Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement

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Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S. i., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).

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Abstract

Introduction

ADN de l'environnement (EDNA) dans les milieux aquatiques se réfère au matériel génétique trouvé dans la colonne d'eau. Des études récentes ont démontré l'utilité de EDNA pour détecter les poissons de divers milieux aquatiques, y compris les étangs, les rivières 1-3 4-8, cours d' eau 9, et l' eau de mer 10-14. La plupart de ces études se sont concentrées sur la détection d'un seul ou de quelques invasive 1,4-6,8,14 et rares ou menacées espèces 3,9, alors que certaines études récentes ont tenté la détection simultanée de plusieurs espèces dans les communautés de poissons locales 7,9, 12,13,15 et mésocosmes 11,12.

Cette dernière approche est appelée «metabarcoding» et EdNA metabarcoding utilise un ou plusieurs ensembles d'amorces de PCR pour coamplify une région de gène à travers taxonomiquement divers échantillons. Elle est suivie par la préparation bibliothèque d'indexation et l'addition de l'adaptateur et les bibliothèques indexées sont analysées par un séquençage parallèle à haut débitPlate-forme. Récemment Miya et al. 12 ont développé des amorces de PCR universelles pour metabarcoding EDNA de poissons (appelés "MiFish"). Les amorces MiFish ciblent une région hypervariable du gène 12S ARNr mitochondrial (163-185 pb), qui contient des informations suffisantes pour identifier les poissons à la famille taxonomique, genre et espèce, sauf pour certains congénères étroitement liés. Avec l'utilisation de ces amorces dans EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 détecté plus de 230 espèces marines subtropicales de réservoirs d'aquarium avec la composition des espèces et des récifs coralliens connus près de l'aquarium.

Tout en optimisant le protocole metabarcoding pour accueillir l'eau de mer naturelle avec des niveaux de concentration de poissons EDNA différents, nous avons remarqué que les amorces MiFish parfois échoué à amplifier la région cible pour la préparation de la bibliothèque ultérieure. Une des raisons les plus probables pour cette amplification PCR échec est le manque de quantités suffisantes de la template ADN contenu dans de petits volumes d'eau filtrée (ie 1-2 L). Bien que la concentration EDNA d'un groupe taxonomique spécifique est inconnaissable avant l'amplification, la filtration de grands volumes d'eau (> 1-2 L) serait un moyen simple et efficace pour recueillir plus EDNA des milieux aquatiques avec l'abondance des poissons rares et la biomasse, tels que ouvert sur la mer et en eaux profondes des écosystèmes.

Par rapport aux filtres en fibre de disques utilisés classiquement dans un certain nombre de recherches poissons EDNA 16, les cartouches filtrantes ont l'avantage d'accueillir de plus grands volumes d'eau avant le colmatage 17. En fait, une étude récente a montré un grand volume (> 20 L) filtration des échantillons d'eau de mer côtières en utilisant des cartouches filtrantes 18. En outre, ils sont emballés individuellement et stérile, ainsi que plusieurs étapes du flux de travaux expérimentaux peuvent être réalisés dans le boîtier de filtre, ce qui réduit la probabilité de contamination du laboratoire 19. Le dernierfonctionnalité est essentielle pour EDNA metabarcoding, où le risque de contamination reste parmi les plus grands défis expérimentaux 20,21. En dépit de ces avantages techniques des cartouches filtrantes, il n'a pas été utilisé dans les études EDNA de poissons à deux exceptions près 8,15.

Ici, nous fournissons un protocole pour la filtration des échantillons d'eau avec la cartouche filtrante et l'extraction de EDNA de son filtre sans avoir à couper ouvrir le boîtier. Nous fournissons également deux systèmes de filtration d'eau de remplacement en fonction des volumes d'eau (≤4 L ou> 4 L). Pour comparer les performances du protocole nouvellement développé et un protocole précédemment utilisé à l' aide d' un filtre en fibre de verre dans notre groupe de recherche 12,14,22,23, nous effectuons EDNA metabarcoding analyse de l' eau de mer à partir d' un énorme réservoir d'aquarium (7.500 m 3 ) avec la composition des espèces connues, et indiquer le nombre d'espèces détectées provenant des deux protocoles que des résultats représentatifs. Ce protocole hcomme été développé pour metabarcoding EDNA de poissons, mais est également applicable à EDNA d'autres organismes.

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Protocol

NOTE: Ce protocole ne traite pas des méthodes d'échantillonnage de l'eau et metabarcoding. L' eau peut être échantillonné de différentes manières en fonction des fins d'étude 16 et voir Miya et al. 12 pour plus de détails sur les méthodes de metabarcoding en utilisant des amorces de MiFish. A noter que l'eau prélevée doit rester très froid et on le filtre en quelques heures pour éviter une dégradation de EdNA. A noter également que ce protocole implique l'utilisation d'un agitateur rotatif et un incubateur, et celui-ci doit être suffisamment grand pour accueillir l'ancien. En outre, une centrifugeuse qui peut accueillir les 15 ml et 50 ml tubes coniques est indispensable pour éliminer le liquide restant dans le filtre de post-filtration et de recueillir l'ADN extrait à l'intérieur de la cartouche, respectivement.

1. Traitement d'un bouchon à vis et 1 L Sac en plastique

REMARQUE: Passer cette étape si le volume de filtration est> 4 L.

  1. Percez un trou dans le centre d'une vis cap (fixé à un sac jetable en matière plastique de 1 litre) ayant le même diamètre (4,8 mm) lorsque le tube faisant saillie à partir d'un connecteur Luer mâle. En utilisant des pinces diagonales, raccourcir le tube du connecteur luer-lock mâle à une longueur appropriée (env. 3 mm) pour éviter le colmatage d'une petite quantité d'eau à l' intérieur du bouchon après filtration.
  2. Appliquer une colle adhésive spécialisée pour le polyéthylène (PE) et polypropylène (PP) à la fois le fond et la surface du connecteur Luer mâle et bouchon à vis, respectivement. Attendez quelques minutes pour une bonne collage (reportez-vous aux instructions du fabricant).
  3. Insérer le connecteur Luer mâle dans le trou du bouchon à vis. Attendre jusqu'à ce que le collage complet des deux pièces (en général> 24 h). Stériliser le bouchon fileté avec le raccord Luer mâle avec 10% d' eau de javel du commerce (env. D'hypochlorite de sodium à 0,6%) avant utilisation.
  4. Poinçonner deux trous au niveau des deux coins inférieurs du sac en plastique de 1 litre, afin de l'accrocher à mesh panneau (étape 3). Assurez-vous que le diamètre des trous est plus grande que celle des dents du panneau de grillage.

2. Assemblée du système de filtration

  1. Fixer le tube à vide poussé au raccord d'une pompe d'aspiration d'entrée et fixer l'autre extrémité du tube à un collecteur. Assurez - vous que les trois rouges t-vannes du collecteur sont en position "off" (c. -à- horizontal).
  2. Le port d'un ensemble propre de gants, insérer un raccord luer femelle et un connecteur à vide au niveau des extrémités supérieure et inférieure du tube en caoutchouc sous vide pour la filtration, respectivement.
  3. attacher soigneusement le raccord Luer femelle à un orifice de sortie de la cartouche filtrante et fixer le raccord à vide un bouchon en silicone.

3. Filtration des échantillons d'eau (≤4 L) à l'aide de la cartouche filtrante

REMARQUE: Passer cette étape si le volume de filtration est> 4 L. Ce système de filtration nécessite un panneau f autonomeou accrocher le sac en plastique rempli de 1 L d'eau. Un panneau en treillis, plusieurs dents, et un support pour le panneau, tous disponibles dans les magasins en ligne, seraient utiles pour assembler cet appareil. Autoclaver l'entrée et la sortie bouchons Luer pour la cartouche filtrante avant utilisation.

  1. Versez l'eau échantillonnée 1 L dans le sac en plastique et fermer le bouchon à vis avec le connecteur luer-lock mâle.
  2. connecter avec soin un orifice d'entrée de la cartouche de filtre assemblé avec le connecteur luer-lock mâle du sac en plastique. Ne pas trop serrer le connecteur luer-lock; sinon l'appareil risque de fuir une fois que le pompage commence. Assurez-vous que toutes les connexions sont sécurisées avant d'accrocher le sac en plastique à partir d'un panneau de mailles.
  3. accrocher soigneusement le sac en plastique avec la cartouche de filtre à partir de deux branches sur le panneau de treillis et insérer un bouchon en silicone dans un orifice d'entrée du collecteur.
  4. Allumez l'aspirateur. Ouvrez les t-vannes rouges pour la filtration. Exécutez le collecteur jusqu'à ce que la cartouche filtrante est sèche, tpoule tourner le t-valve rouge à la position d'arrêt.
  5. Répétez 3.1-3.4 étapes jusqu'à ce que la quantité désirée d'eau est filtrée.
    NOTE: Pour 1 litre d'eau prélevée dans les récifs coralliens subtropicales, il faut environ trois minutes pour la filtration.
  6. Retirez délicatement la cartouche filtrante du sac en plastique et le connecteur à vide.
  7. Coiffer les deux extrémités de la cartouche à l'entrée et à la sortie bouchons Luer.
  8. Étiquette de la cartouche et entrée luer bouchon en utilisant de manière appropriée un stylo résistant aux solvants pour séchage rapide et l'étiquetage non-maculage.
  9. Conservez la cartouche filtrante à -20 ° C avant l'extraction de l'ADN.

4. La filtration de l'eau (> 4 L) Les échantillons à l'aide de la cartouche filtrante

Remarque: Ignorez cette étape si le volume de filtration de l'eau est ≤4 L. Ce système de filtration nécessite une bouteille de livre de 10 L équipé d'une valve et une pointe de pipette 10 ml jetable. Un diamètre intérieur de 10 ml pointe de pipette (15,0 mm) et un cône de la pointefin doit correspondre à un diamètre extérieur de la soupape (15,0 mm) et l'orifice d'entrée de la cartouche filtrante, respectivement. Les deux connexions sont conservées en toute sécurité pendant la filtration dans un ajustement à friction. Stériliser la pointe de la pipette avec 10% de l' eau de Javel commerciale (environ 0,6% d'hypochlorite de sodium) avant utilisation.

  1. Préparer une quantité appropriée d'eau prélevée dans la bouteille de livre. insérer Étroitement la pointe de la pipette de 10 ml dans la valve de 10 L livre bouteille.
  2. insérer de façon étanche l'orifice de sortie de la cartouche filtrante dans l'extrémité de pointe de pipette et insérer le bouchon de silicone dans l'orifice d'entrée du collecteur. Allumez l'aspirateur. Ouvrez les t-vannes rouges pour la filtration. Exécutez le collecteur jusqu'à ce que la cartouche de filtre est sec, puis tournez le t-valve rouge à la position d'arrêt.
    NOTE: Pour 10 L d'eau de mer provenant des récifs coralliens extérieurs subtropicales, il faut environ 30-40 min pour la filtration.
  3. Retirez délicatement la cartouche filtrante du sac en plastique et le connecteur à vide. Cap à la foisles extrémités de la cartouche avec l'orifice d'entrée et de sortie bouchons Luer. Étiquette de la cartouche et entrée luer bouchon en utilisant de manière appropriée un stylo résistant aux solvants pour séchage rapide et l'étiquetage non-maculage. Conservez la cartouche filtrante à -20 ° C avant l'extraction de l'ADN.

5. Extraction de EDNA du filtre

NOTE: Dans les étapes 4 et 5, nous utilisons un kit commercial, en grande partie en suivant un protocole de "sang nucléé" fourni par le kit. Pour plus de simplicité, nous décrivons la procédure de traitement d'une cartouche individuelle. Dans la pratique, nous recommandons le traitement 8 (ou le nombre maximal de la centrifugeuse) ou moins de filtres à la fois.

  1. Préchauffer un incubateur à 56 ° C.
  2. Préparer un tube de 2,0 ml, en coupant le couvercle à charnière du tube. Jeter le bouchon.
    NOTE: Le tube est utilisé comme tube de collecte pour le liquide restant dans le filtre.
  3. Retirer l'entrée (PAS sortie) capuchon Luer de la cartouche du filtre et insérez l'orifice d'entrée into le tube de collecte. sceller hermétiquement une connexion entre le tube de la cartouche et de la collecte en utilisant un film auto-obturant.
  4. Insérer l'unité combinée dans un adaptateur de centrifugeuse pour un tube conique de 15 ml. Centrifuger la cartouche à 5000 g pendant 1 min pour éliminer le liquide restant dans le filtre.
  5. Retirez le tube collecteur de la cartouche du filtre et jeter le tube. Reboucher le port d'entrée de la cartouche.
  6. Préparer un mélange de solution protéinase-K 20 pi, 220 pi de PBS (tampon phosphate salin, non fournie par le kit) et 200 pi de tampon AL.
    REMARQUE: La cartouche filtrante peut accueillir jusqu'à quatre fois les volumes du mélange (. Ca 1,8 ml).
  7. Retirez le bouchon d'entrée et ajouter le mélange (440 pi) dans la cartouche de filtre à l'aide d'une pointe de pipette. Insérer la pipette complètement dans l'orifice d'entrée de sorte que la pointe de la pipette est visible à l'intérieur de la cartouche juste au-dessus de la membrane.
  8. Reboucher l'orifice d'entrée et placer la voiture de filtreTridge sur un agitateur rotatif.
  9. Placez l'agitateur rotatif dans l'incubateur préchauffé à 56 ° C et tourner sur l'agitateur à une vitesse de 20 tours par minute pendant 20 min.
  10. Pendant l'incubation, préparer un nouveau tube de 2,0 ml, étiqueter le tube en utilisant de manière appropriée un stylo résistant aux solvants et le placer dans un tube conique de 50 ml.
    Remarque: les premiers (2,0 ml), et ces derniers tubes (50 ml) sont utilisés pour la collecte de l'ADN extrait et pour maintenir le tube de 2,0 ml.
  11. Après l'incubation, enlever le bouchon d'entrée et insérez l'entrée (PAS la sortie) port de la cartouche dans le tube de 2,0 ml dans le 50 ml tube conique. Fermer le tube conique de 50 ml avec un bouchon à vis.
  12. Centrifuger le tube conique de 50 ml à 5000 g pendant 1 min pour recueillir l'ADN extrait de la cartouche. Retirez la cartouche de filtre et le tube de 2,0 ml en utilisant des pinces stérilisées et boucher le tube. Jeter la cartouche filtrante.

6. La purification de l'ADN Extrait

NOTE: Nous éluer EDNA avec 100 ul de tampon AE au lieu de 200 ul spécifiées dans le manuel du kit commercial.

  1. Ajouter 200 ul d' éthanol (96-100%) pour l'ADN extrait dans le tube de 2,0 ml de l'étape ci - dessus (environ 440 pi), et bien mélanger par tourbillonnement.
  2. Pipeter le mélange dans une colonne de centrifugation dans un tube collecteur de 2 ml. Centrifuger à 5000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement et le tube de collecte.
  3. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml, ajouter 500 pi de tampon AW1, et centrifuger pendant 1 min à 5000 x g. Jeter l'écoulement et le tube de collecte.
  4. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml, ajouter AW2 tampon de 500 pi, et centrifuger pendant 3 min à 20 000 x g. Jeter l'écoulement et le tube de collecte.
  5. Préparer un nouveau tube de 1,5 ml (non fourni par le kit) et étiqueter le tube en utilisant de manière appropriée un stylo étanche pour séchage rapide et l'étiquetage non-maculage. Transférer la colonne spin to le tube de 1,5 ml.
  6. Éluer l'ADN par addition de 100 ul de tampon AE au centre de la membrane de la colonne. Incuber pendant 1 min à température ambiante, puis centrifuger à 6000 g pendant 1 min.
  7. Jeter la colonne de centrifugation et boucher le tube. Stocker l'ADN purifié à -20 ° C.

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Representative Results

Il est techniquement difficile d'isoler et de quantifier seulement EDNA de poissons de la EDNA en vrac extrait, parce que les amorces MiFish coamplify la région cible de certains vertébrés non-poissons, tels que les oiseaux et les mammifères, avec des produits de PCR de la même taille (env. 170 pb ) 12. Au lieu de quantifier les poissons EDNA, nous effectuons MiFish metabarcoding analyse de EDNA à partir d'un réservoir d'aquarium avec la composition des espèces connues en utilisant les deux méthodes différentes de filtration et l'extraction d'ADN, et comparer le nombre d'espèces détectées par bibliothèque des deux protocoles. Cette expérience simple a été conçu pour montrer la faisabilité du présent protocole que les «résultats représentatifs» et non pas de démontrer rigoureusement sa supériorité sur les autres.

Nous avons échantillonné un total de 30 L d'eau de mer à partir d'un réservoir dans le Kuroshio Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japon (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Le réservoir Kuroshio est conçu pour exposer mégafaune marine, avec des dimensions (L x L x P) de 35 mx 27 mx 10 m et un volume total d'eau de 7500 m 3. Il abrite environ 60 grandes espèces de poissons marins -sized caractéristiques pour les zones autour du Kuroshio, l' un des courants de bord ouest circulant vers le nord le long de la longueur entière du Japon. Dans une étude MiFish de metabarcoding précédente, Miya et al. 12 détecté 61 des 63 espèces (97%) contenaient dans le réservoir de cinq 2 l échantillons d'eau de mer.

Pour la filtration de l'eau de mer, on a utilisé des cartouches de filtre (taille des pores = 0,45 um) et des filtres à disques en fibre de verre (taille des pores = 0,70 um). Nous concurremment filtré l'eau de mer sur le même collecteur en utilisant les deux protocoles pour quatre volumes d'eau (1, 2, 3, et 4 L, au total, huit filtres). Après la filtration de l'eau de mer, nous avons également filtré 1 litre d'eau de qualité PCR avec les deux filtres (Fcartouche ilter et le filtre en fibre de verre) que les contrôles négatifs (deux flans de filtre). A partir de ces types de filtres, nous avons extrait EDNA en utilisant les nouveaux et précédemment utilisés protocoles 12, les deux qui emploient le même kit commercial. Un total de 10 échantillons EdNA (y compris les deux contrôles négatifs) ont été soumis à une analyse MiFish metabarcoding comme décrit dans Miya et al. 12

En bref, nous avons effectué le 1er tour de PCR pour amplifier la région cible (12S mitochondrial du gène ARNr;. Ca 170 pb) et d'ajouter des adaptateurs pour le séquençage apparié-end. Pour huit échantillons EDNA (à l'exclusion des deux contrôles négatifs), nous avons effectué 10 PCR réplique pour voir les variations dans le nombre d'espèces détectées au sein de chaque échantillon (total 80) RFP. Nous avons également ajouté le filtre et ébauches de PCR pour chaque huit échantillons EDNA (total 16 RAP). Au total, nous avons obtenu des produits 96 PCR à partir du 1er tour PCR et ils ont été utilisés comme modèles pour la 2e ronde PCR pour la double indexation et en ajoutant des adaptateurs supplémentaires pour la préparation de bibliothèque suivants Miya et al. 12

Le séquençage apparié-end (2 x 150 pb) des 96 bibliothèques a donné 4.127.546 lit, avec une moyenne de 42.995 lit par bibliothèque (40539 lectures dans la cartouche filtrante et 43.121 lit dans le filtre en fibre de verre). Après démultiplexage et après pré-traitement des données brutes, 1.068.266 lectures ont été retenus pour les recherches BLAST pour l'affectation taxonomique. Parmi ces lectures, 830.788 lectures ont été identifiés comme les espèces contenues dans le réservoir Kuroshio (tableau 1). Nous avons détecté 60 espèces de réservoir de 830.788 lectures et le nombre moyen d'espèces détectées pour les 10 PCR répétitions des huit échantillons EDNA variait de 29 pour 1 L (filtre en fibre de verre) à 55 pour 4 L (cartouche de filtre) (tableau 1) . numéros Lisez des deux flans à partir des échantillons de huit EDNA étaient mineures, allant de 0à 12 pour les espèces du réservoir.

Nous avons constaté que le nombre d'espèces détectées par la cartouche filtrante était significativement plus élevé que ceux des filtres en fibre de verre (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001; Figure 1) à travers 1-4 L volumes d'eau de mer. Le nombre d'espèces détectées par la cartouche filtrante étaient environ 1,5 fois plus élevés que ceux utilisant les filtres en fibre de verre et dans les deux procédés, le nombre d'espèces détectées augmente avec le volume d'eau filtrée (ANCOVA, F = 164,2, p <0,001).

Un plus grand nombre d'espèces détectées par la cartouche filtrante peuvent résulter d'une ou plusieurs des étapes suivantes dans les workflows expérimentales: filtration de l'eau prélevée au travers (1) différents matériaux (PVDF hydrophile [polyvinylidène difluorure] vs. microfibres de verre) et / ou (2) des tailles de pores nominales (0,4581; par rapport à 0,70 um m) dans les cartouches filtrantes et les filtres en fibre de verre pourrait conserver plus EDNA de poissons sur l'ancien filtre; (3) l'utilisation d'un agitateur rotatif dans l'incubateur préchauffé produit plus le rendement en ADN à partir des cartouches de filtre que des filtres en fibre de verre plié dans une colonne de centrifugation placé sur un bloc chauffant immobile; (4) la collecte de l'ADN extrait par centrifugation à partir de la cartouche de filtre est plus efficace que celle du filtre en fibre de verre en raison de différents matériaux filtrants et / ou différentes méthodes de centrifugation. Apparemment, une étude plus rigoureuse conçue est nécessaire pour identifier les facteurs responsables pour le nombre toujours plus élevé d'espèces détectées par la cartouche filtrante dans la présente étude.

Figure 1
Figure 1: Le nombre d'espèces Détecté complotèrent contre Volumes Eau filtrée dans MiFish Metabarcoding Ana lyse des EDNA du Kuroshio Tank, Okinawa Churaumi Aquarium. Le nombre d'espèces détectées est limitée aux espèces contenues dans le réservoir. De 30 L d'eau de mer, nous avons filtré 1, 2, 3, et 4 L échantillons en utilisant les cartouches filtrantes et les filtres en fibre de verre et extrait EDNA de ces filtres en utilisant les présents et décrits précédemment protocoles 12, respectivement. Nous avons effectué une analyse de metabarcoding MiFish (détection simultanée de plusieurs espèces) pour 10 PCR réplique des quatre volumes d'eau à l'aide de deux protocoles. La barre horizontale dans la boîte représente la médiane; les bords supérieur et inférieur de la boîte correspondent aux inter-quartiles, les barres verticales correspondent à 1,5 x quartiles, et les points représentent les valeurs aberrantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Tableau 1:.. Composition taxonomique et lire les numéros des 60 espèces détectées dans MiSeq Les analyses des échantillons EDNA du Kuroshio réservoir Seules les espèces contenues dans le réservoir avec des séquences de référence dans la base de données personnalisée sont indiqués S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette table.

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Discussion

Dans de nombreuses études de metabarcoding en utilisant des échantillons environnementaux tels que l' eau et le sol, le traitement post-filtration de la cartouche filtrante est généralement la suivante 24,25: 1) de coupe ouverte ou gerçures le boîtier avec des outils à main (coupe-tube ou une pince); 2) le retrait du filtre de la cartouche; et 3) la découpe du filtre en petits morceaux avec une lame de rasoir pour l'extraction d'ADN. Pour éviter de telles lourdes et longues procédures qui sont sujettes à la contamination dans le laboratoire, nous avons essayé plusieurs méthodes d'extraction d'ADN à l'intérieur du boîtier de la cartouche de filtre à l'aide d'un largement utilisé, kit commercial peu coûteux, et développé avec succès le présent protocole avec favorable les résultats de l' analyse EDNA metabarcoding (figure 1).

L'une des étapes les plus critiques dans le présent protocole est l'utilisation d'un agitateur rotatif dans un incubateur préchauffé, qui est capable de fournir un bon rendement de l'ADN pour la bibliothèque ultérieure préparation dans l'analyse metabarcoding EDNA. sous agitation constante de la solution de proteinase K dans le boîtier à la température optimale facilite probablement l'extraction d'ADN à partir des particules piégées sur le filtre. Notez, cependant, que ce protocole implique l'utilisation d'un agitateur rotatif à la fois et un incubateur, et celui-ci doit être en mesure d'accueillir l'ancien. En outre, une centrifugeuse qui peut accueillir à la fois 15 ml et 50 ml tubes coniques est indispensable pour éliminer le liquide restant dans le filtre de post-filtration et la collecte de l'ADN extrait à l'intérieur de la cartouche, respectivement.

Il est une autre option pour atteindre une telle extraction de l'ADN sans avoir à couper ouvrir la cartouche (voir le tableau des matériaux / Réactifs). Le kit ne pas utiliser d'enzymes pour l'extraction de l'ADN; à la place, il utilise un tampon de lyse spécifique, en combinaison avec une lyse mécanique supplémentaire dans le bourrelet raclée. Dans des expériences préliminaires sur la base de l'eau de mer naturelle de la zone tempérée du Pacifique côtière, nous attempextractions ted ADN à l'aide de ce kit avec un prototype du présent protocole en utilisant le kit commercial. Avec l'utilisation de ce dernier protocole prototype, nous produits d'amplification distincts toujours reconnu dans l'électrophorèse sur gel pour la première ronde de PCR. En revanche, nous avons échoué à obtenir des produits de PCR par l'utilisation d'un kit différent (voir Matériaux / Réactifs Table) , malgré la suite de deux protocoles alternatifs fournis par le fabricant. Considérant que la PCR étapes d'élimination de l' inhibiteur sont inclus dans les deux protocoles de la deuxième kit (voir Matériaux / Réactifs Table), cette observation suggère un manque de quantités suffisantes d'ADN dans le modèle. De tels rendements d'ADN relativement faibles à partir d' échantillons environnementaux à l' aide du second kit sont rapportées dans des études récentes 26,27.

Dans le présent protocole, nous avons choisi la cartouche filtrante avec de grande taille nominale des pores (0,45 um), tandis que les études microbiennes aquatiques conventionally utiliser la plus petite (0,22 um) après préfiltration à travers des filtres plus grands pores de taille (1 à 3) 28 um. Les raisons de notre choix sont simples et directes, et ne sont pas basées sur des arguments théoriques: 1) la taille des pores est beaucoup plus proche de celle des filtres en fibre de verre (0,70 um) nous avons classiquement utilisés dans les précédents EDNA études 12,14, 22,23; 2) il est prévu pour permettre de plus grands volumes d'eau à filtrer que la plus petite. Cette dernière caractéristique est particulièrement importante pour nos projets de recherche actuels subissant dans les open-mer et les eaux profondes des écosystèmes avec l'abondance des poissons rares et la biomasse. En fait, nous avons confirmé la filtration réussie d'un échantillonné indépendamment de 10 litres d'eau de mer provenant du réservoir Kuroshio sans obstruction perceptible (résultats non montrés). Récemment, cependant, Turner et al. 29 ont démontré que 0,2 um filtration maximisée EDNA carpe capture (85% ± 6%) , tout en minimisant totale (non-cible) EDNAcapture (48% ± 3%), mais limitent le colmatage du filtre, cette dimension de pores par rapport à un volume inférieur à 250 ml d'échantillon. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le filtre volume des pores de taille et de l'eau filtration optimale de la cartouche filtrante pour EDNA metabarcoding dans divers types de milieux aquatiques avec différents niveaux d'abondance des poissons et de la biomasse.

L'une des limites de ce protocole est que la filtration de l'eau doit être effectuée dans le laboratoire où une alimentation électrique est disponible. En raison de la stabilité chimique limitée de l' ADN, EDNA commence à se dégrader dès qu'il est versé à partir d' un organisme et est détectable seulement pendant une courte période de temps dans les milieux aquatiques (heures à jours) 30. Par conséquent, il est idéal pour filtrer l'échantillon d'eau immédiatement après le prélèvement pour éviter une dégradation importante de EDNA. À cet égard, l'évolution des méthodes sur place filtration à l'aide de la cartouche filtrante serait une prochaine étape prometteuse. La portabilité et sterility de la cartouche filtrante permettant le développement des méthodes sur le site de filtration, qui fournira EDNA plus intacte qui peut refléter la composition des espèces de la communauté de poissons avec plus de précision dans EDNA metabarcoding. L'EDNA recueillie sur les cartouches filtrantes peut être stabilisé par l'injection d'un réactif commercial 31 (voir Matériaux / Réactifs Table) ou Longmire tampon 32 dans la cartouche avant de le ramener au laboratoire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10 ml pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10 L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

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References

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