Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Immunology and Infection

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Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (120), e54756, doi:10.3791/54756 (2017).

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Abstract

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica poderosa para o estudo da difusão de moléculas dentro de membranas biológicas com elevada resolução espacial e temporal. FCS pode quantificar a concentração e coeficiente de difusão molecular de moléculas marcadas fluorescentemente na membrana da célula. Esta técnica tem a capacidade de explorar as características de difusão molecular de moléculas na membrana plasmática de células do sistema imunológico em estado estacionário (isto é, sem processos que afectam o resultado durante o tempo de medição real). FCS é adequado para o estudo da difusão de proteínas que são expressas em níveis típicos para mais proteínas endógenas. Aqui, um método simples e robusto para determinar a taxa de difusão de proteínas da membrana celular em linfócitos primários é demonstrada. Uma forma eficaz de realizar medições em células vivas marcadas com o anticorpo e observações que ocorrem comumente após a aquisição são descritos. Os avanços recentesno desenvolvimento de corantes fluorescentes foto-estável pode ser utilizada através da conjugação dos anticorpos de interesse de se apropriar corantes que não lixívia extensivamente durante as medições. Além disso, esta permite a detecção de entidades difundem-se lentamente, o que é uma característica comum de proteínas expressas em membranas celulares. O procedimento de análise para extrair parâmetros de concentração e difusão molecular a partir das curvas de autocorrelação gerados é realçado. Em resumo, um protocolo de base para medições de FCS é fornecida; ele pode ser seguido por imunologistas com uma compreensão de microscopia confocal, mas com nenhuma outra experiência anterior de técnicas para a medição de parâmetros dinâmicos, tais como taxas de difusão molecular.

Introduction

Muitas funções células imunitárias dependem de difusão molecular e interacções dentro de membranas. As membranas biológicas são complexas, e muitos factores que podem ser importantes para a função de células imunes pode influenciar a velocidade de difusão de translação de proteínas dentro das membranas celulares 1. Recentemente, mostrou que as células assassinas naturais (NK), os linfócitos que pertencem ao sistema imune inato, exibem difusão diferencial de duas proteínas estudadas na membrana celular, dependendo do estado de activação da célula NK 2.

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica que é capaz de quantificar as taxas de difusão molecular dentro de membranas biológicas. Ela reporta a taxa média de difusão de moléculas marcado por fluorescência em um volume fixo, tipicamente o foco de um microscópio confocal. Ele baseia-se na medição das flutuações em fluorescência que ocorre quando do movimento molecular emum sistema em estado estacionário. FCS tem sido amplamente utilizada para o estudo da difusão de corantes fluorescentes e de proteínas, tanto em solução como em membranas lipídicas. Outros parâmetros de saída afectam a taxa de difusão também pode ser indirectamente estudada dessa forma (por exemplo, mudanças de conformação das proteínas ou interacções das moléculas em membranas celulares) 3, 4. FCS se destaca em comparação com outras técnicas, devido à sua alta sensibilidade, permitindo a possibilidade de detecção de uma única molécula. Ele funciona bem para concentrações moleculares na gama nanomolar a milimolar, o que é típico para os níveis de expressão endógenos da maioria das proteínas 5. Além disso, FCS pode dar uma aproximação do número absoluto de proteínas dentro do volume estudadas, enquanto a maioria das outras técnicas só dão informação relativa sobre os níveis de expressão da proteína. Outros métodos para medir as taxas de difusão molecular em membranas incluem fluorecuperação rescência após a fotodegradação (FRAP), rastreamento única partícula (SPT), múltiplos pinhole FCS, e correlação imagem métodos. Métodos FRAP e correlação de imagem são técnicas de ensemble, que geralmente não dão informações sobre o número absoluto de moléculas 10. Comparado a SPT, a taxa de transferência de FCS é maior em relação à caracterização da média da população. A análise também é menos exigente desde que a taxa média de difusão das moléculas presentes no foco do laser é medido, em vez da taxa de moléculas individuais. Além disso, a menos que microscópios especializados estão disponíveis 11, SPT não pode dar qualquer informação sobre as concentrações, uma vez que a rotulagem padrão SPT deve ser muito baixa para permitir a identificação de moléculas individuais. Por outro lado, exige que as moléculas de FCS em estudo a ser móvel. Ele simplesmente não vai detectar eventuais frações ou moléculas imóveis putativos se movendo muito lentamente. A taxa de difusão das moléculas queresidir no foco mais do que cerca de um décimo do tempo de aquisição não serão correctamente representada nas medições FCS 3, 12. Portanto, coeficientes de difusão gravadas por FCS tendem a ser mais rápido do que as taxas de difusão relatados a partir de técnicas como FRAP e SPT, onde as frações próxima do imóvel e muito lentas são levados em conta também. SPT também dará uma descrição mais pormenorizada da variação das taxas de difusão dentro da população molecular de FCS.

FCS quantifica a flutuação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo dentro do volume animado. No caso das medições de membrana, isto traduz-se na área iluminada da membrana. Neste trabalho, nós utilizamos o fato de que essas flutuações são induzidas por moléculas que exibem difusão browniano e são, assim, mover dentro e fora do volume de excitação. Há também várias outras fontes possíveis para o fluctuações no sinal de fluorescência, tais como a piscar ou a presença de um estado tripleto nas fluoróforos, os efeitos ambientais, de ligação-unbinding do ligando, ou movimento da membrana da célula inteira. Estas fontes de erro putativos precisam ser levados em consideração ao projetar um experimento FCS, a fim de interpretar com precisão os resultados 12, 13. Normalmente, as taxas de difusão lateral em membranas biológicas são baixos devido à aglomeração e interações, tanto entre as proteínas da membrana e entre proteínas e citoesqueleto. Historicamente, a utilização de FCS em membranas tem sido, assim, dificultada pela falta de fluoróforos foto-estáveis, que são necessárias para evitar o branqueamento durante os tempos de trânsito estendido através do foco de excitação 14. No entanto, hoje em dia, há uma abundância de opções para corantes foto-estável adequados. melhorias significativas em detectores e outros equipamentos também permitem a detecção de prote fluorescenteins e corantes de brilho mais baixo. Aqui, um protocolo de base para a aplicação de FCS utilizando linfócitos primários de murino, em que a proteína de interesse é marcado com um anticorpo fluorescentemente marcado, é descrito. Uma abordagem para ajustar as curvas de autocorrelação, a fim de extrair o coeficiente de difusão e a densidade molecular também é mostrada. O protocolo visa ser facilmente seguido por imunologistas sem experiência prévia de técnicas para estudar a difusão de moléculas. No entanto, é esperado um entendimento básico de microscopia confocal (para ganhar esse entendimento básico, ver referência 15). Este protocolo pode ser facilmente adaptado relativamente a outras células em suspensão, ambas linhas celulares e células primárias. Para os utilizadores mais experientes FCS, existem métodos de análise mais refinados, alguns dos quais são descritos na discussão.

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Protocol

1. A coloração para FCS

  1. Isolar células NK de murino a partir de linfócitos do baço utilizando rotulagem esférulas magnéticas, de acordo com o protocolo do fabricante 16. Use 2-3 x 10 5 culas por amostra para os passos seguintes.
    NOTA: Use de selecção negativa para enriquecer a população de células alvo, deixando-a intacta, de modo que as células podem ser marcadas utilizando anticorpos primários sozinho. Ver referência 2 para obter informações mais detalhadas sobre o isolamento de células de camundongos 2.
  2. Para as células de murino que expressam receptores de Fc, bloquear os receptores de Fc com o clone 2.4G2 anticorpo a 5 mg / mL em 25 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e soro fetal de bovino a 1% (FBS) por amostra. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  3. Preparação de mistura de anticorpo.
    1. Utilizar anticorpos directamente conjugados com um fluoróforo foto-estável. Se dois anticorpos contra duas proteínas diferentessão utilizados, fluoróforos de uso que têm espectros de emissão bem-separados para minimizar o cross-talk (por exemplo, animado com os 488 e 633 lasers 2, no final do protocolo referido como os lasers e fluoróforos "verdes" e "vermelhos", respectivamente ).
      NOTA: Se os anticorpos comerciais marcadas com fluoróforos foto-estável não estão disponíveis para os biomarcadores seleccionados, conjugados anticorpos não marcados para os fluoróforos de acordo com as instruções do fabricante. Ver Tabela Materiais para os anticorpos utilizados neste estudo.
    2. Prepara-se uma mistura de anticorpo por diluição de anticorpos marcados fluorescentemente contra a proteína ou proteínas de interesse em PBS + 1% de FBS. Adicionar a mistura de anticorpo para cada amostra a um volume final de 50? L por amostra. Incubar em gelo durante 45 min no escuro.
      NOTA: Optimizar a concentração dos anticorpos previamente para assegurar que o anticorpo é utilizado a uma concentração saturante, tipicamente1-10 ug / ml.
  4. Após a incubação, lavar as células por adição de 250 ul de PBS e centrifugar a 150 xg los durante 3 min. Descartar o sobrenadante.
  5. Repita o passo 1.4.
  6. Ressuspender as células em 200 ul de PBS + 1% de FBS. Manter no gelo e no escuro até aquisição.
    NOTA: As células de murino NK podem ser mantidos em gelo durante até 10 h.

2. Preparação de Microscópio Chambered lamela Slides

NOTA: Use os slides lamela câmaras ou pratos com a espessura tampa de vidro que o microscópio foi otimizado para, seja # 1 ou # 1.5. Se o microscópio não está alinhado para uma determinada espessura, ou se é desconhecida, o anel microscópio colar tem de ser optimizada para a corrente de espessura lamela 17.

  1. Dilui-se a poli-L-lisina com água destilada numa proporção de 1:10. Adicionar 200 ul de diluiu poli-L-lisina para as câmaras e incubar durante 20 min.
  2. Remova oPoli-L-lisina por aspiração e deixe a câmara de ar seco, deixando-a sem uma tampa à temperatura ambiente durante pelo menos 20-30 minutos.

3. Iniciar o Sistema FCS

NOTA: Este protocolo refere-se a um sistema de microscópio e software específicos (ver Materiais / Reagentes Tabela), embora outras configurações microscopia e pacotes de software também pode ser usado.

  1. Ligue o microscópio confocal de varrimento laser com o correlator FCS. Abra o software no modo "Expert". Selecione a lente de imersão em água 40X.
  2. Sob a guia "Adquirir", pressione o botão "Config" e os botões de "Scan" para abrir o "Control Configuração" e as janelas "Controle de Digitalização" (janelas A e B na Figura 1, respectivamente). Sob a guia "ConfoCor", pressione "Measure" para abrir a janela "Medição" (janela C na Figura 1).
  3. Crie uma pasta para salvar o FCSmedições. Iniciar um novo banco de dados de imagem, clicando em "New" na guia "Arquivo".
  4. Usando o botão "Laser", ligue a lâmpada de halogéneo e os lasers relevantes para excitar o fluoróforos (por exemplo, 488 nm para o laser de excitação "verde" e de excitação 633 nm para o laser de excitação "vermelho").
  5. Escolha filtros de excitação e emissão adequados e ativar os detectores correspondentes.
    1. Especificar as configurações para captura de imagem, incluindo os filtros de laser de excitação, excitação e emissão, caminho da luz e detectores para ser usado, na janela "Controle de Configuração".
    2. Da mesma forma, especifique as configurações correspondentes para as medições FCS na janela "Medição", na aba "Configuração do Sistema". Use as configurações mais semelhante possível para a imagem latente e FCS.
    3. Ative os canais de detecção para gravações de FCS, marcando a caixa "Ch1" para o channe verdel e "Ch2" para o canal vermelho na janela "Medição".
      NOTA: As definições devem ser optimizados para o fluoróforo (s) utilizados, como através de uma experiência de imagem confocal padrão. Em experiências posteriores, as mesmas configurações FCS podem ser reutilizados através da abertura de um arquivo de FCS de idade, usando o menu pull-down "ConfoCor" na parte superior da interface do usuário, e escolher "Abrir arquivo". Pressione "Reutilização" na janela de aquisição emergente. Da mesma forma, as configurações de aquisição de imagem pode ser carregado através da abertura de uma imagem salva e pressionando "Reutilização".
  6. Espere até que o laser é estável antes de realizar medições FCS. Isso pode levar até 30 minutos para lasers de gás, enquanto lasers de diodo estabilizar mais rapidamente. Ajuste o pinhole enquanto espera.

4. Ajuste Pinhole

  1. Prepare 0,2-0,5 mM soluções de fluoróforos ou corantes fluorescentes correspondentes à excitação e emissão espectros dos rótulos dos anticorpos. ofluoróforos deve ter sabido coeficientes de difusão 18, 19.
  2. Coloque uma gota de 50 ul de solução de fluoróforo excitado pelo laser verde no centro de um poço numa corrediça lamela câmaras. Coloque uma gota de água destilada no objectivo de água 40X e posicionar o slide. Pressione o botão "Mostrar" para iniciar a luz visível e usar o ocular para encontrar e concentrar-se na queda fluoróforo.
    NOTA: Use o mesmo slide como para medições celulares posteriores, uma vez que pequenas variações putativos de espessura de vidro entre os slides podem afetar o alinhamento microscópio.
  3. Colocar o foco bem dentro da gota de líquido (10-100 uM a partir do fundo).
  4. Na janela "Medição", selecione a guia "Aquisição". Pressione "posição atual" sob o título "Posições" (janela C na Figura 1).
  5. Retornar à guia "Configuração do Sistema" na mesma janela. Definir um alto power para o laser verde.
    NOTA: Uma fonte de laser de alta potência refere-se à saturação (isto é, o sinal fluorescente não aumenta de forma linear, se a potência do laser for aumentada ainda mais). Cerca de 1 mW do sistema de configurações de poder, ou 5-10% da potência do laser max, é normalmente suficiente.
  6. Testar a estabilidade do sinal com a tecla "Start". Isto irá abrir uma janela separada exibindo o traço do tempo e curva de autocorrelação para a medição atual. Verificar que o sinal fluorescente é alta, estável ao longo do tempo, e que mostram as flutuações no kHz, em vez de a Hz.
  7. Selecione o botão "O Ajuste" na janela "Medição". Verifique se está seleccionado o canal de detecção de direito (CH1 ou CH2). Pressione "AutoAdjust X." Se a curva resultante não mostra um máximo clara, ou o máximo é no limite, marque a opção "grosso" e pressione "AutoAdjust X" novamente. Quando a tela, resultando em direção x estiver concluída, faça o saMinha Y pressionando "AutoAdjust Y."
  8. De-selecione "grosso" e alternar entre ajustar X e Y pressionando "AutoAdjust" até que ambos têm maxima clara e os valores não estão mudando entre as medições.
  9. Se as células são marcados com dois fluoróforos diferentes, mover-se para uma câmara onde foi adicionada uma solução de fluoróforo vermelho. Selecione uma fonte de laser de alta para o laser vermelho e repita os passos de 4,6-4,8 para a excitação e detecção de canal vermelho.
    NOTA: Se os valores de X e Y desviar entre os canais em sistemas onde somente uma pinhole é usado para ambos os canais de detecção, selecione valores intermediários e pressione OK para aceitar as alterações. Aqui, para o laser de 488 nm com máximos a X = 79 e Y = 189 e o laser de 633 nm com máximos a X = 80 e Y = 188, os valores de X = 80 e Y = 189 foram seleccionados. A combinação dos 488 nm e 633 nm para a excitação laser dos dois anticorpos marcados com fluoróforos excitados por 488 nm ou 633 nm é uma boa escolha, uma vez que orisco de cross-talk é minimizado se os espectros de emissão não se sobrepõem 2.

5. Meça o tempo de trânsito do fluoróforo gratuito

Nota: por determinação do tempo de trânsito através do foco (taud) de um fluoróforo com um coeficiente de difusão conhecidos, o tamanho do volume de detecção, e, portanto, a área da membrana celular que está dentro do foco, pode ser calculada. O cálculo de taud é descrito na etapa 7.2.

  1. Utilizando as mesmas soluções utilizadas para o ajuste pinhole, defina o tempo de aquisição a 30 seg x 2 repete sob a guia "Aquisição" na janela "Medição" (Figura 1, a janela C).
  2. Iniciar uma medição clicando em "Iniciar" na janela "Medição" (Figura 1, a janela B).
    1. Executar uma série de potência de laser de cada laser de excitação e a correspondente fluoróforo em solução, a partir de ou pertosaturando de energia e diminuindo pela metade para cada medição. Alterar a potência do laser na aba "Configuração do Sistema" da janela "Medição" (Figura 1, a janela C). Pressione o botão "Iniciar" para iniciar uma medição.
      NOTA: Incluir a potência do laser para as medições de células próximas na faixa inferior (por exemplo, medir a 16, o poder de 8, 4 e 2 mW, antes do objetivo) 20. regulações de laser do sistema estão em geral mais elevado do que a excitação de saída e pode variar largamente, dependendo do microscópio e a qualidade de alinhamento. Neste sistema, a faixa de potência acima corresponde a cerca de 60-500 mW de configurações do sistema de energia. É aconselhável usar um medidor de potência para medir a potência de saída antes que o objetivo da primeira vez que um novo microscópio é usado. A potência máxima atual do laser é encontrada sob o botão "Info" da janela "Medição".
    2. Anote as contagens por molecule (CPM, unidade: kHz) de cada medição de energia laser.
    3. Se forem utilizados dois canais de detecção, verifique a janela que mostra a curva de autocorrelação para cross-talk. Usar uma solução contendo apenas fluoróforos verdes para medir detectado autocorrelação FCS no canal de detecção e uma solução vermelha apenas com fluoróforos vermelhos para avaliar a detecção no canal de detecção verde. Como regra geral, manter o CPM detectado a partir do fluoróforo "errado" abaixo de 5% do sinal específico do fluoróforo apropriado.
    4. Verifique se os valores dimensionar linearmente com a potência do laser utilizado. Saturação de CPM na maior potência de laser (isto é, valores ligeiramente mais baixos do que o esperado a partir de uma relação linear) é aceitável.
      NOTA: CPM deve ser bem acima de 10 para a potência mais elevada do laser por quase todos os sistemas de microscópio e fluoróforos comuns e pode ser significativamente maior para sistemas sensíveis. A primeira vez que é utilizado um anticorpo fluorescente recém-conjugada, realizar umamedição de FCS do anticorpo difundir livremente na solução para quantificar o CPM esperado. Antes da medição, o revestimento da câmara de medição com 200 ul de poli-L-lisina enxertados com polietileno-glicol (diluída a 0,5 mg / ml em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Remover o líquido com uma pipeta e permitir que a câmara de ar seco. Salve a solução estoque na geladeira (até 2 semanas) e o estoque de pó no congelador. Ao microscópio, diluir o anticorpo a 1-10 ug / ml em PBS. Siga os passos de 4,2-4,4 e 6,7 neste protocolo. Se a superfície não é revestida com uma solução de anti-aderente, os anticorpos interagem com a superfície do vidro e ser rapidamente consumido a partir da solução.

6. Medidas celular

  1. Adicionar 125 ul de células em PBS + 1% de FCS a partir da suspensão de células marcadas com anticorpo (passo 1.5) e 150 ul de meio transparente de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) para um poço de uma corrediça lamela de 8 poços septadas. Leave as células no escuro a temperatura de medida para, pelo menos, 20 min antes de iniciar as medições de FCS.
    NOTA: Este é o de permitir que as células assentar e anexar ao fundo dos poços e a equilibrar as células e solução para a temperatura de medição.
  2. Na janela "Scan Control" (Figura 1, a janela B), ajuste de zoom 1 e começar uma varredura XY rápido, premindo o botão "Rápido XY". Modificar a potência do laser de modo que seja tão baixo quanto possível, enquanto as células são ainda claramente visíveis. O centro da imagem sobre uma célula redonda de brilho médio, onde a membrana está claramente definido e não há nenhum sinal de fluorescência no citoplasma. Zoom até que a célula abrange a maior parte da imagem.
  3. Selecione uma nova célula se a célula atual está se movendo ou exibe tentáculos, extrusões, ou pontos extremamente brilhantes. Manter o mesmo zoom e potência do laser para todas as células capturadas durante o mesmo experimento.
    NOTA: Uma membrana agitou também pode ser um sinal de apo próximoptose.
  4. Concentre-se no topo da membrana celular. Na aba "Aquisição" do "Medição" janela (Figura 1, a janela C), selecione uma posição para medição FCS ativando "Crosshair". Como alternativa, selecione a guia "LSM Imagem", marcar o ponto de medição queria na imagem LSM, e pressione "Incluir posição."
    NOTA: A parte superior da membrana da célula não será influenciado por anticorpos fluorescentes ou fluoróforos ligados não especificamente para o poli-L-lisina. No entanto, é importante assegurar que a célula não se movem durante a medição (ver os resultados).
  5. Na aba "Aquisição" da janela "Medição" (Figura 1, a janela C), definir o número de repetições de 6-10, com a "medir o tempo" fixada em 10 segundos por repetição.
  6. Retornar à guia "Configuração do Sistema" da janela "Medição". Ajustar a potência do laser para a medição de FCS no âmbito do "Lbotão aser ". Antes o objetivo, use baixo consumo de energia para medições de células, no intervalo entre 1 e 10 mW 20.
    NOTA: Os valores recomendados são um trade-off entre a detecção do sinal e photodamage para as células. Veja o passo 5.2.1 Nota a percentagem de potência do laser estes valores correspondem a.
  7. Iniciar uma medição FCS pressionando "Iniciar" na "Medição" janela (C). Se os agentes de branqueamento de células de forma significativa no início da medição, como detectado por uma gota no rastreio intensidade por mais de 30% durante os primeiros 10 segundos (um exemplo é mostrado na Figura 3A, painel inferior), mover-se para uma outra célula e inferior a potência do laser para as medições futuras.
    1. Se o sinal é perdido, ajuste a focagem na direcção Z. Após a medição está completa, utilizar a janela "Control Scan" (Figura 1, a janela B) para verificar que a célula ainda está centrada, e que a membrana da célula foi medida. Se the celular mudou, descartar a medição.
    2. Na janela de auto-correlação onde a medição é exibido, exclua manualmente repete individuais que contêm manobras de zoom, branqueamento, grandes aglomerados, ou outros artefatos (ver exemplos na Figura 3). Para fazer isso, marcando-os, clicando com o botão direito e escolha "Excluir". Salve o arquivo final em formato .fcs. Economize pelo menos quatro repetições por célula.
  8. Opcionalmente, adquirir uma imagem da célula na secção média (com toda a circunferência da membrana visível) utilizando a janela "Scan Control". Capturar a imagem depois da medição FCS para evitar o branqueamento. Pressione o botão "Single" para iniciar a captura de imagem.
  9. Se usando "Adicionar position" para o posicionamento foco FCS, clique em "Remover posição" antes de passar para a próxima célula.
  10. Mudar para uma nova aliquota de suspensão de células após um máximo de 2 horas de medição para manter as células viáveis ​​throughout o experimento.

7. Análise de FCS

  1. Abra os arquivos .fcs em um software com curva de capacidade de encaixe (ver Materiais / Reagentes Tabela para o software usado neste protocolo).
    NOTA: O software FCS que vem com o microscópio é um bom lugar para se familiarizar com montagem básica, mas o software adicional é necessário para caber difusão membrana bidimensional.
  2. Em primeiro lugar, determinar o tamanho do volume de excitação através da análise das medições fluoróforo livre. Caber uma curva de difusão livre 3-dimensional com as curvas de autocorrelação 21.
    Equação (Eq. 1)
    NOTA: Definição de parâmetros: N: número médio de entidades fluorescentes no volume focal, τ (Tau): tempo de correlação, τ D (taud): tempo de residência médio no volume focal, T 1: probabilidade para os fluoróforos para a o estado tripleto, τ <sub> T: tempo de relaxamento para as transições de estado singleto-tripleto, S: relação entre a altura e largura de diâmetro para o volume focal.
    1. Extrair taud, o tempo de trânsito para moléculas de transferir o foco.
    2. Use os coeficientes de difusão observados taud e publicadas (D) de fluoróforos utilizadas para a calibração 18, 19 para calcular o raio pinhole (ω).
      Equação (Eq. 2)
  3. A análise das curvas de autocorrelação em membranas celulares.
    1. Para visualizar a parte da curva que representa difusão molecular, seleccionar o período de tempo antes de iniciar o declive mais íngreme da curva de autocorrelação e termina após as convergências curva em 1 (por exemplo, 0,001 a 5 segundos para os receptores de superfície de murino; ver Figura 4).
    2. Gerar uma curva média de autocorrelação das repetições individuais i salvosn etapa 6.7.2.
    3. Caber uma curva de difusão de membrana de 2 dimensões para cada média curva de autocorrelação utilizando a Equação 3 3.
      Equação (Eq. 3)
      NOTA: os parâmetros de saída importantes são os seguintes: N é o número médio de moléculas que residem no interior da área da membrana animado. Recalcular a densidade (N / 2 ^ M). τ D (taud): tempo médio de residência na zona focal, restringida pelo dois-dimensionalidade da membrana (s). Recalcular o tempo médio de residência para um coeficiente de difusão (2 ^ M / seg) através do raio do furo de pino determinado (ω) e Equação 2. T1 é a probabilidade de fluoróforos para estar no estado de tripleto. O brilho (CPM) é calculada dividindo a intensidade global média da medição por N.
    4. Se um bom ajuste não é conseguido na primeira tentativa, alterar os valores de partida e / ou os limites superiores e inferiores para as variáveis ​​até this é alcançado.
      NOTA: limites superior mais baixos típicos para taxas de difusão de proteínas nas membranas celulares primárias são 10-500 ms para taud, 0-100% de T1, e 0,1-5 ms para TauT1. Seleccionar os valores iniciais para o encaixe no meio destes intervalos. A parte da curva que representa variações de fluorescência derivados de difusão está tipicamente localizado entre 1 ms e 1 s (ver Figura 4). Dependendo do fluoróforo, não pode, por vezes, ser um segundo processo presente, dando origem a autocorrelação em escalas de tempo mais curtos do que o parâmetro de difusão. Isso é causado por um estado escuro transiente (tripleto) ou intermitente (como muitas vezes ocorrem em proteínas fluorescentes). Um estado triplete é contabilizado na Equação 3, e o modelo apresentado deve, portanto, também fornecem um bom ajuste nessas situações.

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Representative Results

Um resultado típico irá gerar uma curva de autocorrelação com um tempo de trânsito no intervalo de 10 ms para 400 ms para proteínas de membrana. O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 ^ M por 2 para proteínas expressas endogenamente. Verifique cuidadosamente que o CPM não é menor do que o esperado. Isto pode significar que existe uma influência do sinal de fundo. Como regra geral, o sinal de CPM de células que é aceite para a análise não deve ser inferior a 33% do CPM para difundir livremente anticorpos com a mesma potência de laser. O CPM deve escalar linearmente com a potência do laser. A curva de autocorrelação para os receptores da superfície celular imunitária primária deve ser lisa, com a parte mais íngreme entre 0,001 e 1 seg. Veja a Figura 2 para uma curva de autocorrelação de representante e de traço do tempo.

