Добыча на растительной основе Капсулы для микроинкапсуляцию приложений

1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Этот протокол / рукописи описывает упрощенный процесс для производства Спорополленин экзиной капсул (СЭК) от спор clavatum Lycopodium и для загрузки гидрофильных соединений в этих СЭК.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Микрокапсулы, полученные из растений на основе спор или пыльцы обеспечивает надежную платформу для разнообразных применений микрокапсул. Спорополленин экзина капсулы (СЕК) получаются, когда споры или пыльца обрабатываются таким образом, чтобы удалить внутренние sporoplasmic содержимое. Полученные полые микрокапсулы проявляют высокую степень однородности micromeritic и сохраняют сложные микроструктурные особенности, связанные с конкретными видами растений. В данном случае мы демонстрируют обтекаемый процесс для производства СЭК из спор clavatum Lycopodium и для загрузки гидрофильных соединений в этих СЭК. Действующая процедура изоляции SEC была недавно оптимизирована, чтобы значительно снизить требования к обработке, которые обычно используют в SEC изоляции, а также для обеспечения производства неповрежденных микрокапсул. Природные L. clavatum спорами обезжиривают ацетоном, обрабатывают фосфорной кислотой, и тщательно промывают , чтобы удалить sporoplasmiгр содержание. После того, как ацетон обезжириванию, один этап обработки с использованием 85% -ной фосфорной кислоты, как было показано, чтобы удалить все sporoplasmic содержимое. За счет ограничения кислоты времени обработки до 30 ч, можно изолировать чистую Secs и избежать SEC трещиноватость, которое было показано, происходит при длительном времени обработки. Обширные промывание водой, разбавленным кислотам, разбавленным основания, и растворители гарантирует, что все sporoplasmic материалы и химические остатки, надлежащим образом удалены. Способ вакуумного загрузка используется для загрузки модели белка (бычий сывороточный альбумин) в качестве репрезентативного гидрофильным соединением. Вакуумная загрузка обеспечивает простую технику для загрузки различных соединений без необходимости в агрессивных растворителей или нежелательных химических веществ, которые часто необходимы в других протоколах микроинкапсуляции. На основе этих изоляции и загрузки протоколов, ИКС обеспечивают перспективным материалом для использования в разнообразных микрокапсуляции приложений, таких как, терапевтических средств, продуктов питания, косметики и личной тычок по уходудуктов.

Introduction

Существует значительный интерес в натуральных капсул на растительной основе , полученных из растительных спор и пыльце для использования в приложениях микроинкапсуляции. 1-15 В природе, споры и пыльца обеспечивают защиту чувствительных генетических материалов от суровых условий окружающей среды. Базовая структура растительных спор и пыльцы, как правило, включает внешний слой оболочки (экзина), внутренний слой оболочки (intine), а внутренний цитоплазматический материал. Экзины состоит из химически прочного биополимера 1,9,10,13,16 упоминается как Спорополленин и intine состоит в основном из целлюлозных материалов. 16-18 Пустые капсулы , могут быть выделены с помощью различных процессов для удаления 7,9 цитоплазматического материала , белки, и intine слой. 2,12,16 Эти Спорополленин экзиной капсулы (ИКС) обеспечивают привлекательную альтернативу синтетическим инкапсулянтам из - за их узким распределением по размерам и однородной морфологии. 7,9,13,19,20разработка стандартизованных процессов для получения Secs из различных видов растений, таких как Плаун Булавовидный, открывает возможности для широкого спектра микрокапсуляции применений в области доставки лекарственных средств, пищевых продуктов и косметических средств. 6,10-13,21

Для того чтобы получить Secs, исследователи сначала обрабатывают спор и пыльцы с органическими растворителями и кипятили с обратным холодильником в щелочных растворах для удаления цитоплазматического содержимого. 22-25 Тем не менее, оставшаяся структура капсулы была определена по - прежнему содержит целлюлозное intine слой. Для того чтобы устранить это, исследователи исследовали использование длительной кислотной обработки гидролиза с использованием соляной кислоты, горячей серной кислоты, или горячей фосфорной кислоты в течение нескольких дней, 22-25 с фосфорной кислотой становится предпочтительным методом удаления intine SEC. 2 Тем не менее, продолжающийся исследования на протяжении многих лет показал, что различные споры и пыльцу имеют различную степень устойчивости к суровой обработке меняthods обычно используется. 26,27 Некоторые споры и пыльцу полностью деградируют и теряют структурную целостность в сильных щелочных растворах, или становятся сильно повреждены в сильных кислых растворах. 16 Изменчивость в SEC ответ на условия лечения из - за тонких изменений в химической структура и экзина морфология Спорополленин экзины материала между видами. 28 из - за изменчивости в надежности Спорополленин экзиной капсул (СЭК), необходимо оптимизировать условия обработки для каждого вида спор и пыльцы.

Растительные спорами из вида L. clavatum стали наиболее широко изучены единственным источником СЭК. Предполагается , что это в первую очередь из - за его широкой доступности, низкой стоимости, монодисперсности и химической устойчивости 9,29 Споры могут быть легко собраны и содержать sporoplasmic содержимое в виде групп 1 -. 2 мкм клеточных органелл и бiomolecules. 11 Л. clavatum споры были использованы в качестве натурального порошка смазки, 30,31 основы для косметических средств, 30 и в фитотерапии 32-36 для широкого спектра терапевтических применений. В ИКС , полученные из L. clavatum было показано , что более устойчивыми к обработке , чем СЭК от других видов спор и пыльцы. 2 после обработки, в результате ИКС было показано , что сохраняют свои замысловатые microridge структуры и высокой морфологической однородности, обеспечивая при этом большую внутреннюю полость для капсулирования. 7 Исследования показывают , что L. clavatum ИКС могут быть использованы для инкапсулирования лекарственных средств, вакцин 10,13, 11 белков, 7,14 клетки, 8 масла, 5-7,9 и пищевые добавки. 5,15 Наблюдаемые эффективность загрузки SEC относительно высоки по сравнению с обычными герметизация материалы. 7 Есть также целый ряд сообщений о преимуществахв SEC инкапсулирования , такие как способность маскировать вкус, 6,10 и обеспечить некоторую степень естественной защиты от окисления. 12 в существующих исследованиях, наиболее часто используемым методом экстракции SEC для L. clavatum базируется на четырех основных этапов. Шаг один дефлегмацию растворителя в ацетоне в течение 12 ч при 50 & deg ; С до обезжирить спорами. 11 Шаг второй щелочной кипячение с обратным холодильником в 6% -ного раствора гидроксида калия в течение 12 ч при 120 ° С для удаления цитоплазматической и протеиновые материалы. 11 Шаг три является кислота при кипячении в 85% -ной фосфорной кислоты в течение 7 дней при температуре 180 ° с для удаления целлюлозного intine материала. 11 Шаг четвертый представляет собой комплексный процесс стирки с использованием воды, растворителей, кислот и оснований , чтобы удалить все оставшиеся без экзиной материала и остатки химических веществ.

Основными задачами добычи SEC по отношению к инкапсуляции приложений для получения капсул, которые являются пустыми цитоплазматического материала, свободный сюдам потенциально аллергенных белков, и морфологически нетронутыми. 2,37 Однако, с точки зрения промышленного производства, важно также учитывать дополнительные экономические и экологические факторы, такие как, энергоэффективность, продолжительность производства, безопасности, а также в результате отходов. Что касается энергоэффективности, как высокие температуры и длительные периоды времени обработки влияют на себестоимость продукции, а также влияние на окружающую среду. Продолжительность производства и сроки выполнения работ являются ключевыми факторами, влияющими на рентабельность переработки. Особую озабоченность вызывает то , что высокая температура обработки фосфорной кислоты увеличивает проблемы безопасности и известно, приводит к коррозийной масштабированием , что приводит к значительному увеличению содержания инфраструктуры и задержки во время периодического выполнения заказов. 38-40 Где это возможно, сводя к минимуму количество шагов , необходимых может привести значительному сокращению отходов, образующихся. Тем не менее, обычно используются четыре этапа процесса L. добыча clavatum SEC просто эвolved от десятилетий исследований и имел мало фактической оптимизации процесса. В последнее время , Mundargi и др., 41 внесли значительный вклад в текущую работу в этой области путем систематической оценки и оптимизации одного из наиболее часто встречающихся методов экстракции SEC.

В первой части этого исследования: споровой обезжириванию демонстрируется с использованием обработки ацетона при 50 ° С в течение 6 ч; спороплазма и intine удаление процедуры продемонстрированы с использованием 85% обработки фосфорной кислоты при 70 ° С в течение 30 ч; тщательной промывки водой, растворители, кислоты и основания используется для демонстрации удаления остаточных sporoplasmic содержимого; и SEC сушка демонстрируется с использованием конвекционной сушки и вакуумной сушильной печи. В третьей секции, SEC вакуума загрузка демонстрируется с использованием вакуумной загрузки модельного белка, бычий сывороточный альбумин (БСА), с последующим БСА загруженным-втор промывку и лиофилизацию. В четвертом разделе, determinвания эффективности инкапсулирования БСА демонстрируется с использованием центрифугирования, зонд ультразвука, и UV / Vis-спектрометрия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Извлечение Спорополленин экзиной капсулы (ИКС) из L. clavatum Spores

Примечание: Процесс экстракции SEC включает в себя горючий порошок (L. clavatum), горячие едкие кислоты и горючие растворители, поэтому собственно средства индивидуальной защиты (очки, маски, перчатки, лабораторный халат), утвержденной оценки рисков по использованию и утилизации химикаты уполномоченными персонала лаборатории имеет важное значение.

  1. Спора Обезжиривание
    1. Подготовить рефлюкс установку в вытяжном шкафу с использованием стекла конденсатора, системы циркуляции воды и водяная баня (рисунок 1).
    2. Взвесить 100 г L. clavatum споры без образования пыли и от любого источника воспламенения.
      Примечание: Споры, используемые здесь были коммерчески получены (см список материалов).
    3. Передача спорами медленно в 1-литровую политетрафторэтилена (PTFE) круглодонную колбу с магнитным перемешивающим стержнем.
    4. Добавить 500 мл ацетона спор вPTFE колбу и встряхивают колбу аккуратно до получения однородной суспензии.
    5. Поместите PTFE колбу в наборе водяной бане при 50 ° C и подключение к обратным холодильником.
    6. Выполнение кипячении в ацетоне в течение 6 ч при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту, а затем дают остыть при комнатной температуре.
    7. Суспензию фильтруют с использованием фильтровальной бумаги под вакуумом и собирают обезжиренных спорами в больших (диаметром 15 см) стеклянные чашки Петри.
    8. Сухие споры при комнатной температуре (вытяжного шкафа) путем покрытия с алюминиевой фольгой с отверстиями для испарения растворителя.
  2. ацидолиза
    1. Готовят 85% (об / об) фосфорной кислоты с деионизированной (ДИ) воды и передавать обезжиренные сухие спорами с PTFE колбу емкостью 1 л.
    2. Добавить 500 мл фосфорной кислоты (85% об / об) в обезжиренных спор.
    3. Поместите PTFE колбу в наборе водяной бане при 70 ° C и подключение к обратным холодильником.
    4. Выполните нежную дефлегмацию (70 ° C) в фосфорной кислоте в течение 30 ч, а затем позволяютпрохладном при комнатной температуре.
    5. Разбавляют суспензию с помощью 500 мл теплой воды DI и собирать SECS путем вакуумной фильтрации с использованием фильтровальной бумаги.
    6. Передача SECS в стеклянный стакан объемом 3 л, чтобы выполнить серию промываний.
  3. SEC Стиральная
    1. Поместите 3 л стеклянный стакан, содержащий SECS в вытяжном шкафу.
    2. Добавить 800 мл горячей (50 ° C) DI воды к СЭК при осторожном перемешивании в течение 10 мин.
    3. Суспензию фильтруют с помощью фильтровальной бумаги и вакуумной фильтрации настройки.
    4. Соберите SECS в чистом 3 л стеклянный стакан.
    5. Повторите шаги 1.3.1. 1.3.4. пять раз.
    6. Добавить 600 мл горячей (45 ° С) ацетон в СЭК при осторожном перемешивании в течение 10 мин.
    7. Собирают Secs путем фильтрации под вакуумом и передать Secs в чистую 3 л стеклянный стакан.
    8. Повторите шаги 1.3.6. и 1.3.7. с использованием 600 мл горячей (50 ° С) 2 М соляной кислоты.
    9. Повторите шаги 1.3.6. и 1.3.7. используя 600 мл хот (50 ° С), 2 М гидроксида натрия.
    10. Повторите шаги 1.3.1 и 1.3.4 в восемь раз.
    11. Повторите шаги 1.3.6. и 1.3.7. с использованием 600 мл горячей (45 ° С) ацетон.
    12. Повторите шаги 1.3.6. и 1.3.7. с использованием 600 мл горячей (45 ° С) этанол.
    13. Повторите шаги 1.3.6. и 1.3.7. с использованием 800 мл горячей (50 ° С) деионизованной воды.
    14. Передача чистых Секунды до шести больших стеклянные чашки Петри и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 24 часов, чтобы удалить все содержание воды.
    15. Сушат Secs в вакуумной печи при 60 ° С и давлении 1 мбар в вакууме в течение 10 часов или до постоянного веса.
    16. Соберите высушенного SECS и передать бутылку полипропилена.
    17. Храните SECS в сухом шкафу.

2. Характеристика СЭК

  1. Выполнение сканирующей электронной микроскопии анализ 41 с использованием спор и Секунды , произведенные на разных этапах.
  2. Выполнить элементный анализ 41 с использованием спор и Секунды , произведенные на разных этапах. DRy все образцы при температуре 60 ° С в течение по меньшей мере 1 часа до элементного анализа и рассчитывают содержание белка с использованием процентов азота с коэффициентом размножения 6,25. 11 Получение результатов с помощью трехкратным измерениям для каждого образца.
  3. Провести анализ micromeritic свойств с помощью динамического анализатора частиц изображения. 41
  4. Сканирование необработанный, обрабатываются и FITC-БСА-нагруженные ИКС с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. 41

3. биомакромолекула Инкапсуляция с помощью вакуума Погрузочная техника

  1. Готовят раствор 1,2 мл 125 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), используя ДИ воды и перенос в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
  2. Взвешивают 150 мг СЭК и переносят в раствор БСА.
  3. Vortex пробирку в течение 10 мин, с образованием однородного раствора.
  4. Накройте трубку с использованием фильтровальной бумаги.
  5. Перенесите трубку к сублимационной сушилки колбу и сухой в течение 4 ч с вакуумом при 1 мбар.
  6. Выполните шаги 3.1до 3.5. для трех независимых партий.
  7. Собирают БСА загруженное Secs и удалить агломераты с помощью ступки и пестика.
  8. Передача БСА загруженным Secs в 50 мл пробирку и добавляют ДИ воды 2 мл, чтобы удалить остаточный БСА.
  9. Соберите SECS центрифугированием при 4,704 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант.
  10. Повторите промывание дистиллированной водой один раз.
  11. Накройте трубки, содержащей БСА-нагруженных SECS с использованием фильтровальной бумаги.
  12. Передача SECS в морозильную камеру (-20 ° C) и заморозить в течение 1 ч.
  13. Замораживание высушить SECS в течение 24 ч и хранить в морозильной камере до дальнейшей характеристики.
  14. Готовят Secs плацебо без ВСА, используя ту же процедуру, что и на стадиях 3.1. до 3.13.
  15. Подготовьте FITC-БСА нагруженных Secs используя ту же процедуру, как на этапах 3.1. до 3.13.

4. Определение эффективности Encapsulation

  1. Взвесить 5 мг БСА-нагруженных СЭК в 2 мл полипропиленовые пробирки.
  2. Добавить 1,4 мл фосфаТ.Е. буферный солевой раствор, рН 7,4 (PBS) и перемешивают механически в течение 5 мин.
  3. Зонд разрушать ультразвуком суспензию при амплитуде 40% в течение 3-х циклов 10 сек.
  4. Фильтр решение с использованием 0,45 мкм полиэфирсульфона (PES) фильтр.
  5. Выполните ту же процедуру, как на этапах 4.1. 4.4. используя SECS плацебо.
  6. Измеряют поглощение при 280 нм с использованием плацебо в качестве бланка.
  7. Определить количество БСА инкапсулированный с использованием стандартной кривой , бычий сывороточный альбумин ( от 200 до 1000 мкг / мл) в PBS. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оптимизированный процесс экстракции для Спорополленин экзиной капсул

Л. Добыча clavatum SEC было достигнуто за счет трех основных этапов: (1) обезжиривания с использованием ацетона; (2) ацидолиза с использованием фосфорная кислота 85% (об / об); и (3) Обширный SEC стирки с использованием растворителей. Поток обтекаемого процесса экстракции SEC представлена на рисунке 1 A -. Я коротко, то способ включает обезжиривающее стадию ацетоном кипячения с обратным холодильником в течение 6 ч при 50 ° С и обезжиренные споры затем сушат в течение ночи в вытяжном шкафу для удаления остаточного ацетон. Обезжиренные споры были подвергнуты ацидолиза с использованием фосфорной кислоты в течение 30 ч. Во время ацидолиза большинство sporoplasmic материалов раствор ют, а затем удаляют на стадии вакуумной фильтрации. Для того, чтобы удалить остаточный sporoplasmic Материалы для обширный ряд стадий промывки с использованием растворителей, кислот, Основание, и вода выполняется. В ИКС были первоначально сушили при комнатной температуре в течение 24 ч и затем сушили при 60 ° С и давлении 1 мбар в вакууме в течение 10 ч для удаления остаточных растворителей и влаги.

Как показано на рисунке 1, все этапы добычи SEC были выполнены в вытяжном шкафу с уведомлением об опасных свойствах . Во время экстракции SEC, примерно 70% потери массы наблюдается за счет удаления sporoplasmic материалов и наши данные согласуются с существующими сообщениями о производстве чистых и нетронутых СЭК. 7, 19,20,29 обтекаемой процесс от начальной стадии обезжиривания до конечного продукта завершается приблизительно через 5 дней, и процесс может быть легко увеличено до 1 кг партии лабораторного масштаба с использованием надлежащих мер контроля безопасности.

Шаги Инкапсуляция , использующие СЕК представлены на рисунке 1 J - M, это выгодно из - за того , что простые шаги без involvinг жесткие органические растворители или требуют механических усилий сдвига. 7 Наши эксперименты включают инкапсулирования 150 мг СЭК и объем раствора загрузки , достаточное для поглощения со стороны СЭК. Загрузку в этих СЭК ограничена растворимости соединения в отдельных водных или органических растворителях, и загрузка может быть достигнута с помощью любого из трех способов загрузки: пассивный, сжатие и вакуумной загрузки. Тем не менее, вакуумная нагрузка обеспечивает относительно более высокую герметизацию соединений. 7, 19,20

Физико - химические Характеризации Спорополленин экзиной капсулы

Для определения чистоты СЭК , полученных с использованием обтекаемый процесс , представленный на рисунке 1, поверхность и поперечного сечения морфология, micromeritic свойства и элементный состав исследовали на различных этапах процесса экстракции SEC. Как показано вНа рисунке 2, изображения СЭМ показывают интактные спорами с уникальной микроструктурой, и перед обработкой, наблюдались микронных sporoplasmic органеллы на изображении поперечного сечения. С споровой обезжириванию и щелочной обработки не наблюдались морфологические и структурные изменения, кроме разрывающее из sporoplasmic органелл.

На рисунке 3 показаны СЭМ изображения СЭК после ацидолиза с использованием фосфорной кислоты в различные моменты времени от 5 часов до 30 часов. Эти результаты подтверждают, что ацидолиза до 30 ч обеспечивает неповрежденные и чистые SECS лишенные sporoplasmic материалов. Для подтверждения остаточного белкового материала, CHN элементный анализ 29 была выполнена , и данные представлены на рисунке 4. Эти результаты обеспечивают руководство для выбора оптимальных условий обработки для достижения чистого и неповрежденного Secs. В том случае обезжиренной и обрабатывают щелочью СЭК, никакой существенной белковоенаблюдается удаление материала. Тем не менее, с помощью ацидолиза фосфорной кислоты, большинство из белковых материалов, удаляется в 30 ч и дальнейшее уменьшение не наблюдается с увеличением времени процесса до 120 ч. Элементарный данные согласуются с предыдущими сообщениями о расширенной обработке СЭК 7,11 и с коммерческими СЭК.

Micromeritic свойства анализировали с помощью динамического анализа частиц изображения (DIPA) , и результаты представлены на рисунке 5. Эти результаты подтверждают равномерное распределение по размерам СЭК после ацидолиза в течение до 30 часов, с размером 31,0 ± 2,2 мкм. В отличие от этого, SEC структурная целостность уменьшается при длительном ацидолиза и начинает вызывать значительную фрагментацию СЭК за пределами продолжительности лечения 30 час.

На рисунке 6 показаны данные SEM и Dipa для СЭК производства только с ацидолизом Proботки с использованием фосфорной кислоты в течение 30 ч. Эти результаты подтверждают, что после стадии обезжиривания, ацидолиза производства чистых и неповрежденных Secs с равномерным распределением по размерам 32,5 ± 2,7 мкм. Ацидолиза-только ИКС имеют остаточное содержание белка составляет всего 0,15 ± 0,0%, как это определено по отношению к содержанию% азота, 11 , которое сравнимо с СЭК , полученных с помощью щелочи и ацидолиз обработки , как описано выше , и с предыдущими отчетами. 7

Микроинкапсуляция использованием Спорополленин экзиной капсулы

Для того чтобы продемонстрировать использование L. clavatum ИКС , полученные с использованием процесса ацидолиза только микрокапсулирование эксперименты проводили с использованием БСА в качестве модельного белка. Загрузку в СЭК была достигнута с использованием технологии вакуумной загрузки с использованием 150 мг Secs и 1,2 мл 125 мг / мл бычьего сывороточного альбумина. На рисунке 7 показана КЛСМ IMвозраст СЭК до и после ацидолиз только обработки и с FITC-БСА инкапсуляцию. Данные показывают, что необработанные ИКС выставляется аутофлуоресценцию из-за наличия спороплазма составляющих внутри споровой полости. Тем не менее, после того, как ацидолиз только обработку, все sporoplasmic содержимое удалены в результате пустой внутренней полости. Поразительно, но после того, как инкапсуляция FITC-БСА, зеленая флуоресценция наблюдается внутри СЭК, подтверждая инкапсуляцию модельного белка в СЭК. 19,20,41

Кроме того, для изучения морфологических изменений и micromeritic свойства БСА загруженным ИКС, были проведены SEM и анализ DIPA и данные представлены на рисунке 8. Изображения SEM подтверждают наличие нетронутых и чистых microridges после загрузки БСА. Кроме того, не было обнаружено никаких существенных изменений в диаметре, округлости и соотношением сторон после БСА загрузки в СЭК. Эти данные consisteнт с предыдущими сообщениями о инкапсулирования лекарственных средств с использованием СЕК. 7,10

Для определения количества инкапсулированного БСА, БСА экстрагировали из 5 мг БСА-нагруженной СЭК, а данные представлены в таблице 1. Данные показывают , 0,170 ± 0,01 г бычьего сывороточного альбумина нагрузки на грамм СЭК. В целом, SEM, DIPA, CLSM, и количественное определение БСА по спектральным анализом, подтверждают успешное инкапсулирование БСА в L. clavatum ИКС и SEC морфологической устойчивости.

Рисунок 1
Рисунок 1. Оптимизированный процесс экстракции для L. clavatum Спорополленин экзиной капсулы (ИКС). (А) Необработанные спорами. (Б) Спора обезжиривание с помощью дефлегмации настройку при 50 ° С в течение 6 ч. (С) растворитель для фильтрации и сбора ион обезжиренных спор. (D) Сушка обезжиренного спор при комнатной температуре. (Е) Спора ацидолизом в тефлоновой колбе с использованием 85% (об / об) фосфорной кислоты при 70 ° С в течение 30 ч. (F) Кислоты - фильтрация с использованием вакуумной фильтрации SEC сушки с использованием вакуумной печи при температуре 60 ° C и 1 мбар в течение 10 час установки. (G) SEC стиральные с использованием ряда воды, кислоты, основания и растворители стадии промывки. (H). (I) неповрежденными, чистый и сушат Secs в качестве конечного продукта. (J) Смешивание Secs и БСА раствора. (к) гомогенизацию Secs и БСА раствора. (L) , вакуумная загрузка БСА в СЭК. (М) БСА загруженным Secs. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.

54768 / 54768fig2.jpg "/>
Рисунок 2. растровом электронном микроскопе Анализ L. clavatum Spores на различных этапах предварительной кислотной обработки. (A) Необработанные споры , показывающие sporoplasmic клеточных органелл и биомолекул. (В) Ацетон обработанные споры показывая разрушенные sporoplasmic содержание. (C) и (D) щелочами споры , показывающие удаление sporoplasmic содержимого и морщинистой внутренний целлюлозный слой intine. Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. растровом электронном микроскопе Анализ L. clavatum Spores на различных этапах кислотыЛечение от 5 до 30 ч (A - D). Соответственно, 5, 10, 20 и 30 ч обработанный кислотой споры , показывающие нетронутыми внешний микроструктуру и чистую внутреннюю полость. Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Содержание белка из спорами и Спорополленин экзиной капсул (СЭК). Содержание белка после различных этапов лечения. Данные, представленные представляет собой среднее значение трех измерений со стандартным отклонением (п = 3). Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию Oе эта цифра.

Рисунок 5
Рисунок 5. Динамический анализ изображений частиц (ДИПА) из спорами и Спорополленин экзиной капсулы (ИКС) на различных этапах лечения Столбцы (A - C). Соответственно, предварительно кислотная обработка, обработка кислотой, и неповрежденного ИКС. Графики представлены типичные графики диаметра SEC, округлости, соотношение сторон, и края градиента. Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. сканирующей электронной микроскопии (SEM) и динамических изображений Анализ частиц (ДИПА) 30 ч AcidolyСИС только Спорополленин экзиной капсулы (ИКС). (A) ИКС показывая неповрежденную внешнюю микроструктуру и чистую внутреннюю полость. (B) Типичные графики диаметра SEC, округлости и соотношением сторон. Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) Анализ Спорополленин экзиной капсул (СЭК) до и после лечения и БСА Encapsulation. Первая строка изображает необработанные споры , показывающие sporoplasmic клеточный органеллы и биомолекулярная аутофлюоресценция. Вторая строка отображает 30 часов ацидолиза только SECS с пустой внутренней полости. Третья строка изображает FITC-БСА загруженв 30 час ацидолиза только СЭК. (Шкала баров 10 мкм). Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8
Рисунок 8. сканирующей электронной микроскопии (SEM) и динамических изображений Анализ частиц (ДИПА) Характеристика БСА-нагруженных Спорополленин экзиной капсулы (СЭК). (A) СЭМ изображения БСА-нагруженных СЭК. (B) Типичные графики БСА-нагруженной диаметра SEC, округлости, соотношение сторон, и края градиента. Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

материал БСА нагрузка на партию (125 мг / мл) БСА в дозе 5 мг СЭК (мг) Количество БСА загружен (г на г СЭК) Необработанные споры 0,6 мл 0,654 ± 0,05 0,131 ± 0,01 ИКС 1,2 мл 0,831 ± 0,05 0,170 ± 0,01

Таблица 1. Инкапсулирование бычьего сывороточного альбумина (БСА) в необработанную спорами и СЭК. Объем раствора БСА используется для загрузки на 150 мг партии «необработанных спор» или «СЭК». Данные, представленные в среднем составляет трехкратных партий со стандартным отклонением (п = 3). Взято из 41 и используется с разрешения научных докладов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой работе, систематический анализ добычи SEC от L. clavatum спорами представлен и этот отчет показывает , что возможно производить более высокого качества капсулы в то же время достигается значительное рационализацию ранее существовавшего широко используемый протокол. 11 , в отличие от существующего протокола требующих высокой температурой процесса (180 ° C) и длительный продолжительность процесса (7 дней), 11 текущая оптимизация обработки извлечения СПК была в основном направлена на снижение температуры и длительности шага ацидолиз.

В обезжириванию и щелочные способы лечения обеспечивают минимальное удаление sporoplasmic материала из спор. Тем не менее, ацидолиза от 5 ч до 120 ч удаляется максимальное количество sporoplasmic материала. Результаты показали , что общая продолжительность обработки и температура может быть значительно снижено от обычных методов, 11 и что только 30 ч в умеренной температуре (70° C) фосфорной кислоты при условии оптимального качества капсул. Кроме того, после 30 ч ацидолиза, было обнаружено, что ИКС начал ломаться и наблюдалось значительное увеличение фрагментов частиц, предполагая, что вся партия СЭК может быть экспонирование снижение общей структурной целостности. Кроме того, следует отметить , что Л. clavatum считается включающей сравнительно надежную Спорополленин, 2 и что конкретные условия обработки , участвующих в данном протоколе, такие как, концентрации кислоты, температуры и / или длительности гидролиза, возможно , должны быть скорректированы для других видов пыльцы.

Было показано , что производство СЭК ацидолизом-только с помощью фосфорной кислоты (85% об / об) в течение 30 ч Урожайность чистых и неповрежденных СЭК. 41 данных подтверждает , что ацидолизом является решающим этапом в производстве SEC. И, наконец, кислотно-только ИКС были использованы для инкапсулирования БСА и наблюдалась высокая степень нагрузки. Нагрузка ша достигается с применением вакуума, в результате чего внутреннее давление полости СПК изменена, чтобы принудительно начертить БСА раствор в пустой капсулы. Наноканалах (диаметр 15 -. 20 нм), которые были ранее идентифицированы в экзины стенках L. clavatum, 7 позволяют решение войти в большую внутреннюю полость. После загрузки капсулы промывали и сушили в сушилке с вымораживанием с получением свободно текучего порошка.

однородность размера и морфологические характеристики являются важными факторами для оценки качества успешного инкапсулирования материала. Наблюдаемое однородность размера и неповрежденными морфология БСА нагруженным СЭК подтвердили потенциальное использование ацидолизом только обработанного СЭК для микроинкапсуляции приложений.

Эти результаты имеют важное значение для крупномасштабного промышленного производства СЭК и для стимулирования больший интерес потенциальных применений СЭК в микрокапсуляции наркотиков,белки, пептиды, пищевые добавки, биологически активные добавки и косметика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17, (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45, (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43, (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21, (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21, (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22, (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1, (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6, (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31, (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2, (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12, (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26, (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461, (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148, (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5, (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12, (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109, (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47, (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21, (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698, (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57, (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3, (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6, (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190, (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. CRC press. 182 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics