Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

Cancer Research
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Morrison, E., Wai, P., Leonidou, A., Bland, P., Khalique, S., Farnie, G., Daley, F., Peck, B., Natrajan, R. Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures. J. Vis. Exp. (118), e54738, doi:10.3791/54738 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Identifieringen av funktionella förar händelser i cancer är av central betydelse för att främja vår förståelse av cancerbiologi och oumbärlig för upptäckten av nästa generation av nya läkemedelsmål. Det blir uppenbart att mer komplexa modeller av cancer krävs för att till fullo uppskatta de bidragande faktorerna som driver tumörbildning in vivo och öka effektiviteten av nya terapier som gör övergången från prekliniska modeller för kliniska prövningar.

Här presenterar vi en metod för att generera likformiga och reproducerbara tumör sfäroider som kan utsättas för siRNA funktionell screening. Dessa sfäroider uppvisar många egenskaper som finns i fasta tumörer som inte är närvarande i traditionell två-dimensionen kultur. Vi visar att flera vanliga linjer bröstcancerceller är mottagliga för detta protokoll. Dessutom ger vi proof-of-principle-data utnyttjar bröstcancer cellinje BT474, bekräftar derasberoendet av amplifiering av den epidermala tillväxtfaktorreceptorn HER2 och mutation av fosfatidylinositol-4,5-bifosfat 3-kinas (PIK3CA) när den odlas som tumör sfäroider. Slutligen har vi möjlighet att ytterligare undersöka och bekräfta den rumsliga effekterna av dessa beroenden använder immunhistokemi.

Introduction

Solida tumörer uppvisar betydande histologiska, genetiska och mikromiljö inom tumör heterogenitet, som presenterar kliniker med en stor utmaning i att kunna behandla patienter med framgång. Majoriteten av modeller som används för att identifiera nya riktade terapier inte införliva många av dessa funktioner. I själva verket har aktuella riktade terapier som används i kliniken utvecklats under det senaste decenniet som använder screeningmetoder som är beroende av cancercellinjer som odlats under tvådimensionella (2D) odlingsbetingelser. Även om detta har lett till olika framgångar, såsom receptor tyrosinkinashämmare, blir det uppenbart att mer komplexa modeller av cancer krävs för att till fullo uppskatta de bidragande faktorerna som driver tumörbildning in vivo och öka antalet nya behandlingsmetoder som gör övergången från prekliniska modeller till kliniska prövningar. Dessutom är det nu mycket uppskattat att 2D odlingssystem inte återspeglavivo beteende 1,2. Till exempel, i dåligt vaskulariserade tumörer, eftersom efterfrågan på syre och näringsämnen inom mikromiljön överstiga tillgången, regioner av höga och låga leveranser utvecklas. Förekomsten av låg syrehalt (hypoxi) i tumörer, som detekteras genom immunhistokemisk färgning av tumörsnitt för etablerade hypoxiska markörer som karbanhydras IX (CAIX), korrelerar med en sämre kliniska resultat i bröstcancer 3,4 Således innehåller funktioner som hypoxi i screening-modeller kan öka vår förmåga att upptäcka nya läkemedel mål som kommer att bli mer effektiva in vivo. Faktum är att framgångsrikt inriktade aggressiva tumörer som innehåller hypoxi är en klinisk prioritet 5.

Den ändring av traditionella 2D siRNA screening, i ett försök att mera exakt sammanfatta delar av de förhållanden som råder av cancerceller i tumören mikro har lett till identifiering av flera gener thåtmin har befunnits vara viktiga för tumörtillväxt in vivo. Dessa inkluderar funktionella genomiska skärmar utförs under låga serumförhållanden 6, hypoxiska betingelser 7 och i kombination 8. Till exempel, tystande av 6-Phosphofructo-2-kinas / fruktos-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), ett protein som ansvarar för reglering av kol som kommer glykolys, endast inducerade apoptos i prostatacancerlinjer härledda från metastaser vid odling i lågt serum. Tysta PFKFB4 i normala prostatacellinjer under samma betingelser hade ingen effekt, medan utarmning av PFKFB4 helt avlägsnade tillväxten av prostatacancer cellinje xenotransplantat 6.

I en utvidgad panel av bröstcancercellinjer, den tysta mono-karboxylas transportör 4 (MCT4) företrädesvis ledde till en minskning av celltillväxt under förhållanden med låg syrehalt. Denna sårbarhet validerades in vivo i bröstcancer cellinje ortotropisk xenografts. Kanske mest slående, tysta av acetyl-CoA-syntetas 2 (ACSS2), ett enzym som ansvarar för konvertering av acetat till acetyl-CoA, minskad cancercell nummer under näringsstressförhållanden (låg syrehalt och serum) men hade liten eller ingen effekt under normala odlingsbetingelser 8. Ablation av ACSS2 påverkade tillväxten av bröst- och prostatacancer xenografter tyder på att närings gradienter inte existerar isolerat inom tumören mikro och att celler som finns i dessa regioner är avgörande för tumörprogression 8. Vidare ACSS2 konstaterades också att vara viktiga i glioblastom och hepatocellulära karcinom 9,10, vilket tyder på att ökad ACSS2 aktivitet i tumörer kan vara en grundläggande mekanism som stöder tillväxt under ogynnsamma förhållanden.

Sammantaget visar dessa studier visar att rekapitulera de förhållanden som förekommer in vivo och utföra siRNA skärmar tillåter för identifiering av genes väsentliga för cancer överlevnad. Samt impac 2D cancercelltillväxt enligt näringsstressförhållanden, förbrukning av målgener i dessa studier inhiberade cancercellinje sfäroid tillväxt, spegling vad som observerades i tumörxenotransplantat 6,8. Således, cancer cellinje sfäroiderna innehåller flera av de förhållanden som råder i tumören mikro som förlänar känslighet för ACSS2 tysta. I själva verket, sfäroider visar närings gradienter (serum och syre), förändringar i pH, tredimensionella (3D) cell-cellkontakt, men också förändringar i proliferativ celerity med celler som genomgår cellcykeln och apoptos. Detta exemplifieras genom närvaron i cancer sfäroider av nekrotiska regioner, en funktion som inte finns i traditionella 2D kultur.

Cancercell sfäroider har redan använts som mer biologiskt relevanta modeller för att screena småmolekylinhibitorer men detta endast tillåter validering av föreningen effektivitet eller återanvända av kompoFONDERNA ursprungligen design för andra sjukdomar 11. Nuvarande sfäroid screeningmetoder tillåter inte för analys av specifika genen utarmning i en hög genomströmning av hög halt sätt. Här beskriver vi för första gången, en funktionell genomik rörledning för att avslöja specifik gen beroenden använder små störande RNA (siRNA) teknik i cancercell linje sfäroider. Vi har utformat en skräddarsydd bibliotek med siRNA riktar de 200 mest muterade gener i humana bröstcancer och bedömde effekterna av genen utarmning på sfäroid storlek och metabolisk aktivitet i BT474 bröstcancer sfäroider. Vi kunde robust och reproducerbart detektera effekterna av ErbB2 och PIK3CA tysta i 3D kulturer. Dessutom kunde vi bedöma effekten av genen utarmning på den rumsliga arkitektur BT474 sfäroider med hjälp av immunohistokemi.

Protocol

1. Framställning av 96-brunnars siRNA Plates

OBS: De yttre kanterna på en 96-brunnars platta är mer benägna att avdunstning i förhållande till andra brunnar, på så sätt begränsa mängden siRNA till 60 per 96-brunnars platta. Fyll i yttre brunnarna med vanligt medium eller PBS att begränsa denna. Dessutom är en validerings skärm träffar rekommenderas att lindra plåt fördomar.

  1. Späd siRNA till 250-500 ng / mikroliter i reducerad serummedium (enligt tillverkarens rekommendationer) och delprov 10 mikroliter till lämpliga brunnar i ultralåg fästplatta. Utför alla skärmar i tre exemplar.
    OBS: Införliva lämpliga icke-inriktade (negativ) och döda (positiv, såsom UBB och PLK1) siRNA kontroller i plattan design för att säkerställa transfektion effektivitet kan bedömas. Användningen av låga fastsättningsplattor för siRNA arbete är kritisk, eftersom celler kommer att läggas till transfektionsblandningen. Vi kan inte utesluta att vissa tillverkare ultralåg fastsättningplattor kan ha subtila effekter på sfäroid tillväxt. Som sådan rekommenderar vi att dessa testas av slutanvändaren.
  2. Täckplåtar med självhäftande tätningar och förvara vid -20 ° C.

2. Omvänd Transfektion av cellinje

  1. På dagen för skärmen, tina plattorna vid rumstemperatur och snurra under 5 min vid 1000 xg under användning av en bänk-topp-centrifug. Tillsätt 10 mikroliter av minskad serummedium innehållande den optimerade transfektion reagens till varje brunn med en flerkanalspipett. Låt plattorna under 15 min för transfektion komplex innehållande siRNA bildas.
    OBS: Denna studie utnyttjade bröstcancercellinje BT474 för funktionell genomisk screening (odling i hög glukos DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika).
  2. Trypsinize de celler som skall screenas (0,05% trypsin och 0,53 mM EDTA) tills de lossnar från kolven, neutralisera med hjälp av lämplig volym av cellinje specific medium och centrifugera i 5 min vid 1000 xg på en bänk-topp-centrifug för att avlägsna trypsin. Resuspendera celler med en lämplig volym av medium och bestämma exakt mobilnummer med hjälp av en cellräknare.
    OBS: Normalt 5000 celler per brunn är tillräckliga för sfäroid bildning i de flesta testade cellinjer. Det är viktigt att noggrant räkna cellerna som en enda cellsuspension för noggranna storleksjämförelser.
  3. Späd celler till 5000 celler per 180 mikroliter i kallt medium (4 ° C).
    OBS: Tillsatsen av rekonstituerade basalmembranmatriskomponenter kommer att inverka negativt transfektionseffektivitet och det rekommenderas att den inte används. Cellinjen optimering för att bekräfta sfäroid bildar kapacitet och knockdown effekt bör utföras innan skärmen.
  4. Överför cellsuspensionen till en reservoar, till pipett blanda och tillsätt 180 | il till varje brunn i 96-brunnars ultralåg fastsättningsplatta innehållande den siRNA som framställts tidigare (2,1).
  5. Centrifuge plattan vid 1000 x g i en förkyld 4 ° C-centrifug under 10 min och sedan återgå till ett 37 ° C vävnadsodlingsinkubator.
  6. OBS: Cellerna kommer att visas som en mosaik i botten av brunnarna. Under de kommande 12-24 h cellerna kommer att sammanställa ihop till en enda sfär.
  7. Efter 24 h, observera cellerna bildar en enda sfäroid i mitten av brunnen. Tillsätt 100 mikroliter av komplett medium till varje brunn för att främja tillväxt.
  8. Fylla på medium efter tre dagar. Försiktigt bort 100 mikroliter av mediet från varje brunn och tillsätt 100 | il färskt medium.
  9. På dag 7, kvantifiera automatiserade sfäroid storlek på en plattläsare som kvantitativt kan övervaka sfäroid tillväxt över tiden (se avsnitt 3).
  10. Efteråt bestämma cellviabiliteten med hjälp av en självlysande cellviabilitet färgämne (se avsnitt 4).

3. Automatiserad Image Acquisition

  1. Skanna plattorna på en bänk-topp, mikro-brunnar imaging cytometer dag 7.
      <li> Öppna programmet, välj följande: '96 -Ja platta ", välj lämplig skiva och ange ett experiment namn. OBS: Alla ytterligare information kan också läggas in i mjukvaran.
    1. Välj "Tumorsphere" ansökan. Ändra fokus så att sfäroid är i fokus och har optimal kontrast.
      OBS: Vi rekommenderar "bildbaserad fokus" som betydande variationer i sfäroida storlekar förväntas.
    2. Välj de brunnar som kräver scanning och "Start scan".
    3. Använda plattan skannerprogrammet, se till att objektet masken representerar exakt sfäroid storlek. Gör detta genom att justera koloni diameter, gräns Utvidgning, minsta tjocklek och precision inställningar specifika för varje cellinje testades 11,12.
      OBS! Sfäroid kommer då att beräknas med hjälp av mjukvarualgoritm. Till exempel, exakt beräkna området BT474 sfäroider som odlas för sju dagar justera precision till "hög" end ange minimi kolonin diameter 200 iM. Detta bör leda till en lämplig sfäroid mask representativ för sfäroid området.
      OBS: Dessa data kan sedan exporteras från maskinen med hjälp av exportfunktionen i i form av en kommenterad datafil. Datum är platta median normaliserad, kombineras och analyseras antingen genom z-poäng eller strikt standardiserade genomsnittliga skillnaden (SSMD) för att identifiera siRNA som hade en statistiskt signifikant effekt på sfäroid område.

4. Att bestämma cellviabilitet

  1. Efter sfäroid område har beräknats, bestämmer lönsamheten med hjälp av en självlysande livskraft cell färgämne. Förbereda reagenset enligt tillverkarens instruktioner.
  2. Försiktigt bort 100 mikroliter av mediet från varje brunn och tillsätt 100 mikroliter av viabilitet färgämne. Inkubera plattorna under 15 min skanna sedan med hjälp av en självlysande plattläsare.
    OBS: Dessa data kan sedan exporteras från maskinen med hjälp av exportfunktionen i iform av en kommenterad datafil. Datum är platta median normaliserad, kombineras och analyseras antingen genom z-poäng eller strikt standardiserade genomsnittliga skillnaden (SSMD) för att identifiera siRNA som hade en statistiskt signifikant effekt på sfäroid lönsamhet.

Representative Results

Sfäroid analyser i ultralåga fäst 96-brunnsplattor ger en hög genomströmning fenotypisk bedömning av potentiella onkogenicitetsstudie i ett sammanhang som lättare rekapitulerar de fysiologiska förhållanden som råder i tumörer in vivo. Faktum är att de cancercellinjer MCF10DCIS.com och BT474 bildar snäva sfäroida strukturer (Figur 1A) och immunhistologisk utredning av sfäroida sektioner visade tydliga rumsliga förändringar i cellulär och nukleär morfologi. Med tiden, vissa sfäroider som BT474 sfäroider utvecklar nekrotiska regioner, ett vanligt inslag i aggressiva solida tumörer (Figur 1B). Vissa sfäroider inte utvecklar nekrotiska kärnor, såsom MDA-MB-231-cellinjen, men gör displayen markerad variation i den proliferativa markör Ki67, som omvänt korrelerar med kluvna caspsase-3-uttryck, en markör för apoptos (Figur 1C). För att fastställa att flera cellinjer är verkligen Receptiv till siRNA-medierad geners uttryck BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 och JIMT1 celler omvänd transfekterades med siRNA i sju dagar. Närvaron av transfektionsreagens (mock) eller transfektion av kontroll siRNA hade ingen effekt på sfäroid bärkraft, medan tysta av den essentiella genen Ubiquitin B (UBB) signifikant sfäroid livskraft i alla testade cellinjer (Figur 1D).

Vi har utformat en human siRNA bibliotek som omfattade de mest frekvent muterade gener i omarkerade, ER +, HER2 + och trippelnegativ bröstcancer. Detta bibliotek består av gener med känd funktion, såsom MYC, PIK3CA och TP53 och de vars bidrag till cancer är inte fastställd. Skärmen innehåller också flera icke-inriktade styr siRNA (Kontroll # 1, kontroll # 2) och siRNA inriktning viktiga gener, såsom PLK1 och UBB, som fungerar som döda kontroller (tabell 1). Vi valde att använda bröst cancER cellinjer BT474 som de bildar med lätthet sfäroider utan tillsats av rekonstituerat basalmembran, är etablerade arbetshäst cellinjer och har en känd genomisk arkitektur. Till exempel, BT474-celler är positiva för östrogenreceptorn (ER +), överuttrycker den humana epidermala tillväxtfaktorreceptorn 2 (HER2 +) och hamn mutationer i TP53 (E285K) och PIK3CA (K111N) 13.

Användning av det protokoll som beskrivs ovan, övervakas vi effekterna genen uttömning hade på sfäroid storlek och viabiliteten efter sju dagar av siRNA omvänd transfektion (figur 1E). Intressant nog de flesta gener inte har en betydande inverkan på sfäroid område eller viabilitet (Figur 2A). Tysta FOXO3, PIK3CA, erbB2 och SF3B1 resulterade i den mest signifikanta reproducerbar minskning av sfäroid storlek. Denna minskning observerades även i sfäroid viabilitet efter ErbB2 och SF3B1 ljuddämpning. Uppmuntrande, vi confirmed effekterna av PIK3CA, erbB2 och SF3B1 tysta på sfäroid storlek med hjälp ljusfält mikroskopi (Figur 2B). Vi har tidigare identifierat SF3B1 som en essentiell gen i många cellinje modeller och därmed siSF3B1 representerar en bra dödande kontroll förutom UBB 14. Intressant nog alla 200 gener endast tysta E-cadherin resulterade i en signifikant ökning av sfäroid viabilitet (Figur 2A). Undersökning av sfäroid morfologi visade att E-cadherin tystande resulterade i en fullständig redovisning av sfäroid arkitektur, med livskraftiga celler som vilar på botten av den låga fastsättning väl (Figur 2B). Manuell undersökning av skärmen data sfäroid volymen visade att detta också hade iakttagits men hade eliminerats från område kvantifiering på grund av att föremålet är över de begränsningar som storlek. Som tidigare markerat BT474 celler överuttrycker receptorn tyrosinkinas HER2 och hamnen en onkogen mutation i PIK3CA (K111N). Vi bekräftade att tysta ErbB2 och PIK3CA resulterade i reducerad sfäroid livskraft, medan transfektion med icke-målsökande kontroller hade ingen effekt (figur 2C).

Nästa vi undersökte effekten av siRNA utarmning på sfäroid histologi. BT474 sfäroiderna omvänd transfekterades med icke-inriktning kontroll siRNA och siRNA inriktning PIK3CA, erbB2 och UBB. Tysta ErbB2 och UBB resulterade i en minskning av den pro-proliferativ markör Ki67 jämfört med kontroll siRNA (figur 2D). Aktiveringen av pro-apoptotiska markör klyvs kaspas-3 observerades endast efter UBB tysta, vilket tyder på att utarmning av HER2 och PIK3CA resulterade inte i apoptos men var cytostatisk snarare än cytotoxisk. I själva verket hade tystande av HER2 och PIK3CA resultera i en ökning av proteinuttryck av cellcykelstopp protein p27 jämfört med kontroll transfekterade sfäroider.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Sammantaget visar dessa resultat att BT474-celler drivs av onkogena HER2 och PIK3CA signalering när den odlas som 3D sfäroider Ännu viktigare, visar dessa resultat att det är möjligt att. utforma och implementera en skräddarsydd siRNA screening bibliotek av hundratals gener i cancercell linje sfäroider robust och reproducerbart.

Figur 1
Figur 1: Cellinje Optimering för 3-dimensionell tillväxt. A. bröstcancercellinjer, MCF10DCIS.com och BT474 odlades i låga fästplattor för 7 dagar. Bright representativa bilder togs med ett inverterat mikroskop. Skalstrecken = 100 ^ m. B. MCF10DCIS.com och BT474 sfäroider odlades i 28 dagar. 100 mikroliter av färskt medium fylldes var 3 - 4 dagar. Sfäroider fixerades i 3,8% formaldehyd, embedded, snittades och färgades med hematoxylin och eosin (H & E). Representativa bilder visas vid låg och hög förstoring. Skalstrecken representerar 100 pm och 33 pm, respektive. C. MDA-MB-231-sfäroider odlades under 21 dagar. 100 mikroliter av färskt medium fylldes var 3 - 4 dagar. Sfäroider fixerades i 3,8% formaldehyd, inbäddad, snittades och färgades med Ki67 och klyvs kaspas-3. Representativa bilder visas. Skalstrecken = 100 ^ m. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, och JIMT1 cellinjer omvänd transfekterade med mock (endast transfektionsreagens) och styr siRNA och UBB, var ultralåga fastsättningsplattor spinns sedan för att bilda sfäroider. Färskt medium (100 | il) tillsattes på dag 1 och 4. Efter 7 dagar, var cellviabiliteten kvantifierades. Data representerar medelvärde ± SD av två oberoende biologiska replikat som utförs i tre exemplar normaliserad att styra # 1. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av en UNPAIRED Students t-test (p <0,05). E. Ett flödesschema som sammanfattar den omvända transfektion protokoll som används för att funktionellt förhöra gen beroende i cancercell linje sfäroider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Funktionell Genomic Undersökning av BT474 sfäroider avslöjar Onkogen beroenden. A. BT474 celler omvänd transfekterades med 200-genen human siGENOME siRNA bibliotek i tre exemplar. Sfäroid storlek och livsduglighet observerades. Raw datavärden var platta median normaliserade och z-poäng beräknades att identifiera betydande extremvärden större än 1,7x standardavvikelsen för plattan median 15. Notera perifera gener ErbB2, SF3B1, PLK1 och UBB ennd E-cad. siRNA som kraftigt ökade eller minskade sfäroid område och livskraft är skuggade i blått och rött, där rött visar kontroll siRNA-talet. B. Celler omvänd transfekterades med icke-inriktning kontroll, E-cadherin (E-Cad), PIK3CA, erbB2 eller UBB siRNA och sedan snurrade i en extremt låg fästplatta för att bilda sfäroider. Efter 7 dagar, ljusfält representativa sfäroida bilder togs med ett inverterat mikroskop. Skalstrecken = 100 ^ m. C. Cellerna omvänd transfekterades med icke-inriktning kontroll, PIK3CA, erbB2 eller UBB siRNA och sedan snurrade i en extremt låg fästplatta för att bilda sfäroider. Efter 7 dagar, var cellviabiliteten kvantifierades. Data representerar medelvärde ± SD av två oberoende biologiska replikat som utförs i tre exemplar normaliserad att styra # 1. Statistisk signifikans beräknades med användning av ett oparat Students t-test (p <0,05). D. Efter 7 dagar överfördes sfäroider fast, inbäddades, sektionerades och färgadesför H & E, Ki67, klövs caspas-3, och p27. Representativa bilder visas. Skalstrecken = 100 ^ m. Notera H & E i de siControl sfäroiderna verkar mindre på grund av en artefakt av bearbetning och enskilda intakt sfäroider valts för färgning. Men detta inte förringa de observerade förändringarna med de skannade bilderna och cellviabilitet resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Icke inriktning 1 TP53 DST KMT2C obehandlad 1 FCGBP ARID1B FBXM7 TTC40 Icke inriktning 2
GATA3 TTN MUC12 MUC4 AHNAK HUWEI1 DNAH11 ITPR2 ABCA13 CREBBP
MAP2K4 PIK3CA F5 apoB ANKRD30A MUC17 DNAH17 LAMA2 ESS CSMD2
STARD9 USH2A FAT3 LPR2 CSMD3 MYO18B DNAH5 MDN1 ARHGAP5 DNAH9
CXCR3 MUC16 RB1 PKHD1L1 DNAH2 SYNE2 DYNC1H1 PCLO CACNA1B erbB2
PLK1 SYNE1 lyst PTEN SPTA1 obehandlad 2 VHL RYR1 COL6A3 UBB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Icke inriktning 1 Enam RYR2 BRCA2 obehandlad 1 FMN2 HECW1 LAMB4 SI Icke inriktning 2
FHOD3 MACF1 RYR3 C2ORF16 DMD FRG1 HERC2 MYH11 STAB1 ZDBF2
GOLGA6L2 NEB SMG1 CACNA1E DNA14 GCC2 HIVEP2 NIPBL TANC1 ZNF536
HMCN1 NF1 UBR5 CACNA1F DYNC2H1 GON4L HYDIN PKD1L1 TF ANK3
HRNR OBSCN USP34 CYMA5 FAM208B GPR112 ITSN2 RNF213 TPR ASPM
PLK1 PCDH15 XIRP2 COL7A1 FLG2 obehandlad 2 VHL SAGE1 UNC80 UBB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Icke inriktning 1 DCHS2 MUC5B ZFHX4 obehandlad 1 MYO9A SPHKAP CXORF22 NCOR1 VPS13D
DMXL2 MXRA5 ANK2 KIAA1210 PRUNE2 TCHH DANH6 NOTCH2 ANKRD12
BIRC6 DNAH10 TENM1 bankomat LRP1 SCN10A VPS13C DNAH7 SPEN C5ORF42
CDH1 DNAH3 PEG3 DIDO1 MAP1A ScN2a IPTR3 ErbB3 SRRM2 CCDC88A
CUBN NOCK11 RELN DNAH8 MED12 SHROOM2 CEP350 FAT4 SZT2 CHD4
PLK1 EYS SACS KIAA1109 MED13 obehandlad 2 KMT2A VPS13A UBB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Icke-inriktning QSER1 ARID1A WDFY3 obehandlad 1 SDK1 TEX15 LAMA1 Icke inriktning 2
COL14A1 SHROOM3 ATRX EFCAB5 SF3B1 CBFB AHNAK2
CSMD1 TBX3 KIAA0947 FOXA1 ITPR1 DDX3X KIF4A
MEFV UBR4 MYCBP2 INPPL1 FLG HECTD4 FAT2
mgAm VCAN NBEAL1 MAP3K1 AKAP9 GPR98 FOXO3
PLK1 ZNF462 sattX NRP1 HERC1 obehandlad 2 VHL UBB

Tabell 1: Plate Layout och Human siRNA bibliotek avfaltning. Tabellen innehåller innehållet i vart och ett av siRNA pooler och layout för de låga fästplattorna som används i skärmen.

Discussion

Tredimensionella modeller av cancer alltmer används för att utvärdera effekten av kända och nya föreningar som har utformats för att selektivt döda cancerceller. Cancercell sfäroider är strukturer som visar förhållanden som mer liknar de som förekommer i tumörer in vivo, således föreningar som har ökad effektivitet i 3D är mer benägna att ha en effekt in vivo. Men dessa omständigheter inte tillåter för identifiering av potentiellt nya mål som inte har varit föremål för läkemedelsdesign som skulle kunna ha en betydande effekt vid behandling av cancer.

Vi utvecklade en siRNA funktionsgenomik tillvägagångssätt som tillåts för hållbara geners uttryck för upp till sju dagar i cancer cellinjer sfäroider. Det finns flera viktiga steg i protokollet som kräver optimering innan siRNA skärm kan utföras. Förmågan att bilda reproducerbara viabla sfäroider i stor skala är viktigt. Dessutom är ettppropriate transfektion villkor bör noggrant optimeras. Vi föreslår trialing flera olika transfektionsreagens med lämpliga icke-inriktning och döda kontroller innan du försöker skärmen. Vi kunde visa att flera vanliga bröstcancercellinjer, nämligen BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 och JIMT1 var mottaglig för siRNA transfektion. Dessutom ger vi proof-of-principle-data screening de 200 mest muterade gener i bröstcancer i BT474 sfäroider bekräftade sitt beroende av förstärkning av HER2 och onkogen mutation av PIK3CA. Intressant, tysta transkriptionsfaktor FOXO3 resulterade i en minskning av sfäroid storlek men ingen signifikant effekt på lönsamheten. FOXO3 är känd för att reglera svaret på hypoxi, förändra den metaboliska kapaciteten av cancerceller så att de kan anpassa sig lättare till sin omgivning 16. Denna roll skulle kunna störa cellviabilitet behandlingen eftersom den detekterar ATP överflöd, En av de viktigaste produkterna av cellmetabolism.

Till stöd för observation av en minskning av sfäroid storlek, har det visat sig att tysta FOXO3 i HeLa xenografter nedsatt tumörtillväxt och apoptos 17. Det är viktigt att notera att vissa gener kan påverka förmågan hos cancerceller att behålla sin 3D-arkitektur, vilket kan resultera i falska positiva. Till exempel, knockdown av E-cadherin resulterade i upplösning av BT474 sfäroid struktur. Detta hade tidigare rapporterats med hjälp av E-cadherin riktade antikroppar 18. Som med alla screening plattform, bör potentiella mål att återscreenades för att bedöma reproducerbarhet av effekten observerades. Det finns begränsningar för tekniken, nämligen övergående natur siRNA-medierad gen knockdown. Ihållande tysta längre än sju dagar var inte kan uppnås med siRNA.

Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det kan kopplas med olika andra Biometric färgämnen inte bara de som bedömer sfäroid lönsamhet, till exempel, ger rumslig information om sfäroid hypoxi eller övervakning celler som genomgår apoptos. Dessutom, på grund av plattläsaren skannar är relativt snabb och icke-invasiv, effekterna av siRNA på sfäroid storlek kan bedömas över tiden snarare än bara på experiment slutpunkt. I själva verket är vi undersöker för närvarande flera av dessa möjligheter inom vår screening pipeline. Ett alternativt tillvägagångssätt, som utnyttjar 3D-kulturer för att identifiera nya beroenden är användningen av kemiska bibliotek som hämmar antingen ett brett spektrum av mål eller speciella familjer av proteiner. Faktiskt, Bitler et al. utnyttjat denna målinriktad strategi för att identifiera interaktion den syntetiska dödlighet mellan ARID1A status och EZH2 inhibitorer i äggstocks klara cellcarcinomas 19. Upptäckten av crispr-Cas9 gen redigering teknik har också gjort det möjligt att utveckla genetiska skärmar i organoid kulturer och in vivo. Emellertid thans inställning är beroende av att ha lämpliga djuranläggningar och kan kosta oöverkomliga 20.

Sammanfattningsvis anser vi att vi har beskrivit ett protokoll som bättre modeller syre- och närings gradienter, som är karaktäristiska för tumörmikro in vivo, som möjliggör identifiering av nya mål cancer eller robust validering av uppsatta mål. Dessutom kan våra protokoll kan tillämpas på alla typer av cellinje som bildar sfäroider och därmed kan rutinmässigt används i cancerforskning community för hög genomströmning siRNA skärmar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lullaby Oz Biosciences LL70500  lipid-based transfection reagent
Viromer Lipocalyx VB-01LB-01 virus-like polymer transfection reagent
Ultra-low attachment plate Corning CLS7007 96 well plate
Foil plate seals ThermoFisher AB-0626
Luminescent cell viability dye Promega G7570 CellTitre-Glo
Pipette tips (200 μL) Starlab S1111-0806
Pipette tips (10 μL) Starlab S1111-3800
Pipette tips (1, 000 μL) Starlab S1122-1830
Serological pipettes (5 mL) Sarstedt 86.1253.025
Serological pipettes (10 mL) Sarstedt 86.1254.025
Serological pipettes (25 mL) Sarstedt 86.1685.020
RPMI Media GIBCO 11875-093
DMEM Media GIBCO 11965-084
Opti-MEM GIBCO 31985070
Feta bovine serum GIBCO 16140063
siRNA Dharmacon Cherry picked library
Countess Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10312
Celigo S Nexcelom contact company
Victor X5 Perkin Elmer contact company
Benchtop centrifuge Various
Axiovert Inverted brightfield microscope Zeiss contact company
Tissue culture CO2; Incubator Various
Mulitichannel pipette Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (5), 1257-1262 (2004).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  3. Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19, (16), 3660-3668 (2001).
  4. Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120, (7), 1451-1458 (2007).
  5. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11, (6), 393-410 (2011).
  6. Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2, (4), 328-343 (2012).
  7. Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237, (2), 152-165 (2015).
  8. Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27, (1), 57-71 (2015).
  9. Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159, (7), 1603-1614 (2014).
  10. Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159, (7), 1591-1602 (2014).
  11. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
  12. Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
  13. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483, (7391), 603-607 (2012).
  14. Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235, (4), 571-580 (2015).
  15. Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1, (3), 260-273 (2011).
  16. Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19, (6), 968-979 (2012).
  17. Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30, (22), 4554-4570 (2011).
  18. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31, (6), 1403-1413 (2007).
  19. Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21, (3), 231-238 (2015).
  20. Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33, (4), 390-394 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics