Capsules à base de plantes Extraction de microencapsulation pour Applications

1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
Bioengineering

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Summary

Ce protocole / manuscrit décrit un processus simplifié pour la production de capsules de exine sporopollenine (articles) de Lycopodium spores de clavatum et pour le chargement de composés hydrophiles dans ces SECs.

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Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

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Abstract

Les microcapsules provenant de spores ou de pollen à base de plantes fournissent une plate-forme robuste pour une large gamme d'applications de microencapsulation. capsules sporopollenine de exine (SECS) sont obtenus lorsque les spores ou le pollen sont traitées de manière à supprimer le contenu sporoplasmic internes. Les microcapsules creuses résultantes présentent un degré élevé d'uniformité microméritiques et conservent leurs caractéristiques microstructurales complexes liées aux espèces végétales particulières. Ici, nous démontrons un processus simplifié pour la production de SECs de Lycopodium spores de clavatum et pour le chargement de composés hydrophiles dans ces SECs. La procédure actuelle d'isolement SEC a récemment été optimisée afin de réduire de manière significative les exigences de traitement qui sont classiquement utilisés dans l'isolement de la SEC, et d'assurer la production de microcapsules intactes. Natural L. Les spores de clavatum sont dégraissés avec de l' acétone, traitée avec de l' acide phosphorique, et largement lavés pour éliminer sporoplasmicontenu c. Après l'acétone dégraissement, une étape de traitement unique en utilisant 85% d'acide phosphorique a été montré pour supprimer tous les contenus sporoplasmic. En limitant le temps de traitement acide à 30 h, il est possible d'isoler SECs propre et d'éviter la SEC fracturation, qui a été montré pour se produire avec le temps de traitement prolongé. lavage extensif avec de l'eau, les acides dilués, diluer les bases et les solvants assure que tous les résidus de matières chimiques et sporoplasmic sont suffisamment supprimés. La technique de chargement à vide est utilisé pour charger une protéine modèle (sérumalbumine bovine) comme composé hydrophile représentative. Vacuum chargement fournit une technique simple pour charger divers composés sans avoir besoin de solvants agressifs ou des produits chimiques indésirables qui sont souvent nécessaires dans d'autres protocoles de microencapsulation. Sur la base de ces protocoles d'isolement et de chargement, SECs fournir un matériau prometteur pour une utilisation dans un large éventail d'applications de microencapsulation, tels que, la thérapeutique, les aliments, les produits cosmétiques et de soins personnels produits.

Introduction

Il y a beaucoup d' intérêt dans des capsules à base de plantes naturelles obtenues à partir de spores de plantes et les pollens pour une utilisation dans les applications de microencapsulation 1-15 Dans la nature., Les spores et le pollen assurent la protection des matériaux génétiques sensibles contre les conditions environnementales difficiles. La structure de base de spores de plantes et de pollen comprend typiquement une couche externe de l'enveloppe (en exine), une couche d'enveloppe intérieure (intine) et le matériau cytoplasmique interne. L'exine est composé d'un biopolymère chimiquement robuste 1,9,10,13,16 dénommé sporopollénine et la intine est composée essentiellement de matériaux cellulosiques. 16-18 capsules vides peuvent être isolés par divers procédés 7,9 pour éliminer le matériau cytoplasmique , des protéines, et la couche de intine. 2,12,16 Ces capsules de exine sporopollenine (SECs) fournissent une alternative convaincante aux encapsulants synthétiques en raison de leur distribution de taille étroite et la morphologie uniforme. 7,9,13,19,20 ladéveloppement de procédés standardisés pour obtenir SECs de diverses espèces végétales, telles que Lycopodium clavatum, ouvre la possibilité d'une large gamme d'applications de microencapsulation dans les domaines de la délivrance de médicaments, les aliments et les cosmétiques 6,10-13,21.

Afin d'obtenir SECs, les chercheurs ont d' abord été traitées avec des spores et le pollen des solvants organiques et chauffé au reflux dans des solutions alcalines pour éliminer les matières cytoplasmiques. 22-25 Cependant, la structure de la capsule restante a été déterminée à contenir encore la couche intine cellulosique. Afin d'éliminer cela, les chercheurs ont exploré l'utilisation de longue traitement d'hydrolyse acide avec de l' acide chlorhydrique, l' acide sulfurique chaud, ou de l' acide phosphorique chaud pendant plusieurs jours, 22-25 avec de l' acide phosphorique de devenir la méthode préférée de intine élimination SEC. 2 Toutefois, en cours la recherche au cours des années a montré que diverses spores et pollens ont des degrés de résistance différents à la me traitement durethodes couramment utilisé. 26,27 Quelques spores et les pollens sont complètement dégradés et perdent toute intégrité structurelle dans les solutions alcalines fortes, ou deviennent fortement endommagés dans des solutions acides forts. 16 La variabilité de la réponse SEC à des conditions de traitement est due à des variations subtiles dans le produit chimique exine structure et la morphologie du matériau de sporopollenine exine entre les espèces. 28 en raison de la variabilité de la robustesse des capsules de exine sporopollenine (articles), il est nécessaire d'optimiser les conditions de traitement pour chaque espèce de spores et le pollen.

Les spores de plantes de l'espèce L. clavatum sont devenus la source unique la plus largement étudiée de SECs. Il est proposé que cela est principalement dû à sa grande disponibilité, à faible coût, monodispersité et robustesse chimique 9,29 Les spores peuvent être facilement récoltées et contient le contenu sporoplasmic sous la forme de groupements de 1 -. 2 um organites cellulaires et biomolecules. 11 L. Les spores clavatum ont été utilisés comme lubrifiant de poudre naturelle, une base 30,31 pour les produits cosmétiques, 30 et 32-36 en phytothérapie pour une large gamme d'applications thérapeutiques. Les SECs obtenus à partir de L. clavatum ont été montré pour être plus résistante au traitement que SECs d'autres espèces de spores et le pollen. 2 Après le traitement, les SECs résultant ont été montré pour conserver leurs structures de microridge complexes et l' uniformité morphologique , tout en offrant une grande cavité interne pour l' encapsulation. 7 Des études indiquent que L. SECs clavatum peuvent être utilisés pour l'encapsulation des médicaments, des vaccins, des 10,13 11 protéines, 7,14 cellules, 8 huiles, 5-7,9 et compléments alimentaires. 5,15 observés efficacité de chargement de la SEC sont relativement élevés par rapport aux classiques encapsulation des matériaux. 7 Il existe également un certain nombre d'avantages signalésà SEC encapsulation telles que la capacité de masquer les goûts, 6,10 et de fournir un certain degré de protection naturelle contre l' oxydation. 12 Dans les études existantes, SEC la méthode la plus couramment utilisée pour l' extraction L. clavatum est basé sur quatre étapes principales. La première étape consiste à reflux de solvant dans l' acétone pendant jusqu'à 12 heures à 50 ° C pour dégraisser les spores. 11 La deuxième étape est le reflux alcalin dans 6% d' hydroxyde de potassium pendant jusqu'à 12 heures à 120 ° C pour éliminer cytoplasmique et les matières protéiniques. 11 Etape trois est reflux acide dans 85% d' acide phosphorique jusqu'à 7 jours à 180 ° C pour éliminer le matériau de intine cellulosique. 11 la quatrième étape est un processus de lavage complet en utilisant l' eau, les solvants, les acides et les bases pour éliminer tout le reste du matériel non exine et les résidus chimiques.

Les principaux objectifs de l'extraction SEC par rapport aux applications d'encapsulation sont de produire des capsules qui sont vides de matériau cytoplasmique, libre from protéines potentiellement allergènes, et morphologiquement intacts. 2,37 Cependant, du point de vue de la fabrication industrielle, il est également important de tenir compte de facteurs économiques et environnementaux supplémentaires, tels que l' efficacité énergétique, la durée de la production, la sécurité, et les déchets résultant. En ce qui concerne l'efficacité énergétique, des températures élevées et des longs délais de traitement influent sur les coûts de production ainsi que l'empreinte environnementale. la durée de la production et le délai d'exécution sont des facteurs clés qui influent sur la rentabilité de traitement. Il est particulièrement préoccupant que le traitement de l' acide phosphorique à haute température augmente les problèmes de sécurité et est connu pour entraîner l'entartrage corrosif qui conduit à des augmentations significatives de la maintenance des infrastructures et des retards dans les délais de traitement par lots 38-40. Lorsque cela est possible, ce qui réduit le nombre d'étapes nécessaires peut conduire à réduire de manière significative les déchets produits. Cependant, le couramment utilisé en quatre étapes de L. extraction clavatum SEC a simplement evolved de décennies de recherche et a eu peu d'optimisation de processus réel. Récemment, Mundargi et al., 41 a apporté une contribution importante aux travaux en cours dans ce domaine par une évaluation systématique et d' optimiser l' une des techniques d'extraction de la SEC les plus fréquemment rapportés.

Dans la première partie de cette étude: spore dégraissement est démontrée en utilisant le traitement de l'acétone à 50 ° C pendant 6 heures; procédures de sporoplasme et d'enlèvement intine sont démontrées en utilisant 85% de traitement d'acide phosphorique à 70 ° C pendant 30 heures; lavage extensif avec de l'eau, les solvants, l'acide, et la base est utilisé pour démontrer l'élimination des matières résiduelles sporoplasmic; et le séchage SEC est démontrée utilisait le séchage par convection et séchage sous vide four. Dans la troisième section, SEC vide chargement est démontrée utilisait le chargement à vide d'une protéine modèle, l'albumine de sérum bovin (BSA), suivi par BSA-chargé-SEC lavage et lyophilisation. Dans la quatrième section, la détermintion de l'efficacité d'encapsulation est démontrée BSA utilisait une centrifugation, d'une sonde ultrasons, et UV Vis spectrométrie /.

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Protocol

1. Extraction de sporopollenine Exine Capsules (SECs) de L. clavatum spores

Remarque: Le processus d'extraction SEC implique une poudre inflammable (L. clavatum), acides corrosifs chauds, et des solvants inflammables, l' équipement donc approprié de protection individuelle (lunettes, masque, gants, blouse de laboratoire), l' évaluation des risques approuvée sur l' utilisation et l' élimination des produits chimiques par le personnel de laboratoire autorisé est essentiel.

  1. Spore dégraisse
    1. Préparer un reflux set-up dans une hotte en utilisant un condenseur en verre, système de circulation d'eau, et le bain d'eau (Figure 1).
    2. Peser 100 g L. spores clavatum sans créer de poussière et loin de toute source d'ignition.
      Remarque: Les spores utilisées ici ont été obtenus dans le commerce (voir la liste des matériaux).
    3. spores lentement à une 1 L polytétrafluoroéthylène (PTFE) ballon à fond rond avec une tige d'agitation magnétique de transfert.
    4. Ajouter 500 ml d'acétone aux spores dans leflacon de PTFE et agiter le flacon doucement pour former une suspension homogène.
    5. Placer le ballon de PTFE dans l'ensemble du bain d'eau à 50 ° C et se connecter au condenseur à reflux.
    6. Effectuer le reflux dans de l'acétone pendant 6 heures sous agitation à 200 tours par minute, puis laisser refroidir à température ambiante.
    7. Filtrer la suspension en utilisant du papier filtre sous vide et de recueillir les spores dégraissées dans les grandes (15 cm de diamètre) des boîtes de Pétri en verre.
    8. Sécher les spores à la température ambiante (hotte) en couvrant avec une feuille d'aluminium avec des trous pour l'évaporation du solvant.
  2. acidolyse
    1. Préparer 85% (v / v) d'acide phosphorique avec désionisée (DI) et le transfert de spores sèches dégraissées à un 1 L PTFE flacon.
    2. Ajouter 500 ml d'acide phosphorique (85% v / v) pour les spores dégraissées.
    3. Placer le ballon de PTFE dans un ensemble de bain d'eau à 70 ° C et se connecter au condenseur à reflux.
    4. Effectuer doux reflux (70 ° C) dans l'acide phosphorique pendant 30 heures, puis laisserrefroidir à température ambiante.
    5. Diluer la suspension à l'aide de l'eau DI 500 ml au chaud et de recueillir les SECs par filtration sous vide en utilisant un papier filtre.
    6. Transférer le SECs à un 3 bêcher de verre pour effectuer une série de lavages.
  3. SEC laver
    1. Placer le 3 L bêcher en verre contenant SECs dans une hotte.
    2. Ajouter (50 ° C) Eau DI 800 ml chaud aux SECs en agitant doucement pendant 10 min.
    3. Filtrer la suspension à l'aide d'un papier filtre et d'une filtration sous vide mis en place.
    4. Recueillir le SECs dans un endroit propre 3 L bêcher en verre.
    5. Répétez les étapes 1.3.1. à 1.3.4. cinq fois.
    6. Ajouter 600 ml à chaud (45 ° C) l'acétone aux SECs en agitant doucement pendant 10 min.
    7. Recueillir les SECs par filtration sous vide et transférer les SECs à un nettoyage de 3 L bêcher en verre.
    8. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml à chaud (50 ° C) d'acide chlorhydrique à 2 M.
    9. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml d'hot (50 ° C), 2 M d'hydroxyde de sodium.
    10. Répétez les étapes 1.3.1 et 1.3.4 huit fois.
    11. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml à chaud (45 ° C) d'acétone.
    12. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml à chaud (45 ° C), de l'éthanol.
    13. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 800 ml chaud (50 ° C) de l'eau DI.
    14. Transférer les SECs propres à six grandes boîtes de Pétri en verre et sec dans une hotte à température ambiante pendant 24 heures pour éliminer tout le contenu de l'eau.
    15. Sécher les SECs dans une étuve sous vide à 60 ° C et 1 mbar, sous vide pendant 10 h ou jusqu'à poids constant.
    16. Recueillir le SECs séché et transférer à une bouteille en polypropylène.
    17. Stocker le SECs dans une armoire sèche.

2. Caractérisation des SECs

  1. Effectuer électronique à balayage analyse microscopique 41 en utilisant des spores et SECs produites à différents stades.
  2. Effectuer l' analyse élémentaire 41 en utilisant des spores et SECs produites à différents stades. réry tous les échantillons à 60 ° C pendant au moins 1 h avant l' analyse élémentaire et calculer la teneur en protéines en utilisant pour cent d' azote avec un facteur de multiplication de 6,25. 11 Obtenir des résultats en utilisant des mesures en triple pour chaque échantillon.
  3. Effectuer microméritiques analyse des propriétés à l' aide d' un analyseur d' image dynamique des particules. 41
  4. Numérisation non traité, traité et SECs FITC-BSA-chargés en utilisant la microscopie à balayage laser confocal. 41

3. biomacromolécule Encapsulation par Vacuum Chargement Technique

  1. Préparer 1,2 ml de 125 mg / ml de solution d'albumine de sérum bovin (BSA) en utilisant de l'eau déminéralisée et transférer dans un tube de polypropylene de 50 ml.
  2. Peser 150 mg de SECs et transfert à la solution BSA.
  3. Vortexer le tube pendant 10 minutes pour former une solution homogène.
  4. Couvrir le tube en utilisant du papier filtre.
  5. Transférer le tube dans un ballon à lyophilisateur et sécher pendant 4 h sous vide à 1 mbar.
  6. Effectuer les étapes 3.1à 3,5. pour les trois lots indépendants.
  7. Recueillir le SECs BSA-chargé et éliminer les agglomérats en utilisant un mortier et un pilon.
  8. Transférer les SECs BSA-chargés dans un tube de 50 ml et ajouter 2 ml d'eau DI pour éliminer le BSA résiduel.
  9. Recueillir les SECs par centrifugation à 4704 xg pendant 5 minutes et jeter le surnageant.
  10. Répétez le lavage à l'eau DI fois.
  11. Couvrir le tube contenant SECs BSA-chargés à l'aide de papier filtre.
  12. Transférer les SECs dans un congélateur (-20 ° C) et congeler pendant 1 heure.
  13. Lyophiliser la SECs pendant 24 heures et à stocker dans un congélateur jusqu'à une caractérisation plus poussée.
  14. Préparer les SECs placebo sans BSA en utilisant la même procédure que dans les étapes 3.1. à 3.13.
  15. Préparer les FITC-BSA SECs chargés en utilisant la même procédure que dans les étapes 3.1. à 3.13.

4. Détermination de l'efficacité Encapsulation

  1. Peser 5 mg de SECs BSA-chargés dans 2 ml tubes en polypropylène.
  2. Ajouter 1,4 ml phosphate une solution saline tamponnée à pH 7,4 (PBS) et au vortex pendant 5 min.
  3. Probe Soniquer la suspension à 40% d'amplitude pendant 3 cycles de 10 sec.
  4. Filtrer la solution à l'aide d'un 0,45 um Polyéthersulfone (PES) filtre.
  5. Effectuez la même procédure que dans les étapes 4.1. à 4,4. utilisant SECs placebo.
  6. Mesurer l'absorbance à 280 nm en utilisant un placebo comme un blanc.
  7. Quantifier la quantité de BSA encapsulé à l' aide d' une courbe standard de la BSA (200 à 1000 pg / ml) dans du PBS. 42

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Representative Results

Processus d'extraction fuselée pour sporopollenine exine Capsules

L. extraction clavatum SEC a été réalisée par trois étapes principales: (1) Dégraisse utilisant de l' acétone; (2) acidolyse à l'aide d'acide phosphorique à 85% (v / v); et (3) un lavage extensif SEC en utilisant des solvants. Le flux du processus d'extraction SEC simplifiée est présentée à la figure 1 A -. I En bref, le processus implique une étape de dégraissage avec de l' acétone au reflux pendant 6 heures à 50 ° C et les spores dégraissés ont ensuite été séchées pendant une nuit dans une hotte pour éliminer résiduelle acétone. Les spores dégraissées ont été soumis à une acidolyse au moyen d'acide phosphorique pendant 30 heures. Au cours de acidolyse la plupart des matériaux sont dissous sporoplasmic et ensuite éliminé au cours de l'étape de filtration sous vide. Afin d'éliminer les matières résiduelles sporoplasmic une longue série d'étapes de lavage en utilisant des solvants, l'acide, La base et l'eau est effectuée. Les SECs ont d'abord été séchées à température ambiante pendant 24 h et encore séché à 60 ° C et 1 mbar pendant 10 h sous vide pour éliminer les solvants résiduels et l'humidité.

Comme le montre la figure 1, toutes les étapes d'extraction de la SEC ont été effectuées dans une hotte avec un avis de danger. Lors de l' extraction SEC, environ 70% de perte de masse est observée en raison de l'élimination des matières sporoplasmic et nos données sont compatibles avec les rapports existants de la production de SECs propres et intacts. 7, 19,20,29 Le processus simplifié de l'étape de dégraissage initial le produit final est achevée en environ 5 jours et le processus peut être facilement mise à l'échelle jusqu'à un 1 kg laboratoire lot à l'échelle avec des contrôles de sécurité appropriés.

Étapes Encapsulation utilisant SECs sont présentés à la figure 1 J - M, ceux - ci sont avantageux en raison d'être des mesures simples sans involving Les solvants organiques agressifs ou nécessitant des forces de cisaillement mécaniques. 7 Nos expériences d'encapsulation comporte 150 mg de SECs et un volume de solution de charge suffisante pour l' absorption par les SECs. Le chargement de ces SECs est limité par la solubilité du composé dans les solvants aqueux ou organiques sélectionnés, et le chargement peut être réalisé par l'une des trois méthodes de chargement: passif, la compression et le vide chargement. Cependant, le chargement à vide fournit l' encapsulation relativement plus élevée de composés. 7, 19,20

Caractérisations physicochimiques de sporopollenine Exine Capsules

Pour déterminer la propreté des SECs produites en utilisant le processus simplifié présenté à la figure 1, la surface et la section transversale morphologie, propriétés microméritiques, et la composition élémentaire ont été examinés à différentes étapes du processus d'extraction SEC. Comme représenté sur laFigure 2, les images MEB indiquent spores intactes avec une microstructure unique, et avant le traitement, organites sporoplasmic échelle du micron ont été observées dans l'image en coupe transversale. Avec spores dégraissement et un traitement alcalin sans changements morphologiques et structurels ont été observés en dehors de la rupture des organites sporoplasmic.

La figure 3 présente des images SEM d'SECs après acidolyse au moyen d' acide phosphorique à divers points de temps de 5 h à 30 h. Ces résultats confirment que acidolyse jusqu'à 30 heures fournit des SECs intacts et propres dépourvus de matériaux sporoplasmic. Afin de confirmer la matière protéinique résiduelle, l' analyse élémentaire CHN 29 a été réalisée et les données sont présentées dans la figure 4. Ces résultats fournissent un guide pour choisir la meilleure condition de traitement pour atteindre SECs propres et intacts. Dans le cas de dégraissée et alcalin traité SECs, aucune protéinique substantiellel'enlèvement de matière est observée. Cependant, avec acidolyse au moyen d'acide phosphorique, la majorité des matières protéiniques est éliminé 30 h et aucune réduction supplémentaire est observée avec l'augmentation du temps de traitement allant jusqu'à 120 heures. Les données élémentaire est conforme aux précédents rapports sur le traitement prolongé de SECs 7,11 et avec SECs commerciaux.

Propriétés microméritiques ont été analysées par analyse d' images de particules dynamique (DIPA) et les résultats sont présentés sur la figure 5. Ces résultats appuient la distribution de taille uniforme de SECs après une acidolyse pour un maximum de 30 heures, avec une taille de 31,0 ± 2,2 um. En revanche, SEC intégrité structurelle diminue avec acidolyse prolongée et commence à provoquer une fragmentation importante des SECs au-delà de 30 h durées de traitement.

La figure 6 montre les données MEB et DIPA pour SECs produites avec seulement acidolyse protransformation utilisant de l'acide phosphorique pendant 30 heures. Ces résultats confirment que, après l'étape de dégraissage, acidolyse produit SECs intacts et propres avec une distribution de taille uniforme de 32,5 ± 2,7 um. Acidolyse uniquement SECs ont une teneur en protéine résiduelle de seulement 0,15 ± 0,0%, telle que déterminée par rapport à la teneur en % d'azote, 11 ce qui est comparable à SECs produites par un traitement alcalin et d' acidolyse tel que discuté ci - dessus et avec les rapports précédents. 7

Microencapsulation utilisant sporopollenine Exine Capsules

Afin de démontrer l'utilisation de L. SECs clavatum produites en utilisant le procédé d'acidolyse uniquement, des expériences de micro - encapsulation ont été réalisées en utilisant la BSA comme protéine modèle. Chargement dans SECs a été réalisée en utilisant une technique de chargement sous vide en utilisant 150 mg SECs et 1,2 ml de 125 mg / ml de BSA. La figure 7 montre l'im CLSMans SECs avant et après le traitement d'acidolyse seule et avec FITC-BSA encapsulation. Les données indiquent que SECs non traitées présentent une autofluorescence en raison de la présence de constituants sporoplasme à l'intérieur de la cavité de spores. Cependant, après le traitement d'acidolyse seule, tous les contenus sporoplasmic sont retirés résultant dans une cavité intérieure vide. Étonnamment, après encapsulation de FITC-BSA, on observe une fluorescence verte à l' intérieur du SECs, ce qui confirme l'encapsulation de la protéine dans le modèle sec. 19,20,41

En outre, pour étudier les changements morphologiques et les propriétés microméritiques de BSA-chargés SECs, SEM et de l' analyse de DIPA ont été menées et les données sont présentées à la figure 8. Les images MEB confirment la présence de microcrêtes intactes et propres après BSA chargement. En outre, aucune modification importante n'a été observée dans le diamètre, la circularité, et le ratio d'aspect après BSA chargement dans SECs. Ces données sont Consistent avec les rapports précédents sur l'encapsulation de médicaments en utilisant SECs. 7,10

Pour quantifier la quantité d'enrobé de BSA, BSA a été extrait à partir de 5 mg de SAB chargé SECs et les données sont présentées dans le tableau 1. Les données indiquent 0,170 ± 0,01 g de BSA par gramme de chargement sec. Dans l' ensemble, la SEM, DIPA, CLSM, et la quantification des BSA par analyse spectrographique, confirment l'encapsulation réussie de BSA en L. SECs clavatum et SEC stabilité morphologique.

Figure 1
Figure 1. Processus rationalisée Extraction de L. clavatum sporopollenine Exine Capsules (SECs). (A) des spores non traitées. (B) Spore délipidation en utilisant un reflux set-up à 50 ° C pendant 6 h. (C) filtration de solvants et de recueillir ion de spores dégraissées. (D) séchage des spores dégraissées à la température ambiante. (E) spore acidolyse dans un ballon de PTFE en utilisant 85% (v / v) d' acide phosphorique à 70 ° C pendant 30 h. filtration (F) un acide en utilisant une filtration sous vide set-up. lavage (G) SEC en utilisant une série d'eau, d' acide, de base, et les solvants des étapes de lavage. (H) séchage SEC en utilisant un four à vide à 60 ° C et 1 mbar sous vide pendant 10 heures. (I) Intact, propre , et séché sECs comme produit final. (J) Le mélange de solution sECs et BSA. (K) Homogénéisation de solution sECs et BSA. (L) Vacuum chargement de BSA dans sECs. sECs (M) BSA-chargés. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Analyse au microscope électronique à balayage de L. clavatum Spores pendant les différentes étapes du traitement pré-acide. (A) spores non traitées montrant organelles et biomolécules cellulaires sporoplasmic. (B) Acétone spores traitées montrant perturbé le contenu sporoplasmic. (C) et (D) Alkali traités spores montrant l' enlèvement des matières sporoplasmic et ridée couche intine cellulosique interne. Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 Analyse par microscopie électronique à balayage de L. clavatum Spores pendant les différentes étapes de l' acideLe traitement entre 5 et 30 h (A - D). Respectivement, 5, 10, 20 et 30 h traitées à l' acide des spores présentant une microstructure externe intacte et de la cavité interne propre. Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Teneur en protéines des Spores et sporopollenine Exine Capsules (SECs). La teneur en protéines après différentes étapes du traitement. Les données représentées est une moyenne des mesures en triple avec un écart type (n = 3). Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande of ce chiffre.

Figure 5
Figure 5. Dynamic Imaging Analyse des particules (DIPA) des Spores et sporopollenine Exine Capsules (SECs) à différentes étapes du traitement des colonnes (A - C). Sont respectivement, le traitement pré-acide, un traitement acide, et SECs intacts. Les parcelles sont des graphiques représentatifs de diamètre SEC, circularité, rapport d'aspect, et le gradient de bord. Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. microscopie électronique à balayage (MEB) et Dynamic Imaging Analyse des particules (DIPA) de 30 h Acidoly(A) SECs sis seule sporopollenine Exine Capsules (SECs). montrant microstructure externe intacte et cavité interne propre. (B) graphiques représentatifs de diamètre SEC, circularité, et l'aspect ratio. Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. confocale à balayage laser (CLSM) Analyse des sporopollenine Exine Capsules (SECs) avant et après le traitement et la BSA Encapsulation. La première ligne représente les spores non traitées montrant organite cellulaire sporoplasmic et biomolécules autofluorescence. La deuxième ligne représente 30 h SECs de acidolyse uniquement avec une cavité intérieure vide. La troisième ligne représente FITC-BSA chargéen 30 h SECs de acidolyse seule. (Barres d'échelle sont de 10 um). Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. microscopie électronique à balayage (MEB) et Dynamic Imaging Analyse des particules (DIPA) Caractérisation des BSA-chargés sporopollenine Exine Capsules (SECs). Images (A) SEM de SECs BSA-chargés. (B) des graphiques représentatifs de diamètre BSA chargé SEC, circularité, rapport d'aspect, et le gradient de bord. Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Matériel BSA chargement par lot (125 mg / ml) BSA à 5 mg SECs (mg) Montant de BSA chargé (g par g de SECs) spores non traitées 0,6 ml 0,654 ± 0,05 0,131 ± 0,01 SECs 1,2 ml 0,831 ± 0,05 0,170 ± 0,01

Tableau 1. Encapsulation d'albumine de sérum bovin (BSA) dans Non traitée Spores et sec. Volume de solution BSA utilisé pour le chargement par lot de 150 mg de «spores non traitées» ou «SECs». Les données représentées est une moyenne des lots en triple avec un écart type (n = 3). Adapté de 41 et utilisé avec la permission de rapports scientifiques.

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Discussion

Dans ce travail, une analyse systématique de l' extraction SEC de L. Les spores de clavatum est présenté et ce rapport montre qu'il est possible de produire des capsules de qualité supérieure tout en réalisant une importante rationalisation du protocole couramment utilisé pré-existant. 11 Contrairement au protocole existant nécessitant une température élevée de processus (180 ° C) et une longue durée de traitement (7 jours), 11 l' optimisation de la SEC courant de traitement d'extraction a été essentiellement axé sur la réduction de la température et de la durée de l'étape d'acidolyse.

Les traitements de dégraissage et alcalins fournissent une élimination minimale de matière sporoplasmic de spores. Cependant, acidolyse de 5 h à 120 h retiré le montant maximum de la matière sporoplasmic. Les résultats ont indiqué que la durée totale du traitement et la température peuvent être considérablement réduites par des techniques classiques, 11 et que seulement 30 h à température modérée (70° C) d'acide phosphorique à condition que les capsules de la qualité optimale. En outre, au-delà de 30 h acidolyse, on a constaté que la SECs a commencé à se fracturer et on a observé une augmentation significative des fragments de particules, ce qui suggère que la totalité du lot de SECs peut être présente une réduction de l'intégrité structurelle globale. En outre, il convient de noter que L. clavatum est considérée comme comprenant sporopollenine relativement robuste, 2 et que les conditions de traitement spécifiques impliqués dans ce protocole, tels que, la concentration de l' acide, la température, et / ou de la durée d'hydrolyse, peut être nécessaire d'ajuster pour les autres espèces de pollen.

Il a été montré que la production de SECs par acidolyse en utilisant uniquement de l' acide phosphorique (85% v / v) pendant 30 h donne des SECs propres et intactes. 41 Les données confirment que l' acidolyse est une étape cruciale dans la production SEC. Enfin, l'acide uniquement SECs ont été utilisés pour l'encapsulation de BSA et un haut degré de chargement a été observée. Le chargement wcomme réalisée par l'application d'un vide, de sorte que la pression interne de la cavité SEC est modifiée pour tirer de force la solution de BSA dans les capsules vides. Nanocanaux (diam . 15 - 20 nm), ce qui a été précédemment identifiée dans les parois Exine de L. clavatum, 7 permettent la solution d'entrer dans la grande cavité interne. Après le chargement, les capsules ont été lavées et séchées dans un lyophilisateur pour obtenir une poudre à écoulement libre.

La taille et l'uniformité des caractéristiques morphologiques sont des facteurs importants pour l'évaluation de la qualité d'un matériau d'encapsulation efficace. L'uniformité de taille observée et la morphologie intacte de BSA chargé SECs confirmé l'utilisation potentielle de SECs acidolyse-traitée uniquement pour les applications de microencapsulation.

Ces résultats sont importants pour la production industrielle à grande échelle de SECs et pour stimuler l'intérêt pour les applications potentielles de SECs dans la microencapsulation de médicaments,des protéines, des peptides, des compléments alimentaires, nutraceutiques et cosmétiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

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