마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 추출 공장 기반 캡슐

1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

이 프로토콜 / 원고는 석송의 포자에서 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 생산을위한 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스에 대해 설명합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

식물 기반 포자 또는 꽃가루에서 파생 된 마이크로 캡슐은 마이크로 캡슐화 응용 프로그램의 다양한 범위에 대한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 내부 sporoplasmic 내용을 제거하기 위해 포자 또는 꽃가루가 처리 될 때 Sporopollenin의 exine 캡슐 (SEC 초)을 얻을 수있다. 얻어진 중공의 마이크로 캡슐이 균일 micromeritic 고도를 나타내고, 특히 식물 종에 관련된 복잡한 미세 기능을 유지한다. 여기서, 우리는 석송의 포자에서 SEC 초 생산을 위해 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스를 보여줍니다. 현재 SEC 분리 과정은 최근 크게 종래 SEC 분리에 사용되는 프로세싱 요구를 감소하고, 본래 마이크로 캡슐의 제조를 위해 최적화되어있다. 자연 L. 속 clavatum 포자 인산으로 처리하여, 아세톤으로 탈지 광범위 sporoplasmi를 제거하는 세척C 내용. 아세톤으로 탈지 후, 85 % 인산을 사용하여 단일 공정 단계 sporoplasmic 모든 내용을 제거하는 것으로 나타났다. 30 시간에 산 처리 시간을 제한함으로써, 깨끗한 SEC 초를 분리 및 장기간의 처리 시간이 발생하는 것으로 나타났다 SEC의 파쇄를 방지 할 수있다. 물 광범위한 세척, 산을 희석 기지를 희석 용매 모든 sporoplasmic 물질 및 화학 잔류 물이 적절하게 제거되었는지 확인합니다. 진공로드 기법 대표적인 친수성 화합물로서 모델 단백질 (소 혈청 알부민)을로드하는 데에 이용된다. 진공로드들은 다른 마이크로 캡슐화 프로토콜에서 요구되는 가혹한 용매 또는 바람직하지 않은 화학 물질 없이도 다양한 화합물을로드하는 간단한 기술을 제공한다. 이러한 분리 및로드 프로토콜을 기반으로 초 남음 마이크로 캡슐화와 같은 응용 프로그램, 치료제, 식품, 화장품의 다양한 범위에서 사용하기에 유망한 재료 및 퍼스널 케어 자극을 제공ucts을.

Introduction

이 마이크로 캡슐화 응용 프로그램에서 사용하기 위해 식물의 포자와 꽃가루에서 얻은 천연 식물성 캡슐에 상당한 관심이. 인 자연에서 1-15, 포자 및 꽃가루는 가혹한 환경 조건에 대한 민감한 유전 물질에 대한 보호를 제공합니다. 식물 포자 꽃가루의 기본 구조는 통상적으로 외부 쉘 층 (exine) 내부 쉘층 (intine) 내부의 세포질 물질을 포함한다. exine는 sporopollenin이라 화학적 강력한 1,9,10,13,16 생체 고분자로 구성되고 intine 주로 셀룰로오스 재료로 구성된다. 16-18 빈 캡슐 7,9 다양한 공정에 의해 단리 할 수 세포질 물질을 제거하기위한 , 단백질, 그리고 intine 층. 2,12,16이 sporopollenin exine 캡슐 (초 남음) 그들의 좁은 크기 분포 균일 한 형태로 합성 봉지에 강력한 대안을 제공합니다. 7,9,13,19,20에게를이러한 석송 같은 다양한 식물 종으로부터 SEC 초를 얻기 표준화 된 프로세스의 개발은, 약물 전달, 식품, 화장품 등의 분야에서 마이크로 캡슐화 광범위한 응용 가능성을 연다. 6,10-13,21

SEC 초를 얻기 위해, 연구자들은 제 1 유기 용매와 포자 및 꽃가루를 처리 한 세포 내 내용물을 제거하는 알칼리 용액에서 환류시켰다. 22-25하지만, 나머지 캡슐 구조가 여전히 셀룰로오스 intine 층을 포함하도록 결정 하였다. 이것을 제거하기 위해, 연구자들은 SEC의 intine 제거 바람직한 방법되고 인산으로 몇 일 동안 22-25 염산, 뜨거운 황산, 또는 뜨거운 인산을 사용하여 장시간 산성 가수 분해 처리의 사용을 탐구. (2) 그러나, 지속적인 수년에 걸쳐 연구는 다양한 포자와 꽃가루가 날 처리 가혹한에 탄력성의 다른 학위를 가지고 있음을 보여 주었다thods 일반적으로 사용. (26, 27) 일부 포자와 꽃가루가 완전히 분해하고 강한 알칼리 용액에서 모든 구조적 무결성을 잃고, 또는 무겁게 강한 산성 용액에 손상.가 16 처리 조건에 SEC 응답의 변화는 화학 물질의 미묘한 변화에 기인 구조 및 화학 종 사이의 sporopollenin의 exine 재료 exine 형태. 28 인해 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 견고성의 변동, 포자 꽃가루 각 종의 처리 조건을 최적화 할 필요가있다.

L. 종의 식물 포자 속 clavatum는 SEC 초 가장 널리 연구 단일 소스되고있다. . 이는이 때문에 널리 이용 가능성, 낮은 비용, 단 분산 및 화학적 안정성에 주로 제안된다 9, 29 포자가 쉽게 하나의 그룹의 형태 sporoplasmic 내용을 수확하여 포함 할 수있다 - 2 ㎛의 세포 소기관 및 Biomolecules. 11 L. 속 clavatum 포자 치료 다양한 용도 천연 분말 윤활제 화장품 30,31베이스, 3032-36 한방에 사용되어왔다. L.로부터 얻어진 SEC 초 속 clavatum 포자 및 처리 후의 꽃가루.이 다른 종으로부터의 SEC 초 이상 처리 탄력적으로 도시 된, 결과 SEC 초들은 복잡 microridge 구조 및 높은 형태 균일 캡슐화 넓은 내부 공동을 제공하는 동시에 유지하는 것으로 나타났다. 7 연구는 것을 나타냅니다 L. 속 clavatum SEC 초 마약, 10, 13 백신, 11 단백질, 7, 14 셀, 8 오일, 5-7,9 및 식품 보조제의 캡슐화에 사용할 수 있습니다. 5,15 관찰 SEC 적재 효율은 기존에 비해 상대적으로 높은 캡슐화 재료. 7은도보고 혜택을 제공하고 있습니다SEC 밀봉하는 등, 6,10 맛을 마스킹하기위한 산화에 대하여 천연 어느 정도의 보호를 제공한다. 기존의 연구에서 12 능력 L. 위해 가장 일반적으로 사용되는 SEC 추출법 등 속 clavatum은 네 가지 주요 단계를 기반으로합니다. 단계 하나는 포자를 탈지 50 ° C에서 최대 12 시간 동안 아세톤 용매 환류입니다. 11 2 단계는 세포질과 단백질 물질을 제거하기 위해 120 ° C에서 최대 12 시간 동안 6 % 수산화 칼륨의 알칼리성 환류입니다. 11 단계 세 180 ° C에서 최대 7 일 동안 85 % 인산에 산 환류는 셀룰로오스 intine 재료를 제거하는 것이다. 11 4 단계가 나머지 비 exine 물질을 제거하기 위해 물, 솔벤트, 산, 염기를 사용하는 포괄적 인 세척 공정 인 화학 잔류 물.

밀봉 애플리케이션 관련 SEC 추출의 주된 목적은, 자유를 이리저리 세포질 물질의 비어있는 캡슐을 제조한다잠재적 인 알레르겐 단백질이 M 및 형태 학적 손상. 2,37을 그러나, 산업 제조의 관점에서, 그러한 에너지 효율, 제조 시간, 안전 및 얻어진 폐기물 추가적인 경제적, 환경 적 요인을 고려하는 것도 중요하다. 에너지 효율에 관해서, 높은 온도와 긴 처리 시간을 모두 생산 비용뿐만 아니라 환경에 미치는 영향을 미칩니다. 생산 기간 및 소요 시간 처리 수익성을 좌우하는 중요한 요소이다. 특히 관심 고온 인산 처리 안전 문제를 증가시키고, 일괄 처리 시간에서 상당한 인프라 정비의 증가 지연에 이르게 부식성 스케일링 될 것으로 알려져 있다는 것이다. 38-40 가능한 경우 발생할 수 필요한 단계의 수를 최소화 크게 생성 된 폐기물을 감소시킨다. 그러나, 일반적으로 L.의 4 단계 프로세스를 사용 속 clavatum SEC 추출은 단순히 EV가연구의 수십 년에서 olved 거의 실제 프로세스 최적화를했다. 최근 Mundargi는 등. (41)은 체계적으로 평가하고 가장 일반적으로보고 된 SEC 추출 기술 중 하나를 최적화함으로써이 분야에서 진행중인 작업에 상당한 기여를했다.

본 연구의 제 1 섹션에서 : 포자 탈지 6 시간 동안 50 ℃에서 아세톤 처리를 이용하여 설명된다; sporoplasm 및 intine 제거 절차는 30 시간 동안 70 ° C에서 85 % 인산 처리를 이용하여 증명된다; 물, 용매, 산 및 염기와 광범위한 세정 잔류 sporoplasmic 콘텐츠의 제거를 입증하기 위해 사용된다; 삼성 전자의 건조는 대류 건조 및 진공 오븐 건조를 이용하여 설명된다. 세 번째 섹션에서 삼성 진공 로딩이 모델 단백질의 진공로드를 이용하여 증명하고, 다음에 소 혈청 알부민 (BSA), 세척 및 동결 건조를 BSA는 --SEC를로드. 네 번째 섹션에서 determinBSA에 캡슐화 효율 ATION는 초음파 프로브를 원심 분리를 이용하고, UV / 비스 분석법 설명된다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L.에서 Sporopollenin Exine 캡슐 1. 추출 (SEC 초) 속 clavatum 포자

주 : SEC 추출 과정의 가연성 분말 (L. 속 clavatum), 고온 부식 산, 가연성 용제, 따라서 적절한 개인 보호 장비 (고글, 안면 마스크, 장갑, 실험실 코트), 사용에 승인 된 위험 평가 및 처분을 포함한다 공인 실험실 직원이 화학 물질은 필수적이다.

  1. 포자 탈지
    1. 유리 냉각기, 물 순환 시스템 및 수조 (도 1)를 사용하여 흄 후드의 환류 설정을 준비한다.
    2. 100g L. 무게 떨어진 점화원에서 먼지를 만들고없이 속 clavatum 포자.
      참고 : 상업적으로 얻을 수 있었다 여기에 사용 된 포자 (자료 목록을 참조하십시오).
    3. 자기 교반 막대로 1 L의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 둥근 바닥 플라스크에 천천히 전송 포자.
    4. 의 포자에 500 ml의 아세톤 추가PTFE 플라스크 균질 현탁액을 부드럽게 진탕 플라스크.
    5. 50 ° C에서 물 목욕 세트의 PTFE 플라스크를 놓고 환류 냉각기에 연결합니다.
    6. 200 rpm으로 교반하면서 6 시간 동안 아세톤에 환류를 수행 한 다음 실온에서 냉각 할 수 있습니다.
    7. 진공 상태에서 여과지를 사용하여 현탁액을 여과하고, 대형 (15cm 직경) 유리 페트리 접시에 탈지 포자를 수집합니다.
    8. 용매 증발을위한 구멍이있는 알루미늄 호일로 덮어 실온 (흄 후드)에서 포자를 건조.
  2. 분해법
    1. 85 % 탈 (DI) 물 (v / v)의 인산을 준비하고 1 L의 PTFE 플라스크에 탈지 건조 포자를 전송합니다.
    2. 탈지 포자에 인산 (85 % v / v)의 500 ML을 추가합니다.
    3. 70 ℃에서 수욕 세트의 PTFE 플라스크를 놓고 환류 응축기에 연결한다.
    4. 30 시간 동안 인산에 부드러운 환류 (70 ° C)을 수행 한 다음에 허용실온에서 냉각.
    5. 500 ml의 따뜻한 DI 물을 사용하여 상기 현탁액을 희석하고, 필터 종이를 사용하는 진공 여과에 의해 수집 SEC 초.
    6. 세척액의 시리즈를 수행하기 위해 세 L 유리 비커에 SEC 초 옮긴다.
  3. 삼성 세탁기
    1. 흄 후드에서 SEC 초를 포함하는 3 L의 유리 비커를 놓습니다.
    2. 10 분 동안 부드러운 교반과 SEC 초에 800 ml의 고온 (50 ° C) DI 물을 추가합니다.
    3. 여과지 진공 여과 설정을 사용하여 상기 현탁액을 필터.
    4. 깨끗한 3 L의 유리 비커에 SEC 초를 수집합니다.
    5. 반복 1.3.1 단계를 반복합니다. 1.3.4합니다. 다섯 번.
    6. 10 분 동안 부드러운 교반과 SEC 초에 600 ml의 고온 (45 ° C) 아세톤을 추가합니다.
    7. 진공하에 여과에 의해 SEC 초를 수집하고 깨끗한 3 L의 유리 비커에 SEC 초를 전송합니다.
    8. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (50 ℃) 2 M 염산을 사용.
    9. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 호 600 ml에 사용t (50 °의 C) 2 M 수산화 나트륨.
    10. 반복 1.3.1과 1.3.4 8 번 단계를 반복합니다.
    11. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (45 ° C) 아세톤을 사용.
    12. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (45 ° C) 에탄올을 사용.
    13. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 800 ㎖ (50 ℃)의 DI 물을 사용.
    14. 모든 수분을 제거하기 위해 24 시간 동안 실온에서 흄 후드에서 여섯 대형 유리 페트리 접시 건조에 깨끗한 SEC 초를 전송합니다.
    15. 60 ℃에서 10 시간 또는 일정 중량까지 1 밀리바의 진공에서 진공 오븐에서 건조 SEC 초.
    16. 건조 SEC 초를 수집하고 폴리 프로필렌 병에 전송할 수 있습니다.
    17. 건조 캐비닛에 SEC 초를 저장합니다.

SEC 초 2. 특성

  1. 다른 단계에서 생성 된 포자와 SEC 초를 사용하여 주사 전자 현미경 분석 (41)을 수행합니다.
  2. 다른 단계에서 생성 된 포자와 SEC 초를 사용하여 원소 분석 (41)을 수행합니다. 디스피 원소 분석 전에 최소한 1 시간 동안 60 ° C에서 모든 샘플은 6.25의 곱셈과 퍼센트 질소를 이용하여 단백질 함량을 계산한다.도 11는 각 샘플에 대한 삼중 측정하여 결과를 얻을.
  3. 동화상 입자 분석기를 사용 micromeritic 특성 분석을 수행. 41
  4. 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 미처리 스캔 처리 및 FITC-BSA로드 된 SEC 초. 41

진공로드 기술 3. 생체 거대 분자 캡슐화

  1. 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 DI 물과 전달을 이용하여 125 ㎎을 1.2 ㎖ / ml의 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 제조 하였다.
  2. SEC 초 150 mg의 무게를 측정하고, BSA 용액에 전송할 수 있습니다.
  3. 균질 한 용액을 형성하기 위해 10 분 동안 튜브를 소용돌이.
  4. 여과지를 이용하여 튜브를 커버.
  5. 1 밀리바에서 진공 4 시간 동안 동결 건조기 플라스크 건조에 튜브를 전송합니다.
  6. 3.1 단계 수행3.5. 3 개의 독립적 인 배치합니다.
  7. BSA에로드 SEC 초를 수집하고 박격포와 유 봉을 사용하여 응집체를 제거합니다.
  8. 50 ML 튜브에 BSA-로드 SEC 초를 전송하고 잔여 BSA를 제거하는 2 ml의 탈 이온수를 추가합니다.
  9. 5 분 4704 XG에서 원심 분리하여 SEC 초를 수집하고 상층 액을 버린다.
  10. 한 번 탈 이온수로 세척을 반복합니다.
  11. 여과지를 사용하여 BSA로드 SEC 초를 포함하는 튜브를 커버.
  12. 냉동실 (-20 ° C)에 SEC 초를 전송하고 1 시간 동안 동결.
  13. 추가로 특성화 될 때까지 냉장고에 24 시간 저장을위한 SEC 초 건조 동결.
  14. 단계 3.1에서와 동일한 절차를 사용하여 BSA없는 위약 SEC 초를 준비한다. 3.13에.
  15. 단계 3.1에서와 동일한 절차를 이용하여 FITC-BSA로드 SEC 초를 준비한다. 3.13에.

캡슐화 효율 4. 결정

  1. 2 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 BSA-로드 SEC 초 5 mg의 무게.
  2. 1.4 ml의 포스 추가테 5 분 동안 생리 식염수의 pH가 7.4 (PBS)와 소용돌이를 버퍼링.
  3. 프로브는 10 초 3 회 40 %의 진폭의 현탁액을 초음파 처리.
  4. 0.45 ㎛의 폴리 에테르 설폰 (PES) 필터를 사용하여 상기 용액을 필터.
  5. 단계 4.1에서와 동일한 절차를 수행한다. 4.4. 위약 SEC 초를 사용.
  6. 공백으로 위약을 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한다.
  7. BSA의 양은 PBS에서 BSA 표준 곡선 (200 내지 1,000 μg의 / ㎖)을 사용하여 캡슐화 정량화. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sporopollenin Exine 캡슐에 대한 간소화 된 추출 과정

L. 속 clavatum SEC 추출은 세 가지 주요 단계에 의해 달성되었다 : (1) 아세톤을 사용하여 탈지; (2) 분해법은 인산에게 85 %를 사용 (v / v)의; (3) 광범위한 SEC 세척 용제를 사용. 유선형 SEC 추출 처리의 흐름은도 1 (A)에 제시된다 -. I 간단히, 처리는 50 ° C에서 6 시간 동안 아세톤 환류와 탈지하는 단계를 포함하고, 탈지 포자는 잔류 제거 퓸 후드에서 밤새 건조시켜 아세톤. 탈지 포자를 30 시간 동안 인산을 사용하는 분해법 하였다. 분해법 동안 sporoplasmic 재료의 대부분이 용해 된 후 진공 여과 단계 동안 제거 하였다. 산 용매를 사용하여 잔류 sporoplasmic 재료를 세척 단계의 광범위한 일련 제거하기 위해서베이스, 물을 수행한다. 초 남음 처음 24 시간 동안 건조시키고, RT에서 10 시간, 잔류 용매 및 수분을 제거하기 위해 추가로 60 ° C 1 밀리바의 진공에서 건조 하였다.

도 1에 도시 된 바와 같이, 모든 SEC 추출 단계가 위험 통지 흄 후드에서 수행 하였다. SEC 추출하는 동안 약 70 %의 질량 손실은 sporoplasmic 물질의 제거로 인해 관찰하고 데이터는 깨끗하고 손상 SEC 초 생산 기존의보고와 일치한다.도 7 19,20,29 유선형 과정 초기 탈지 공정에서 최종 제품에 약 5 일 만에 완료되고 프로세스가 쉽게 적절한 안전 제어와 1kg 실험실 규모의 배치까지 확장 할 수 있습니다.

때문에 involvin하지 않고있는 간단한 단계에 M, 이러한 유리하다 - SEC 초를 이용하여 캡슐화 단계는 그림 1 J에 제시g 거친, 유기 용매 또는 기계적 전단력을 요구. 7 우리 밀봉 실험은 150 mg의 SEC 초 및 SEC 초 흡수하여 충분한 로딩 용액 량을 포함한다. 이러한 초 후 로딩 선택된 수성 또는 유기 용매에 화합물의 용해도에 의해 제한되고,로드는로드 세 방법 중 하나에 의해 달성 될 수있다 : 수동 압축하고, 진공로드. 그러나, 진공 로딩 화합물의 상대적으로 높은 캡슐화를 제공합니다. 7, 19, 20

Sporopollenin Exine 캡슐의 물리 화학적 요소 특성 분석

도 1에 나타난 공정을 간소화하여 제조 SEC 초의 청결도를 결정하기 위해, 표면 및 단면 형태, micromeritic 속성, 원소 조성은 SEC 추출 과정의 다른 단계에서 조사 하였다. 도시 된 바와 같이도 2는 SEM 이미지는 고유 한 미세 구조로 그대로 포자를 나타내고, 처리 전에 마이크론 스케일 sporoplasmic 소기관의 단면 이미지에서 관찰되었다. 포자 탈지 및 알칼리 처리로 어떤 형태 학적 및 구조적 변화는 sporoplasmic 세포 기관의 파열에서 떨어져 관찰되지 않았다.

도 3은 5 시간 내지 30 시간까지 다양한 시점에서의 인산을 사용하는 분해법 SEC 초 이후의 SEM 이미지를 나타낸다. 최대 30 시간 동안 분해법 이러한 결과 지원 sporoplasmic 물질없는 그대로 깨끗한 SEC 초를 제공합니다. 잔류 단백질 물질을 확인하기 위해, CHN 원소 분석 (29)을 수행하고, 데이터는 이들 결과는 깨끗하고 손상 SEC 초를 달성하는 최적의 처리 조건을 선택하기위한 지침을 제공하는도 4에 제시되어있다. 탈지 및 알칼리 처리 SEC 초의 경우, 실질적인 단백질 없다물질 제거가 관찰된다. 분해법은 인산을 사용하여 단, 단백질 성 물질의 대부분은 30 시간에 제거하고, 더 이상의 감소는 120 시간에 처리 시간을 증가 관찰되지 않는다. 원소 데이터는 SEC 초 7,11의 연장 처리에 상업 SEC 초에 이전 보고서와 일치한다.

Micromeritic 특성 동화상 입자 분석 (DIPA)로 분석하고, 결과가 31.0 ± 2.2 ㎛의 크기는,이 결과는 최대 30 시간 동안 분해법 후 SEC 초의 균일 한 크기 분포를 지원도 5에 제시되어있다. 반면, 삼성 구조적 무결성 장시간 분해법으로 감소하고 30 시간 처리 기간을 넘어 SEC 초 상당한 분열을 야기하기 시작합니다.

그림 6은 분해법 프로로 제작 SEC 초에 대한 SEM 및 DIPA 데이터를 보여줍니다30 시간 동안 인산을 사용 cessing. 이러한 결과는 탈지 단계 이후에, 32.5 ± 2.7 ㎛의 균일 한 크기 분포와 깨끗하고 그대로 SEC 초를 생산 분해법 확인합니다. 분해법 전용 초 남음 상기 이전 보고서 바와 같이 알칼리 분해법에 의해 제조 처리 SEC 초에 필적 %의 질소 함량을 결정 대하여, 11 0.15 ± 0.0 %의 잔류 단백질 함량을 갖는다. (7)

Sporopollenin Exine 캡슐을 사용하여 마이크로 캡슐화

L.의 사용을 설명하기 위해, 분해법 전용 프로세스를 사용하여 제조 초 남음 속 clavatum, 마이크로 캡슐화 실험 모델 단백질로서 BSA를 사용하여 수행 하였다. SEC 초에 적하 7도. 150 mg의 SEC 초 및 125 ㎎ / ㎖ BSA 1.2 mL로하여 진공 로딩 기술을 사용하여 달성 CLSM 메신저를 도시 한전 분해법 전용 처리 후 및 FITC-BSA 캡슐화와 SEC 초 세. 데이터 인해 포자 캐비티 내부 sporoplasm 성분의 존재로 그 치료 SEC 초 전시자가 형광을 나타냅니다. 그러나, 분해법 전용 가공 후, 모든 sporoplasmic 내용은 빈 내부 공동의 결과로 제거됩니다. 놀랍게도, FITC-BSA의 밀봉 후 녹색 형광 SEC 초에 모델 단백질의 캡슐화를 확인은 SEC 초 내부에서 관찰된다. 19,20,41

또한, SEC 초, SEM 및 DIPA 분석을 실시 하였다 BSA로드 및 데이터가 그림 8에 표시됩니다. SEM 이미지는 BSA 로딩 후 그대로 깨끗한 microridges의 존재를 확인의 형태 학적 변화와 micromeritic 특성을 조사한다. 또한, 그다지 큰 변화는 SEC 초 BSA로 로딩 한 후 직경, 원형, 및 종횡비가 관찰되지 않았다. 이 자료는 consiste 있습니다NT SEC 초를 사용하여 약물의 캡슐에 이전 보고서와. 7, 10

캡슐화 된 BSA의 양을 정량화하는, BSA는 BSA로드 SEC 초 5 ㎎으로부터 추출하고, 그 데이터는 표 1에 제시되어있다.이 데이터는 SEC 초 그램 당 BSA 로딩 0.170 ± 0.01 g을 나타낸다. 전반적으로, SEM, DIPA, CLSM 및 분광 분석에 의해 BSA의 정량은, L.에서 BSA의 성공적인 캡슐화를 확인 속 clavatum SEC 초 삼성 전자 형태 안정성.

그림 1
L. 그림 1. 간소화 추출 과정 속 clavatum Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초). (A) 비 처리 포자. (B) 포자 6 시간 동안 50 ℃에서 환류 설정을 사용하여 탈지. (C) 용매를 여과 수집 탈지 포자 이온. (D)을 실온에서 탈지 포자 건조. (E) 30 시간 동안 70 ° C에서 85 % (v / v) 인산을 사용하여 PTFE 플라스크 포자 분해법. (F) 산 여과 진공 여과를 사용하여 셋업. (G) SEC 물, 산, 염기의 시리즈를 사용하여 세정하고, 용매 세척 단계. (H) SEC 건조 60 ℃, 10 시간, 1 밀리바의 진공에서 진공 오븐을 사용. (I) 그대로 클린 및 (K). SEC 초와 BSA 용액을 혼합. 최종 제품으로 (J)를 SEC 초를 건조 SEC 초와 BSA 용액을 균질화. SEC 초에 BSA의 (L) 진공로드. (M) BSA-로드 SEC 초입니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

54768 / 54768fig2.jpg "/>
L. 그림 2. 주사 전자 현미경 분석 전 산 처리의 다른 단계 동안 속 clavatum 포자. (A) sporoplasmic 세포 소기관과 생체 분자를 나타내는 처리되지 않은 포자. (B) 아세톤 처리 포자가 sporoplasmic 내용을 중단 표시합니다. (C)(D) 알칼리가 sporoplasmic 내용의 제거를 보여주는 포자를 처리하고 주름 내부 셀룰로오스 intine 층. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
L. 그림 3. 주사 전자 현미경 분석 산의 다른 단계 동안 속 clavatum 포자5 ~ 30 시간으로 처리 (A - D). 각각 그대로 외부 미세 깨끗한 내부 공동을 나타내는 5, 10, 20, 30 시간 산 처리 된 포자. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
포자 및 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초). 치료의 다양한 단계 후 단백질 함량 그림 4. 단백질 함량. 표시 데이터 표준 편차 중으로 측정의 평균이다 (N = 3). (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.

그림 5
포자의 그림 5. 동적 이미징 입자 분석 (DIPA) 및 Sporopollenin Exine 캡슐 치료의 여러 단계에서 (SEC 초)(A - C)가. 각각 미리 산 처리, 산 처리, 그대로 SEC 초입니다. 플롯 SEC 직경, 원형, 종횡비, 에지 기울기를 나타내는 그래프이다. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 동적 이미징 입자 분석 (DIPA) 30 시간의 Acidoly그대로 외부 미세하고 깨끗한 내부 공동을 보여주는 동생 전용 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초). (A) SEC 초. (B) SEC 직경, 원형 및 화면 비율의 대표 그래프. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7. 공 초점 레이저 주사 현미경 전과 치료 및 BSA 캡슐화 후 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초)의 (CLSM) 분석. 첫 번째 행은 sporoplasmic 세포 소기관 및 생체 분자의 자기 형광을 나타내는 치료 포자를 보여줍니다. 두 번째 행은 비어있는 내부 공동 30 시간의 분해법 전용 SEC 초를 나타낸다. 세 번째 행은 FITC-BSA가로드 묘사30 시간의 분해법 전용 SEC 초에. (스케일 바는 10 μm의 수 있습니다). (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 BSA로드 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초)의 동적 이미징 입자 분석 (DIPA) 특성. BSA-SEC 초로드의 (A) SEM 이미지. (B) BSA로드 SEC 직경, 원형, 종횡비, 에지 기울기의 대표 그래프. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자료 배치 당 BSA 로딩 (125 ㎎ / ㎖) 5 mg을 초 후 BSA (mg)을 BSA의 양로드 (SEC 초 g 당 g) 처리되지 않은 포자 0.6 ml의 0.654 ± 0.05 0.131 ± 0.01 SEC 초 1.2 ml의 0.831 ± 0.05 0.170 ± 0.01

처리되지 않은 포자와 SEC 초에 소 혈청 알부민 (BSA) 표 1. 캡슐화. BSA 용액의 부피는 '치료 포자'또는 'SEC 초'의 150 mg을 배치 당 로딩에 사용됩니다. 표시 데이터 표준 편차 세중 배치의 평균 (N = 3). (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 작품, L.에서 SEC 추출의 체계적인 분석 속 clavatum 포자 제시이 보고서는 또한 높은 공정 온도 (180 ° C)을 필요로하는 기존의 프로토콜과 대조적으로, 기존의 일반적으로 사용되는 프로토콜. 11 크게 간소화를 달성하면서 고품질의 캡슐을 제조 할 수 있음을 표시하고, 긴 처리 시간 (7 일) 11 현재 SEC 추출 처리 최적화 주로 분해법 단계의 온도 및 시간을 절감에 집중 하였다.

탈지 및 알칼리 처리는 포자에서 sporoplasmic 재료의 최소한의 제거를 제공한다. 120 시간이 sporoplasmic 물질의 최대 양을 제거에 그러나, 5 시간에서 분해법. 결과는 총 처리 시간 및 온도를 급격히 종래 기술 (11)로부터 감소하고 중간 온도에서 30 시간 것이 될 수 있다는 것을 나타내는 (70° C)을 인산 최적 품질 캡슐을 제공 하였다. 또한, 30 시간의 분해법을 넘어, 그것은 SEC 초는 SEC 초의 전체 배치는 전반적인 구조적 무결성의 감소를 나타내는 될 수 있음을 시사 파괴하기 시작했다 입자 파편의 상당한 증가가 관찰되었다 것으로 나타났습니다. 또한, 그 주목해야 L. 속 clavatum는 비교적 견고한 sporopollenin 2를 포함하는 것으로 간주되고, 이러한 산의 농도, 온도 및 / 또는 가수 분해 시간 등이 프로토콜에 관련된 특정 처리 조건이 다른 꽃가루 종 조정해야 할 수도있다.

그것은 보였다 그 분해법 만 사용하여 인산 (85 % V는 / v)의 30 시간 수율 깨끗하고 그대로 SEC 초를 위해. (41) 데이터는 분해법은 SEC의 생산에 중요한 단계임을 확인하여 SEC 초 생산. 마지막으로, 산 전용 초 남음 BSA의 밀봉에 사용 된 로딩의 높은 수준을 관찰 하였다. 로딩 wSEC 내부 캐비티 압력 강제 빈 캡슐로 BSA 용액을 그리도록 변경된다 진공의 적용에 의해 달성있다. 나노 채널 (직경 15 -. 20 ㎚), 이전에 L.의 exine 벽에서 확인되었다 속 clavatum 7은 용액 큰 내부 공동 내로 입력 할 수있다. 로딩 후, 캡슐을 세척하고, 자유 유동 분말을 수득 동결 건조기에서 건조시켰다.

크기의 균일 성 및 형태 학적 특성은 성공적인 밀봉 재료의 품질을 평가하기위한 중요한 요소이다. BSA로드 SEC 초의 관찰 크기의 균일 성 및 손상 형태는 마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 분해법 전용 처리 SEC 초의 잠재적 인 사용을 확인했다.

이러한 결과는 SEC 초의 대규모 산업 생산과 약물의 마이크로 캡슐화에 SEC 초 잠재적 애플리케이션에서 큰 관심을 자극 중요단백질, 펩티드, 보조 식품, 기능 식품, 화장품.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17, (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45, (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43, (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21, (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21, (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22, (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1, (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6, (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31, (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2, (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12, (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26, (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461, (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148, (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5, (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12, (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109, (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47, (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21, (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698, (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57, (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3, (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6, (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190, (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. CRC press. 182 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics