养团没有被跨越实验室17标准化。此外,在蛋黄提供荧光脂质类似物可视运输和膳食脂类18的积聚,图像细胞成分包括既作为活体染料3和通过共价掺入复合脂脂滴,通过薄层色谱法调查代谢(TLC)19 20的定量测定。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

这些协议已批准由卡内基科学研究所机构动物护理和使用委员会(协议编号139)。

1.动物的制备

  1. 保持在14小时成虫和幼虫在28°C:10小时亮:暗周期。每日两次与壳牌免费卤虫 (拆封,不孵化,开始在14 DPF)和商业微丸饲料成年人。
  2. 这些协议的使用6-7 DPF幼虫由AB背景的自然产卵收集优化。协议可以修改为其他年龄和背景的幼虫。不提供外源性食物前6 DPF。
  3. 麻醉与三卡因在胚胎介质(EM)的幼虫(4.2毫升4毫克每100毫升的EM / ml的三卡因)在室温(RT)。

2.富含脂质蛋黄饲料的研制

  1. 准备和储存鸡蛋蛋黄。分开12鸡蛋蛋黄和蛋白。池蛋黄,等分1毫升到1.5毫升管,并储存在-80°C至1年(12蛋黄会让〜80等分)。池白人,存储和脂质差,富含蛋白质的饲料使用。
  2. 制备荧光脂质类似物(多个)如果需要的话也可以加入到蛋黄饲料。
    1. 根据制造商的说明暂停购买的,粉末状的荧光脂质在100%乙醇或100%氯仿类似物在0.1微克/微升(见下面的注释讨论溶剂),等分试样在不透明玻管,用石蜡膜密封,并存储。由于有机溶剂的迅速蒸发不使用等份体积小于〜400μl的用于长期存储。
      注意:如果所述脂质类似物悬浮在乙醇中,脂质类似物的大量将被使用,因为它 N 2下干燥快于氯仿。如果脂质类似物悬浮在乙醇它不具有在步骤2.2.4它添加到脂质体进料之前被干燥并重新悬浮,但总乙醇浓度不应超过0。在脂质体饲料1%以避免乙醇潜在的混杂生理效应。
    2. 荧光脂肪酸类似物:准备在EM20毫升5%蛋黄乳剂的总体积。从该制备每份5毫升与6.4μM4,4-二氟-4-硼杂3α,4α二氮杂-s-苯并二茚的实时共焦成像和食物摄取测定或1μg/ ml的终浓度(BODIPY C16) BODIPY C 12的立体成像。转移荧光脂质类似物的所需量到1.5毫升的塑料管中。干脂质下N 2流,注意不要吹出来脂管。
    3. 随即,在悬浮移液器流下来管的两侧5微升100%的乙醇,加入95微升EM,拌匀。
      注:该混合物应该出现均匀;如果彩色脂残留在管的侧面或液体出现块状,脂质还没有完全溶解,并且需要更多的乙醇。保护管来回m个光并存储在冰上。
    4. 荧光胆固醇类似物:在5ml 0.5-5%蛋黄乳剂实时成像研究制备2.4微克/毫升胆固醇的最终浓度。转移胆固醇所需量到1.5毫升的塑料管中。干脂质下N 2流,注意不要吹出来脂管。
    5. 立即,重悬在15微升的RT的100%乙醇吹打流走在管的两侧,并在纯化H 2 O与85微升的RT 1%无脂肪酸的BSA混合避光管并存储在冰上。
  3. 准备蛋黄脂质体饲料。
    1. 蛋黄的解冻等分试样添加到EM在50毫升锥形管中。涡稀释蛋黄混合物1-2分钟;该混合物应该似乎是均匀的乳液。
    2. 通过细滤网倒入混合液,以去除蛋白质集团,并收集在一个新的,新鲜的50毫升锥形管。
    3. 脉冲sonica在室温下创建的脂质体:;忒蛋液用四分之一英寸的锥形微尖(6 W输出强度的5倍(5×1秒,停1秒关闭)暂停各组间间隔5-10秒)。超声器电源设置仪器依赖,因此需要每个仪器和微尖的优化。
      注:在室温连续晃动脂质体混合物,以保持均匀待用。
  4. 荧光脂质类似物添加到蛋黄脂质体,如果需要的话。超声处理后,立即吸管调制脂质到脂质体混合物和涡旋以高速进行30秒掺入到脂质体中。通过包装箔管避光混合物,并继续在室温下摇摆。

3.饲养范式

  1. 准备幼虫喂养。
    1. 在此之前开始进料,屏幕幼虫可能妨碍喂食明显的形态缺陷。转移幼虫60毫米×15毫米的培养皿或6-或12孔PLATES,EM降低到最低限度,并用5毫升制备的脂质体溶液的更换。
    2. 如果需要的话,未喂食对照幼虫转移至5ml EM和/或5毫升5%蛋清在EM和并行处理。
  2. 轻轻摇动,在培养摇杆幼虫(30转29-31°C)在整个饲料,鼓励食物的摄入量,同时继续从光盾,如果荧光脂类似物都存在。如果幼虫需要被暴露于光,使与一个有色玻璃培养箱罩曝光。
  3. 在饲养期结束时,冲洗自由游泳的幼虫在EM中的3倍。
    注:幼虫开始在饲料中的任何一点消耗脂质体。如果这是至关重要的幼虫开始在同一时间喂养,屏幕食物的摄入量(见3.4)后,饲养1小时,只返回已开始喂养蛋黄乳液来完成饲料的幼虫。
  4. 屏幕在这一点食物摄入幼虫少数不得EAT(一般0-5〜%)。审查已麻醉或略微在冰上冷却的金属块上,以确定他们是否供给幼虫的肠中:已消耗脂质体幼虫将具有变暗肠( 图1)。
  5. 图片或过程幼虫立即食物的摄入。或者,在新鲜的EM地方幼虫,并在28℃下孵育以允许发生代谢的处理。

4.安装幼虫实时成像

  1. 准备安装介质。
    1. 为3%的甲基纤维素:添加0.75克甲基纤维素至25ml接近沸腾EM,旋涡,岩石在RT至完全溶解2-3天,并储存在4℃的多年来在-20℃。在4℃下冷冻和解冻的重复循环将去除气泡。在刨冰店3%甲基纤维素而安装的幼虫。
    2. 对于1.2%的低贴装琼脂糖:添加将0.3g琼脂糖低熔点至25毫升EM和通过将煮沸,分装于2ml溶解ŧubes,并在散热块上26-28℃的维护。未使用的等分试样可被存储在RT或-20℃,并在使用时再次煮沸。确保琼脂糖是不够冷静暴露于幼虫,也可能是过热之前来处理。
  2. 对于低倍率,介质通量实时成像,放置在冰上的金属块上的组织载玻片并等待滑动冷却。粘在应用3%甲基纤维素大方量(已保持在4℃的冰)到幻灯片,转移幼虫到3%甲基纤维素,使用钓线扑克(0.41毫米直径的渔线玻璃毛细管的端部)创建一个誓言排出过量的EM(使甲基纤维素不会稀释后)和根据需要的幼虫放置。
  3. 对于短期(<20分钟),以正直的油再现客观的高倍率实时成像,支座与盖玻片瘦到方法幼虫。
    1. 使用基于氰基丙烯酸酯胶(强力胶),以附加氨基酸22毫米×30mm的盖玻片载玻片的一端。使用扑克把3%的甲基纤维素的细线上邻近于盖玻片的载玻片,并用大口径巴斯德吸管转移幼虫的幻灯片。删除多余的EM所以不会稀释甲基纤维素。
    2. 使用扑克,轻轻的在他们的边甲基纤维素定位幼虫(左侧最高图像更加肝脏,右侧朝上图像胆囊)与他们的头旁边的盖玻片。
    3. 在第二盖玻片的角,并轻轻点强力胶放置在安装盖玻片盖玻片和其他在幻灯片的一个边缘,桥接幼虫。注意不要在此步骤或同时成像,使幼虫仍然没有受伤客观上施加过大的压力。
  4. 对于长期,以正直的浸泡的目的高倍率成像,琼脂糖安装幼虫。幼虫添加到1.2%低熔点的一小等分试样的琼脂糖然后转移幼虫在小体积琼脂糖到培养皿。
    1. 迅速与琼脂糖凝固之前扑克定位幼虫。允许琼脂糖干燥2-3分钟,用新鲜的EM完全覆盖琼脂糖,以防止其干燥。
  5. 对于长期,有一个倒置的目标高倍率成像,安装在琼脂糖玻璃底菜幼虫。
    1. 在冰上冷却的金属块。将通过组织分开,以防止过度冷却和冻结幼虫金属块上的菜。转移幼虫的菜,并用纸巾吸液去除EM。
    2. 将28°的幼虫顶部ç低熔点琼脂糖(1.2%)的下降,并立即用扑克(左侧到最佳图像肝脏,右侧下到图像胆囊)位置。从冷块中移除盘,晾干2-3分钟,并添加新鲜的EM足够体积,以覆盖琼脂糖(〜2-5毫升)中。

5.食物摄入量化验

  1. 在含有6.4微米的BODIPY C 16蛋黄脂质体饲料年底,在一个塑料1.5或2 ml管集中最低10幼虫洗净,去掉EM和捕捉冻结。样本可以被存储在避光几个月-80℃。
    注意:如果可能的话,收集多个重复。它在此步骤以收集未喂食的幼虫正常化为背景脂质荧光(从同一离合器理想幼虫被使用)是重要的。
  2. 执行修改后的布莱代尔脂质提取3,21。
    1. 将100μl均质缓冲液(20mM三Cl,1mM EDTA)中加入在冰上的样品(或者纯化H可使用2 O)。均质与微尖超声发生器冰(5秒共:1秒1秒关闭)。检查幼虫是完全均质;如果没有,重复。转移到13毫升一次性玻璃培养管(也可使用其它的玻璃管)。
      注:氯仿​​是危险的;执行所有后续脂质前在RT在化学罩牵引步骤。
    2. 对于每100微升匀浆缓冲液的使用时,添加375微升的1:2(氯仿:甲醇)。涡街30-60秒,孵化10分钟,加入125微升每使用100微升同质化缓冲氯仿,涡旋30秒。
    3. 加200毫摩尔Tris pH为125微升7.5%用100微升匀浆缓冲液,涡旋30秒,离心(2,000×g下,5分钟,RT,避光)。小心地从离心分离机取出样品。它们将被分成两相:上部相是水性的,幼虫碎片的接口,以及一个较低的有机相(含有脂质)。
    4. 用干净的玻璃吸管收集底部有机相,并将其转移到一个干净的13毫升玻璃管。
      注:请注意,以避免在界面的水相和幼虫杂物;如果发生污染,重复离心步骤和追忆。丢弃上层,水相;它可能有助于移除并丢弃此收集有机相之前相。可将样品储存在-80℃下长达1个月。
    5. 在真空下干燥有机相(0.12个大气压),同时避光。不要继续干样品后,液体蒸发,因为它会降低脂溶性。重悬脂质2:1(氯仿:甲醇),并存储在冰上。氯仿的最佳体积:甲醇溶液取决于所用的检测方法;开始低,继续稀释需要。一般原则是用10微升10池幼虫。
  3. 发现在均匀时间间隔对整个样品体积到引导TLC板上并扫描与常规用于生物分子成像( 例如 ,荧光板读数器)的激光扫描仪的板。对于包括在具有500-650 nm和最大发射激发最大值从510-665纳米材料清单荧光脂类似物,使用488纳米的激光,并收集排放在520纳米。
    1. 量化与成像软件的每个点的总荧光。
      注意:正常为通过减去配对,未喂食的幼虫样品的荧光天然存在的背景脂质荧光。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

当在29-31℃的摇杆喂,大部分健康的幼虫(≥95%),将1小时内食用。一旦消耗蛋黄乳液,幼虫肠道变暗的颜色。非常暗的肠可以在2小时( 图1)中观察到。如果幼虫喂食物或不喂,肠道是明确的。幼虫喂养蛋清表现出扩张肠腔中不颜色变暗。

图1
图1:筛选幼虫食物摄入野生型6单丝旦的幼虫喂养5%蛋黄中的EM 2小时或并联中的EM处理,得到未喂食对照。不喂食幼虫有清肠而当在10倍于实体镜成像已经消耗蛋黄喂养幼虫有黑暗的肠子。刻度条表示为0.1mm。请点击此处查看该图的放大版本。

用荧光脂类似物饲养允许全身交通和膳食脂肪的堆积亚细胞可视化。荧光信号在整个幼虫喂养5%蛋黄的消化器官(肠,肝,胰)本与6.4微米的荧光C 16模拟8小时搭载有盖玻片稀薄的方法和带有一个直立目标成像( 2)3。

图2
图2:6 DPF幼虫的荧光脂类似物可视化饲料脂肪运输代表的合成图像(头朝右)喂5%蛋黄EM 6.4μMBODIPY FL C 16 8小时。幼虫被安装在3%甲基纤维素的盖玻片稀薄的方法和以正直的63X成像上用氩激光器的单光子共聚焦显微镜油浸物镜。比例尺代表20微米。肝,L;肠,我;胰腺,P,胆囊,GB;从开发生物3许可转载。 请点击此处查看该图的放大版本。

各种脂质类似物允许的独特集细胞结构的可视化,因为它们是有差异代谢成复合脂( ,甘油三酯,胆固醇酯,磷脂)。继4 - 8小时饲料,荧光C 16和C 12类似物标记的脂滴,荧光灯FL C 5标签脂滴,肝,胰腺管,细胞膜和动脉网络和荧光C 2模拟标签肝,胰腺导管和蜂窝膜( 3)3。

ove_content“FO:保together.within页=”1“> 图3
图3:不同的荧光脂质类似物标签唯一蜂窝器官幼虫的代表性合成图像供给5%的蛋黄中的EM与6.4μMBODIPY FL C 16,C 12,C 5,C 2为4-8小时(6旦) 。 C 16类似物在肠的脂滴(LD)的观察到的,C 12和C 5类似物在肠LD和肠腔,并在肠腔 C 2类似物。幼虫被盖玻片安装在3%的甲基纤维素瘦到方法和用氩激光器的单光子共焦显微镜的直立63X油浸物镜成像。比例尺代表20微米。转载来自药品Discov今天派息模型 22 许可_blank“>请点击此处查看该图的放大版本。

幼虫的食物摄取测定法开发研究如何基因突变,转基因的基因表达,和/或外源治疗影响幼虫食物摄取。幼虫被馈送用荧光脂质类似物掺入,以指示所消耗的食物的量的富含脂质的膳食。未喂食的幼虫被收集在平行于正常化为存在于幼虫背景荧光的量,增加在该荧光脂质类似物可以被检测的灵敏度。该测定被用于显示载脂蛋白A-IVb.1(载脂蛋白A-IVb.1)减小食物摄取的过表达。此前喂食物的Tg(HSP70:载脂蛋白A-IVb.1:mCherry)幼虫取食10%蛋黄6.4微米的荧光C 16的模拟4小时7 DPF消耗比野生型幼虫脂肪少约30%( 4)20。


图4:代表性的摄食量测定野生型(WT)和Tg的(HSP70:mCherry:载脂蛋白-IVb.1)与6.4μMBODIPY FL C 16 4小时(FED)或(Tg)的幼虫喂养10%鸡蛋黄在平行于EM(未喂食)处理。 (A)的幼虫合并(10),提取脂质,并萃取液点样在TLC板上。 (B)总荧光定量,任意荧光单位(AFU),归在减法喂食的兄弟姐妹背景荧光表达,并表示相对于WT。 Tg的幼虫过表达的ApoA-IVb.1摄取较少的荧光标记的脂质类似物如由比较WT(成对学生t检验,p <0.001; N = 9时,每个实验20幼虫)。盒子表示25-75 百分,并且平均中指示。胡须显示10-90 百分点。转载从派息型号机甲20许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

此处所描述的技术允许研究治疗幼虫斑马鱼用富脂质的饲料,在活幼虫可视膳食脂质加工,并量化幼虫的食物摄取。为确保成功,应特别注意考虑到几个关键步骤。商业鸡蛋不同;尽量减少潜在的可变性,我们执行的有机鸡蛋所有检测从没有被富集的Omega-3脂肪酸免费笼鸡。较低的投饲率可能在鱼类观察不到6岁DPF剩余卵黄内生的能源供应,不健康的鱼或鱼妨碍食物的摄入量( 下巴或肠畸形,无法正常游泳)发展的突变。该法伯实验室通常执行在6-7天受精后(DPF)喂养的研究,因为幼虫不需要外源性食物,直到其内生蛋黄店都用尽,蛋黄枯竭允许消化系统更好的可视化。馈送在RT也大大降低了吃幼虫的数目。未能屏幕幼虫的食物摄入量,并在随后的实验可能混淆结果无意纳入喂食物的幼虫。另外,为了保护荧光脂质类似物,并与类似物馈送所有幼体样品,从光时能够维持最大荧光,因而测定灵敏度是重要的。最后,如果食物的摄入量进行衡量,不允许饲料和大通(饲料后代谢周期)超过共有4个小时,因为饭后将开始排出体外。目前,在该吃饭和相关的荧光脂类似物排出体外的速度是未知的,但荧光可以在整个幼虫体内持续至少2天交饲料(JPO和SAF未发表的数据)。

有几种方法来修改和解决协议回答感兴趣的实验问题。富含脂质的饲料可以在t各个时期进行IME:1小时将提供一个小餐,而4小时将填补肠道有大量的脂质。然而,饲养幼虫比6小时长不推荐为蛋黄和EM未在无菌条件并在蛋黄/白色乳液细菌过度生长制备可能混淆的结果( ,增加的炎症,改变的肠道微生物群配置文件)。幼虫可以立即喂食,调查进行了简短的冷却或麻醉固定饲料幼虫的急性影响后检查迅速开始复温后,再喂,但冷却是固定幼虫在麻醉可能会出现呕吐的最好方法(SAF未发表的观察)。可替代地,追周期可以在进料后进行,以允许研究之前膳食脂质转运和代谢。虽然进料在5毫升脂质体溶液通常进行,进料已成功在体积从1到20ml进行。不同浓度蛋黄的s时,可以用于幼体的饲料;的法伯实验室常规进行,用5%的蛋黄(1毫升蛋黄加入到19毫升EM),0.5%的蛋黄,10%的蛋黄实验。

有必须考虑荧光脂质类似物的潜在限制。当选择荧光脂质类似物的是要考虑的荧光部分如何脂质生理学处理并且其中是关于脂质的化学结构解释结果时是重要的。例如,甘油三酯之前吸收分解为游离脂肪酸和甘油,和胆固醇酯成游离胆固醇和脂肪酸,在肠腔。因此,如果荧光甘油三酯或胆固醇酯类似物在饮食提供在体内观察到的荧光将跟踪脂肪酸,游离胆固醇或甘油,该荧光部分连接到,而不是原来的甘油三酯或胆固醇酯。不同fluorescen吨脂质类似物标记独特的细胞结构,这一事实应选择3中加以考虑。还值得注意的,相对于天然脂肪酸的代谢,增加了一个BODIPY部分的大致相当于加入〜2-3个碳原子的脂肪酸链长(SAF未公布的数据)。

此处所描述的技术代表了在该领域中描述以前测定显著进步。其中幼虫喂养供电,以这只鸡蛋黄饲料开发之前,两名手稿详细的研究硬煮鸡蛋蛋黄4,23。此处所描述的技术提出了蛋黄并不需要是硬熬煮和粉末在使用前和粉状蛋黄具有非常短的半衰期,由于其快速氧化的优点。液体蛋黄,也可以作为脂质体是容易接受有效膳食递送荧光脂质类似物制备。可替代地,放射性标记的脂质可用于不变拟tigate饮食脂质代谢和衡量食物摄入量,但荧光脂类似物不存在与放射性相关的安全隐患。然而,如果研究人员希望使用放射性标记的脂质,所述法伯实验室进行的研究,以验证放射性标记的脂质可以被并入,并与成功馈送,脂质体19。这里所描述的荧光脂类似物被选中是因为他们表现出高度相似的代谢内源性和放射性脂类,并且是低收入和高功率成像足够亮。

前述这种技术喂荧光脂质类似物幼虫的发展,没有其他的方法是可用的可视化在体内的膳食脂质转运和积累。荧光脂质类似物的直接可视化可以提供比使用生理学的间接措施,例如血清脂质的优点。斑马鱼幼体摄食量的精确测量也是一个长期的STA在外地nding挑战。唯一的选择就是文化草履虫,与荧光示踪剂的亲脂性4-(4-(二癸氨基)苯乙烯基)贴上标签- N -methylpyridinium碘(4迪-10-ASP),让幼虫喂养,并测量荧光用酶标仪24腹内区域。最后,这些技术具有的可以适用于这两种介质通量筛选(膳食脂质加工的向前遗传筛选),以及集中的高倍率成像研究的优点( ,反向遗传,假设驱动的研究)。在将来,这些技术可以应用到的表型和筛选的代谢和胃肠道疾病的多种机型中的斑马鱼。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4, (4), 501 (2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30, (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360, (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232, (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111, (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8, (12), 81485 (2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121, (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132, (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), 36474 (2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53, (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292, (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7, (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8, (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10, (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44, (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7, (12), 52549 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics