प्राथमिक लिम्फोसाइटों के प्लाज्मा झिल्ली प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा में आणविक प्रसार

Immunology and Infection

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Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (120), e54756, doi:10.3791/54756 (2017).

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Abstract

प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ जैविक झिल्लियों के भीतर अणुओं के प्रसार के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। एफसीएस कोशिका झिल्ली में fluorescently लेबल अणुओं की आणविक एकाग्रता और प्रसार गुणांक यों कर सकते हैं। इस तकनीक (वास्तविक माप समय के दौरान परिणाम को प्रभावित करने प्रक्रियाओं के बिना, यानी) स्थिर अवस्था में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में अणुओं की आणविक प्रसार विशेषताओं का पता लगाने की क्षमता है। एफसीएस प्रोटीन है कि सबसे अंतर्जात प्रोटीन के लिए विशिष्ट स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं के प्रसार के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। इधर, प्राथमिक लिम्फोसाइट पर कोशिका झिल्ली प्रोटीन के प्रसार की दर निर्धारित करने के लिए एक सीधा और मजबूत विधि का प्रदर्शन किया है। एंटीबॉडी से सना हुआ जीवित कोशिकाओं और अधिग्रहण के बाद आमतौर पर होने वाली टिप्पणियों पर माप प्रदर्शन करने के लिए एक प्रभावी तरीका बताया गया है। हाल ही में प्रगतिफोटो-स्थिर फ्लोरोसेंट रंगों के विकास में रुचि के एंटीबॉडी conjugating रंगों कि माप के दौरान बड़े पैमाने पर ब्लीच नहीं है उचित द्वारा उपयोग किया जा सकता है। साथ ही, इस धीरे-धीरे diffusing संस्थाओं का पता लगाने, जो कोशिका झिल्ली में व्यक्त प्रोटीन की एक आम सुविधा है के लिए अनुमति देता है। उत्पन्न autocorrelation घटता से आणविक एकाग्रता और प्रसार मानकों को निकालने के लिए विश्लेषण प्रक्रिया पर प्रकाश डाला है। सारांश में, एफसीएस मापन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है; यह immunologists द्वारा confocal माइक्रोस्कोपी की समझ के साथ है, लेकिन इस तरह के आणविक प्रसार की दर के रूप में गतिशील मापदंडों को मापने के लिए तकनीक का कोई अन्य पिछले अनुभव के साथ पीछा किया जा सकता है।

Introduction

कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं कार्यों आणविक प्रसार और झिल्ली के भीतर बातचीत पर भरोसा करते हैं। जैविक झिल्लियों जटिल हैं, और कई कारकों है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह सेलुलर झिल्ली 1 के भीतर प्रोटीन के translational प्रसार की गति को प्रभावित कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। हमने हाल ही में पता चला है कि प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.), सहज प्रतिरक्षा प्रणाली से संबंधित लिम्फोसाइट, एन.के. सेल सक्रियण 2 की स्थिति पर निर्भर करता है कोशिका झिल्ली में दो अध्ययन प्रोटीन का अंतर प्रसार दिखा रहे हैं।

प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) एक तकनीक है कि जैविक झिल्लियों के भीतर आणविक प्रसार की दर बढ़ाता करने में सक्षम है। यह की fluorescently एक निश्चित मात्रा में लेबल अणुओं औसत प्रसार दर, आम तौर पर एक confocal खुर्दबीन का ध्यान केंद्रित रिपोर्ट। यह प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव की माप है कि में आणविक आंदोलन पर होते हैं पर आधारित हैस्थिर अवस्था में एक प्रणाली है। एफसीएस व्यापक रूप से, फ्लोरोसेंट रंगों और प्रोटीन के प्रसार के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है दोनों समाधान में और लिपिड झिल्ली के भीतर। प्रसार दर प्रभावित करने वाले अन्य उत्पादन मानकों को भी परोक्ष रूप से इस फैशन में अध्ययन किया जा सकता है (जैसे, प्रोटीन कोशिका झिल्ली पर अणुओं की बातचीत के गठनात्मक परिवर्तन) 3, 4। एफसीएस एकल अणु का पता लगाने के लिए संभावना की अनुमति अपने उच्च संवेदनशीलता के कारण अन्य तकनीकों की तुलना में बाहर खड़ा है। यह millimolar श्रृंखला के लिए nanomolar, जो सबसे अधिक प्रोटीन 5 की अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर के लिए विशिष्ट है में आणविक सांद्रता के लिए अच्छी तरह से काम करता है। इसके अलावा, एफसीएस जबकि अधिकांश अन्य तकनीकों केवल प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के बारे में जानकारी देने के रिश्तेदार, अध्ययन मात्रा के भीतर प्रोटीन की कुल संख्या का एक सन्निकटन दे सकते हैं। अन्य तरीकों आणविक प्रसार की दर को मापने के लिए झिल्ली के भीतर Fluo शामिलphotobleaching (FRAP) के बाद rescence वसूली, एक कण ट्रैकिंग (एसपीटी), कई पिनहोल एफसीएस, और छवि सहसंबंध के तरीकों। FRAP और छवि सहसंबंध के तरीकों पहनावा तकनीक है, जो आम तौर पर अणुओं 10 की पूर्ण संख्या के बारे में जानकारी नहीं देते हैं। एसपीटी की तुलना में, एफसीएस के throughput आबादी औसत निस्र्पक के संबंध में अधिक है। विश्लेषण भी कम मांग के बाद से लेजर फोकस के भीतर मौजूद अणुओं की औसत प्रसार दर मापा जाता है, न कि एकल अणुओं की दर से अधिक है। इसके अलावा, जब तक कि विशेष माइक्रोस्कोप उपलब्ध 11 हैं, एसपीटी नहीं सांद्रता के बारे में किसी भी जानकारी के बाद से मानक SPT लेबलिंग बहुत एकल अणुओं की पहचान के लिए अनुमति देने के लिए कम होना चाहिए दे सकते हैं। दूसरी ओर, एफसीएस अध्ययन के तहत अणुओं मोबाइल होने की आवश्यकता है। यह बस किसी भी ख्यात स्थिर भिन्न या बहुत धीरे धीरे आगे बढ़ अणुओं का पता नहीं लगा होगा। अणुओं के प्रसार की दर है किअधिग्रहण के समय के लगभग दसवां सही ढंग से एफसीएस माप 3, 12 में प्रतिनिधित्व नहीं दिया जाएगा की तुलना में अब फोकस के भीतर रहते हैं। इसलिए, प्रसार एफसीएस द्वारा दर्ज गुणांक FRAP और एसपीटी, जहां बंद करने वाली स्थिर और बहुत धीमी गति से भिन्न के रूप में अच्छी तरह से ध्यान में रखा जाता तरह की तकनीक से सूचना प्रसार की दर से अधिक तेजी से हो जाते हैं। एसपीटी भी की तुलना में एफसीएस होगा आणविक आबादी के भीतर प्रसार की दर की परिवर्तनशीलता के एक अधिक विस्तृत विवरण देना होगा।

एफसीएस उत्साहित मात्रा के भीतर समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की अस्थिरता quantifies। झिल्ली माप के मामले में, यह झिल्ली के प्रबुद्ध क्षेत्र के लिए अनुवाद। इस पत्र में, हम तथ्य यह है कि इस तरह के उतार चढ़ाव ब्राउनियन प्रसार का प्रदर्शन करते अणुओं द्वारा प्रेरित कर रहे हैं और इस प्रकार में और उत्तेजना की मात्रा के बाहर जा रहे हैं का उपयोग। वहाँ भी fluctua के लिए कई अन्य संभावित स्रोत हैंइस तरह निमिष या fluorophores, पर्यावरण प्रभाव में एक त्रिक राज्य की उपस्थिति, बंधन-unbinding ligand, या पूरे कोशिका झिल्ली के आंदोलन के रूप में प्रतिदीप्ति संकेत में माहौल। ये ख्यात त्रुटि के सूत्रों का कहना है कि जब आदेश में सही परिणाम 12, 13 की व्याख्या करने में एक एफसीएस प्रयोग डिजाइन को ध्यान में रखा जाना चाहिए। आमतौर पर, जैविक झिल्लियों में पार्श्व प्रसार की दर भीड़ और संबंधों के कारण कम कर रहे हैं, दोनों झिल्ली प्रोटीन के बीच और प्रोटीन और cytoskeleton के बीच। ऐतिहासिक, झिल्ली में एफसीएस के उपयोग इस प्रकार फोटो स्थिर fluorophores, जो उत्तेजना फोकस 14 के माध्यम से बढ़ाया पारगमन समय के दौरान विरंजन से बचने के लिए आवश्यक हैं की कमी आड़े आती कर दिया गया है। बहरहाल, आज, वहाँ उपयुक्त तस्वीर स्थिर रंगों के लिए बहुत सारे विकल्प हैं। डिटेक्टरों और अन्य हार्डवेयर में महत्वपूर्ण सुधार भी फ्लोरोसेंट prote का पता लगाने की अनुमतिभारतीय नौसेना पोत और कम चमक के रंगों। इधर, murine प्राथमिक लिम्फोसाइट का उपयोग कर एफसीएस के आवेदन, जहां ब्याज की प्रोटीन एक fluorescently के साथ लेबल है टैग की एंटीबॉडी के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल, वर्णित है। आदेश प्रसार गुणांक और आणविक घनत्व निकालने के लिए autocorrelation घटता फिट करने के लिए एक दृष्टिकोण यह भी दिखाया गया है। प्रोटोकॉल आसानी से अणुओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए तकनीक का कोई पूर्व अनुभव के साथ immunologists द्वारा पीछा किया जा रहा करना है। हालांकि, confocal माइक्रोस्कोपी की एक बुनियादी समझ की उम्मीद है (इस बुनियादी समझ हासिल करने के लिए, संदर्भ 15 देखें)। इस प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसानी से अन्य निलंबन की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता दोनों सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं। अधिक अनुभवी एफसीएस उपयोगकर्ताओं के लिए, और अधिक परिष्कृत विश्लेषण के तरीकों मौजूद हैं, जिनमें से कुछ चर्चा में वर्णित हैं।

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Protocol

1. के लिए एफसीएस धुंधला

  1. चुंबकीय मनका लेबलिंग का उपयोग निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार 16 तिल्ली लिम्फोसाइट से murine एन.के. कोशिकाओं को अलग। निम्न चरणों के लिए नमूना प्रति 2-3 x 10 5 कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    नोट: लक्ष्य सेल की आबादी को समृद्ध करने के लिए नकारात्मक चयन प्रयोग करें, यह अछूता छोड़ रहा है, ताकि कोशिकाओं अकेले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग लेबल किया जा सकता है। चूहों 2 से सेल अलगाव के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए संदर्भ 2 देखें।
  2. एफसी रिसेप्टर्स व्यक्त murine कोशिकाओं के लिए, 5 माइक्रोग्राम / फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) नमूना प्रति 25 μl में μl में एंटीबॉडी क्लोन 2.4G2 साथ एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करना।
    1. उपयोग एंटीबॉडी सीधे एक तस्वीर स्थिर fluorophore संयुग्मित। अगर दो अलग अलग प्रोटीन के खिलाफ दो एंटीबॉडीइस्तेमाल किया, उपयोग fluorophores है कि पार बात (जैसे, 488 और 633 लेज़रों 2 से उत्साहित है, बाद में प्रोटोकॉल में करने के लिए "हरी" और "लाल" लेजर और fluorophores के रूप में क्रमश: कम से कम करने के लिए भेजा अच्छी तरह से अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा हैं )।
      नोट: फ़ोटो-स्थिर fluorophores के साथ लेबल वाणिज्यिक एंटीबॉडी का चयन किया बायोमार्कर के लिए उपलब्ध नहीं हैं, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार fluorophores को साधना लेबल हटाया गया एंटीबॉडी। इस अध्ययन में इस्तेमाल एंटीबॉडी के लिए सामग्री तालिका देखें।
    2. प्रोटीन या पीबीएस + 1% FBS में ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी गिराए द्वारा एक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक नमूने के लिए एंटीबॉडी मिश्रण नमूना प्रति 50 μl के अंतिम मात्रा में जोड़े। अंधेरे में 45 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
      नोट: अग्रिम में एंटीबॉडी की एकाग्रता का अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए कि एंटीबॉडी एक saturating एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है, आम तौर पर1-10 माइक्रोग्राम / एमएल।
  4. ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के 250 μl जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 3 मिनट के लिए 150 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. दोहराएँ कदम 1.4।
  6. पीबीएस + 1% FBS के 200 μl में कोशिकाओं Resuspend। बर्फ पर और अधिग्रहण तक अंधेरे में रखें।
    नोट: Murine एन.के. कोशिकाओं के लिए 10 घंटे के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है।

2. माइक्रोस्कोप संभाग coverglass स्लाइड्स की तैयारी

नोट: उपयोग संभाग coverglass स्लाइड या कवर कांच मोटाई कि माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया गया है, # 1 या # 15 या तो साथ व्यंजन। माइक्रोस्कोप एक निश्चित मोटाई के लिए गठबंधन नहीं है, या यदि यह अज्ञात है, माइक्रोस्कोप कॉलर रिंग वर्तमान coverglass मोटाई 17 के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. 1:10 के अनुपात में आसुत जल से पतला पाली एल लाइसिन। कक्षों को पतला पाली एल Lysine के 200 μl जोड़ें और 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. हटाएपाली एल लाइसिन आकांक्षा से और कम से कम 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक ढक्कन के बिना जा रहा द्वारा चैम्बर शुष्क हवा।

3. एफसीएस प्रणाली शुरू

नोट: इस प्रोटोकॉल हालांकि अन्य माइक्रोस्कोपी setups और सॉफ्टवेयर संकुल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, (देखें सामग्री / अभिकर्मकों तालिका) एक विशेष माइक्रोस्कोप सिस्टम और सॉफ्टवेयर को दर्शाता है।

  1. एफसीएस correlator साथ लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग चालू करें। "विशेषज्ञ मोड" में सॉफ्टवेयर खोलें। 40X पानी विसर्जन लेंस का चयन करें।
  2. "अधिग्रहण" टैब के अंतर्गत, प्रेस "विन्यास" और "स्कैन" बटन "विन्यास नियंत्रण" और "स्कैन नियंत्रण" विंडोज (Windows एक और चित्रा 1 में बी, क्रमशः) खोलने के लिए। "Confocor" टैब के तहत, प्रेस "उपाय" "मापन" खिड़की (चित्रा 1 में खिड़की सी) खोलने के लिए।
  3. बचाने के लिए एफसीएस एक फ़ोल्डर बनाएँमाप। "नया" पर क्लिक करें "फाइल" टैब के अंतर्गत द्वारा एक नई छवि डेटाबेस शुरू करो।
  4. "लेजर" बटन का उपयोग करना, हैलोजन लैंप और रोमांचक fluorophores के लिए प्रासंगिक लेज़रों पर बारी (उदाहरण के लिए, "हरी" उत्तेजना लेजर और "लाल" उत्तेजना लेजर के लिए 633 एनएम उत्तेजना के लिए 488 एनएम)।
  5. उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें और इसी का पता लगाने को सक्रिय करें।
    1. छवि पर कब्जा करने के लिए सेटिंग्स निर्दिष्ट करें, उत्तेजना लेजर, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर, प्रकाश पथ, और डिटेक्टरों सहित "विन्यास नियंत्रण" विंडो में, इस्तेमाल किया जाएगा।
    2. इसी तरह, "मापन" विंडो में एफसीएस मापन के लिए इसी सेटिंग्स निर्दिष्ट "सिस्टम विन्यास" टैब के अंतर्गत। इमेजिंग और एफसीएस के लिए संभव के रूप में समान सेटिंग्स का उपयोग करें।
    3. हरी channe के लिए "Ch1" बॉक्स को चेक करके एफसीएस रिकॉर्डिंग के लिए पता लगाने के चैनलों को सक्रिय करेंएल और "मापन" विंडो में लाल चैनल के लिए "Ch2"।
      नोट: सेटिंग्स एक मानक confocal इमेजिंग प्रयोग के रूप में, fluorophore (एस) का इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। बाद के प्रयोगों में, एक ही एफसीएस सेटिंग्स, एक पुराने एफसीएस फ़ाइल खोलने यूजर इंटरफेस के शीर्ष पर "Confocor" पुल-डाउन मेनू का उपयोग कर, और चुनने के द्वारा पुन: उपयोग किया जा सकता है "ओपन फ़ाइल।" प्रेस "पुन: उपयोग" उभरते अधिग्रहण विंडो में। इसी तरह, छवि अधिग्रहण सेटिंग्स एक बचाया छवि खोलने और दबाने से लोड किया जा सकता "पुन: उपयोग।"
  6. रुको जब तक लेजर एफसीएस माप प्रदर्शन से पहले स्थिर है। यह लेजर डायोड तेजी से स्थिर है, जबकि गैस लेज़रों के लिए 30 मिनट तक का समय लग सकता है। देर इंतज़ार कर रहे पिनहोल समायोजित करें।

4. पिनहोल समायोजन

  1. fluorophores या फ्लोरोसेंट रंगों एंटीबॉडी पर लेबल की उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए इसी का 0.2-0.5 माइक्रोन के समाधान तैयार करें।fluorophores, 19 नाम से जाना होगा प्रसार गुणांक 18।
  2. fluorophore एक संभाग coverglass स्लाइड में एक अच्छी तरह से केंद्र में हरे रंग की लेजर से उत्साहित के साथ समाधान की एक 50 μl बूंद रखो। 40x पानी उद्देश्य पर आसुत जल की एक बूंद रखो और स्लाइड स्थिति। "विज़" बटन प्रकाश दिखाई शुरू करते हैं और आंख का उपयोग नहीं कर पाते और fluorophore बूंद पर ध्यान केंद्रित करने के लिए दबाएँ।
    नोट:, बाद में सेल के मापन के लिए के रूप में ही स्लाइड उपयोग कांच मोटाई में ख्यात मामूली बदलाव के बाद से स्लाइड्स के बीच माइक्रोस्कोप संरेखण को प्रभावित कर सकते हैं।
  3. फोकस में अच्छी तरह से अंदर तरल ड्रॉप (नीचे से 10-100 माइक्रोन) रखें।
  4. "मापन" विंडो में, "अधिग्रहण" टैब का चयन करें। प्रेस "पदों" के तहत "मौजूदा स्थिति" (चित्रा 1 में खिड़की सेल्सियस)।
  5. एक ही विंडो में "सिस्टम विन्यास" टैब पर लौटें। एक उच्च पी सेटहरे रंग की लेजर के लिए ower।
    नोट: एक उच्च शक्ति लेजर saturating शक्ति (यानी, फ्लोरोसेंट संकेत रैखिक वृद्धि नहीं करता है, तो लेजर शक्ति आगे बढ़ जाती है) को दर्शाता है। लगभग 1 प्रणाली मेगावाट बिजली सेटिंग्स, या अधिकतम लेजर शक्ति के 5-10%, आमतौर पर पर्याप्त है।
  6. दबाकर संकेत की स्थिरता परीक्षण "प्रारंभ।" इस समय का पता लगाने और वर्तमान माप के लिए autocorrelation वक्र प्रदर्शित एक अलग विंडो खुल जाएगा। जाँच करें कि फ्लोरोसेंट संकेत समय के साथ, उच्च स्थिर है, और किलोहर्ट्ज़ के बजाय हर्ट्ज रेंज में दिखा उतार-चढ़ाव।
  7. "मापन" विंडो में "हे समायोजित करें" बटन का चयन करें। अगर सही पता लगाने के चैनल (Ch1 या CH2) का चयन किया जाता है की जाँच करें। प्रेस "AutoAdjust एक्स" जिसके परिणामस्वरूप वक्र एक स्पष्ट अधिकतम प्रदर्शित नहीं करता है, तो या अधिकतम किनारे पर है, फिर "मोटे" विकल्प और प्रेस "AutoAdjust एक्स" निशान। जब एक्स-दिशा में जिसके परिणामस्वरूप स्क्रीन समाप्त हो गया है, एसए करनाY के लिए मुझे "AutoAdjust वाई" दबाने से
  8. का समायोजन एक्स और वाई के बीच "मोटे" और वैकल्पिक डी-चयन दबाने "AutoAdjust" जब तक दोनों स्पष्ट Maxima है और मूल्यों मापन के बीच नहीं बदल रहे हैं के द्वारा।
  9. कोशिकाओं को दो अलग अलग fluorophores के साथ लेबल रहे हैं, तो एक कक्ष जहां लाल fluorophore समाधान जोड़ा गया है के लिए कदम। लाल लेजर के लिए एक उच्च शक्ति लेजर का चयन करें और दोहराने लाल उत्तेजना और पता लगाने के चैनल के लिए कदम 4.6-4.8।
    नोट: एक्स और वाई मूल्यों सिस्टम में चैनलों जहां केवल एक पिनहोल दोनों का पता लगाने के चैनलों के लिए प्रयोग किया जाता है के बीच भटक जाते हैं, मध्यवर्ती मूल्यों का चयन करें और परिवर्तनों को स्वीकार करने के लिए ठीक दबाएँ। इधर, एक्स = 79 और वाई = 189 पर Maxima के साथ 488 एनएम लेजर और एक्स = 80 और वाई = 188, मूल्यों एक्स = 80 और वाई = 189 पर Maxima के साथ 633 एनएम लेजर के लिए चयन किया गया था। 488 एनएम या 633 एनएम से उत्साहित fluorophores के साथ लेबल दो एंटीबॉडी की उत्तेजना के लिए 488 एनएम और 633 एनएम लेज़रों के संयोजन, एक अच्छा विकल्प है क्योंकियदि उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 2 ओवरलैप नहीं पार बात के लिए जोखिम कम से कम है।

5. उपाय फ्री Fluorophore के पारगमन समय

नोट: एक ज्ञात प्रसार गुणांक के साथ एक fluorophore का ध्यान केंद्रित (TauD) के माध्यम से पारगमन समय निर्धारित करने, पता लगाने के वॉल्यूम के आकार, और इसलिए कोशिका झिल्ली कि ध्यान के भीतर है के क्षेत्र की गणना की जा सकती है। TauD की गणना कदम 7.2 में वर्णित है।

  1. पिनहोल समायोजन के लिए इस्तेमाल एक ही समाधान का प्रयोग, "मापन" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की सी) में "अधिग्रहण" टैब के अंतर्गत 30 सेकंड एक्स 2 दोहराता के लिए अधिग्रहण के समय निर्धारित किया है।
  2. "मापन" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की बी) में पर "शुरू" पर क्लिक करके एक माप की शुरुआत करें।
    1. प्रत्येक उत्तेजना लेजर और समाधान में इसी fluorophore, के लिए एक लेजर शक्ति श्रृंखला प्रदर्शन पर या निकट शुरूबिजली saturating और प्रत्येक माप के लिए आधे से कम हो। "मापन" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की सी) के 'सिस्टम विन्यास "टैब में लेजर शक्ति बदलें। एक माप शुरू करने के लिए "शुरू" बटन दबाएँ।
      नोट: कम रेंज में आगामी सेल मापन के लिए लेजर शक्ति शामिल हैं (जैसे, 16, 8, 4, और 2 μW सत्ता पर मापने, उद्देश्य से पहले) 20। लेजर प्रणाली सेटिंग्स उत्पादन उत्तेजना से सामान्य उच्च में हैं और माइक्रोस्कोप और संरेखण की गुणवत्ता के आधार पर काफी हद तक भिन्न हो सकते हैं। इस प्रणाली में, ऊपर बिजली रेंज लगभग 60-500 प्रणाली सेटिंग्स की μW शक्ति से मेल खाती है। यह उद्देश्य से पहले पहली बार एक नया माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है बिजली उत्पादन को मापने के लिए एक बिजली मीटर का उपयोग करने की सलाह दी है। लेजर की वर्तमान अधिकतम शक्ति "मापन" खिड़की का "जानकारी" बटन के नीचे पाया जाता है।
    2. नीचे तिल प्रति मायने रखता लिखेंcule (सीपीएम, इकाई: किलोहर्ट्ज़) प्रत्येक लेजर शक्ति माप से।
    3. दो का पता लगाने के चैनलों का इस्तेमाल कर रहे हैं, खिड़की पार बात के लिए autocorrelation वक्र प्रदर्शित की जाँच करें। एक समाधान केवल हरी fluorophores लाल का पता लगाने के चैनल में पता चला एफसीएस autocorrelation और केवल लाल fluorophores के साथ एक समाधान हरी पता लगाने के चैनल में पता लगाने का आकलन करने के उपाय करने के लिए युक्त प्रयोग करें। अंगूठे का एक नियम के रूप में, सीपीएम "गलत" उचित fluorophore से विशिष्ट संकेत के 5% से नीचे fluorophore से पता चला रखने के लिए।
    4. जाँच करें कि मानों लेजर का इस्तेमाल किया शक्ति के साथ रैखिक पैमाने। उच्चतम लेजर सत्ता में सीपीएम की संतृप्ति (यानी, थोड़ा कम मूल्यों एक रेखीय रिश्ते से उम्मीद की तुलना में) स्वीकार्य है।
      ध्यान दें: सीपीएम लगभग सभी माइक्रोस्कोप सिस्टम और आम fluorophores के लिए उच्चतम लेजर शक्ति के लिए अच्छी तरह से 10 से ऊपर होना चाहिए और संवेदनशील प्रणालियों के लिए काफी अधिक हो सकता है। पहली बार एक नव संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है, एक प्रदर्शनएंटीबॉडी के एफसीएस माप स्वतंत्र रूप से समाधान में diffusing उम्मीद सीपीएम यों की। माप करने से पहले, कोट पॉलीथीन ग्लाइकोल कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (0.5 मिलीग्राम पीबीएस में / एमएल पतला) के साथ grafted पाली एल लाइसिन के 200 μl के साथ माप चैम्बर। एक pipet के साथ तरल निकालें और शुष्क हवा चैम्बर अनुमति देते हैं। शेयर फ्रीजर में (अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए) फ्रिज में समाधान और पाउडर शेयर बचाओ। माइक्रोस्कोप पर, 1-10 माइक्रोग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर के लिए एंटीबॉडी पतला। का पालन 4.2-4.4 और इस प्रोटोकॉल में 6.7 कदम। सतह एक गैर छड़ी समाधान के साथ लेपित नहीं है, तो एंटीबॉडी कांच की सतह के साथ बातचीत करेंगे और तेजी से समाधान से समाप्त हो जायेंगे।

6. सेल माप

  1. एंटीबॉडी लेबल सेल निलंबन (1.5 कदम) और एक 8 अच्छी तरह से संभाग coverglass स्लाइड में से एक अच्छी तरह से पारदर्शी रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम 1640 (RPMI) के 150 μl से पीबीएस + 1% एफसीएस में कोशिकाओं के 125 μl जोड़ें। Leएफसीएस माप शुरू करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए माप तापमान पर अंधेरे में कोशिकाओं AVE।
    नोट: यह बसा है और कुओं की तह तक देते हैं और माप तापमान के लिए कोशिकाओं और समाधान संतुलित करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति है।
  2. "स्कैन नियंत्रण" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की बी) में, जूम 1 सेट और "फास्ट XY" बटन दबाने से एक तेजी से XY स्कैन शुरू करते हैं। लेजर शक्ति को संशोधित इतना है कि यह संभव के रूप में के रूप में कम है, जबकि कोशिकाओं को अभी भी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। औसत चमक, जहां झिल्ली स्पष्ट रूप से परिभाषित किया गया है और वहाँ कोशिका द्रव्य में कोई फ्लोरोसेंट संकेत है की एक दौर सेल पर छवि केन्द्र। में ज़ूम जब तक सेल छवि के सबसे शामिल हैं।
  3. एक नया सेल का चयन करता है, तो वर्तमान सेल extrusions, या अत्यंत उज्ज्वल धब्बे बढ़ रहा है या प्रदर्शित करता है tendrils। सभी कोशिकाओं को एक ही प्रयोग के दौरान कब्जा के लिए एक ही जूम और लेजर शक्ति रखें।
    नोट: एक झालरदार झिल्ली भी आगामी एपीओ का संकेत हो सकता हैवर्त्मपात।
  4. कोशिका झिल्ली के शीर्ष पर ध्यान दें। "मापन" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की सी) के 'अधिग्रहण' टैब में, सक्रिय द्वारा एफसीएस माप के लिए एक स्थान का चयन करें "Crosshair।" वैकल्पिक रूप से, "एल एस एम छवि" टैब का चयन एल एस एम छवि में चाहता था माप स्थान चिह्नित, और प्रेस "की स्थिति में जोड़ें।"
    नोट: कोशिका झिल्ली के शीर्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी या fluorophores unspecifically पाली एल लाइसिन के लिए बाध्य से प्रभावित नहीं किया जाएगा। हालांकि, यह पता लगाना है कि सेल माप के दौरान कदम नहीं है (परिणाम देखें) महत्वपूर्ण है।
  5. "मापन" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की सी) के 'अधिग्रहण' टैब में, "उपाय टाइम" दोहराने प्रति 10 सेकंड पर सेट के साथ, 6-10 को दोहराता की संख्या निर्धारित किया है।
  6. "मापन" खिड़की के "सिस्टम विन्यास" टैब पर लौटें। 'एल के तहत एफसीएस माप के लिए लेजर बिजली समायोजित करेंaser "बटन। उद्देश्य से पहले, कम बिजली की सेल मापन के लिए, 1 और 10 μW 20 के बीच सीमा में उपयोग करें।
    नोट: सिफारिश मूल्यों संकेत का पता लगाने और कोशिकाओं को photodamage के बीच एक व्यापार बंद कर रहे हैं। देखें कदम 5.2.1 नोट लेजर शक्ति का प्रतिशत इन मूल्यों के अनुरूप हैं।
  7. "मापन" खिड़की (विंडो सी) में "प्रारंभ" दबाने से एक एफसीएस माप शुरू। अगर सेल bleaches काफी माप की शुरुआत में, के रूप में (एक उदाहरण चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, कम पैनल) के पहले 10 सेकंड के दौरान अधिक से अधिक 30% द्वारा तीव्रता का पता लगाने में एक बूंद से पता लगाया है, एक और सेल और कम करने के लिए कदम भविष्य के मापन के लिए लेजर शक्ति।
    1. संकेत खो दिया है, जेड दिशा में ध्यान समायोजित। माप पूर्ण होने पर, जांच करने के लिए है कि सेल अभी भी केंद्रित है और उस कोशिका झिल्ली मापा गया था "स्कैन नियंत्रण" खिड़की (चित्रा 1, खिड़की बी) का उपयोग करें। यदिई सेल ले जाया गया है, माप त्यागें।
    2. ऑटो सहसंबंध खिड़की जहां माप प्रदर्शित किया जाता है, मैन्युअल व्यक्ति को दोहराता है कि जूमिंग युद्धाभ्यास, विरंजन, बड़े समूहों, या अन्य कलाकृतियों (चित्रा 3 में उदाहरण देखें) हैं जिनमें हटाएँ। , उन्हें चिह्नित राइट क्लिक करके, और चुनने से यह मत करो "हटाएँ।" .fcs प्रारूप में अंतिम फ़ाइल सहेजें। सेल के अनुसार कम से कम चार दोहराता बचाओ।
  8. वैकल्पिक रूप से, "स्कैन नियंत्रण" विंडो का उपयोग कर मध्यम वर्ग (झिल्ली दिखाई की संपूर्ण परिधि के साथ) पर सेल की एक छवि अधिग्रहण। एफसीएस माप के बाद छवि पर कब्जा विरंजन से बचने के लिए। छवि पर कब्जा शुरू करने के लिए "सिंगल" बटन दबाएँ।
  9. का उपयोग कर एफसीएस फोकस स्थिति के लिए "स्थिति" जोड़ें, तो क्लिक करें अगले सेल पर जाने से पहले "स्थिति निकालें"।
  10. माप की 2 घंटा की अधिकतम बाद सेल निलंबन की एक नई विभाज्य के लिए परिवर्तित कोशिकाओं व्यवहार्य throughou रखने के लिएप्रयोग टी।

7. एफसीएस विश्लेषण

  1. वक्र ढाले क्षमता के साथ एक सॉफ्टवेयर में .fcs फ़ाइलें खोलें (इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के लिए देख सामग्री / अभिकर्मकों तालिका)।
    नोट: एफसीएस सॉफ्टवेयर है कि माइक्रोस्कोप के साथ आता है बुनियादी फिटिंग के साथ परिचित बनने के लिए एक अच्छी जगह है, लेकिन अतिरिक्त सॉफ्टवेयर दो आयामी झिल्ली प्रसार फिट करने के लिए आवश्यक है।
  2. सबसे पहले, मुक्त fluorophore माप का विश्लेषण करके उत्तेजना वॉल्यूम के आकार का निर्धारण। Autocorrelation घटता 21 के लिए एक 3-आयामी मुक्त प्रसार वक्र फिट।
    समीकरण (Eq। 1)
    नोट: मापदंडों के परिभाषा: एन: सहसंबंध समय, τ डी (TauD): फोकल मात्रा τ (ताऊ) में फ्लोरोसेंट संस्थाओं की संख्या मतलब फोकल मात्रा में औसत निवास समय, टी 1: fluorophores के लिए संभाव्यता में होना त्रिक राज्य, τ <उप> टी: स्वेटर-त्रिक राज्य बदलाव के लिए विश्राम का समय, एस: ऊंचाई के अनुपात व्यास फोकल मात्रा के लिए चौड़ाई के लिए।
    1. TauD, पारगमन समय अणुओं फोकस हस्तांतरण करने के लिए निकालें।
    2. पिनहोल त्रिज्या (ω) की गणना करने के लिए प्रयोग करें अंशांकन 18, 19 के लिए इस्तेमाल किया fluorophores की मनाया TauD और प्रकाशित प्रसार गुणांक (डी)।
      समीकरण (Eq। 2)
  3. कोशिका झिल्ली पर autocorrelation घटता का विश्लेषण।
    1. वक्र आणविक प्रसार का प्रतिनिधित्व करने का हिस्सा कल्पना करने के लिए, समय सीमा autocorrelation वक्र के तेज ढलान से पहले शुरू करने और 1 पर वक्र समानता के बाद समाप्त चयन (जैसे, 5 सेकंड murine सतह रिसेप्टर्स के लिए 0,001, चित्रा 4 देखें)।
    2. व्यक्ति को बचाया मैं दोहराता की औसत autocorrelation वक्र उत्पन्नn कदम 6.7.2।
    3. एक 2-आयामी झिल्ली प्रसार वक्र प्रत्येक में औसतन करने के लिए 3 समीकरण 3 का उपयोग autocorrelation वक्र फिट।
      समीकरण (Eq। 3)
      नोट: एन उत्साहित झिल्ली क्षेत्र के भीतर रहने वाले अणुओं की औसत संख्या है: महत्वपूर्ण उत्पादन मानकों इस प्रकार हैं। घनत्व (एन / माइक्रोन 2) को पुनर्गणना। τ डी (TauD): फोकल क्षेत्र में औसत निवास समय, झिल्ली (एस) के दो-आयामी द्वारा प्रतिबंधित। एक प्रसार गुणांक (माइक्रोन 2 / सेक) निर्धारित पिनहोल त्रिज्या (ω) और समीकरण 2. T1 के माध्यम से करने के लिए पुनर्गणना औसत निवास समय fluorophores त्रिक राज्य में होने के लिए संभावना है। चमक (सीपीएम) एन द्वारा माप की औसत समग्र तीव्रता को विभाजित करके गणना की है
    4. एक अच्छी फिट पहली कोशिश पर हासिल नहीं है, तो, थी जब तक चर के लिए शुरू मूल्यों और / या ऊपरी और निचले सीमा बदलनेएस हासिल की है।
      नोट: प्राथमिक कोशिका झिल्ली में प्रोटीन प्रसार की दर के लिए विशिष्ट ऊपरी निचले सीमा TauD के लिए 10-500 मिसे, T1 के लिए 0-100%, और TauT1 के लिए 0.1-5 मिसे हैं। इन अंतराल के बीच में फिटिंग के लिए मूल्यों को शुरू करने का चयन करें। वक्र प्रसार से निकाली गई आम तौर पर 1 मिसे और 1 सेकंड के बीच स्थित है प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव का प्रतिनिधित्व करने के हिस्से (चित्रा 4 देखें)। fluorophore पर निर्भर करता है, वहाँ कभी कभी, एक दूसरे की प्रक्रिया उपस्थित होने के प्रसार पैरामीटर की तुलना में कम समय के तराजू पर autocorrelation को जन्म देने के कर सकते हैं। यह (अक्सर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए होते हैं) के रूप में एक क्षणिक अंधेरे राज्य (त्रिक) या निमिष के कारण होता है। एक triplet राज्य 3 समीकरण के लिए जिम्मेदार है, और इस प्रकार प्रस्तुत मॉडल भी इन स्थितियों में एक अच्छा फिट प्रदान करना चाहिए।

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Representative Results

एक ठेठ परिणाम झिल्ली प्रोटीन के लिए 400 मिसे के लिए 10 मिसे की रेंज में एक पारगमन समय के साथ एक autocorrelation की अवस्था उत्पन्न होगा। अणुओं की संख्या endogenously व्यक्त प्रोटीन के लिए लगभग 200 माइक्रोन 2 प्रति 0.5 के बीच भिन्न हो सकते हैं। ध्यान से जाँच करें कि सीपीएम कम से अधिक की उम्मीद नहीं है। यह मतलब हो सकता है पृष्ठभूमि संकेत का एक प्रभाव है कि वहाँ। अंगूठे का एक नियम के रूप में, कोशिकाओं पर सीपीएम संकेत है कि विश्लेषण के लिए स्वीकार कर लिया है सीपीएम की तुलना में कम 33% स्वतंत्र रूप से एक ही लेजर शक्ति पर एंटीबॉडी diffusing के लिए नहीं होना चाहिए। सीपीएम लेजर शक्ति के साथ रैखिक पैमाने चाहिए। प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के लिए autocorrelation वक्र 0,001 और 1 सेकंड के बीच तेज भाग के साथ, चिकनी होने की उम्मीद है। एक प्रतिनिधि autocorrelation वक्र और अपने समय का पता लगाने के लिए चित्र 2 देखें।

के रूप में शुरूआत में संक्षेप में उल्लेख किया है,फिर कई मामलों में जहां एफसीएस प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव के अन्य स्रोतों, जो संकेत confounding करने के लिए योगदान के प्रभाव के कारण आणविक प्रसार मापने के लिए उपयुक्त नहीं है। चित्रा 3 मामलों में एक विशेष सेल या माप दोहराने खारिज किया जाना चाहिए का उदाहरण दिखाता है। यह पहले से ही उल्लेख किया गया है कि एक अत्यंत कम संकेत (बहुत कम सीपीएम) सेल को खारिज करने का कारण है। अलग-अलग सेल discarding के लिए एक और कारण यह है कि सेल (चित्रा 3 ए) बढ़ रहा है। विरंजन के मामले (चित्रा 3 बी) या बड़े समूहों मौजूद हैं (चित्रा -3 सी) में, माप अगर प्रभाव काफी या पूरे माप भर में मौजूद है खारिज किया जाना चाहिए। इस सुविधा के लिए एक या दो दोहराता में ही मौजूद है, तो इन व्यक्तिगत दोहराता खारिज किया जा सकता है, लेकिन शेष दोहराता अभी भी प्रयोग किया जा सकता है।

यह महत्वपूर्ण है कि दोनों सही उपयोग करने के लिएमॉडल डेटा फिट करने के लिए और भी सावधानी से जांच करने के लिए है कि फिट बारीकी autocorrelation की अवस्था के साथ overlaps। चित्रा 4 में, अच्छे और बुरे की अवस्था फिट बैठता है के उदाहरण दिखाए जाते हैं। वक्र का प्रतिनिधित्व प्रसार (सबसे तेजी से झुका हुआ हिस्सा) के हिस्से के लिए करीब ध्यान देना। यह भी पता लगाना है कि दोनों शुरुआत और वक्र का झुका हुआ भाग के अंत मॉडल के आधार पर अच्छी तरह से फिट हैं महत्वपूर्ण है। फिट बुरा है, इस तरह से चलती है, विरंजन, या समूहों के रूप में, एक अंतिम सेल त्यागने के लिए निर्णय लेने से पहले शुरू मूल्यों और / या ऊपरी और निचले सीमा (एक उचित सीमा के भीतर) को संशोधित स्पष्ट समस्याओं के बिना है।

आकृति 1
चित्रा 1: एफसीएस सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में यहाँ दिखाया गया है, एफसीएस अधिग्रहण और इमेजिंग के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण संचालित करने के लिए आवश्यक मुख्य खिड़कियां हैं। विंडो ए, "विन्यास सहntrol "खिड़की किरण पथ, लेजर चैनलों, और इमेजिंग के लिए फिल्टर के लिए नियंत्रण खिड़की है। खिड़की बी" स्कैन नियंत्रण "इमेजिंग के लिए खिड़की और पता चलता स्कैनिंग सेटिंग। विंडो सी है" मापन "खिड़की, के लिए खिड़की एफसीएस माप सेटिंग्स के सेटअप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एच-डी 2 डी प्रमुख उतक अनुरूपता वर्ग diffusing के प्रतिनिधि ट्रेस और autocorrelation घटता रहा हौसले से पृथक murine एन.के. कोशिकाओं में अणुओं की सतह। आकृति में ऊपरी पैनल 7x 10 सेकंड के माप के पूरे समय का पता लगाने के समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव चलता। कम पैनल का प्रतिनिधित्वइन सात दोहराता से औसतन autocorrelation की अवस्था है। Autocorrelation वक्र की ऊंचाई व्युत्क्रमानुपाती मोबाइल fluorescently की एकाग्रता फोकल मात्रा के भीतर लेबल एच 2 डी डी संस्थाओं के लिए आनुपातिक है। वक्र के ढलान के तेज भाग में एक्स अक्ष मूल्य, आयाम के आधे औसत निवास समय की fluorescently फोकल मात्रा के भीतर एच 2 डी डी अणुओं लेबल का प्रतिनिधित्व करता है। प्रस्तुत माप संदर्भ 2 में प्रकाशित आंकड़ों के सेट का एक हिस्सा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: समस्याग्रस्त सेल निशान के उदाहरण हैं। (ए) एक चलती सेल, ट्रेस एक स्थिर बेसल le नहीं होने के उदाहरण के रूप मेंवेल। शीर्ष पैनल एक उदाहरण है, जहां पूरे सेल के रूप में इस समय बिंदु के बाद बहुत कम संकेत द्वारा प्रतिनिधित्व किया, लगभग 35 सेकंड के बाद ध्यान से बाहर ले जाया गया है पता चलता है। कम पैनल में, प्रभाव कई सेकंड के अंतराल पर स्पष्ट undulations के साथ और अधिक सूक्ष्म है। (बी) सेल विरंजन, ट्रेस समय के साथ कम की ऊंचाई प्रदर्शित। माप के अंत में उस के लिए माप के शुरू में पता लगाने की ऊंचाई की तुलना करें। (सी) बड़े समूहों, ट्रेस में spikes द्वारा प्रतिनिधित्व की उपस्थिति। ऊपरी पैनल में, 20-25 सेकंड में एक बड़े क्लस्टर मौजूद है। कम पैनल में, कई समूहों माप भर में मौजूद हैं। प्रस्तुत माप संदर्भ 2 में प्रकाशित आंकड़ों के सेट का एक हिस्सा हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4: वक्र ढाले और बच के साथ प्रतिनिधि autocorrelation घटता। लाल और नीले रंग की खड़ी रेखा फिटिंग के लिए इस्तेमाल किया समय खिड़की की सीमा प्रतिनिधित्व करते हैं। (ए) एक नमूना autocorrelation वक्र करने के लिए एक 2-आयामी प्रसार मॉडल के एक प्रतिनिधि फिट का उदाहरण है। ऊपरी पैनल में, हरी वक्र (मॉडल), नीला वक्र (अधिग्रहीत autocorrelation) ओवरले एक अच्छा फिट का संकेत है। कम पैनल वक्र ढाले से अवशिष्ट पता चलता है। 1 सेकंड के आसपास उतार चढ़ाव है, जो अच्छी तरह से फिट नहीं हैं, सेल माप के लिए विशिष्ट हैं और संतोषजनक रहे हैं। (बी) एक ही autocorrelation वक्र करने के लिए 2-आयामी प्रसार का एक बुरा फिट का उदाहरण है। फिट मॉडल autocorrelation वक्र उपरिशायी नहीं है, और यह 1 में कम पैनल (ए और बी) वक्र ढाले से अवशिष्ट दिखाने पर एकाग्र नहीं होता। बचबुरा फिट करने के लिए काफी बड़ा है, विशेष रूप से वक्र के प्रसार भाग के लिए कर रहे हैं। प्रस्तुत माप संदर्भ 2 में प्रकाशित आंकड़ों के सेट का एक हिस्सा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

के लिए एफसीएस इस प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं (murine, मानव, या अन्य प्रजाति) के सभी प्रकार पर सतह के अणुओं की आणविक गतिशीलता के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एफसीएस उपायों स्थानिक-सामयिक जीवित कोशिकाओं में एकल अणु संकल्प करने के लिए नीचे आणविक गतिशीलता। आणविक घनत्व, साथ ही ब्याज की प्रोटीन के प्रसार की दर और क्लस्टरिंग गतिशीलता, autocorrelation घटता से निकाला जा सकता है।

फ्लोरोसेंट लेबलिंग सफल एफसीएस प्रयोगों के लिए निर्णायक महत्व का है। कोशिका झिल्ली पर ब्याज के प्रोटीन पारंपरिक रूप से एंटीबॉडी का उपयोग चिह्नित किया गया है, और एंटीबॉडी अक्सर भोले प्रतिरक्षा कोशिकाओं में सतह प्रोटीन पर इस्तेमाल के लिए सबसे सुविधाजनक हैं। बिना लेबल वाले एंटीबॉडी सीधे एक उच्च आणविक चमक के साथ फोटो स्थिर फ्लोरोसेंट रंगों संयुग्मित किया जाना चाहिए। एंटीबॉडी विकार के लिए fluorophore के चयन के माप की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है। से फ्लो के लिए मानक लेबल,ऐसे fluorescein और phycoerythrin आधारित रंगों के रूप में, तेजी से विरंजन की वजह से सिफारिश नहीं कर रहे हैं। एंटीबॉडी के लिए सीधी विकार के लिए फोटो-स्थिर रंगों वर्तमान में कई कंपनियों द्वारा प्रदान की जाती हैं। निर्माताओं आमतौर पर विकार और जिसके परिणामस्वरूप संयुग्मित एंटीबॉडी की शुद्धि के लिए संतोषजनक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और यह कुछ ही घंटों में किया जा सकता है। यह भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए एफसीएस संभव है, लेकिन विशेष देखभाल, लेजर शक्ति को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन सबसे फोटो-स्थिर रासायनिक fluorophores से विरंजन के लिए सामान्य होने का खतरा अधिक कर रहे हैं। पिछले अनुभव के अनुसार, अधिक अभिव्यक्ति प्रोटीन का अक्सर भीड़ के कारण प्रसार दर में काफी कमी है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग अनुपयुक्त बनाता है की ओर जाता है।

पिनहोल अंशांकन माप करने से पहले यह भी एक महत्वपूर्ण कदम है। फोकल वॉल्यूम के आकार का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया fluorophores प्रसार गुणांक नाम से जाना होगाएस (2 समीकरण देखें)। फोकल मात्रा के आकार का निर्धारण करने के लिए स्वतंत्र एंटीबॉडी लेबल के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को बारीकी से इसी fluorophores का प्रयोग करें। इस इष्टतम संकेत दक्षता और रंग चैनलों के बीच संभावित पार सहसंबंध के समुचित पता लगाने आश्वस्त करने के लिए किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रणाली शक्तियों का एक सीमा से अधिक होने की उम्मीद है उत्पादन में संकेत देता है कि स्वतंत्र रूप से diffusing fluorophores के एक एफसीएस लेजर शक्ति श्रृंखला प्रदर्शन। प्रयोगों के बीच एक ही लेजर सत्ता में सीपीएम की तुलना प्रयोगों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए।

विश्लेषण चरण में, जब यह मॉडल फिटिंग चर के लिए उचित पर्वतमाला और शुरुआती मूल्यों डाल करने के लिए आवश्यक है। इसी तरह के सेल प्रणाली से पहले प्रकाशित ज्ञान का उपयोग करें अच्छी शुरुआत अंक खोजने के लिए। सैद्धांतिक रूप से, एफसीएस एक मात्रात्मक तकनीक है, लेकिन जब से इष्टतम स्थितियों शायद ही कभी होती है, सावधानी की एक निश्चित डिग्री जब परिणामों की व्याख्या लिया जाना है। उतार-चढ़ाव के सभी प्रकार के दर्ज हो जाएगा,भले ही इस तरह के उतार-चढ़ाव की उत्पत्ति का। इसलिए, यह आदेश संभव त्रुटि स्रोतों को बाहर करने में प्रायोगिक प्रणाली के बारे में जितना संभव हो उतना जानकारी के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, पूरे कोशिका झिल्ली के आंदोलन जबकि समाधान में मुक्त fluorophores के ख्यात दूषित पदार्थों को कम से कम दस गुना कम TauD साथ फैलाना होगा अब TauD (चित्रा 3) के साथ उतार-चढ़ाव को जन्म देगा।

यह बुनियादी प्रोटोकॉल कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है। दो प्रोटीन विभिन्न fluorophores के साथ लेबल रहे हैं, तो सह-प्रसार (बातचीत का एक अप्रत्यक्ष उपाय) पार से संबंध का पता लगाने के कार्यप्रणाली का विस्तार से आकलन किया जा सकता है। किस हद तक ये प्रोटीन कोशिका झिल्ली में एक दूसरे के लिए बाध्य व्यक्तिगत रंग चैनलों के autocorrelation घटता की ऊंचाई को पार से संबंध वक्र रिश्तेदार की ऊंचाई का प्रतिनिधित्व करती है। पार से संबंध माप सॉफ्टवेयर में Ch1-CH2 रूप में चिह्नित है। पूर्वपार से संबंध का विश्लेषण CISE पार बात के लिए नियंत्रण की आवश्यकता है और इस प्रकार कुछ हद तक यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक जटिल है। कैसे इस बुनियादी प्रोटोकॉल के विस्तार के रूप में आगे बढ़ने के लिए, का एक विस्तृत विवरण, Strömqvist एट अल में पाया जा सकता है। 13। जेड दिशा में स्थिति का अनुकूलन करने के लिए, जेड स्कैनिंग एफसीएस 22 का इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले अनुभव के अनुसार, यह इस मैन्युअल रूप से करना संतोषजनक रहा है। यह भी एक एफसीएस autocorrelation वक्र 23 करने के लिए कई प्रसार गुणांक फिट करने के लिए संभव है। यह अलग प्रसार दर के साथ और उप-जनसंख्या का कम से कम एक की अनुमानित प्रसार की दर की उप-जनसंख्या की संख्या के पिछले ज्ञान की आवश्यकता है। अन्यथा, वहाँ भी कई मुफ्त चर, जो फिटिंग अविश्वसनीय प्रस्तुत करना होगा। एक विशिष्ट उदाहरण एक सतह प्रोटीन जिसका प्रसार दर काफी एक ligand के बंधन से धीमा है होगा। अंत में, cleaniपूरी तरह से हटाने के बिना दोहराता outliers का पता लगाने एनजी संभव 24 है।

एक फ्लोरोसेंट संकेत की कमी एक आम समस्या निवारण करने के लिए है। स्वतंत्र रूप से fluorophores diffusing के लिए, यदि बूंद फ्लोरोसेंट है की जाँच करने के लिए हैलोजन लैंप का उपयोग करें। बूंद फ्लोरोसेंट नहीं है, तो एक थोड़ा बढ़ा एकाग्रता (एनएम सीमा के भीतर) के साथ fluorophores का एक नया बैच मिश्रण है और फिर कोशिश करें। जाँच करें कि फोकस है फ्लोरोसेंट बूंद के भीतर, लेज़रों पर सॉफ्टवेयर में बदल रहे हैं, लेजर शक्ति के लिए पर्याप्त है, सही उत्सर्जन फिल्टर और डिटेक्टरों चुना जाता है, और "एफसीएस मापन" विंडो में सही चैनल सक्रिय कर रहे हैं (कदम देखना 3.6)। लेजर शुरू करो और देखो की ओर से नेत्रहीन पुष्टि करने के लिए है कि लेजर प्रकाश नमूना पहुंचता है। सीधे लेजर स्रोत की जांच कर रहा से बचें। चुने गए उत्सर्जन फिल्टर लेजर तरंग दैर्ध्य शामिल हैं, एक शटर स्वतः डिटेक्टर को होने वाले नुकसान से बचने के लिए प्रकाश पथ रोकेंगे। मैंएफ सभी सेटिंग्स ठीक हैं, लेकिन कोई प्रकाश, आता लेजर, एफसीएस प्रणाली, और कंप्यूटर को फिर से शुरू करते हैं। एक विशेषज्ञ से पूछें कि एक फ्लोरोसेंट संकेत की कमी बनी रहती है। यदि लेबल की कोशिकाओं प्रतिदीप्ति प्रदर्शित नहीं करते एक सरलीकृत प्रक्रिया लागू होता है। हैलोजन लैंप के साथ प्रतिदीप्ति की उपस्थिति की पुष्टि; लेज़रों पर बारी लेजर चैनलों का चयन करें, और लेजर बिजली समायोजित करें। कोशिका झिल्ली पर एक स्थान का चयन करें, या तो "Crosshair" या "स्थिति को जोड़ने" विकल्प (कदम 6.4 देखें) का उपयोग। अगले नमूना करने के लिए स्विच यदि संकेत अभी भी बहुत कम है।

तकनीक के उतार-चढ़ाव के आधार के एक महत्वपूर्ण पहलू अणुओं यथोचित पता लगाया जा करने के लिए मोबाइल होना जरूरी है। बहुत धीरे धीरे अणुओं या पूरे माप समय के दौरान ध्यान केंद्रित करने की तुलना में छोटे क्षेत्रों के भीतर फंस अणुओं के भागों चलती इसलिए नहीं मापा जा सकता। इस सतह घनत्व के संभावित मूल्यवान समझना और प्रसार दर के एक overestimation की ओर जाता है। ब्लीचिंगइसके अलावा, दोनों घनत्व और TauD की एक ख्यात मूल्यवान समझना के लिए योगदान कर सकते हैं के बाद से अणुओं अब समय वे लेजर प्रबुद्ध फोकल मात्रा में खर्च किया जा रहा प्रक्षालित की संभावना अधिक होगा। पृष्ठभूमि (फोकल हवाई जहाज़ के बाहर से प्रतिदीप्ति) से प्रभाव, दूसरे हाथ पर, कृत्रिम रूप से पता लगाया अणुओं की संख्या बढ़ाने के लिए और मापा सीपीएम कम होगा। इससे पहले, पूर्ण घनत्व निर्धारण में कुल अधिकतम त्रुटि% 20 40 के आसपास होने का अनुमान था। हालांकि, यह आम तौर पर एक-दूसरे से अलग जैविक नमूने की तुलना करने के लिए संभव है, के बाद से त्रुटि के सूत्रों का कहना है ज्यादातर मामलों में, कर रहे हैं, प्रयोगों भर में बराबर। एक अन्य संभावित त्रुटि स्रोत है कि एंटीबॉडी द्विसंयोजक कर रहे हैं, जिसका अर्थ है कि प्रत्येक एंटीबॉडी संभवतः दो लक्ष्य अणुओं के लिए बाध्य कर सकते हैं। लेखक इस घटना का पालन नहीं किया था, लेकिन यह गारंटी नहीं किया जा सकता है कि यह अन्य एंटीबॉडी के लिए एक वैश्विक सुविधा है। bivalence की क्षमता को प्रभावित करना चाहिएइसलिए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया। विशिष्ट प्राथमिक और लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन कभी नहीं लगातार दो द्विसंयोजक लेबल से कृत्रिम समूहों उत्प्रेरण के उच्च जोखिम की वजह से इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कोशिकाओं के बजाय ब्याज की प्रोटीन की फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल संस्करणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है, हर प्रोटीन केवल एक लेबल होगा। हालांकि, इस अभिकर्मक की आवश्यकता है, जो हमेशा वांछनीय नहीं है और नहीं भी संभव हो सकता है (उदाहरण के लिए, सीधे मानव रक्त से अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं का उपयोग करते हैं)। अंत में, एकल बिंदु एफसीएस छवियों रिकॉर्ड नहीं है। छवियों प्रकाशन या अन्य प्रयोजनों के लिए आवश्यक हैं, इन अलग से सॉफ्टवेयर की इमेजिंग भाग का उपयोग कर कब्जा कर लिया जाना चाहिए। हमेशा कोशिका की सतह के अनावश्यक विरंजन से बचने के लिए एफसीएस माप के बाद छवियों पर कब्जा।

विपरीत एफसीएस, इस तरह के रूप में पारंपरिक FRAP confocal माइक्रोस्कोपी आधारित, और छवि सह-संबंध के तरीके प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव यों नहीं कर सकतेएकल अणु के स्तर 6 पर। छवि सहसंबंध के तरीके में परोक्ष रूप से और कम संकल्प के साथ अणुओं की संख्या को मापने, लेकिन वे पूरे imaged क्षेत्र में 25 से अधिक आणविक प्रसार और क्लस्टरिंग की परिवर्तनशीलता का आकलन कर सकते हैं। स्टैंडर्ड SPT confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है, परिमाण से एफसीएस 7 कम के आदेश लेबलिंग का एक आदर्श स्तर है। इसलिए, लेबल प्रोटीन का घनत्व मानक SPT से नहीं मापा जा सकता है। अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ SPT का संयोजन (जैसे, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी या photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) घनत्व और आंदोलन का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है, लेकिन यह बहुत ही विशेष रंगों या प्रोटीन 11 की आवश्यकता है। इस तरह, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी और उत्सर्जन समाप्त उत्तेजित माइक्रोस्कोपी अक्सर तय की आवश्यकता नमूने और प्राथमिक का एक संयोजन और labelin के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में सुपर संकल्प तकनीक,जी 26। स्थानीयकरण जबकि प्रणाली की गतिशीलता अक्सर मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है, बहुत ही सटीक इसलिए है। SPT और सुपर संकल्प तकनीक की तुलना में, एफसीएस भी विश्लेषण और परिणाम की निकासी के लिए काफी कम कंप्यूटर शक्ति और समय की आवश्यकता है। प्रवाह cytometry इम्यूनोलॉजी के workhorse है और कृपापूर्वक साथ एफसीएस जोड़ा जा सकता है। सेल छंटनी, उदाहरण के लिए, अगर तस्वीर स्थिर रंगों छँटाई करने से पहले इस्तेमाल किया गया था चयनित कक्ष आबादी पर बाद में माप के द्वारा पीछा किया जा सकता है। एफसीएस इस प्रकार एक पद्धति है कि अकेले या संयोजन में अन्य तरीकों की स्थापना के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल एकल अणु के स्तर पर कोशिका झिल्ली के भीतर प्रतिरक्षा सेल गतिशीलता और बातचीत के वर्तमान में अज्ञात सुविधाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, चयनित सबसेट बनाम पूरी आबादी की सुविधाओं तुलना में किया जा सकता है। यह भी प्रतिरक्षा सेल थेरेपी के लिए एक चयन कदम के रूप में एक संभावित भूमिका है। चूंकि माप करनासेल नहीं उपभोग, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कार्यक्षमता की जांच के लिए सबसे अन्य विधियों के विपरीत, व्यक्तिगत कोशिकाओं संभावित बरामद किया और संवर्धित किया जा सकता है। इस प्रकार, एफसीएस घटता के विश्लेषण के बाद, होनहार कोशिकाओं निकाले और ख्यात नैदानिक ​​अनुप्रयोगों सहित अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

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Acknowledgements

हम जीस Confocor 3 साधन के रखरखाव के लिए और सेल माप के बारे में उपयोगी टिप्स के लिए डॉ Vladana Vukojevic, आण्विक चिकित्सा के लिए केंद्र, कारोलिंस्का Institutet धन्यवाद। इस अध्ययन Vetenskapsrådet से अनुदान (अनुदान संख्या 2012 1629), मैगनस Bergvalls stiftelse, और Stiftelsen क्लेस Groschinskys minnesfond से द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II Miltenyi Biotec NordenAB 130-096-892 Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum Sigma-Adlrich F7524 Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline - - Made in house 
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 PAA The Cell Culture Company  E15-848 Transparent medium
Antibody clone 2.4G2 Thermo Fischer Scientific 553140 For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody  Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody  BD Pharmingen 558915 Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488 Mobiotech MFP-A2181 Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) SuSoS AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride Sigma-Aldrich 432202 Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A20006 Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope  Zeiss LSM510
Software: Confocor 3 Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox Matlab Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo-scientific  155411 8 wells, 1.0 borosilicate bottom

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References

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