Como mencionado brevemente na introdução, ore vários casos onde FCS não é adequado para medir difusão molecular devido à influência de outras fontes de variação de fluorescência, que contribuem para confundir o sinal. A Figura 3 mostra exemplos de casos em que uma célula, ou medição particular de repetição devem ser descartados. Já foi mencionado que um sinal extremamente baixa (muito baixo CPM) é motivo para descartar a célula. Outra razão para descartar a célula individual é que a célula está em movimento (Figura 3A). No caso de branqueamento (Figura 3B) ou se grandes aglomerados estão presentes (Figura 3C), a medição deve ser descartado se o efeito é considerável ou presente em toda a medição. Se este recurso só está presente em uma ou duas repetições, estas repetições individuais podem ser descartados, mas poderão ainda ser utilizadas as repetições restantes.

É importante utilizar tanto a correctamodelo para ajustar os dados e também para verificar cuidadosamente se o ajuste estreitamente coincide com a curva de autocorrelação. Na Figura 4, os exemplos de boas e más ajustes de curva são mostradas. Preste muita atenção para a parte da curva que representa a difusão (a parte mais forte inclinação). É também importante assegurar que o início e o fim da parte inclinada da curva são bem ajustada pelo modelo. Se o ajuste é ruim, sem problemas aparentes, tais como móveis, branqueamento, ou clusters, modificar os valores iniciais e / ou os limites superiores e inferiores (dentro de um intervalo razoável) antes de tomar uma decisão final para descartar a célula.

figura 1
Figura 1: interface de software FCS. Mostrado aqui são os principais janelas necessárias para operar a ferramenta de software para aquisição de FCS e de imagem, conforme descrito no protocolo. Janela A, o "Co Configuraçãontrol "janela é a janela de controle para o caminho do feixe, canais de laser e filtros para imagens. Janela B é o" Scan Controle "janela para a imagem e mostra as configurações de digitalização. Janela C é a" janela de medição ", a janela para o configuração das configurações de medição FCS. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: traço Representante e autocorrelação curvas de difusão d classe de histocompatibilidade principal H-2D I superfície moléculas em células NK isoladas de fresco murino. O painel superior da figura mostra a flutuação de fluorescência como uma função de tempo ao longo de todo o traço do tempo de 7x 10 medições seg. O painel inferior representamé a curva de autocorrelação em média a partir destas sete repetições. A altura da curva de autocorrelação é inversamente proporcional à concentração de fluorescência celular marcado d entidades H-2D dentro do volume focal. O valor do eixo-X na parte mais íngreme da inclinação da curva, metade da amplitude, representa o tempo de residência médio de marcado de forma fluorescente H-2D moléculas de d dentro do volume focal. A medida apresentada é uma parte do conjunto de dados de publicada em 2 de referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Exemplos de traços de células problemáticas. (A) Uma célula em movimento, tal como exemplificado pelo traço não ter um basal estável level. O painel superior mostra um exemplo em que a célula inteira foi transferida para fora do foco após aproximadamente 35 segundos, tal como representado pelo sinal muito baixo depois deste ponto de tempo. Na parte inferior do painel, o efeito é mais subtil, com ondulações aparente a um intervalo de vários segundos. (B) celular exibindo branqueamento, a altura do traço diminuir com o tempo. Comparar a altura do traço no início da medição para que, no final da medição. (C) A presença de grandes grupos, representados por picos no rastreamento. No painel superior, um grande aglomerado a 20-25 seg está presente. Na parte inferior do painel, vários grupos estão presentes ao longo da medição. As medições são apresentados uma parte do conjunto de dados de publicada em 2 de referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 4: Curvas de autocorrelação representativos com curvas de diferentes resíduos. As linhas verticais vermelhas e azuis representam os limites da janela de tempo utilizado para a montagem. (A) Exemplo de uma forma representativa de um modelo de difusão 2-dimensional para uma curva de amostra de auto-correlação. No painel superior, a curva verde (o modelo) se sobrepõe à curva azul (a autocorrelação adquirida), indicando um bom ajuste. O painel inferior mostra o resíduo a partir da curva de ajuste. As flutuações de cerca de 1 segundo, que não estão bem equipados, são típicos para a medição de células e são toleráveis. (B) Exemplo de um mau ajuste de difusão 2-dimensional para a mesma curva de autocorrelação. O modelo ajustado não sobrepõe a curva de autocorrelação, e não convergem para 1. Os painéis inferiores em (A e B) mostram o residual do ajuste de curva. os resíduossão significativamente maiores para o mau ajuste, especialmente para a parte de difusão da curva. A medida apresentada é uma parte do conjunto de dados de publicada em 2 de referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo para o FCS pode ser usada para a avaliação da dinâmica molecular de moléculas de superfície sobre todos os tipos de células do sistema imunológico (murinos, humana, ou de outras espécies). Medidas FCS dinâmica molecular espaço-temporais para baixo a resolução única molécula em células vivas. A densidade molecular, bem como a taxa de difusão e de agrupamento dinâmica das proteínas de interesse, podem ser extraídos a partir das curvas de autocorrelação.

A marcação fluorescente é de importância crucial para experiências bem sucedidas FCS. As proteínas de interesse na membrana da célula têm sido tradicionalmente marcadas utilizando anticorpos, e anticorpos são muitas vezes mais convenientes para utilização em proteínas de superfície em células do sistema imunológico naive. anticorpos não marcados devem ser directamente conjugado com corantes fluorescentes foto-estável com um brilho de alto peso molecular. A selecção do fluororo para a conjugação do anticorpo é importante para a qualidade das medições. rótulos padrão para citometria de fluxo,tais como fluoresceína e os corantes à base de ficoeritrina, não são recomendadas devido à rápida branqueamento. corantes foto-estável para conjugação directa aos anticorpos são actualmente prestados por várias empresas. Os fabricantes fornecem geralmente satisfatórios para protocolos de conjugação e purificação do anticorpo conjugado resultante, e isto pode ser feito em poucas horas. É também possível realizar FCS utilizando proteínas fluorescentes, mas especial cuidado deve ser tomado para minimizar a potência do laser, uma vez que as proteínas fluorescentes são, em geral, mais propensas ao branqueamento do que a maioria dos fluoróforos químicas foto-estável. De acordo com a experiência anterior, sobre-expressão de proteínas, muitas vezes leva a uma redução considerável na taxa de difusão, devido à aglomeração, o que torna a utilização de proteínas fluorescentes não adaptado.

calibração do furo de pino antes das medições é também um passo crítico. Os fluoróforos utilizados para a determinação do tamanho do volume focal deve ter sabido coeficiente de difusãos (ver Equação 2). Use fluoróforos livres correspondentes estreitamente ao espectro de emissão dos marcadores de anticorpos para determinar o tamanho do volume focal. Isto deve ser feito para assegurar a eficiência óptima de sinal e a detecção adequada de potenciais correlações cruzadas entre os canais de cor. Executar uma série de potência de laser de FCS dos fluoróforos que difundem livremente para assegurar que o sistema dá o sinal de saída esperado ao longo de um intervalo de potências. Compare a CPM na mesma potência do laser entre experimentos para assegurar a coerência entre experimentos.

Na etapa de análise, é essencial para colocar intervalos razoáveis ​​e valores iniciais para as variáveis ​​na montagem dos modelos. Usar o conhecimento publicado anteriormente de sistemas de células semelhantes a encontrar bons pontos de partida. Teoricamente, FCS é uma técnica quantitativa, mas desde que as condições ideais raramente ocorrem, um certo grau de cautela tem que ser tomado na interpretação dos resultados. Todos os tipos de flutuações serão gravados,independentemente da origem de tais flutuações. Portanto, é útil ter o máximo de informação possível sobre o sistema experimental, a fim de eliminar eventuais fontes de erro. Por exemplo, o movimento da membrana de célula total irá dar origem a flutuações com mais taud (Figura 3A), enquanto que os contaminantes putativos dos fluoróforos livres na solução se difunde com, pelo menos, dez vezes mais curto taud.

Este protocolo básico pode ser modificado de várias maneiras. Se duas proteínas estão marcados com diferentes fluoróforos, co-difusão (uma medida indirecta de interacção) pode ser avaliada pela expansão da metodologia para detectar a correlação cruzada. O grau em que estas proteínas se ligam uns aos outros na membrana da célula é representada pela altura da curva de correlação cruzada em relação à altura das curvas de autocorrelação dos canais de cor individuais. A correlação cruzada é denotado como Ch1-Ch2 no software de medição. O préanálise cise de correlação cruzada requer controles para cross-talk e é, portanto, um pouco mais complicado do que o protocolo aqui apresentado. Uma descrição detalhada de como proceder, como uma extensão para este protocolo básico, podem ser encontrados em Strömqvist et ai. 13. Para optimizar o posicionamento na direcção-z, z-digitalizar FCS pode ser usada 22. De acordo com a experiência anterior, tem sido satisfatória para fazer isso manualmente. É também possível encaixar vários coeficientes de difusão para uma curva de autocorrelação FCS a 23. Isto requer o conhecimento prévio do número de subpopulações com diferentes taxas de difusão e das taxas de difusão aproximado de pelo menos uma das subpopulações. Caso contrário, haverá muitas variáveis ​​livres, o que tornará o encaixe não confiável. Um exemplo típico seria uma proteína de superfície, cuja taxa de difusão é consideravelmente retardada pela ligação de um ligando. Finalmente, purng o traço de outliers sem inteiramente remover repete é possível 24.

A falta de um sinal de fluorescência é um problema comum para solucionar problemas. Para difundir livremente fluoróforos, use a lâmpada de halogéneo para verificar se a queda é fluorescente. Se a gota não é fluorescente, misturar um novo lote de fluoróforos com um ligeiro aumento de concentração (dentro da gama dos nM) e tentar novamente. Verifique se o foco está dentro da gota fluorescente, os lasers são ligados no software, a potência do laser é suficiente, os filtros e detectores de emissão corretas são escolhidos, e os canais certos na janela "FCS Medição" são activadas (veja o passo 3.6). Comece o laser e olhar de lado para confirmar visualmente que a luz do laser atinge a amostra. Evite olhar directamente para a fonte de laser. Se o filtro de emissão seleccionada engloba o comprimento de onda do laser, um obturador bloqueia automaticamente o percurso da luz para evitar danos para o detector. Euf todas as definições são bons, mas nenhuma luz chega, re-iniciar os lasers, o sistema FCS, e o computador. Perguntar a um especialista se a falta de um sinal fluorescente persiste. Um procedimento simplificado se as células marcadas não apresentam fluorescência. Confirmar a presença de fluorescência com a lâmpada de halogénio; ligar os lasers, selecionar os canais de laser, e ajustar a potência do laser. Selecione uma posição na membrana celular, ou usando o "Crosshair" ou a opção "Adicionar cargo" (veja o passo 6.4). Mudar para a próxima amostra se o sinal ainda é muito baixa.

Um aspecto importante da base flutuação da técnica é que as moléculas têm de ser razoavelmente móvel para ser detectada. As fracções de moléculas ou moléculas retidas dentro das áreas mais pequenas do que o foco durante todo o tempo de medição movendo muito lentamente, portanto, não pode ser medido. Isto leva a uma possível subestimação de densidades superficiais e uma superestimação da taxa de difusão. Branqueamentotambém pode contribuir para uma subestimação putativa, tanto da densidade e taud, uma vez que as moléculas terão uma probabilidade maior de ser branqueada quanto mais tempo eles passam no volume focal iluminado-laser. Influência do fundo (fluorescência do lado de fora do plano focal) seria, por outro lado, aumentar artificialmente o número de moléculas detectadas e diminuir o CPM medido. Anteriormente, o erro máxima total na determinação da densidade absoluta foi estimada em cerca de 40% 20. No entanto, geralmente é possível comparar diferentes amostras biológicas para o outro, uma vez que as fontes de erro são, na maioria dos casos, igual ao longo das experiências. Outra fonte potencial de erro é que os anticorpos são bivalentes, o que significa que cada anticorpo pode potencialmente se ligam a duas moléculas alvo. Os autores não observaram este fenómeno, mas não se pode garantir que este é um recurso global para outros anticorpos. A potencial influência da bivalência devepor conseguinte, ser testados individualmente para cada anticorpo. A combinação de anticorpos primários e secundários marcados específicos nunca deve ser usada, devido ao elevado risco de induzir aglomerados artificiais a partir de duas etiquetas sucessivas bivalentes. Se, em vez de células foram transfectadas com versões marcadas com proteínas fluorescentes da proteína de interesse, cada proteína terá apenas uma etiqueta. No entanto, este requer a transfecção, o que nem sempre é desejável e pode mesmo não ser possível (por exemplo, se usando células imunitárias directamente isolados a partir de sangue humano). Finalmente, um único ponto FCS não grava imagens. Se as imagens são necessários para a publicação ou outros fins, estes devem ser capturados separadamente usando a parte de imagem do software. capturar sempre imagens após medições FCS para evitar o branqueamento desnecessária de superfície da célula.

Ao contrário de FCS, microscopia tradicional baseado em confocal, como FRAP e metodologias de correlação imagem não pode quantificar flutuações de fluorescênciano nível única molécula-6. Metodologias de correlação imagem medir o número de moléculas indiretamente e com menor resolução, mas eles podem avaliar a variabilidade da difusão molecular e clustering sobre toda a área com imagens 25. Padrão SPT medido por microscopia confocal tem um nível ideal de rotulagem, ordens de grandeza mais baixa do que FCS 7. Portanto, a densidade de proteínas marcadas não pode ser medido pela TSC padrão. A combinação de SPT com outras técnicas de microscopia (por exemplo, microscopia óptica reconstrução estocástico ou microscopia localização fotoativação) permite que a densidade e movimento a ser avaliada, mas requer corantes ou proteínas 11 muito especializados. técnicas de super-resolução, tais como amostras muitas vezes exigem fixos estruturados microscopia de iluminação e emissão estimulada esgotados microscopia, e uma combinação de primário e anticorpos secundários para Labeling 26. A localização é portanto muito preciso, enquanto que a dinâmica do sistema não pode muitas vezes ser avaliada. Em comparação com técnicas de super-resolução SPT e, FCS também requer muito menos energia do computador e tempo para a análise e extração de resultados. A citometria de fluxo é o carro-chefe da imunologia e pode ser favoravelmente combinado com FCS. separação de células pode, por exemplo, ser seguido por meio de medições subsequentes sobre as populações celulares seleccionadas se corantes foto-estável tinha sido utilizado antes da triagem. FCS é, portanto, uma metodologia que pode ser utilizada sozinha ou em combinação com outros métodos estabelecidos.

Este protocolo pode ser utilizado para identificar características actualmente desconhecidos da dinâmica de células imunitárias e interacções dentro da membrana celular no nível de uma única molécula. Além disso, as características de populações inteiras contra subconjuntos seleccionadas podem ser comparadas. Tem também um papel potencial como um passo de selecção para a terapia celular imunológica. Uma vez que as medições de ODnão consumir o celular, diferentemente da maioria dos outros métodos para investigar a funcionalidade das células imunes, as células individuais podem potencialmente ser recuperadas e cultivadas. Assim, após a análise das curvas de FCS, as células promissores pode ser extraído e expandido para aplicações adicionais, incluindo aplicações clínicas putativos.

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Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Vladana Vukojević, Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska para a manutenção do instrumento Zeiss ConfoCor 3 e para dicas úteis sobre medições celulares. Este estudo foi financiado por subvenções do Vetenskapsrådet (número de concessão 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse e de Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II Miltenyi Biotec NordenAB 130-096-892 Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum Sigma-Adlrich F7524 Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline - - Made in house 
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 PAA The Cell Culture Company  E15-848 Transparent medium
Antibody clone 2.4G2 Thermo Fischer Scientific 553140 For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody  Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody  BD Pharmingen 558915 Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488 Mobiotech MFP-A2181 Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) SuSoS AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride Sigma-Aldrich 432202 Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A20006 Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope  Zeiss LSM510
Software: Confocor 3 Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox Matlab Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo-scientific  155411 8 wells, 1.0 borosilicate bottom

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References

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