Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione

Bioengineering

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Summary

Questo protocollo / manoscritto descrive un processo semplificato per la produzione di capsule exine sporopollenin (sec) da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi SECs.

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Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

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Abstract

Microcapsule derivati ​​da spore o pollini vegetali forniscono una solida piattaforma per una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione. capsule sporopollenin exine (sec) si ottengono quando spore o polline sono trattati in modo da rimuovere il contenuto sporoplasmic interne. Le microcapsule risultanti cave presentano un elevato grado di uniformità micromeritica e conservano intricate caratteristiche microstrutturali relative alle particolari specie vegetali. Qui, dimostriamo un processo semplificato per la produzione di secondi da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi sec. L'attuale procedura di isolamento SEC è stato recentemente ottimizzato per ridurre in modo significativo i requisiti di elaborazione che vengono convenzionalmente utilizzati in isolamento SEC, e per garantire la produzione di microcapsule intatti. L. naturale spore clavatum sono sgrassati con acetone, trattata con acido fosforico, e ampiamente lavati per rimuovere sporoplasmicontenuti c. Dopo l'acetone sgrassante, è stato dimostrato che una singola fase di lavorazione con acido fosforico 85% per rimuovere tutti i contenuti sporoplasmic. Limitando il tempo di elaborazione acido per 30 ore, è possibile isolare SEC pulite ed evitare SEC fratturazione, che ha dimostrato di verificarsi con tempo di lavorazione prolungato. lavaggio abbondante con acqua, acidi diluiti, diluire basi e solventi assicura che tutti i residui di materiale e chimiche sporoplasmic siano adeguatamente rimossi. La tecnica del vuoto di carico è utilizzata per caricare un modello proteine ​​(albumina sierica bovina) come composto idrofilico rappresentativo. Vacuum loading fornisce una tecnica semplice per caricare vari composti senza la necessità di solventi o sostanze chimiche aggressive indesiderabili che sono spesso richiesti in altri protocolli di microincapsulazione. Sulla base di questi protocolli di isolamento e di carico, SEC fornire un materiale promettente per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione, ad esempio, terapie, alimenti, cosmetici, e prod cura personaledotti.

Introduction

C'è un notevole interesse in capsule a base di piante naturali ottenuti da spore di piante e pollini per l'uso in applicazioni di microincapsulazione. 1-15 In natura, spore e polline forniscono protezione per i materiali genetici sensibili nei confronti di condizioni ambientali difficili. La struttura di base di spore vegetali e polline tipicamente comprende uno strato esterno shell (esina), uno strato guscio interno (intine), e il materiale citoplasmatico interna. Il exine comprende un biopolimero chimicamente robusta 1,9,10,13,16 denominato sporopollenin e intine è composto principalmente da materiali cellulosici. 16-18 capsule vuote possono essere isolati da vari processi 7,9 per rimuovere il materiale citoplasmatico , proteine, e lo strato intine. 2,12,16 Queste capsule exine sporopollenin (sec) forniscono una valida alternativa per incapsulanti sintetici a causa della loro distribuzione concentrata dimensioni e morfologia uniforme. 7,9,13,19,20 ilsviluppo di processi standardizzati per ottenere secondi da varie specie vegetali, come Lycopodium clavatum, si apre la possibilità di una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione nei campi della somministrazione dei farmaci, alimenti e cosmetici. 6,10-13,21

Per ottenere SECs, ricercatori prima trattati spore e polline con solventi organici e ricadere in soluzioni alcaline per rimuovere contenuti citoplasmatici. 22-25 Tuttavia, la struttura della capsula rimanente è stato determinato per contenere ancora il livello intine cellulosico. Per eliminare questo, i ricercatori hanno esplorato l'uso di prolungato trattamento idrolisi acida con acido cloridrico, acido solforico caldo, o acido fosforico caldo per diversi giorni, 22-25 con acido fosforico diventando il metodo preferito di rimozione intine SEC. 2 Tuttavia, continua ricerca nel corso degli anni ha dimostrato che i vari spore e pollini hanno diversi gradi di resistenza al me elaborazione durathods comunemente usato. 26,27 Alcune spore e pollini sono completamente degradati e perdono tutto integrità strutturale in soluzioni alcaline forti, o diventano pesantemente danneggiato in forti soluzioni acide. 16 La variabilità in risposta SEC a condizioni di trattamento è dovuta a lievi variazioni nella chimica struttura e la morfologia exine del materiale sporopollenin exine tra le specie. 28 a causa della variabilità nella robustezza dei sporopollenin capsule exine (sec), è necessario ottimizzare le condizioni di elaborazione per ogni specie di spore e polline.

Spore pianta dal specie L. clavatum sono diventati la fonte singola più studiati della SEC. Si propone che questo è soprattutto a causa della sua ampia disponibilità, a basso costo, monodispersity, e la robustezza chimica 9,29 Le spore possono essere facilmente raccolto e contiene contenuti sporoplasmic sotto forma di raggruppamenti di 1 -. 2 micron organelli cellulari e Biomolecules. 11 L. spore clavatum sono stati utilizzati come lubrificante polvere naturale, 30,31 base per cosmetici, 30 e in erboristeria 32-36 per un'ampia gamma di applicazioni terapeutiche. I SEC ottenuti da L. clavatum hanno dimostrato di essere più resistente al trattamento di secondi da altre specie di spore e polline. 2 Dopo l'elaborazione, i SEC risultanti hanno dimostrato di mantenere le loro strutture microridge intricate e un'elevata uniformità morfologica, fornendo una grande cavità interna per l'incapsulamento. 7 Gli studi indicano che L. SEC clavatum possono essere utilizzati per l'incapsulamento dei farmaci, vaccini, 10,13 11 proteine, 7,14 cellule, 8 oli, 5-7,9 e integratori alimentari. 5,15 osservati efficienza di carico SEC sono relativamente alti in confronto ai tradizionali incapsulamento materiali. 7 Non ci sono anche una serie di vantaggi segnalatiSEC incapsulamento come la capacità di mascherare gusti, 6,10 e per fornire un certo grado di protezione naturale contro l'ossidazione. 12 Negli studi esistenti, il metodo di estrazione più comunemente usato SEC per L. clavatum si basa su quattro fasi principali. Passo è riflusso del solvente in acetone per 12 ore a 50 ° C per sgrassare le spore. 11 Fase due è riflusso alcalina in idrossido di potassio 6% fino a 12 ore a 120 ° C per rimuovere citoplasmatica e materiali proteici. 11 Fase tre è riflusso acido in acido fosforico 85% fino a 7 giorni a 180 ° C per rimuovere il materiale intine cellulosiche. 11 Fase quattro è un processo di lavaggio completo con acqua, solventi, acidi e basi per rimuovere materiale non exine restante e residui chimici.

Gli obiettivi principali di estrazione SEC in relazione alle applicazioni di incapsulamento sono per la produzione di capsule che sono vuoti di materiale citoplasmatica, gratis from proteine potenzialmente allergeniche, e morfologicamente intatto. 2,37 Tuttavia, dal punto di vista della produzione industriale, è anche importante considerare fattori economici e ambientali, quali l'efficienza energetica, durata della produzione, la sicurezza, ei residui risultanti. Per quanto riguarda l'efficienza energetica, sia ad alte temperature e tempi di lavorazione lunghi incidono sui costi di produzione e impatto ambientale. la durata della produzione e tempi di risposta sono fattori chiave che influenzano l'elaborazione redditività. Di particolare interesse è che il trattamento acido fosforico alta temperatura aumenta i problemi di sicurezza ed è noto per causare incrostazioni corrosivo che porta a un aumento significativo nella manutenzione delle infrastrutture e ritardi nei tempi di consegna dei lotti. 38-40 Ove possibile, riducendo al minimo il numero di passaggi necessari può portare per ridurre significativamente i rifiuti prodotti. Tuttavia, comunemente utilizzati quattro fasi di L. Estrazione clavatum SEC ha semplicemente evolved da decenni di ricerca e ha avuto poca ottimizzazione del processo vero e proprio. Recentemente, Mundargi et al., 41 ha fatto un significativo contributo ai lavori in corso in questo campo, valutando in modo sistematico e ottimizzando una delle tecniche di estrazione SEC più comunemente riportati.

Nella prima sezione di questo studio: spore sgrassamento è dimostrata utilizzando trasformazione acetone a 50 ° C per 6 ore; procedure sporoplasm e rimozione intine siano dimostrate utilizzando 85% trattamento acido fosforico a 70 ° C per 30 h; vasta lavaggio con acqua, solventi, acidi, e la base viene usata per dimostrare la rimozione del contenuto sporoplasmic residui; e SEC asciugatura è dimostrato utilizzando la convezione di essiccazione e il vuoto forno di essiccazione. Nella terza sezione, SEC vuoto carico è dimostrata utilizzando loading vuoto di una proteina modello, albumina di siero bovino (BSA), seguita da BSA-caricata-SEC lavaggio e liofilizzazione. Nella quarta sezione, la determinzione del rendimento incapsulamento BSA è dimostrata utilizzando centrifugazione, sonda sonicazione, e UV / Vis spettrometria.

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Protocol

1. Estrazione di sporopollenin exine capsule (SEC) da L. clavatum spore

Nota: Il processo di estrazione SEC comporta una polvere infiammabile (L. clavatum), acidi corrosivi caldi, e solventi infiammabili, quindi un equipaggiamento di protezione individuale (occhiali, maschera viso, guanti, camice da laboratorio), la valutazione dei rischi approvato il loro utilizzo, e lo smaltimento dei prodotti chimici da personale di laboratorio autorizzato è essenziale.

  1. spore sgrassante
    1. Preparare un reflusso set-up in una cappa aspirante tramite un condensatore di vetro, sistema di circolazione dell'acqua e bagnomaria (Figura 1).
    2. Pesare 100 g L. spore clavatum senza creare polvere e lontano da fonti di ignizione.
      Nota: Le spore utilizzate qui sono state commercialmente ottenuto (vedi Materiali List).
    3. spore Trasferire lentamente ad una 1 L politetrafluoroetilene (PTFE) pallone a fondo tondo con un agitatore magnetico.
    4. Aggiungere 500 ml di acetone per le spore delpallone PTFE e scuotere delicatamente il pallone in modo da formare una sospensione omogenea.
    5. Porre il pallone PTFE nel set bagnomaria a 50 ° C e connettersi al condensatore a riflusso.
    6. Eseguire riflusso in acetone per 6 ore con agitazione a 200 rpm e poi si lascia raffreddare a temperatura ambiente.
    7. Filtrare la sospensione con carta da filtro sotto vuoto e raccogliere le spore sgrassate in grandi (15 cm di diametro) piatti di vetro di Petri.
    8. Essiccare le spore a temperatura ambiente (cappa) coprendo con un foglio di alluminio con fori per evaporazione del solvente.
  2. acidolisi
    1. Preparare 85% (v / v) di acido fosforico con acqua deionizzata (DI) e trasferire spore secco sgrassate in un matraccio PTFE 1 L.
    2. Aggiungere 500 ml di acido fosforico (85% v / v) alle spore sgrassate.
    3. Porre il pallone PTFE in un set bagno di acqua a 70 ° C e connettersi al condensatore a riflusso.
    4. Eseguire dolce riflusso (70 ° C) in acido fosforico per 30 ore e quindi si lascia araffreddare a temperatura ambiente.
    5. Diluire la sospensione con acqua DI 500 ml caldo e raccogliere i SEC per filtrazione sotto vuoto usando carta da filtro.
    6. Trasferire il SECs ad un bicchiere di vetro 3 L per eseguire una serie di lavaggi.
  3. SEC lavaggio
    1. Posizionare il bicchiere di vetro 3 L contenente SEC in una cappa aspirante.
    2. Aggiungere (50 ° C) acqua deionizzata 800 ml caldo per le SEC con delicata agitazione per 10 minuti.
    3. Filtrare la sospensione utilizzando carta da filtro e filtrazione sottovuoto set-up.
    4. Raccogliere la SEC in un bicchiere di vetro pulito 3 L.
    5. Ripetere i punti 1.3.1. a 1.3.4. cinque volte.
    6. Aggiungere 600 ml a caldo (45 ° C) acetone per le SECs con blanda agitazione per 10 min.
    7. Raccogliere le sec in filtrazione sotto vuoto e trasferire i secondi per un bicchiere di vetro pulito 3 L.
    8. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (50 ° C) 2 M di acido cloridrico.
    9. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml Hot (50 ° C) 2 M di idrossido di sodio.
    10. Ripetere i punti 1.3.1 e 1.3.4 otto volte.
    11. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. usando 600 ml a caldo (45 ° C) di acetone.
    12. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (45 ° C) di etanolo.
    13. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 800 ml a caldo (50 ° C) acqua deionizzata.
    14. Trasferire i SEC pulite a sei grandi piatti in vetro di Petri e secco in una cappa aspirante a temperatura ambiente per 24 ore per rimuovere tutti i contenuti di acqua.
    15. Essiccare le SECs in stufa da vuoto a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore o fino a peso costante.
    16. Raccogliere la SEC secca e trasferimento in una bottiglia in polipropilene.
    17. Conservare la SEC in un armadio asciutto.

2. Caratterizzazione di SEC

  1. Eseguire elettronico a scansione analisi microscopica 41 con spore e SEC prodotte in diverse fasi.
  2. Effettuare analisi elementare 41 con spore e SEC prodotte in diverse fasi. Dry tutti i campioni a 60 ° C per almeno 1 ora prima analisi elementare e calcolare il contenuto proteico con azoto per cento, con un fattore di moltiplicazione di 6,25. 11 ottenere risultati utilizzando misurazioni triplicato per ogni campione.
  3. Condurre micromeritica analisi proprietà utilizzando un analizzatore di immagini di particelle dinamica. 41
  4. Scansione non trasformati, elaborati e SEC FITC-BSA-caricati usando la microscopia confocale a scansione laser. 41

3. Biomacromolecule incapsulamento da vuoto Tecnica Caricamento

  1. Preparare 1,2 ml di 125 mg / ml soluzione albumina sierica bovina (BSA) usando acqua deionizzata e trasferire in una provetta di polipropilene da 50 ml.
  2. Pesare 150 mg di SEC e trasferire alla soluzione BSA.
  3. Agitare la provetta per 10 minuti per formare una soluzione omogenea.
  4. Coprire il tubo con carta da filtro.
  5. Trasferire il tubo in un pallone liofilizzatore e asciugare per 4 ore con vuoto a 1 mbar.
  6. Eseguire i passaggi 3.1a 3,5. per tre lotti indipendenti.
  7. Raccogliere il SECs BSA-caricati e rimuovere gli agglomerati utilizzando un mortaio e pestello.
  8. Trasferire i SEC BSA-caricati ad un tubo da 50 ml e aggiungere acqua DI 2 ml per rimuovere il residuo di BSA.
  9. Raccogliere le SEC per centrifugazione a 4.704 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
  10. Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata una volta.
  11. Coprire il tubo contenente SEC BSA-caricati con carta da filtro.
  12. Trasferire i secondi per un congelatore (-20 ° C) e congelare per 1 ora.
  13. Congelare asciugare la SEC per 24 ore e conservare in un congelatore fino ulteriore caratterizzazione.
  14. Preparare i SEC placebo senza BSA utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13.
  15. Preparare i FITC-BSA SEC caricati utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13.

4. Determinazione del incapsulamento efficienza

  1. Pesare 5 mg di BSA SEC-caricati in 2 ml di tubi di polipropilene.
  2. Aggiungere 1,4 ml phosphaTE soluzione salina tamponata a pH 7,4 (PBS) e vortex per 5 min.
  3. Probe Sonicare la sospensione a 40% dell'ampiezza per 3 cicli di 10 sec.
  4. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,45 micron Polietersulfone (PES).
  5. Eseguire la stessa procedura descritta nella passi 4.1. a 4.4. utilizzando SEC placebo.
  6. Misurare l'assorbanza a 280 nm con placebo, come uno spazio vuoto.
  7. Quantificare la quantità di BSA incapsulato utilizzando una curva standard BSA (200 a 1.000 mg / ml) in PBS. 42

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Representative Results

Processo di estrazione semplificata per sporopollenin exine Capsule

La L. Estrazione clavatum SEC è stato raggiunto da tre fasi principali: (1) Sgrassante con acetone; (2) acidolisi con acido fosforico 85% (v / v); e (3) Ampia SEC lavaggio con solventi. Il flusso del processo di estrazione SEC aerodinamico è presentato in Figura 1 A -. I Brevemente, il processo comporta una fase di sgrassatura con acetone ricadere per 6 ore a 50 ° C e le spore sgrassate sono stati quindi essiccati durante la notte in una cappa aspirante per rimuovere residui acetone. Le spore sgrassate stati sottoposti a acidolisi con acido fosforico per 30 hr. Durante acidolisi la maggior parte dei materiali sporoplasmic vengono sciolti e poi rimosso durante la fase di filtrazione sotto vuoto. Al fine di rimuovere materiali sporoplasmic residui una vasta serie di fasi di lavaggio con solventi, acido, Viene eseguita base, e acqua. Le SECs stati inizialmente essiccati a temperatura ambiente per 24 ore e in seguito essiccati a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore per rimuovere solventi e umidità residua.

Come mostrato in figura 1, sono state eseguite tutte le fasi di estrazione SEC in una cappa aspirante con un avviso di pericolo. Durante l'estrazione SEC, circa perdita di massa 70% si osserva a causa della rimozione di materiali sporoplasmic e nostri dati è coerente con i rapporti esistenti della produzione di SEC puliti e intatti. 7, 19,20,29 Il processo semplificato dal punto iniziale sgrassamento al prodotto finale si completa in circa 5 giorni e il processo può essere facilmente scalata fino a 1 kg laboratorio lotto bilancia con adeguati controlli di sicurezza.

Passaggi di incapsulamento che utilizzano SEC sono presentati nella Figura 1 J - M, questi sono vantaggiosi a causa di essere semplici passaggi senza involving solventi organici aggressivi o che richiedono forze di taglio meccanici. 7 I nostri esperimenti di incapsulamento comporta 150 mg di SEC e un volume di soluzione di carico sufficiente per l'assorbimento da parte delle sec. Il caricamento di queste SEC è limitata dalla solubilità del composto in solventi acquosi od organici selezionati, e il caricamento può essere ottenuta con qualsiasi dei tre metodi di caricamento: passiva, compressione e vuoto carico. Tuttavia, sottovuoto loading fornisce relativamente maggiore incapsulamento di composti. 7, 19,20

Caratterizzazioni fisico-chimiche della sporopollenin exine capsule

Per determinare la pulizia di SEC prodotte utilizzando il processo razionalizzato illustrato nella figura 1, la superficie e trasversale morfologia, proprietà micromeritica e composizione elementare sono stati esaminati in diverse fasi del processo di estrazione SEC. Come mostrato inFigura 2, le immagini SEM indicano spore intatti con una microstruttura unica, e prima della trasformazione, organelli sporoplasmic micron scala sono stati osservati nell'immagine trasversale. Con spore sgrassante e trattamento con alcali sono stati osservati cambiamenti morfologici e strutturali parte la rottura degli organelli sporoplasmic.

La figura 3 mostra le immagini SEM di SEC dopo acidolisi con acido fosforico in vari momenti da 5 ore a 30 ore. Questi risultati sostegno che acidolisi per un massimo di 30 ore fornisce SEC intatti e puliti privi di materiali sporoplasmic. Al fine di confermare materiale proteico residuo, CHN analisi elementare 29 è stata eseguita e dati vengono presentati in Figura 4. Questi risultati forniscono una linea guida per la scelta della migliore condizione di trasformazione per ottenere SEC puliti e intatti. Nel caso di sgrassata e alcali trattata SECs, non proteinico sostanzialesi osserva asportazione di materiale. Tuttavia, con acidolisi con acido fosforico, la maggior parte dei materiali proteici viene rimosso in 30 ore e nessun ulteriore riduzione si osserva all'aumentare del tempo di processo fino a 120 ore. I dati elementale è coerente con precedenti rapporti sul trattamento prolungato di SEC 7,11 e con SECs commerciali.

Proprietà micromeritica sono stati analizzati mediante analisi di immagine dinamica delle particelle (DIPA) ed i risultati sono presentati nella Figura 5. Questi risultati supportano la distribuzione uniforme dimensioni SECs dopo acidolisi fino a 30 ore, con una dimensione di 31,0 ± 2,2 micron. Al contrario, SEC integrità strutturale diminuisce con acidolisi prolungata e comincia a causare notevoli frammentazione delle SECs oltre periodi di trattamento di 30 hr.

La Figura 6 mostra i dati SEM e DIPA per SECs prodotte solo acidolisi proelaborazione con acido fosforico per 30 ore. Questi risultati confermano che dopo la fase di sgrassatura, acidolisi prodotta SEC puliti e intatti con una distribuzione di dimensione uniforme del 32,5 ± 2,7 micron. Acidolisi sola SECs hanno un contenuto proteico residua di soli 0,15 ± 0,0%, come determinato rispetto al contenuto% di azoto, 11 che è paragonabile a SEC prodotti da alcali e acidolisi trattamento come discusso sopra e relazioni precedenti. 7

Microincapsulazione utilizzando sporopollenin exine Capsule

Per dimostrare l'uso di L. SEC clavatum prodotti utilizzando il processo acidolisi-only, esperimenti di microincapsulazione sono stati effettuati utilizzando BSA come una proteina modello. Il caricamento nel SEC è stata ottenuta utilizzando una tecnica di vuoto del carico con 150 SECs mg e 1,2 ml di 125 mg / ml di BSA. Figura 7 mostra il CLSM imetà compresa tra i SEC prima e dopo l'elaborazione acidolisi-only e con FITC-BSA incapsulamento. I dati indicano che la SEC non trattati mostra autofluorescenza a causa della presenza di costituenti sporoplasm all'interno della cavità spore. Tuttavia, dopo l'elaborazione acidolisi-solo, tutti i contenuti sporoplasmic vengono rimossi con un conseguente cavità interna vuota. Sorprendentemente, dopo l'incapsulamento di FITC-BSA, fluorescenza verde si osserva all'interno della SEC, confermando l'incapsulamento del modello di proteine in sec. 19,20,41

Inoltre, per indagare i cambiamenti morfologici e le proprietà micromeritica di BSA-caricati SEC, SEM e l'analisi DIPA sono state condotte ed i dati sono presentati in figura 8. Le immagini SEM confermano la presenza di microridges intatti e puliti dopo BSA carico. Inoltre, non sono stati osservati cambiamenti sostanziali di diametro, circolarità, e rapporto di aspetto dopo BSA carico in sec. Questi dati sono Consistent con le precedenti relazioni sul incapsulamento dei farmaci che utilizzano sec. 7,10

Per quantificare la quantità di incapsulato BSA, BSA è stato estratto da 5 mg di BSA-caricato SEC, ed i dati vengono presentati nella Tabella 1. I dati indicano 0,170 ± 0,01 g di BSA carico per grammo di SECs. Nel complesso, il SEM, DIPA, CLSM, e quantificazione di BSA mediante analisi spettrografica, confermano l'incapsulamento successo di BSA in L. SEC clavatum e SEC stabilità morfologica.

Figura 1
Figura 1. Processo semplificato di estrazione per L. clavatum sporopollenin exine Capsule (SEC). (A) le spore non trattati. (B) Spore sgrassante con un set-up riflusso a 50 ° C per 6 ore. (C) filtrazione di solventi e raccogliere ione di spore sgrassate. (D) Essiccazione di spore sgrassate a temperatura ambiente. (E) Spore acidolisi nel pallone PTFE con 85% (v / v) di acido fosforico a 70 ° C per 30 h. filtrazione (F) Acido mediante filtrazione sotto vuoto set-up. lavaggio (G) SEC utilizzando una serie di acqua, acido, base, e solventi fasi di lavaggio. (H) SEC essiccazione utilizzando stufa da vuoto a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore. (I) Intact, pulito , ed essiccato SEC come prodotto finale. (J) miscelazione della soluzione di SEC e BSA. (K) omogeneizzazione della soluzione SECs e BSA. (L) carico di vuoto di BSA in SECs. SEC (M) BSA-caricati. cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Scanning Electron analisi microscopica di L. clavatum spore durante le diverse fasi di trattamento pre-acido. (A) spore non trattati mostrano organelli cellulari sporoplasmic e biomolecole. (B) Acetone spore trattate mostrando interrotti contenuto sporoplasmic. (C) e (D) alcali trattati spore che mostra la rimozione dei contenuti sporoplasmic e rugosa strato intine cellulosico interno. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Scanning Electron analisi microscopica di L. clavatum spore durante le diverse fasi di AcidoTrattamento da 5 a 30 ore (A - D). Rispettivamente, 5, acidato spore 10, 20, e 30 hr mostrano intatta microstruttura esterna e cavità interna pulita. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. contenuto proteico delle spore e sporopollenin exine capsule (sec). Il contenuto proteico, dopo varie fasi del trattamento. Dati rappresentati è una media di misurazioni in triplicato con deviazione standard (n = 3). Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di rapporti scientifici. Cliccate qui per vedere una versione più grande of questa figura.

Figura 5
Figura 5. dinamica Imaging Analisi delle particelle (DIPA) di spore e sporopollenin exine capsule (sec) nelle varie fasi di trattamento Colonne (A - C). Sono, rispettivamente, il trattamento pre-acido, trattamento acido e SECs intatti. Parcelle sono grafici rappresentativi di diametro SEC, circolarità, aspect ratio, e il gradiente bordo. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. microscopia elettronica a scansione (SEM) e Dynamic Imaging Analisi delle particelle (DIPA) del 30 hr AcidolySEC sis-solo sporopollenin exine Capsule (sec). (A) mostrano intatto microstruttura esterna e cavità interna pulita. (B) i grafici rappresentativi di diametro SEC, circolarità, e rapporto di aspetto. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. confocale a scansione laser microscopia (CLSM) Analisi di sporopollenin exine capsule (SEC) prima e dopo il trattamento e BSA incapsulamento. La prima fila raffigura spore non trattati mostrano sporoplasmic organello cellulare e biomolecole autofluorescenza. La seconda riga raffigura 30 hr SECs acidolisi solo con una cavità interna vuota. La terza fila raffigura FITC-BSA caricatoin 30 hr SEC acidolisi-only. (Barre di scala sono 10 micron). Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. microscopia elettronica a scansione (SEM) e Dynamic Imaging Analisi delle particelle (DIPA) Caratterizzazione di BSA-caricati sporopollenin exine capsule (SEC). Immagini (A) SEM di SEC BSA-caricati. (B) grafici rappresentativi di BSA-caricato diametro SEC, circolarità, aspect ratio, e il gradiente bordo. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Materiale BSA carico per batch (125 mg / ml) BSA in 5 secondi mg (mg) Quantità di BSA caricato (g per g di secondi) spore non trattati 0,6 ml 0.654 ± 0.05 0,131 ± 0,01 SEC 1,2 ml 0,831 ± 0,05 0.170 ± 0.01

Tabella 1. incapsulamento di albumina sierica bovina (BSA) in non trattate spore e SEC. Volume di soluzione BSA utilizzato per il carico per 150 mg di lotto 'spore non trattati' o 'SEC'. Dati rappresentati è una media dei lotti in triplicato con deviazione standard (n = 3). Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di rapporti scientifici.

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Discussion

In questo lavoro, un'analisi sistematica di estrazione SEC da L. spore clavatum viene presentato e questo rapporto mostra che è possibile produrre capsule di qualità superiore ottenendo anche una semplificazione significativa del preesistente protocollo comunemente utilizzato. 11 Contrariamente al protocollo esistente che richiede una temperatura elevata processo (180 ° C) e durata lungo processo (7 giorni), 11 all'ottimizzazione trasformazione di estrazione corrente SEC è concentrata principalmente riducendo la temperatura e la durata della fase acidolisi.

I trattamenti sgrassanti e alcali forniscono minima asportazione di materiale sporoplasmic da spore. Tuttavia, acidolisi da 5 ore a 120 ore rimossa la quantità massima di materiale sporoplasmic. I risultati hanno indicato che la durata totale trasformazione e temperature potrebbero essere drasticamente ridotti da tecniche convenzionali, 11 e che solo 30 ore a temperatura moderata (70° C) acido fosforico disponibile capsule qualità ottimale. Inoltre, oltre il 30 hr acidolisi, si è constatato che la SEC iniziò a fratturarsi ed è stato osservato un aumento significativo frammenti di particelle, suggerendo che l'intera partita di SECs può esporrà una riduzione integrità strutturale complessiva. Inoltre, va notato che L. clavatum è considerato comprendere sporopollenin relativamente robusto, 2 e che le condizioni di lavorazione specifici coinvolti in questo protocollo, come ad esempio, la concentrazione di acido, la temperatura e / o la durata idrolisi, potrebbe essere necessario un aggiustamento per le altre specie di polline.

E 'stato dimostrato che la produzione di SEC per acidolisi-acidi fosforici mediante (85% v / v) per 30 hr rendimenti SEC puliti e intatti. 41 I dati confermano che acidolisi è il passo cruciale nella produzione SEC. Infine, gli acidi unici SECs sono stati utilizzati per l'incapsulamento di BSA, ha mostrato un alto grado di carico. Il carico wcome ottenuto con l'applicazione di un vuoto, per cui la pressione interna della cavità SEC è alterato per disegnare forza la soluzione BSA nelle capsule vuote. Nanochannels (diametro 15 -. 20 nm), che sono stati precedentemente identificati nelle pareti exine di L. clavatum, 7 permettono la soluzione di entrare nella grande cavità interna. Dopo il caricamento, le capsule vengono lavate ed essiccate in un congelamento-essiccatore per produrre una polvere liberamente scorrevole.

Dimensione uniformità e caratteristiche morfologiche sono fattori importanti per valutare la qualità di un materiale di incapsulamento successo. L'uniformità dimensioni e morfologia osservata intatto di BSA-caricato SEC hanno confermato l'uso potenziale di acidolisi solo elaborati secondi per le applicazioni di microincapsulazione.

Questi risultati sono importanti per la produzione su larga scala industriale di SEC e per stimolare un maggior interesse per le potenziali applicazioni della SEC nella microincapsulazione di farmaci,proteine, peptidi, integratori alimentari, nutraceutici e cosmetici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

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