细胞形态改变与细胞运动的影像

Developmental Biology

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Karim, M. R., Haruta, T., Matsumoto, T., Oda, H., Taniguchi, H. Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies. J. Vis. Exp. (118), e54764, doi:10.3791/54764 (2016).

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Abstract

原肠是国内第一套多细胞动物,例如果蝇胚胎发育过程中出现形态的动态事件。这种形态学改变也被认为是上皮间质转化(EMT)。 EMT的失调与纤维化和癌症转移有关。有新出现的证据表明,EMT是由多个的分子机制来控制。作为控制根尖狭窄这样,许多关键基因也已知可用于在癌转移中观察到的EMT的重要因素。像果蝇原肠胚形成过程中的EMT,上皮细胞可被诱导以改变它们的形状和被重新编程的细胞命运重定向朝向各种其它类型的细胞。在这里,我们提供果蝇原肠胚形成的鲁棒成像方法以测定在此阶段的胚胎发育的形态发生细胞运动和细胞命运识别的开始。使用这种方法,我们确定Ç在原肠胚形成的时间ELL重排并用GFP在原肠胚形成示范根尖狭窄的重要性标记DE-cadherin的。

Introduction

原肠胚是所述第一组的多细胞动物如果蝇 1,2-胚胎发育过程中出现的形态动态事件。有趣的是,新的证据表明,这一过程是通过机械和分子机制3之间的相互作用调控。此外,上皮至间质转变(EMT),这是在原肠胚形成的关键过程,也牵连在人类疾病过程,如癌症转移4-8。作为控制根尖狭窄这样,许多基因也被称为是在癌症转移9中观察到的EMT的关键因素。因此,在原肠胚形成的时间根尖狭窄是调查前述监管机制,以提高我们的癌症转移的理解的优秀典范。该技术的优点是,我们可以在实时的,因此,原肠胚形成的时间观察细胞的运动,我们将能够筛选参与原肠胚以及肿瘤转移的基因。

虽然相对未知的,细胞-细胞粘附被认为在根尖狭窄1中发挥中心作用。 果蝇遗传学非常适合于单细胞水平调查探索调控的分子机制。这种模式将使我们在原肠揭开根尖狭窄的重要性。此外,这种方法可以用于筛选参与癌转移的基因。 果蝇原肠胚形成的捕获实时图像,进一步使我们更详细地了解管理组织重排的分子机制。在此,我们提供了一个简单的方法的全面说明实现这一目标。

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Protocol

注意:在此研究中使用的转基因果蝇包括以下内容:DE-CAD :: GFP 10。

1.苹果板的制作

  1. 制备12.5克琼脂,125毫升100%市售苹果汁12.5克葡萄糖,和375毫升H 2 O的热混合物的混合物在微波中,并将其倒入3cm的细胞培养皿。储存在4℃下以供将来使用该混合物。
  2. 准备苹果平板后,加入在它上面揉酵母泥薄薄的一层,让苍蝇产卵。

2.胚胎制备及实时成像协议

  1. 将约50苍蝇(男25例,女25例),在一个瓶子交配,随后隔夜产卵上覆盖揉酵母苹果平板。在瓶口设置苹果汁板。 保持瓶孵化器倒置。裹塑现货果蝇瓶铝箔提示日Ë苍蝇奠定更加鸡蛋。
  2. 第二天早晨,用新的替换旧的苹果汁板。
  3. 让苍蝇通过包装瓶用铝箔产卵3至4小时。
  4. 三四个小时后,收集用刷子或棉花不好从苹果汁板胚胎滤网胚胎,用PBS洗涤。洗胚胎2至3次以上,用PBS在12孔培养皿中。
  5. Dechorionate用50%的漂白剂的胚胎在12孔培养皿5分钟。
  6. 继dechorionation过程中,2至3次以上,用PBS洗胚胎。
  7. 胚胎转移到含有PBS和选择阶段,在显微镜下5胚胎基于透明在其边境水平3cm的细胞培养皿。移液器用200微升枪头上演胚胎。
  8. 下一步,放置在一个玻璃盖玻片两个选定的胚胎,并去除多余的PBS捻的细棉纸。定向胚胎起来的背侧用捻的细棉纸盖玻片。在此之后,附加胚胎的玻璃盖玻片用细针和扭曲的纸巾硅脂。
  9. 加卤烃油700的一小滴上的胚胎并放置含有胚胎上凹滑动倒置盖玻片,留在滑动底部一些空间。
  10. 检查用共焦成像系统中,氩气/ 488激光,以及一个油浸物镜(63X)的胚胎。
    注:确定在适当的发育阶段的胚胎是重要捕获原肠胚形成事件的图像。在这些条件下,观察几乎所有的胚胎正常发育高达至少阶段14.分析胚胎可进一步培养以开发作为成人。

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Representative Results

这里,我们显示了果蝇胚胎的原肠胚形成事件和胚胎制备过程的一般概述( 图1)。细胞膜用DE-cadherin的:: GFP和细胞运动的实时成像在原肠胚形成的时间在果蝇进行( 图2)进行标记。由于DE-cadherin的GFP的苍蝇让我们想象细胞粘附路口,我们能够追踪顶端细胞的形状和使用该系统的动作。更重要的是,该系统还允许我们跟踪的内源性DE-cadherin的表达模式。

图1
图1:胚胎制备工艺的总体概述。 A)设立产蛋苍蝇。 b)收集胚胎,并放置在一个胚胎过滤器。 C)洗涤后ING用PBS胚胎,立即dechorionate他们。 D)胚胎转移到使用PBS 3cm的细胞培养皿。 E)吸取是在正确的发展阶段,并把他们放在盖玻片的胚胎。 F)连接使用真空脂胚胎盖玻片。 G)接下来,添加卤烃油下降到盖玻片。 高)最后放置盖玻片上的幻灯片缩进倒挂。胚胎是现在准备时间推移成像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:一个实验方法的使用DE-CAD ::基于GFP的实时成像在原肠胚形成的结果。细胞膜用DE-cadherin的标记::GFP和细胞运动实时成像果蝇的原肠胚形成过程中被抓获,然后约500秒顶端细胞周边采用DE-冠心病的GFP荧光,以便追查使用一组典型的时间推移图像的单个细胞的顶端区域可视化;比例尺= 20微米。该箭头显示,其中根尖狭窄和内陷发生。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halocarbon oil 700 Sigma MKBH 5726
Vacuum grease Silicone Beckman 335148
Glass coverslip  Matsunami glass Thickness No1 24 - 36 mm
Embryo stariner Corning Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles Hitec MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies REF (10)

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References

  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15, (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193, (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13, (1), 3 (2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5, (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35, (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527, (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (20), 8284-8289 (2009).

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