Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (120), e54756, doi:10.3791/54756 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een krachtige techniek voor het bestuderen van diffusie van moleculen in biologische membranen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. FCS kan de moleculaire concentratie en diffusiecoëfficiënt van fluorescent gelabelde moleculen te kwantificeren in het celmembraan. Deze techniek heeft het vermogen om de moleculaire diffusie eigenschappen van moleculen in het plasmamembraan van immuuncellen in normaal staand (dus zonder processen die het resultaat tijdens het werkelijke meettijd). FCS is geschikt voor het bestuderen van de diffusie van eiwitten die tot expressie op niveaus kenmerkend voor de meeste endogene eiwitten. Hier, wordt een eenvoudige en robuuste methode om de diffusiesnelheid van celmembraaneiwitten op primaire lymfocyten bepalen aangetoond. Een effectieve manier om metingen aan antilichaam-gekleurde levende cellen en veel voorkomende waarnemingen na de overname uitvoeren, worden beschreven. De recente ontwikkelingenin de ontwikkeling van stabiele foto-fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt door het conjugeren van het antilichamen van belang kleurstoffen die niet uitgebreid hebben bleken tijdens de metingen bestemmen. Bovendien maakt dit de detectie van langzaam diffunderende entiteiten die een gemeenschappelijk kenmerk eiwitten aanwezig in celmembranen. De analyse procedure om de concentratie en verspreiding parameters moleculaire extraheren uit de gegenereerde autocorrelatie bochten is gemarkeerd. Samengevat wordt een basisprotocol FCS metingen ontvangen; Het zal door immunologen met verstand van confocale microscopie doch zonder andere ervaring van technieken voor het meten van de dynamische parameters, zoals moleculaire diffusiesnelheid.

Introduction

Veel immuuncellen functies afhankelijk moleculaire diffusie en interacties binnen membranen. Biologische membranen zijn complex en vele factoren die belangrijk zijn voor de functie van immune cellen kan de snelheid van translationele diffusie van eiwitten beïnvloeden binnen celmembranen 1 kan zijn. We hebben onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen, lymfocyten behoren tot het aangeboren immuunsysteem vertonen differentiële diffusie van twee onderzochte eiwitten op de celmembraan afhankelijk van de toestand van NK-celactivering 2.

Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een techniek die in staat kwantificeren moleculaire diffusiesnelheid in biologische membranen. Rapporteert de gemiddelde diffusiesnelheid van fluorescent gelabelde moleculen in een vast volume, meestal de focus van een confocale microscoop. Het is gebaseerd op de meting van de fluctuaties in fluorescentie die optreden bij moleculaire beweging ineen systeem in stabiele toestand. FCS is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de diffusie van fluorescerende kleurstoffen en proteïnen, zowel in oplossing als in lipide membranen. Andere uitvoerparameters die de diffusiesnelheid kan ook indirect worden bestudeerd op deze manier (bijvoorbeeld conformationele veranderingen in eiwitten of interacties van moleculen over celmembranen) 3, 4. FCS onderscheidt zich in vergelijking met andere technieken vanwege de hoge gevoeligheid, waardoor de mogelijkheid van één molecuul detectie. Het werkt goed voor moleculaire concentraties in het nanomolair tot millimolair bereik, die typisch is voor endogene expressieniveaus van de meeste eiwitten 5. Bovendien kan FCS een benadering van het absolute aantal eiwitten in de bestudeerde volume te geven, terwijl de meeste andere technieken alleen relatieve informatie over eiwit expressie levels geven. Andere methoden om moleculaire diffusie tarieven te meten binnen membranen omvatten fluocerend herstel na fotobleken (FRAP), enkel deeltje tracking (SPT), meervoudige pinhole FCS en beeldcorrelatie methoden. FRAP en beeldcorrelatie methoden zijn ensemble technieken, die over het algemeen geen informatie over het absolute aantal moleculen 10 te geven. Vergeleken met SPT, de doorvoer van FCS hoger met betrekking tot karakterisering van de gemiddelde bevolking. De analyse is ook minder veeleisend aangezien de gemiddelde diffusiesnelheid van de aanwezigheid in het laserfocus moleculen wordt gemeten in plaats van de snelheid van enkele moleculen. Ook, tenzij gespecialiseerde microscopen zijn verkrijgbaar 11, SPT kan geen informatie over de concentratie te geven, omdat standaard SPT etikettering zeer laag mogelijk te maken voor de identificatie van enkele moleculen moet zijn. Anderzijds, FCS vereist de moleculen onder studie mobiel. Het zal gewoon niet vermeende immobiele fracties of moleculen bewegen heel langzaam op te sporen. De diffusiesnelheid van moleculen dieverblijf op de focus langer dan ongeveer een tiende van de overname tijd zal niet correct worden weergegeven in FCS metingen 3, 12. Daarom diffusiecoëfficiënten opgenomen door FCS meestal sneller dan diffusiesnelheden gerapporteerd door technieken zoals FRAP en SPT, waarbij de nagenoeg in immobiele en zeer traag fracties rekening mee gehouden worden. SPT zal ook een meer gedetailleerde beschrijving van de variabiliteit van de diffusie-tarieven binnen de moleculaire bevolking dan FCS wil.

FCS kwantificeert de fluctuatie van fluorescentie-intensiteit in de tijd binnen de opgewonden volume. Bij membraan metingen, vertaalt het verlichte oppervlak van het membraan. In deze paper, maken we gebruik van het feit dat dergelijke fluctuaties worden veroorzaakt door moleculen vertonen Brownse diffusie en zijn dus bewegen in en uit de excitatie volume. Er zijn ook verschillende andere mogelijke bronnen voor de schommelingenties in het fluorescentiesignaal, zoals knipperen of de aanwezigheid van een triplet toestand in de fluoroforen, milieueffecten binding-ontbinding van ligand, of beweging van het gehele celmembraan. Deze vermeende foutbronnen rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een FCS experiment om de resultaten 12, 13 te interpreteren. Typisch, laterale diffusie tarieven in biologische membranen zijn laag als gevolg van verdringing en interacties, zowel tussen membraaneiwitten en tussen eiwitten en het cytoskelet. Historisch gezien is de toepassing van FCS in membranen is dus belemmerd door het gebrek aan foto-stabiele fluoroforen, die nodig zijn om het bleken tijdens de verlengde looptijden door het excitatie brandpunt 14 te voorkomen. Echter, vandaag, zijn er tal van mogelijkheden voor geschikte foto-stabiele kleurstoffen. Significante verbeteringen in detectoren en andere hardware ook toestaan ​​dat de detectie van fluorescerende proteins en kleurstoffen van lagere helderheid. Hier, een basisprotocol voor de toepassing van FCS met knaagdiermodellen primaire lymfocyten, waarbij het eiwit van belang wordt gemerkt met een fluorescent gelabeld antilichaam, beschreven. Een benadering van de autocorrelatie krommen teneinde de diffusiecoëfficiënt en de moleculaire dichtheid extraheren passen wordt ook getoond. Het protocol is gericht op het wordt gemakkelijk gevolgd door immunologen zonder eerdere ervaring van technieken om de verspreiding van moleculen te bestuderen. Er is echter een basiskennis van confocale microscopie verwacht (om deze basiskennis te krijgen, zie referentie 15). Dit protocol kan betrekkelijk gemakkelijk worden aangepast aan andere suspensiecellen, beide cellijnen en primaire cellen. Voor gevorderde gebruikers FCS, meer verfijnde analyse methoden bestaan, waarvan sommige worden beschreven in de bespreking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kleuring voor FCS

  1. Isoleer muriene NK-cellen van milt lymfocyten met behulp van magnetische kralen labeling, volgens het protocol van de fabrikant 16. Gebruik 2-3 x 10 5 cellen per monster voor de volgende stappen.
    OPMERKING: negatieve selectie de beoogde celpopulatie verrijken, waarbij het onaangetast, zodat de cellen kunnen worden gelabeld met primaire antilichamen alleen. Zie referentie 2 voor meer informatie over cel isolatie van muizen 2.
  2. Voor muriene cellen die Fc-receptoren blokkeren de Fc-receptoren met het antilichaam kloon 2.4G2 bij 5 ug / ul in 25 ui fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1% foetaal runderserum (FBS) per monster. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Bereiding van antilichaam mengsel.
    1. Gebruik antilichamen direct geconjugeerd aan een foto-stabiele fluorofoor. Als twee antilichamen tegen twee verschillende eiwittengebruikte gebruik fluoroforen die goed gescheiden emissiespectra de overspraak te minimaliseren (bijvoorbeeld, opgewekt door de 488 en 633 lasers 2, later in het protocol aangeduid als de "groene" en "rode" lasers en fluoroforen, respectievelijk hebben ).
      NB: Als commerciële antilichamen die zijn gemerkt met een foto-stabiele fluoroforen zijn niet beschikbaar voor de geselecteerde biomarkers, conjugaat niet-gemerkte antilichamen tegen de fluoroforen volgens de instructies van de fabrikant. Zie Materialen tabel voor de antilichamen gebruikt in deze studie.
    2. Bereid een antilichaam mengsel door verdunning fluorescent gelabelde antilichamen tegen het eiwit of de eiwitten van belang in PBS + 1% FBS. Voeg het antilichaam mengsel aan elk monster tot een eindvolume van 50 ul per monster. Incubeer op ijs gedurende 45 minuten in het donker.
      OPMERKING: Optimaliseren van de concentratie van de antilichamen vooraf te waarborgen dat het antilichaam wordt gebruikt bij een verzadigingsconcentratie, typisch1-10 ug / ml.
  4. Na incubatie was de cellen door toevoeging van 250 pi PBS en centrifugeer ze op 150 g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant.
  5. Herhaal stap 1.4.
  6. Resuspendeer de cellen in 200 pl PBS + 1% FBS. Blijf op ijs en in het donker tot overname.
    OPMERKING: Muizen NK cellen kunnen worden bewaard op ijs tot 10 uur.

2. Voorbereiding van de Microscope Chambered dekglaasje Slides

LET OP: Gebruik chambered dekglaasje dia's of gerechten met het deksel glasdikte dat de microscoop is geoptimaliseerd voor, ofwel # 1 of # 1.5. Indien de microscoop niet is gepositioneerd op een bepaalde dikte, of indien het bekend, de microscoop kraag ring moet worden geoptimaliseerd voor de dekglaasje dikte 17.

  1. Verdun poly-L-lysine met gedestilleerd water in een 1:10 verhouding. Voeg 200 gl verdunde poly-L-lysine om de kamers en incubeer gedurende 20 minuten.
  2. Verwijder depoly-L-lysine door afzuigen en laat de kamer lucht drogen met zonder deksel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20-30 minuten.

3. Het starten van de FCS System

Opmerking: Dit protocol betreft een specifiek microscoopsysteem en software (zie Materialen / Reagentia tabel), hoewel andere microscopie opstellingen en software ook worden gebruikt.

  1. Zet de confocale laser scanning microscoop met de FCS correlator. Open de software in de "Expert mode". Selecteer de 40X water immersie lens.
  2. Onder het tabblad "Acquire", druk op de "Config" en "Scan" om de "Configuration Control" en de "Scan Control" windows (windows A en B in figuur 1, respectievelijk) te openen. Onder het tabblad "Confocor", druk op "Measure" om het venster "Measurement" (venster C in figuur 1) te openen.
  3. Maak een map aan de FCS te reddenafmetingen. Start een nieuwe beeldbank door te klikken op "Nieuw" onder het tabblad "Bestand".
  4. Met behulp van de "Laser" knop, zet de halogeenlamp en de relevante lasers voor opwindende de fluoroforen (bijvoorbeeld 488 nm voor de "groene" excitatie laser en 633 nm excitatie voor de "rode" excitatie laser).
  5. Kies geschikte excitatie en emissie filters en de bijbehorende detektoren te activeren.
    1. Geef de instellingen voor het vastleggen van beelden, met inbegrip van de excitatie laser, excitatie en emissie filters, lichtpad en detectoren te worden gebruikt, in het venster "Configuration Control".
    2. Ook geeft u de desbetreffende instellingen voor de FCS metingen in het venster "Measurement", onder het tabblad "System Configuration". Gebruik als overeenkomstige instellingen mogelijk voor beeldvorming en FCS.
    3. Activeer de detectie kanalen voor FCS opnames door het vakje "Ch1" voor de groene channel en "Ch2" voor het rode kanaal in het venster "waardering".
      OPMERKING: De instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor het fluorofoor (en), zoals in een standaard confocale beeldvorming experiment. In de daaropvolgende experimenten, kan dezelfde FCS instellingen worden hergebruikt door het openen van een oude FCS-bestand, met behulp van de "Confocor" pull-down menu aan de bovenkant van de user interface, en te kiezen voor "Open het bestand." Druk op "Hergebruik" in het venster opkomende overname. Op dezelfde manier kan beeldacquisitie instellingen worden geladen door het openen van een opgeslagen afbeelding en drukken "Hergebruik."
  6. Wacht tot de laser stabiel voordat FCS metingen. Dit kan tot 30 minuten voor gas lasers, terwijl diode lasers sneller te stabiliseren. Pas de pinhole tijdens het wachten.

4. Pinhole Adjustment

  1. Bereid 0,2-0,5 uM oplossingen fluoroforen en fluorescente kleurstoffen volgens de excitatie- en emissiespectra van de labels op de antilichamen. Defluoroforen moet hebben geweten diffusiecoëfficiënten 18, 19.
  2. Liep 50 ul druppel van oplossing met de fluorofoor geëxciteerd door de groene laser in het midden van een putje in een chambered dekglaasje dia. Doe een druppel gedestilleerd water op de objectieve 40X water en de positie van de dia. Druk op de "Vis" knop om zichtbaar licht te beginnen en gebruik het oculair te vinden en zich richten op de fluorofoor druppel.
    LET OP: Gebruik dezelfde dia als voor later cel metingen, aangezien vermeende kleine variaties in de dikte van het glas tussen de dia's de microscoop uitlijning kan beïnvloeden.
  3. Leg de focus zowel in de vloeistof druppel (10-100 urn van de bodem).
  4. In het venster "Measurement", selecteert u het tabblad "Acquisition". Druk "huidige positie" in het "posities" (venster C in figuur 1).
  5. Ga terug naar het tabblad "System Configuration" in hetzelfde venster. Een hoge power voor de groene laser.
    OPMERKING: Een hoog laservermogen verwijst naar de verzadigende vermogen (dat wil zeggen, heeft het fluorescerende signaal niet lineair toeneemt wanneer het laservermogen verder wordt verhoogd). Rond 1 mW systeeminstellingen macht, of 5-10% van de maximale laservermogen, is meestal genoeg.
  6. Test de stabiliteit van het signaal door te drukken op "Start." Dit zal een apart venster met de tijd trace en autocorrelatie curve voor de huidige meting te openen. Controleer of de fluorescerende signaal hoog stabiel in de tijd, en tonen schommelingen in de kHz plaats van Hz.
  7. Selecteer de knop "O Adjust" in het venster "waardering". Controleer of de juiste detectiekanaal (Ch1 of Ch2) wordt geselecteerd. Druk op "AutoAdjust X." Indien de resulterende curve een duidelijke maximum vertoont, of het maximum is aan de rand, markeer de "grove" optie en druk op "AutoAdjust X" weer. Wanneer het resulterende scherm in de x-richting is beëindigd, doen de same om Y door te drukken "AutoAdjust Y."
  8. De-selecteer "grof" en wisselen tussen het aanpassen van X en Y door te drukken "AutoAdjust" totdat beide duidelijke maxima en de waarden veranderen niet tussen de metingen.
  9. Als cellen worden gemerkt met twee verschillende fluoroforen, naar een kamer waar rode fluorofoor oplossing toegevoegd. Kies een hoog laservermogen voor de rode laser en herhaal de stappen 4,6-4,8 voor de rode excitatie en detectie-kanaal.
    LET OP: Als X en Y waarden afwijken tussen de kanalen in systemen waarbij slechts één pinhole wordt gebruikt voor zowel de detectie kanalen, selecteert u tussenliggende waarden en druk op OK om de wijzigingen te accepteren. Hier, voor de 488 nm laser met maxima bij X = 79 en Y = 189 en 633 nm laser met maxima bij X = 80 en Y = 188, waarden X = 80 en Y = 189 geselecteerd. De combinatie van de 488 nm en 633 nm lasers voor excitatie van de twee antilichamen gemerkt met fluoroforen bekrachtigd door 488 nm of 633 nm is een goede keuze, omdat hetrisico voor cross-talk wordt geminimaliseerd als de emissiespectra elkaar niet overlappen 2.

5. Meet de looptijd van de Vrije Fluorofoor

OPMERKING: Bij het bepalen van de doorgangstijd door het brandpunt (TauD) van een fluorofoor met een bekende diffusiecoëfficiënt, de grootte van het detectievolume, en derhalve het gebied van het celmembraan dat binnen de focus, kan worden berekend. De berekening van TauD wordt beschreven in stap 7.2.

  1. Met behulp van dezelfde oplossingen voor de pinhole aanpassing, stelt de overname tijd tot 30 seconden x 2 herhaalt onder het tabblad "Acquisition" in het venster "Measurement" (Figuur 1, venster C).
  2. Start een meting door te klikken op "Start" in het venster "Measurement" (Figuur 1, venster B).
    1. Voer een laservermogen reeks per excitatielaser en de overeenkomstige fluorofoor in oplossing beginnend op of nabijverzadigen van de macht en het verminderen van de helft voor elke meting. Verander het laservermogen in het tabblad "System Configuration" van het venster "Measurement" (Figuur 1, venster C). Druk op de knop "Start" om een ​​meting te starten.
      OPMERKING: Neem het laservermogen voor de komende celmetingen in het onderste bereik (gemeten bij 16, 8, 4, 2 en uW vermogen voor de doelstelling) 20. Systeem laserinstellingen het algemeen hoger dan de uitgang excitatie- en kunnen grotendeels variëren afhankelijk van de microscoop en de kwaliteit van de aanpassing. In dit systeem, de bovengenoemde vermogensbereik overeen met ongeveer 60-500 uW systeeminstellingen macht. Het is aangeraden om een ​​power meter te gebruiken om het vermogen te meten voor het doel dat de eerste keer dat een nieuwe microscoop gebruikt. De huidige maximale vermogen van de laser is te vinden onder de "Info" knop van het venster "waardering".
    2. Noteer de tellingen per molCule (CPM, eenheid: kHz) van elkaar laservermogen meting.
    3. Als twee detectie kanalen worden gebruikt, controleer het venster met de autocorrelatie curve voor cross-talk. Gebruik een oplossing die alleen groene fluoroforen gedetecteerde FCS autocorrelatie in de rode detectiekanaal en een oplossing met slechts rode fluoroforen om detectie beoordelen in het groene detectiekanaal meten. Als vuistregel, houdt de gedetecteerde uit het "verkeerde" fluorofoor dan 5% van het specifieke signaal van de juiste fluorofoor CPM.
    4. Controleer dat de waarden schalen lineair met de laservermogen gebruikt. Verzadiging van CPM bij de hoogste laservermogen (dat wil zeggen, iets lagere waarden dan verwacht van een lineair verband) is aanvaardbaar.
      OPMERKING: CPM moet ruim boven 10 de hoogste laservermogen voor bijna alle microscoopsystemen en gemeenschappelijke fluoroforen en kan aanzienlijk hoger gevoelige systemen. De eerste keer dat een nieuwe antilichaam geconjugeerd fluorescerend wordt gebruikt, voert eenFCS meting van het antilichaam vrij diffunderen in oplossing de verwachte CPM kwantificeren. Vóór de meting, laag de meetkamer met 200 pl poly-L-lysine geënt met polyethyleenglycol (verdund tot 0,5 mg / ml in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de vloeistof met een pipet en laat de kamer naar de lucht drogen. Sla de voorraad oplossing in de koelkast (tot 2 weken) en het poeder voorraad in de vriezer. Bij de microscoop verdunnen antilichaam tegen 1-10 ug / ml in PBS. Volg de stappen 4,2-4,4 en 6,7 in dit protocol. Als het oppervlak is gecoat met een kleefvrije oplossing, zullen antilichamen interactie met het glasoppervlak en wordt snel uitgeput uit de oplossing.

6. celmetingen

  1. Voeg 125 ul van cellen in PBS + 1% FCS van het antilichaam-gelabelde celsuspensie (stap 1.5) en 150 ul van transparante Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI) in een putje van een 8-well chambered dekglaasje dia. Leave de cellen in het donker bij meettemperatuur gedurende ten minste 20 minuten voordat FCS metingen.
    Opmerking: Dit is om de cellen te laten bezinken en hechten aan de bodem van de putjes en de cellen en oplossing in evenwicht komen de meettemperatuur.
  2. In het venster "Scan Control" (Figuur 1, venster B), stel zoom 1 en start een snelle XY scan door op de "Fast XY" knop. Verander het laservermogen zodat deze zo laag mogelijk terwijl de cellen nog duidelijk zichtbaar. Het beeld op een knoopcel van gemiddelde helderheid, waarbij het membraan duidelijk omschreven en er geen fluorescerend signaal in het cytoplasma. Zoom in totdat de cel omvat het grootste deel van het beeld.
  3. Selecteer een nieuwe cel als de huidige cel beweegt of displays ranken, profielen, of extreem heldere vlekken. Houd dezelfde zoom en laservermogen voor alle cellen gevangen tijdens hetzelfde experiment.
    LET OP: Een verstoorde membraan kan ook een teken van de komende apo zijnptosis.
  4. Richten op de bovenkant van de celmembraan. In het tabblad "Acquisition" van de "waardering" venster (Figuur 1, venster C), selecteert u een positie voor FCS-meting door het activeren van "Crosshair." Of selecteer het tabblad "LSM Beeld", markeer de wilde meetpunt beeld lsm in en druk op de "positie toevoegen."
    Opmerking: het gebruik van het celmembraan wordt niet beïnvloed door fluorescerende antilichamen of fluoroforen aspecifiek gebonden aan het poly-L-lysine. Het is echter belangrijk te vergewissen dat de cel niet bewegen tijdens de meting (zie de resultaten).
  5. In het tabblad "Acquisition" van het venster "Measurement" (Figuur 1, venster C), stelt u het aantal herhalingen tot 6-10, met de "Meet Time" vastgesteld op 10 sec per herhalen.
  6. Ga terug naar het tabblad "System Configuration" van het venster "waardering". Stel het laservermogen voor de FCS-meting onder de "Laser button ". Voor de doelstelling, het gebruik laag vermogen voor mobiele metingen, in het gebied tussen 1 en 10 uW 20.
    LET OP: De aanbevolen waarden zijn een trade-off tussen de signaaldetectie en photodamage aan cellen. Zie stap 5.2.1 NB het percentage laservermogen deze waarden komen overeen.
  7. Start een FCS-meting door te drukken "Start" in de "waardering" window (raam C). Als de cel bleekmiddelen aanzienlijk het begin van de meting, zoals gedetecteerd door een afname van de intensiteit sporen met meer dan 30% gedurende de eerste 10 seconden (een voorbeeld wordt getoond in Figuur 3A, onderste paneel), naar een andere cel en lagere het laservermogen voor toekomstige metingen.
    1. Als het signaal verloren gaat, past u de focus in de Z-richting. Nadat de meting is voltooid, gebruikt het venster "Scan Control" (Figuur 1, venster B) om te controleren of de cel nog steeds gecentreerd en dat de celmembraan gemeten. Als the cel is verhuisd, gooi de meting.
    2. In de autocorrelatie venster waarin de meting wordt weergegeven, handmatig individuele herhalingen dat zoomen manoeuvres, bleken, grote clusters of andere artefacten (zie voorbeelden in figuur 3) bevatten verwijderen. Doe dit door ze te markeren, de rechtermuisknop te klikken en te kiezen voor "Verwijderen." Sla het laatste bestand in .fcs formaat. Bewaar ten minste vier herhalingen per cel.
  8. Eventueel krijgen een beeld van de cel aan het middendeel (het hele omtrek van het membraan zichtbaar) in het venster "Scan Control". Leg het beeld na de FCS-meting bleken te voorkomen. Druk op de "Single" knop om het beeld vast te leggen starten.
  9. Bij gebruik van de FCS aandacht positionering "positie toevoegen", klik op "Remove position" alvorens over te gaan naar de volgende cel.
  10. Veranderen in een nieuwe aliquot van celsuspensie na maximaal 2 h gemeten aan de cellen levensvatbaar blijven throughout het experiment.

7. FCS Analyse

  1. Open de .fcs bestanden in een software met een curve fitting vermogen (zie Materialen / Reagentia Tafel voor de software die wordt gebruikt in dit protocol).
    LET OP: De FCS-software die wordt geleverd met de microscoop is een goede plek om vertrouwd te raken met elementaire montage te worden, maar extra software nodig is om te passen tweedimensionale membraan diffusie.
  2. Bepaal eerst de grootte van de excitatie- volume door analyse van het vrije fluorofoor metingen. Breng een 3-dimensionale vrij diffusie bocht naar autocorrelatie bochten 21.
    Vergelijking (Vgl. 1)
    LET OP: Definitie van parameters: N = gemiddeld aantal fluorescerende entiteiten in het brandpunt volume, τ (Tau): correlatie tijd τ D (TauD): de gemiddelde verblijftijd in het brandpunt volume, T 1: kans voor de fluoroforen om in de triplet toestand, τ <sub> T: relaxatietijd de singlet-triplet toestand overgangen, S: verhouding van hoogte tot diameter breedte van de focale volume.
    1. Extract TauD, is de looptijd van moleculen om de focus te brengen.
    2. Gebruik de waargenomen TauD gepubliceerd diffusiecoëfficiënt (D) van fluoroforen worden gebruikt voor de kalibratie 18, 19 aan de pinhole radius (ω) berekenen.
      Vergelijking (Vgl. 2)
  3. Analyse van de autocorrelatie bochten op celmembranen.
    1. Het deel van de kromme die moleculaire diffusie visualiseren, selecteert de tijd beginnen voor de steilste helling van de autocorrelatie curve en eindigend na de bocht convergentie van 1 (bijvoorbeeld 0,001 tot 5 s voor muizen oppervlaktereceptoren zie figuur 4).
    2. Genereer een gemiddelde autocorrelatie curve van de individuele herhalingen opgeslagen in stap 6.7.2.
    3. Monteer een 2-dimensionale membraan diffusie curve aan elke gemiddelde autocorrelatie curve met behulp van Vergelijking 3 3.
      Vergelijking (Vgl. 3)
      OPMERKING: Belangrijke uitvoerparameters zijn: N is het gemiddelde aantal moleculen die binnen de opgewonden membraanoppervlak. Herberekenen om dichtheid (N / um 2). τ D (TauD): de gemiddelde verblijftijd in het concentratiegebied, beperkt door de twee-dimensionaliteit van het membraan (s). Herbereken de gemiddelde verblijftijd van een diffusiecoëfficiënt (2 um / sec) via de bepaalde pinhole radius (ω) en Vergelijking 2. T1 is de kans op fluoroforen om in de triplet toestand. De helderheid (CPM) wordt berekend door de gemiddelde totale intensiteit van de meting door N.
    4. Als er een goede pasvorm niet wordt bereikt bij de eerste poging, verander de startwaarden en / of de boven- en ondergrens voor de variabelen tot this wordt bereikt.
      LET OP: Typisch upper-ondergrens voor eiwit diffusie prijzen voor primaire celmembranen 10-500 msec voor TauD, 0-100% voor de T1, en 0,1-5 msec voor TauT1. Selecteer startwaarden voor de montage in het midden van deze intervallen. Het deel van de kromme die fluorescentie fluctuaties afgeleid van diffusie is gewoonlijk tussen 1 ms en 1 seconde (zie figuur 4). Afhankelijk van de fluorofoor er soms een tweede werkwijze aanwezig zijn, die tot autocorrelatie op kortere tijdschaal dan de parameter diffusie. Dit wordt veroorzaakt door een voorbijgaande donkere toestand (triplet) of knippert (zo vaak voorkomen voor fluorescerende eiwitten). Een triplet toestand wordt verantwoord in vergelijking 3, en het gepresenteerde model moet dus ook zorgen voor een goede pasvorm in deze situaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een typisch resultaat wordt een autocorrelatie curve met een looptijd in het traject van 10 msec tot 400 msec voor membraaneiwitten genereren. Het aantal moleculen kan variëren van 0,5 tot ongeveer 200 urn per 2 voor endogeen tot expressie gebrachte eiwitten. Controleer zorgvuldig of de CPM is niet lager dan verwacht. Dit kan betekenen dat er een invloed van het achtergrondsignaal. Als een vuistregel dient de CPM signaal op cellen die wordt geaccepteerd voor analyse niet minder dan 33% van de CPM vrij diffunderen antilichamen gelijktijdig laservermogen. De CPM moet lineair schalen met de laser macht. De autocorrelatie curve voor primaire immune celoppervlakreceptoren verwachting glad zijn, met het steilste deel tussen 0,001 en 1 sec. Zie figuur 2 voor een representatieve autocorrelatie curve en zijn tijd trace.

Zoals kort vermeld in de inleiding, dere aantal situaties waarin FCS is niet geschikt voor het meten van moleculaire diffusie door de invloed van andere bronnen van fluorescentie fluctuaties, die bijdragen aan het signaal verstorende. Figuur 3 toont voorbeelden van gevallen waarin een bepaalde cel of meting herhaalt moet worden weggegooid. Er is al gezegd dat een extreem lage signaal (zeer lage CPM) is veroorzaken voor het teruggooien de cel. Een andere reden voor het weggooien individuele cel dat de cel beweegt (figuur 3A). Bij bleken (figuur 3B) of grote clusters aanwezig zijn (figuur 3C), moet de meting worden weggegooid als het effect aanzienlijk of aanwezig door de gehele meting. Als deze functie is alleen aanwezig in één of twee herhalingen, kunnen deze individuele herhalingen worden weggegooid, maar de resterende herhalingen kan nog steeds worden gebruikt.

Het is belangrijk om zowel gebruik de juistemodel om de data te passen en ook om zorgvuldig na te gaan of de pasvorm nauw overlapt met de autocorrelatie curve. In figuur 4, zijn voorbeelden van goede en slechte curve past getoond. Let goed op het gedeelte van de curve die diffusie (de meest steile gedeelte). Het is ook belangrijk om te verzekeren dat zowel het begin en het einde van het schuine gedeelte van de curve zijn goed gemonteerd door het model. Als de pasvorm is slecht, zonder duidelijke problemen zoals verplaatsen, bleken of clusters, de startwaarden en / of de boven- en ondergrenzen (binnen een redelijke marge) modificeren alvorens een definitieve beslissing om de cel ontdoen.

Figuur 1
Figuur 1: FCS software-interface. Hier worden de belangrijkste ramen nodig de software voor FCS verwerving en beeldvorming werken, zoals beschreven in het protocol. Venster A, de "Configuration Control "window is de controle-venster voor de bundel pad, laser kanalen en filters voor de beeldvorming. Window B is de" Scan Control "venster voor de beeldvorming en toont de scaninstellingen. Window C is de" Measurement "venster, het venster voor de setup van de instellingen FCS-meting. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Representatieve trace en autocorrelatie rondingen van het verspreiden van H-2D d major histocompatibility klasse I oppervlakte moleculen in vers geïsoleerde muizen-NK-cellen. Het bovenste paneel in de figuur toont de fluorescentie fluctuatie als functie van de tijd gedurende de gehele tijddiagram van 7x 10 seconden metingen. Het onderste paneel vertegenwoordigenis de gemiddelde autocorrelatie curve van deze zeven herhalingen. De hoogte van de autocorrelatie curve is omgekeerd evenredig met de concentratie van mobiele fluorescent gelabelde H-2D d entiteiten binnen de focale volume. De x-as waarde bij het steilste gedeelte van de helling van de curve, de helft van de amplitude vertegenwoordigt de gemiddelde verblijftijd van fluorescent gelabelde H-2D d moleculen in het focale volume. De meting wordt gepresenteerd is een deel van de dataset gepubliceerd in referentie 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Voorbeelden van problematische cel sporen. (A) Een bewegende cel, zoals blijkt uit het spoor niet een stabiele basale level. Het bovenpaneel toont een voorbeeld waarbij de gehele cel onscherp is bewogen na ongeveer 35 seconden, zoals weergegeven door het zeer lage signaal nadat dit tijdstip. In het onderste paneel, het effect subtieler, golvingen duidelijk met een interval van enkele seconden. (B) Cell weergave bleken, de hoogte van het spoor afneemt met de tijd. Vergelijk de hoogte van de tracering bij het begin van meting dat aan het eind van de meting. (C) De aanwezigheid van grote clusters, vertegenwoordigd door pieken in het spoor. In het bovenste paneel, een grote cluster bij 20-25 sec is aanwezig. In het onderste deel, verschillende clusters gehele meting aanwezig. De gepresenteerde metingen zijn een deel van de dataset gepubliceerd in referentie 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 4: Vertegenwoordiger autocorrelatie bochten met curve-fitting en residuen. De rode en blauwe verticale lijnen geven de grenzen van het tijdvenster wordt gebruikt voor de montage. (A) Voorbeeld van een representatieve pasvorm van een 2-dimensionaal diffusiemodel een monster autocorrelatie curve. In het bovenste paneel, de groene curve (het model) overlays de blauwe curve (de overgenomen autocorrelatie), wat wijst op een goede pasvorm. Het onderste paneel toont de resterende van de curve fitting. De schommelingen rond 1 seconde, die niet goed zijn aangebracht, zijn kenmerkend voor celmetingen en zijn aanvaardbaar. (B) Voorbeeld van een slechte pasvorm van 2-dimensionale diffusie dezelfde autocorrelatie curve. Het aangepaste model niet overlappen de autocorrelatie curve, en het niet convergeren bij 1. De onderste panelen in (A en B) tonen de resterende uit de curve fitting. de residuenaanzienlijk groter voor de slechte pasvorm, vooral voor de diffusie deel van de curve. De meting wordt gepresenteerd is een deel van de dataset gepubliceerd in referentie 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol FCS kan worden gebruikt voor de beoordeling van de moleculaire dynamica van oppervlaktemoleculen op alle soorten immuuncellen (muizen, mensen of andere soorten). FCS maatregelen tijdruimtelijke moleculaire dynamica omlaag naar single-molecule resolutie in levende cellen. De moleculaire dichtheid, evenals de diffusiesnelheid en clustering dynamiek van de eiwitten van belang, kan worden gewonnen uit de autocorrelatie krommen.

De fluorescerende labeling is van cruciaal belang voor een succesvolle FCS experimenten. Eiwitten van belang op de celmembraan traditioneel wordt gelabeld met antilichamen en antilichamen zijn vaak het meest geschikt voor gebruik op oppervlakte-eiwitten in naïeve immuuncellen. Ongelabelde antilichamen moeten direct worden geconjugeerd aan foto-stabiele fluorescerende kleurstoffen met een hoog moleculair helderheid. De keuze van de fluorofoor voor antilichamen conjugatie is belangrijk voor de kwaliteit van de metingen. Standaard etiketten voor flowcytometrie,zoals fluoresceïne en-fycoerythrine gebaseerde kleurstoffen, worden niet aanbevolen als gevolg van snelle bleken. Foto-stabiele kleurstoffen voor directe conjugatie met antilichamen worden momenteel door verschillende bedrijven. De fabrikanten meestal bevredigend protocollen voor conjugatie en zuivering van het resulterende geconjugeerde antilichaam, en dit kan worden gedaan in een paar uur. Het is ook mogelijk om FCS te voeren met fluorescente proteïnen, maar speciale zorg moet worden genomen om het laservermogen te minimaliseren, aangezien fluorescente proteïnen over het algemeen gevoeliger voor bleken dan de foto-stabiele chemische fluoroforen. Volgens eerdere ervaring overexpressie van eiwitten vaak leidt tot een aanzienlijke vermindering van de diffusiesnelheid gevolge van het verzamelen, die het gebruik van fluorescerende eiwitten ongeschikt maakt.

Pinhole ijking vóór de metingen ook een kritische stap. De fluoroforen gebruikt voor het bepalen van de grootte van het brandpunt volume moet diffusiecoëfficiënt hebben gewetens (zie Vergelijking 2). Gebruik vrije fluoroforen nauw aansluit bij de emissiespectra van labels het antilichaam de omvang van de focale volume bepalen. Dit moet worden gedaan om het optimale signaal efficiëntie en goede detectie van mogelijke cross-correlaties tussen de kleurkanalen te verzekeren. Voer een FCS laservermogen reeks de vrij diffunderende fluoroforen zodat het systeem geeft de verwachte uitgangssignaal over een bereik van krachten. Vergelijk de CPM op hetzelfde laservermogen tussen de experimenten om de samenhang tussen experimenten te waarborgen.

In de analysestap, is het essentieel om redelijk bereik en beginwaarden voor de variabelen het plaatsen van het model te zetten. Gebruik eerder gepubliceerde kennis van vergelijkbare mobiele systemen om goede aanknopingspunten te vinden. Theoretisch FCS is een kwantitatieve techniek, maar omdat optimale omstandigheden zelden voor, een zekere mate van voorzichtigheid moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten. Allerlei fluctuaties wordt opgenomen,ongeacht de oorsprong van dergelijke schommelingen. Daarom is het nuttig om zoveel mogelijk informatie over het experimentele systeem om mogelijke foutbronnen uitgesloten. Zo wordt beweging van het gehele celmembraan hierdoor fluctuaties met langere TauD (figuur 3A) te geven, terwijl mogelijke verontreinigingen van de vrije fluoroforen in de oplossing diffunderen met ten minste tien maal korter TauD.

Dit eenvoudige protocol kan op verschillende manieren worden gemodificeerd. Als twee eiwitten gelabeld met verschillende fluoroforen, kan co-diffusie (een indirecte maat voor interactie) worden bepaald door het uitbreiden van de methode voor de kruiscorrelatie gedetecteerd. De mate waarin deze eiwitten binden aan elkaar in de celmembraan wordt vertegenwoordigd door de hoogte van de kruiscorrelatie curve opzichte van de hoogte van de autocorrelatie krommen van de afzonderlijke kleurkanalen. Kruiscorrelatie wordt aangeduid als Ch1-Ch2 in de meting software. de preprecieze analyse van cross-correlatie vereist controles voor cross-talk en is daarmee iets ingewikkelder dan het protocol hier gepresenteerd. Een gedetailleerde beschrijving van hoe verder te gaan, in het verlengde van deze fundamentele protocol, kunnen worden gevonden in Strömqvist et al. 13. Om de positionering in de z-richting te optimaliseren kan z-scannen FCS worden 22. Volgens eerdere ervaring is het passend om dit handmatig te doen. Het is ook mogelijk om meerdere diffusiecoëfficiënten aanpassen aan een FCS autocorrelatie curve 23. Dit vereist voorkennis van het aantal subpopulaties met verschillende diffusiesnelheden en de geschatte diffusiesnelheden van ten minste één van de subpopulaties. Anders zal er teveel vrij variabelen, waarbij de fitting onbetrouwbaar maken. Een typisch voorbeeld hiervan is een oppervlakte-eiwit waarvan de diffusiesnelheid aanzienlijk afgeremd door de binding van een ligand. Tot slot, schoonmakng het spoor van uitschieters zonder volledig verwijderen van herhalingen is mogelijk 24.

Het ontbreken van een fluorescerend signaal is een veelvoorkomend probleem oplossen. Voor vrij diffunderen fluoroforen, gebruik dan de halogeenlamp om te controleren of de daling is fluorescerend. Als de daling is niet fluorescent, meng een nieuwe batch van fluoroforen met een licht verhoogde concentratie (binnen het nM bereik) en probeer het opnieuw. Controleer of de focus binnen de tl-drop, de lasers zijn ingeschakeld in de software, het laservermogen voldoende is, de juiste emissie-filters en detectoren worden gekozen, en de juiste kanalen in het venster "FCS Measurement" zijn geactiveerd (zie stap 3.6). Start de laser en kijk vanaf de zijkant om visueel te bevestigen dat het laserlicht het monster bereikt. Kijk niet recht in de laserbron. Als het geselecteerde uitstralingsfilter omvat de lasergolflengte wordt een sluiter automatisch het lichtpad blokkeren om schade aan de detector te vermijden. ikf alle instellingen zijn prima, maar geen licht komt, re-start de lasers, de FCS-systeem, en de computer. Vraag een expert als het gebrek aan een fluorescent signaal aanhoudt. Een vereenvoudigde procedure van toepassing als de gelabelde cellen niet fluorescentie tonen. Bevestigen de aanwezigheid van fluorescentie met de halogeenlamp; zet de lasers, selecteert u de laser kanalen, en stel het laservermogen. Selecteer een positie op de celmembraan, ofwel met behulp van de "Crosshair" of optie 'positie toevoegen "(zie stap 6.4). Overschakelen naar het volgende monster als het signaal nog steeds te laag.

Een belangrijk aspect van de fluctuatie basis van de techniek is dat moleculen redelijkerwijs mobiele te detecteren zijn. Zeer langzaam fracties van moleculen of moleculen gevangen in gebieden die kleiner zijn dan de concentratie tijdens de volledige meettijd kan dus niet worden gemeten. Dit leidt tot een mogelijke onderschatting van de oppervlakte dichtheden en een overschatting van de diffusiesnelheid. Blekenkan ook bijdragen aan een vermeend onderschatting van zowel de dichtheid en TauD, aangezien moleculen een hogere waarschijnlijkheid van de langere tijd die zij doorbrengen in de laser verlichte focale volume gebleekt hebben. Invloed van de achtergrond (fluorescentie van buiten het brandvlak) zou anderzijds, kunstmatig verhogen het aantal gedetecteerde moleculen en de gemeten CPM verlagen. Eerder, de totale maximale fout in de absolute bepaling dichtheid werd geschat op ongeveer 40% 20 is. Het is echter vaak mogelijk om verschillende biologische monsters met elkaar te vergelijken, omdat de foutbronnen zijn in de meeste gevallen gelijk gedurende de experimenten. Een andere potentiële foutbron is dat antilichamen zijn bivalent, wat betekent dat elk antilichaam mogelijk kunnen binden aan twee doelmoleculen. De auteurs hebben dit verschijnsel niet waarnemen, maar kan niet worden gegarandeerd dat dit een globale eigenschap voor andere antilichamen. De mogelijke invloed van bivalentiepunt moetendaarom afzonderlijk worden getest op elk antilichaam. De combinatie van specifieke primaire en gelabelde secundaire antilichamen mag niet worden gebruikt vanwege het hoge risico van het induceren van kunstmatige clusters van twee opeenvolgende tweewaardige labels. Als cellen plaats getransfecteerd met fluorescent-gelabeld eiwit versies van het eiwit van belang, zal ieder eiwit één label. Dit vereist echter transfectie, hetgeen niet altijd wenselijk en mogelijk zelfs niet mogelijk (bijvoorbeeld bij gebruik van immuuncellen rechtstreeks geïsoleerd uit menselijk bloed). Tot slot single-point FCS doet geen beelden opnemen. Als beelden zijn vereist voor publicatie of andere doeleinden dienen deze afzonderlijk vastgelegd met de beeldvormende gedeelte van de software. vangen beelden altijd na FCS metingen onnodige bleken van het celoppervlak voorkomen.

In tegenstelling tot FCS, traditionele confocale microscopie gebaseerde, zoals FRAP, en beeldcorrelatie methodieken kan niet kwantificeren fluorescentie schommelingenbij de single-molecule level 6. Beeldcorrelatie methodes meten het aantal moleculen indirect met lagere resolutie, maar ze kunnen de variabiliteit van moleculaire diffusie en clustering beoordelen over het gehele belichte gebied 25. Standard SPT gemeten met behulp van confocale microscopie heeft een ideale niveau van de etikettering, ordes van grootte lager dan FCS 7. Derhalve kan de dichtheid van gelabelde proteïnen niet worden gemeten door standaard SPT. De combinatie van SPT met andere microscopische technieken (bijvoorbeeld stochastische optische microscopie reconstructie of fotoactivatie lokalisatie microscopie) kan de dichtheid en beweging moeten worden beoordeeld, maar het vereist zeer gespecialiseerde kleurstoffen of eiwitten 11. Super-resolutie technieken, zoals gestructureerde verlichting microscopie en gestimuleerde emissie uitgeput microscopie, vereisen vaak vaste monsters en een combinatie van primaire en secundaire antilichamen voor LabelinG 26. Lokalisatie is daarom zeer nauwkeurig, maar de dynamiek van het systeem kan niet vaak worden beoordeeld. In vergelijking met SPT en super-resolutie technieken, FCS vereist ook aanzienlijk minder rekenkracht en tijd voor de analyse en extractie van de resultaten. Flowcytometrie is het werkpaard van immunologie en kunnen gunstig worden gecombineerd met FCS. Celsortering kan bijvoorbeeld worden gevolgd door achtereenvolgende metingen op een geselecteerde cel populatie foto-stabiele kleurstoffen reeds vóór de sortering gebruikt. FCS is dus een methode die alleen of in combinatie worden gebruikt met andere gevestigde werkwijzen.

Dit protocol kan worden gebruikt om nog onbekende functies van immuuncellen dynamiek en interacties te identificeren in de celmembraan van de individuele molecuul. Verder kunnen kenmerken van hele populatie versus geselecteerde subsets vergelijken. Het heeft ook een potentiële rol als een selectiestap voor immuuncel therapie. Sinds de metingen te doenniet consumeren de cel, in tegenstelling tot de meeste andere methoden voor het onderzoek naar de functionaliteit van de immuuncellen, kunnen individuele cellen mogelijk worden hersteld en gekweekt. Nadat dus de analyse van de FCS krommen, veelbelovende cellen worden geëxtraheerd en uitgebreid voor extra applicaties, zoals mogelijke klinische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Vladana Vukojević, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet voor het onderhoud van de Zeiss Confocor 3 instrument en handige tips met betrekking tot mobiele metingen. Deze studie werd gefinancierd door subsidies van Vetenskapsrådet (subsidie ​​nummer 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, en vanuit Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II Miltenyi Biotec NordenAB 130-096-892 Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum Sigma-Adlrich F7524 Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline - - Made in house 
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 PAA The Cell Culture Company  E15-848 Transparent medium
Antibody clone 2.4G2 Thermo Fischer Scientific 553140 For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody  Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody  BD Pharmingen 558915 Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488 Mobiotech MFP-A2181 Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) SuSoS AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride Sigma-Aldrich 432202 Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A20006 Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope  Zeiss LSM510
Software: Confocor 3 Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox Matlab Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo-scientific  155411 8 wells, 1.0 borosilicate bottom

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
  2. Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
  3. Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
  4. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
  5. Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
  6. Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
  7. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
  8. Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. 336-348 (2015).
  9. Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
  10. Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
  11. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
  12. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. 709-725 (2014).
  13. Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
  14. Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
  15. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
  16. Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
  17. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
  18. Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
  19. Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
  20. Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
  21. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
  22. Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
  23. Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
  24. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
  25. Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
  26. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics