幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪:摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

Biology

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Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

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Abstract

Introduction

腸は食物脂質の処理を調節する機構は、肝臓は、複合脂質の合成およびリポタンパク質代謝を制御し、これらの器官は、食物摂取量を制御するために、中枢神経系でどのように機能するか完全には理解されています。これは、肥満、心臓血管疾患、糖尿病、および非アルコール性脂肪肝疾患の現在の流行に照らして、この生物学を解明するために、生物医学的関心です。細胞培養およびマウスにおける研究食物中の脂肪と病気の間の機械的な関係の理解の大部分を提供している、およびゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ)は、この作業を補完する理想的なモデルとして浮上しています。

ゼブラフィッシュは、急速に発展、高等脊椎動物1,2と同様の胃腸(GI)器官、脂質代謝、およびリポタンパク質の輸送があり、遺伝的に扱いやすいです。幼虫のゼブラフィッシュの光学的透明性は、in vivo試験 particulaを容易にGI系の研究のためのRの利点その細胞外環境( すなわち 、胆汁、微生物、内分泌シグナリングは)ex vivoでのモデル化することは事実上不可能であるようにとゼブラフィッシュ幼生のイメージングを生きるために、遺伝的扱いやすさとconducivenessを組み合わせた研究によれば、体食物の操作高脂肪3,4、 -コレステロール5、および-炭水化物ダイエット6,7)、および心血管疾患8の様々なモデル、糖尿病9,10、脂肪肝11-13、および肥満14-16、代謝洞察のホストを提供するために浮上しています。

代謝研究に幼虫のゼブラフィッシュの移行の重要な側面は、ゼブラフィッシュとゼブラフィッシュの独自の強みを活用した新規アッセイの開発に他のモデル動物で開発された技術の最適化です。このプロトコルは、技術がLIPI幼虫のゼブラフィッシュを養うために開発され、最適化された提示しますDが豊富な食事は、細胞内の解像度に全身から食餌脂質処理を可視化し、食物摂取量を測定します。それが脂肪やコレステロールの高レベルが含まれているとして、鶏の卵黄を〜(脂質が構成する脂質の豊富な食事を構成するために〜5%がコレステロールであるそのうちの鶏の卵黄の58%を、選ばれた、60%はトリグリセリドであり、35%がリン脂質であります)。ゼブラフィッシュダイエットと摂食連隊は、ラボ17全体で標準化されていないとして、鶏の卵黄は、典型的な市販のゼブラフィッシュマイクロペレット食品(〜15%の脂質)、それは特定の脂肪酸種の既知の割合で標準化された飼料であるという利点よりも多くの脂肪を提供します。また、卵黄に設けられた蛍光脂質類似食物脂質18の輸送および蓄積を可視化、脂質滴を含む画像の細胞成分複合脂質に両方としてバイタル色素3および共有結合の取り込みを介して作用することにより、薄層クロマトグラフィー(TLC)を介して代謝を調査19 20についての定量的アッセイを提供します。

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Protocol

これらのプロトコルは、科学施設内動物管理使用委員会のためのカーネギー研究所(プロトコル番号139)によって承認されています。

1.動物の準備

  1. 10時間明:暗サイクル14時間で28℃で大人と幼虫を維持します。シェル無料アルテミア (デカプセル化、非ハッチング、14 DPFで開始)と商用マイクロペレット1日2回大人フィード。
  2. これらのプロトコルは、ABの背景の自然産卵により収集6-7 DPFの幼虫の使用に最適化されています。プロトコルは、他の年齢や背景の幼虫のために改変することができます。前6 DPFに外因性の食べ物を提供しないでください。
  3. (ミリリットルは、EMは100あたり4 mg / mlでトリカインの4.2ミリリットル)を室温(RT)で胚のメディア(EM)にトリカインで幼虫を麻酔します。

脂質の豊富な卵黄フィードの調製

  1. 鶏の卵黄を準備し、格納します。 12鶏卵の卵黄と白を分離します。 1.5に卵黄、アリコート1ミリリットルをプールmlチューブ、および1年のCまで-80℃で保存してください(12黄身は〜80アリコートを行います)。白人のプール、店舗、および脂質に乏しい、タンパク質が豊富な飼料として使用します。
  2. 所望であれば、卵黄飼料に添加される蛍光脂質類似体(複数可)を準備します。
    1. 製造元の指示に従って、不透明なガラス管に、アリコート(次の注意溶剤を議論を参照してください)/μlの0.1μgので100%エタノールまたは100%クロロホルムで購入し、粉末状の蛍光脂質類似体をサスペンドパラフィルムで密封し、そして店。有機溶媒の急速な蒸発に長期保存のために〜400μlのより少ない分量のボリュームを使用しないでください。
      注:脂質類似体をエタノール中に懸濁されている場合、それはクロロホルムよりN 2下でより速く乾燥するので、脂質類似体の大ボリュームが使用されます。脂質アナログをエタノールに懸濁された場合には、ステップ2.2.4でリポソームフィードに追加する前に乾燥させ、再懸濁する必要はありませんが、全体のエタノール濃度が0を超えてはなりません。リポソーム飼料中1%エタノールの潜在的に交絡生理学的効果を回避します。
    2. 蛍光脂肪酸類似体の場合:EMで20ミリリットルの5%卵黄乳剤の総容量を準備します。それから、ライブ共焦点イメージングおよび食物摂取アッセイまたはを1μg/ mlの6.4μM4,4-ジフルオロ-4-ボラ- 3A、4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY C 16)の最終濃度で5ミリリットルのアリコートを調製実体顕微鏡イメージングのためのBODIPY C 12。 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに蛍光脂質類似体の所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。
    3. すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペットで5μlの100%エタノール中に再懸濁は、95μlのEMを追加し、よく混ぜます。
      注:混合物が均質に表示されます。着色された脂質は、チューブの側面に残るか、液体が塊状の表示された場合、脂質は完全に可溶化し、より多くのエタノールを必要としていません。あちこちにチューブを守ります氷の上メートルの光とストア。
    4. 蛍光コレステロールアナログの場合:ライブイメージング研究のための5ミリリットル百分の0.5から5卵黄エマルジョン中2.4 / mlのコレステロールの最終濃度を準備します。 1.5mL容のプラスチックチューブにコレステロールの所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。
    5. すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペッティングし、精製し、H 2 O中にRTの1%脂肪酸フリーBSAの85μlのと混合することによって、RTの100%エタノール15μlの中で再懸濁光からチューブを保護し、氷上で保存します。
  3. 卵黄リポソームフィードを準備します。
    1. 50ミリリットルコニカルチューブにEMに卵黄の解凍アリコートを追加します。ボルテックス1-2分間希釈した卵黄の混合物;混合物は、均質なエマルションであることが表示されます。
    2. タンパク質のコングロマリットを削除し、新しい、新鮮な50mlコニカルチューブに収集するために、細かいメッシュストレーナーを通して混合物を注ぎます。
    3. パルスソニカリポソームを作成するために、RTで:;四分の一インチテーパーマイクロチップ(6 W出力強度5倍(上の5×1秒、1秒オフ)が5月10日各セット間の秒の一時停止)と卵の混合物TE。超音波処理器の電源設定は、機器に依存しているため、各楽器やマイクロチップのための最適化を必要とします。
      注:継続的に使用するまで均質性を維持するために、RTでリポソーム混合物を揺すります。
  4. 必要に応じて、卵黄リポソームに蛍光脂質類似体を追加します。すぐに超音波処理した後、リポソームに組み込む30秒間高速でリポソーム混合渦に準備脂質をピペット。ホイルでチューブを包むことにより、光から混合物を保護し、室温で揺れ続けます。

3.摂食パラダイム

  1. 給餌のために幼虫を準備します。
    1. 摂食を妨げることが明らかな形態学的欠陥のための飼料、画面の幼虫を開始する前に。 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿または6または12ウェルのPLAへの転送の幼虫TES、最小限にEMを削減し、準備されたリポソーム溶液5mlで置き換えます。
    2. 必要に応じて、5ミリリットルEMに無給電制御の幼虫を転送および/または5ミリリットル5%卵白EMおよび並列に扱います。
  2. ゆっくり蛍光脂質類似体が存在する場合、光から遮蔽するために継続しながら、食物摂取を奨励するために、フィードを通じてインキュベートロッカー内の幼虫(30 rpmで29-31°C)を揺すります。幼虫は、光にさらされる必要がある場合は、着色ガラスインキュベーターカバーで露出を最小限に抑えることができます。
  3. 給餌期間の終了時に、EMで3回、自由に泳ぐ幼虫をすすぎます。
    注:幼虫は、フィード中の任意の時点でリポソームを消費し始めることができます。それは幼虫が同時に供給開始することが重要である場合には、食物摂取のための画面送りの1時間後(3.4を参照)、フィードを完了するために、卵黄エマルジョンへの給電を開始している唯一の幼虫を返します。
  4. 少数EAない可能性食物摂取のために、この時点で幼虫を選別トン(一般〜0から5パーセント)。彼らが供給されているかどうかを判断するために麻酔またはわずかに氷の上の金属ブロック上で冷却された幼虫の腸を調べます。リポソームを消費した幼虫は暗く腸( 図1)を持つことになります。
  5. すぐに食物摂取のための画像やプロセスの幼虫。代わりに、新鮮なEMにおける場所の幼虫および代謝処理が発生することを可能にするために28℃でインキュベートします。

ライブイメージング用4.取付幼虫

  1. マウントメディアを準備します。
    1. 3%メチルセルロースの場合:-20°Cで年間の沸点近くEM、渦、4°Cで2〜3日間完全に溶解するまで室温でロック、店舗の25ミリリットルに0.75グラムのメチルセルロースを追加します。 4℃での凍結および解凍の繰り返しサイクルは、気泡を除去します。幼虫を搭載しながら、氷上で3%のメチルセルロースを保管してください。
    2. 1.2%の低マウントアガロースの場合:25 mLのEMにアガロース低溶融、沸騰させることによって溶解し、2ミリリットルのトンへの一定分量の0.3グラムを追加ubes、およびヒートブロック上で26から28℃に維持します。未使用のアリコートを室温で保存するか、または-20℃と使用時に再び煮沸することができます。アガロースは幼虫にさらすか、加熱過剰とすることができる前に処理するのに十分クールであることを確認してください。
  2. 低倍率、中スループットライブイメージングのために、氷の上の金属ブロックに組織上のスライドガラスを配置し、スライドを冷却するのを待ちます。フィッシングラインの火かき棒を使用して、3%メチルセルロースに幼虫を転送する、スライド上に(氷上で4℃に維持されている)、3%メチルセルロースの寛大な量を適用するに接着(0.41ミリメートルの直径釣り糸ガラス毛細管の端)メチルセルロースが希釈されないように(過剰EMドレイン)、必要に応じて幼虫を配置するための婚約を作成します。
  3. 直立オイル出現を目的とした短期(<20分)、高倍率のライブイメージングのため、希薄に法カバーガラスで幼虫をマウントします。
    1. にシアノアクリレートベースの接着剤(スーパーグルー)を使用しますスライドガラスの一端にAA 22ミリメートル×30ミリメートルカバースリップを添付します。カバーガラスに隣接してスライド上の3%メチルセルロースの細い線を入れて、広い口径パスツールピペットを用いてスライドに幼虫を転送するためにポーカーを使用してください。それはメチルセルロースを希釈しないように余分なEMを削除します。
    2. カバースリップの隣に自分の頭でポーカーを使用して、そっとその両側にメチルセルロースで幼虫を配置(アップ肝臓の複数の画像を左、右の画像に胆嚢をアップ側)。
    3. 優しく第二カバーガラスのコーナーとのスポット瞬間接着剤は、幼虫をブリッジ、取り付けられたカバースリップ上にカバースリップ、スライド上の他の一端を配置します。幼虫は無傷のままであるように、このステップの間、またはイメージングしながら目的で、過剰な圧力をかけないように注意してください。
  4. 直立浸対物レンズとの長期、高倍率のイメージングでは、アガロースで幼虫をマウントします。転送アガロースその後、1.2%の低融点の小アリコートに幼虫を追加します。シャーレにアガロースの小容積の幼虫。
    1. 迅速アガロースが固化する前に、ポーカーで幼虫を置きます。アガロースは2-3分間乾燥し、乾燥からそれを防ぐために、新鮮なEMと完全にアガロースをカバーすることができます。
  5. 長期的には、反転を目的とした高倍率のイメージングは​​、アガロースでガラスボトムディッシュに幼虫をマウントします。
    1. 氷の上の金属ブロックを冷却します。過冷却と幼虫の凍結を防止するために組織によって分離された金属ブロック上に皿を置きます。皿に幼虫を移し、組織で吸上により、EMを削除します。
    2. 幼虫の上に28°C低融点アガロース(1.2%)の低下を置き、すぐにポーカー(ダウン最高の画像を左側肝臓、ダウン胆嚢像に右側)と位置付けます。寒ブロックから皿を外し、2-3分間乾燥させ、そしてアガロースをカバーするために、新鮮なEMの十分なボリュームを追加(〜2〜5ミリリットル)。

5.食物摂取検定

  1. 6.4μMBODIPY C 16を含む卵黄リポソームフィードの終わりには、EMを取り外し、プラスチック1.5または2ミリリットルチューブに10洗浄幼虫の最小値をプールし、凍結スナップ。サンプルは、数ヶ月間、光から保護し、-80℃で保存してもよいです。
    注:可能な場合は、複数の複製を収集します。バックグラウンド脂質蛍光(同クラッチから理想的に幼虫が使用されている)のために正規化するために、この段階で未吸血幼虫を収集することが重要です。
  2. 修正されたブライ・ダイアーの脂質抽出3,21を実行します
    1. (代替的に精製されたH 2 Oを使用することができる)、氷上でサンプルに100μlの均質化緩衝液(20mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA)を加えます。マイクロチップ超音波処理装置(:1秒間オフに1秒5秒の合計)と氷上でホモジナイズします。その幼虫を確認し、完全に均質化されています。ない場合は、繰り返します。 13 mlの使い捨てガラス培養チューブに移す(他のガラス管を使用してもよいです)。
      注:クロロホルムは危険です。後続のすべての脂質の元を実行します化学フード内で室温で牽引段階。
    2. 2(クロロホルム:メタノール)を使用均質化緩衝液の各100μlのために、1の375μlを添加します。ボルテックス30-60秒、10分間インキュベート、使用100μlの均質化緩衝液、渦30秒あたりのクロロホルム125μlを添加します。
    3. (光から保護2000のx グラム 、5分、RT)を用い、100μlの均質化緩衝液、ボルテックス30秒、および遠心あたり200 mMトリスpH7.5の125μlのを追加します。慎重に遠心分離機からサンプルを削除します。上部相は水性である幼虫破片のインターフェースを、下部有機相(脂質を含有する):これらは2相に分離されます。
    4. きれいなガラスピペットを用いて底部、有機相を回収し、清潔な13 mLのガラス管にそれを転送します。
      注:界面における水相と幼虫破片を避けるように注意してください。汚染が発生した場合には、遠心分離工程および再収集を繰り返します。上部の水相を捨てます。削除して、これを破棄するために役立つかもしれません有機相を収集する前に相。サンプルは、最大1ヶ月間-80℃で保存することができます。
    5. 光から保護しながら、真空下での有機相(0.12気圧)を乾燥させます。それは、脂質溶解性を低下させるように、液体が蒸発した後の試料を乾燥し続けないでください。 1(クロロホルム:メタノール)2に脂質を再懸濁し、氷上で保存します。クロロホルムの最適量:メタノール溶液を使用する検出方法に依存します。低起動し、必要に応じて希釈するために続けています。一般的なガイドラインは、10プールされた幼虫のために10μLを使用することです。
  3. チャネリングTLCプレート上に等間隔でサンプル全体のボリュームを発見し、日常的に生体分子イメージングのために使用されるレーザスキャナ( 例えば 、蛍光プレートリーダー)でプレートをスキャンします。 510から665ナノメートルから500〜650 nmおよび発光極大からの励起極大を有する物質のリストに含まれる蛍光脂質類縁体は、520 nmで488 nmのレーザー発光コレクションでの使用。
    1. イメージングソフトウェアで各スポットの全蛍光を定量化します。
      注意:自然対になった、未吸血幼虫サンプルの蛍光を差し引くことにより、バックグラウンド脂質蛍光を発生するための正しいです。

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Representative Results

29-31℃でロッカーに供給すると、健康な幼虫(≥95%)の大半は、1時間以内に食べるようになります。卵黄エマルジョンを消費すると、幼虫の腸は、カラーで暗くなります。非常に暗い腸2時間( 図1)で観察することができます。幼虫が未吸血されているか、または供給するために失敗した場合、腸は透明なまま。幼虫供給卵白展示色で暗くしない膨張した腸管腔。

図1
図1:食物摂取のための幼虫のスクリーニング野生型6 DPFの幼虫は2時間EMに5%の卵黄を供給または食物を与えられていないコントロールを得るために、EMで平行して処理しました。ステレオスコープの10Xで撮像時に卵黄を消費した給餌幼虫が暗い腸を持っていながら未吸血幼虫は明確な腸を持っています。スケールバーは、0.1ミリメートルを表しています。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

蛍光脂質類縁体で供給すること全身輸送と食物脂質の細胞内蓄積の可視化を可能にします。蛍光シグナルは8時間16アナログが希薄に法カバースリップでマウントし、直立目的( で撮像された6.4μM蛍光Cで5%の卵黄を与えた幼虫の消化器官(腸、肝臓、および膵臓)全体に存在し、 2)3。

図2
図2:蛍光脂質類似体の可視化食物脂質輸送 6-DPFの幼虫(右直面ヘッド)の代表的な合成画像が8時間6.4μMBODIPY FL C 16とEMの5%の卵黄を供給しました。幼虫は希薄に法カバースリップにより、3%メチルセルロースに搭載され、直立63Xで画像化しましたアルゴンレーザーを備えた単一光子共焦点顕微鏡での油浸対物レンズ。スケールバーは20μmで表します。肝臓、L;腸、I。膵臓、P、胆嚢、GB。 Devのバイオ3からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

それらは示差複合脂質( 例えば 、トリグリセリド、コレステロールエステル、リン脂質)に代謝されるので、様々な脂質類似体は、細胞構造のユニークなセットの可視化を可能にします。次の4から8時間は、フィード蛍光C 16とC 12類似体は脂肪滴、蛍光FLのC 5ラベルの脂肪滴、肝臓および膵管、細胞膜、および動脈ネットワーク、および蛍光C 2アナログは、肝臓および膵管と細胞をラベルにラベルを付けます膜( 3)3。

ove_content「FO:キープtogether.withinページ= "1"> 図3
図3:異なる蛍光脂質類似体ラベルユニークな携帯臓器幼虫の代表的な合成画像は6.4μMBODIPY FL C 16、C 12、C 5、または4-8時間(6 DPF)のためのC 2とEMで5%の卵黄を供給しました。 C 16類似体は腸、C 12及びC 5腸LDにおけるアナログおよび腸管腔、および腸管腔におけるC 2アナログの脂肪滴(LD)で観察されます。幼虫をリーンにする方法カバースリップにより、3%メチルセルロースに取り付けられ、アルゴンレーザーを備えた単一光子共焦点顕微鏡上で直立63X油浸対物レンズを用いて画像化しました。スケールバーは、20ミクロンを表します。 医薬品Discov今日ディスモデル 22からの許可を得て転載_blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

幼虫の食物摂取アッセイは変異トランスジェニック遺伝子の過剰発現、および/または外因性の治療は、幼虫の食物摂取量をどのように影響するかの遺伝子を調査するために開発されました。幼虫は、消費された食物の量を示すために、蛍光脂質類似体でスパイクした脂質の豊富な食事を与えています。無給電幼虫蛍光脂質類似体が検出可能な感度を増加させる、幼虫に存在するバックグラウンド蛍光の量を正規化するために並行して収集されます。このアッセイは、アポリポタンパク質A-IVb.1(アポA-IVb.1)食物摂取を減少させるの過剰発現を示すために使用されました。以前は未吸血のTg(HSP70:アポA-IVb.1:mCherryを)幼虫は7 DPFで4時間6.4μM蛍光C 16アナログと10%の卵黄を与えた( 4)20野生型の幼虫より約30%少ない脂質を消費します。


図4:代表的食物摂取アッセイ野生型(WT)及びTg(HSP70:アポA-IVb.1:mCherryを)ガラス転移温度(Tg)幼虫を飼育した10%鶏卵黄4時間(FED)または6.4μMBODIPY FL C16とEM(食物を与えられていない)に並列に処理します。 (A)幼虫をプールした(n = 10)し、脂質を抽出し、抽出物をTLCプレート上にスポットしました。 (B)の総蛍光を定量化した、減算することによって食物を与えられていない兄弟姉妹でのバックグラウンド蛍光のための正規化された任意の蛍光単位(AFU)で表され、WTに対して表します。 Tgの幼虫は、WTと比較することによって示されるようにアポA-IVb.1より少ない蛍光標識脂質類似体を摂取過剰発現(あり; n = 9、実験あたり20幼虫スチューデントt検定対の、p <0.001)。ボックスは、25~75 パーセンタイルを表し、中央値が示されています。ウィスカーは、10から90 パーセンタイルを示します。復刻Disのモデルメカ20から許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここに記載された技術は、研究者は、脂質の豊富な飼料と幼虫のゼブラフィッシュを扱うライブ幼虫に食餌脂質処理を可視化し、幼虫の食物摂取量を定量化することができます。成功を確実にするために、特別な注意は、いくつかの重要なステップに与えられるべきです。コマーシャル鶏の卵は異なります。潜在的な変動を最小限に抑えるために、我々は、オメガ3脂肪酸について濃縮されていないケージフリー鶏から有機卵のすべてのアッセイを行います。下側の供給速度は、より若い6食物摂取( すなわち 、顎または腸奇形、適切に泳ぐことができないことを)妨げる発達変異を有する内因性卵黄エネルギー供給、不健康な魚、または魚を残りとDPF魚で観察することができます。それらの内因性卵黄店が排出されると卵黄の枯渇は、消化器系のより良い可視化を可能にするまで、幼虫は外因性の食べ物を必要としないため、ファーバー研究室では、一般的に6〜7日後に受精(DPF)で供給した研究を行います。給餌RTでも大幅に食べる幼虫の数を減らすことができます。食物摂取とその後の実験で未吸血幼虫が意図せずに含めるための幼虫のスクリーニングに失敗すると、結果を混乱させることがあります。加えて、最大蛍光、したがって、アッセイの感度を維持することが可能な場合は、光からの蛍光脂質類似体、および類似体を与え、すべての幼虫のサンプルを保護することが重要です。食物摂取が測定される場合は最後に、食事を排泄するために開始されますので、フィード、チェイス(ポストフィード代謝期間)は、4時間の合計を超えることはできません。現在、食事と関連する蛍光脂質類似体が排泄される速度は不明であるが、蛍光は、少なくとも2日後にフィード(JPOとSAF未発表データ)のための幼虫の体全体に持続することができます。

興味のある実験的な質問に答えるためのプロトコルを変更し、解決する方法はいくつかあります。脂質の豊富な供給は、Tの様々な期間のために行うことができますIME:4時間は、脂質を大量に腸にいっぱいになりますしながら、1時間は、少量の食事を提供します。しかし、長い6時間以上の幼虫を供給して卵黄として推奨されておらず、EMは、結果を混乱することができる無菌状態と卵黄/ホワイトエマルジョン中の細菌異常増殖( すなわち 、増加した炎症、改変された腸内細菌叢のプロファイルを)用意されていません。幼虫は急速に再加温後に再び供給し始める簡単な冷却または麻酔によって固定化された飼料幼虫の急性影響を調査するために供給した後、すぐに調べることができますが、冷却は麻酔時に嘔吐を示すことができるの幼虫などの固定化の好適な方法(SAF未発表の観察)です。代替的に、チェイス期間は研究前食物脂質の輸送および代謝を可能にするために供給した後に行うことができます。飼料は、通常、5mLのリポソーム溶液中で行われるが、フィードは正常に1から20mlまでの範囲の容量で行われています。様々な濃度卵黄のsが幼虫のフィードを使用することができます。ファーバー研究室では、日常的に5%の卵黄を用いた実験を行い、(1ミリリットル卵黄は19ミリリットルEMに追加)、0.5%の卵黄、及び10%の卵黄。

考慮しなければならない蛍光脂質類似体の潜在的な制限があります。蛍光脂質類似体を選択するときには、脂質は、生理学的に処理され、結果を解釈する際に蛍光部分は、脂質の化学構造上のどこかを検討することが重要です。例えば、トリグリセリドは吸収前に腸管腔に、遊離コレステロールと脂肪酸に遊離脂肪酸およびグリセロール、およびコレステロールエステルに分解されます。蛍光トリグリセリドやコレステロールエステルアナログは食事で提供されている場合そのため、体内で観察された蛍光は、蛍光部分は、オリジナルではなく、トリグリセリドやコレステロールエステルに結合している脂肪酸、遊離コレステロール、またはグリセロールを追跡します。異なるfluorescenトン脂質類似体は、ユニークな細胞構造にラベルを付け、そしてこの事実は、選択3時に考慮すべきです。またノートの、天然脂肪酸の代謝に比べ、BODIPY部分の付加は、脂肪酸の鎖長(SAF未発表データ)に〜2-3の炭素を添加するとほぼ同じです。

ここに記載された技術は、フィールドに記載され、以前のアッセイに対して著しい進歩を表しています。幼虫の電源が入って供給されたこの鶏卵黄飼料の開発に先立ち、2写本は詳細な研究は、固ゆで卵は4,23卵黄 。ここに記載された技術は、卵黄をゆで、粉末使用する前に、その粉末卵黄は、その急速な酸化に非常に短い半減期を有することが必要がないという利点を提供します。液状卵黄も容易に、効率的な栄養送達のために、蛍光脂質類似体を受け入れるリポソームとして調製することができます。あるいは、放射性標識された脂質がinvesに使用することができます食餌脂質代謝をtigateし、食物摂取を測定したが、蛍光脂質類似体は、放射能に関連した安全上の問題を提示しません。研究者は、放射性標識脂質を使用したい場合は、ファーバー研究室では、放射性標識脂質が中に組み込まれ、成功裏に供給することができることを確認するための研究、リポソーム19を行いました。ここに記載の蛍光脂質類似体は、それらが内因性および放射性標識された脂質に非常に類似した代謝を示すために選択し、低・高出力イメージングのために十分に明るいでした。

幼虫に蛍光脂質類似体を養うために、この技術の開発に先立ち、他の方法は、in vivoでの食事性脂質輸送と蓄積を可視化するために利用可能ではなかったです。蛍光脂質類似体の直接可視化は、血清脂質のような生理学の間接的な尺度を使用して上の利点を提供することができます。幼虫のゼブラフィッシュの食物摂取量の正確な測定は、長STAましたフィールドに挑戦をnding。唯一の選択肢は、蛍光親油性トレーサー4-(4-(ジデシルアミノ)スチリル)にラベルを付け、培養ゾウリムシにした- N -methylpyridiniumヨウ化物(4ジ-10-ASP)、幼虫が餌、との蛍光を測定することを可能にしますプレートリーダー24と腹腔内の領域。最後に、これらの技術は両方の培地スループットスクリーニング(食物脂質処理、すなわち 、前方の遺伝子スクリーニング)ならびに集束高倍率画像化研究に適用可能であるという利点を有する( すなわち 、遺伝的、仮説駆動研究逆)。今後は、これらの技術は、ゼブラフィッシュにおける代謝およびGI疾患の表現型と画面の多様なモデルに適用することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

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References

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4, (4), 501 (2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30, (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360, (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232, (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111, (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8, (12), 81485 (2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121, (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132, (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), 36474 (2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53, (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292, (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7, (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8, (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10, (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44, (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7, (12), 52549 (2012).

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