Microencapsulation अनुप्रयोगों के लिए के निष्कर्षण संयंत्र आधारित कैप्सूल

1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
Bioengineering

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Summary

इस प्रोटोकॉल / पांडुलिपि नागबेली बीजाणुओं से sporopollenin exine कैप्सूल (एसईसी) के उत्पादन के लिए और इन एसईसी में हाइड्रोफिलिक यौगिकों की लोडिंग के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया का वर्णन करता है।

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Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

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Abstract

संयंत्र आधारित बीजाणुओं या पराग से निकाली गई microcapsules Microencapsulation आवेदनों की एक विविध रेंज के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करते हैं। Sporopollenin exine कैप्सूल (एसईसी) प्राप्त कर रहे हैं जब बीजाणुओं या पराग संसाधित कर रहे हैं ताकि आंतरिक sporoplasmic सामग्री हटा दें। जिसके परिणामस्वरूप खोखला microcapsules micromeritic एकरूपता के एक उच्च डिग्री प्रदर्शन और जटिल microstructural विशेष पौधों की प्रजातियों से संबंधित सुविधाओं बरकरार रहती है। इस के साथ साथ, हम नागबेली बीजाणुओं से सेकेंड के उत्पादन के लिए और इन एसईसी में हाइड्रोफिलिक यौगिकों की लोडिंग के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया प्रदर्शित करता है। वर्तमान एसईसी अलगाव की प्रक्रिया हाल ही में काफी प्रसंस्करण आवश्यकताओं जो पारंपरिक एसईसी अलगाव में उपयोग किया जाता है कम करने के लिए, और बरकरार microcapsules का उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है। प्राकृतिक एल clavatum बीजाणुओं, एसीटोन के साथ defatted रहे हैं फॉस्फोरिक एसिड के साथ इलाज किया, और बड़े पैमाने पर sporoplasmi दूर करने के लिए धोयासी सामग्री। एसीटोन Defatting के बाद, एक एकल प्रसंस्करण 85% फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग कदम सभी sporoplasmic सामग्री को हटाने के लिए दिखाया गया है। 30 घंटा के लिए एसिड प्रसंस्करण समय सीमित करके, यह साफ एसईसी को अलग-थलग और एसईसी fracturing, जो लंबे समय तक प्रसंस्करण समय के साथ होते दिखाया गया है से बचने के लिए संभव है। पानी के साथ व्यापक धोने, एसिड पतला पतला ठिकानों, और सॉल्वैंट्स सुनिश्चित करता है कि सभी sporoplasmic सामग्री और रासायनिक अवशेषों पर्याप्त रूप से हटा रहे हैं। वैक्यूम लोडिंग तकनीक एक प्रतिनिधि हाइड्रोफिलिक यौगिक के रूप में एक मॉडल प्रोटीन (गोजातीय सीरम albumin) लोड करने के लिए उपयोग किया जाता है। वैक्यूम लोड हो रहा है कठोर सॉल्वैंट्स या अवांछनीय रसायन है जो अक्सर अन्य Microencapsulation प्रोटोकॉल में आवश्यक हैं के लिए आवश्यकता के बिना विभिन्न यौगिकों लोड करने के लिए एक सरल तकनीक प्रदान करता है। इन अलगाव और लदान प्रोटोकॉल पर आधारित, सेक्टर जैसे Microencapsulation अनुप्रयोगों, चिकित्सा विज्ञान, खाद्य पदार्थ, सौंदर्य प्रसाधन की एक विविध रेंज में इस्तेमाल के लिए एक आशाजनक सामग्री, और व्यक्तिगत देखभाल ठेस प्रदानठेस।

Introduction

वहाँ प्राकृतिक संयंत्र आधारित Microencapsulation अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए संयंत्र के बीजाणुओं और पराग से प्राप्त कैप्सूल में महत्वपूर्ण हित है। 1-15 प्रकृति में, बीजाणुओं और पराग कठोर पर्यावरण की स्थिति के खिलाफ संवेदनशील आनुवंशिक सामग्री के लिए सुरक्षा प्रदान करते हैं। संयंत्र बीजाणुओं और पराग के बुनियादी ढांचे को आम तौर पर एक बाहरी खोल परत (exine), एक भीतरी खोल परत (intine), और आंतरिक cytoplasmic सामग्री शामिल हैं। Exine एक रासायनिक मजबूत biopolymer 1,9,10,13,16 sporopollenin के रूप में करने के लिए भेजा के शामिल है और मुख्य रूप से intine cellulosic सामग्री के शामिल है। 16-18 खाली कैप्सूल विभिन्न प्रक्रियाओं 7.9 से अलग किया जा सकता cytoplasmic सामग्री को हटाने के लिए , प्रोटीन, और intine परत। 2,12,16 ये sporopollenin exine कैप्सूल (एसईसी) सिंथेटिक encapsulants के लिए एक सम्मोहक विकल्प अपने संकीर्ण आकार के वितरण और वर्दी आकृति विज्ञान के कारण 7,9,13,19,20 प्रदान करते हैं।मानकीकृत प्रक्रियाओं ऐसे नागबेली के रूप में विभिन्न प्रजातियों के पौधे, से प्राप्त करने के लिए एसईसी के विकास, दवा वितरण, खाद्य पदार्थ, और सौंदर्य प्रसाधनों के क्षेत्र में Microencapsulation आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संभावित खोलता है। 6,10-13,21

आदेश एसईसी प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं ने सबसे पहले कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ बीजाणुओं और पराग इलाज और क्षारीय समाधान में refluxed cytoplasmic सामग्री हटा दें। 22-25 हालांकि, शेष कैप्सूल ढांचा अभी भी cellulosic intine परत को रोकने के लिए निर्धारित किया गया था। इस हटाने के लिए आदेश में, शोधकर्ताओं फॉस्फोरिक एसिड के साथ कई दिनों में हाइड्रोक्लोरिक एसिड, सल्फ्यूरिक एसिड गर्म, या गर्म फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग, 22-25 एसईसी intine हटाने का पसंदीदा तरीका बनता जा रहा लंबे समय तक अम्लीय हाइड्रोलिसिस प्रसंस्करण का उपयोग का पता लगाया। 2 हालांकि, चल रहे पिछले कुछ वर्षों में अनुसंधान से पता चला है कि विभिन्न बीजाणुओं और पराग कठोर मेरे प्रसंस्करण के लिए लचीलापन की डिग्री भिन्न हैthods आमतौर पर इस्तेमाल किया। 26,27 कुछ बीजाणुओं और पराग पूरी तरह से अपमानित कर रहे हैं और मजबूत क्षारीय समाधान में सभी संरचनात्मक अखंडता खो देते हैं, या भारी मजबूत अम्लीय समाधान में क्षतिग्रस्त कर दिया। बनने के 16 उपचार की स्थिति के लिए एसईसी जवाब में परिवर्तनशीलता रासायनिक में सूक्ष्म परिवर्तनों की वजह से है संरचना और प्रजातियों के बीच sporopollenin exine सामग्री के exine आकृति विज्ञान। 28 sporopollenin exine कैप्सूल (एसईसी) की मजबूती में परिवर्तनशीलता के कारण, यह बीजाणु और पराग की एक प्रजाति के लिए प्रसंस्करण की स्थिति का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है।

प्रजातियों एल से संयंत्र बीजाणुओं clavatum सेकेंड के सबसे व्यापक रूप से अध्ययन ही स्रोत बन गए हैं। यह प्रस्ताव है कि यह अपने व्यापक उपलब्धता, कम लागत, monodispersity, और रासायनिक मजबूती के कारण मुख्य रूप से है 9,29 बीजाणुओं आसानी से 1 के समूहों के रूप में काटा जा सकता है और उसमें sporoplasmic सामग्री -। 2 माइक्रोन सेलुलर organelles और खiomolecules। 11 एल clavatum बीजाणुओं चिकित्सीय अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक प्राकृतिक पाउडर स्नेहक, 30,31 सौंदर्य प्रसाधनों के लिए एक आधार है, के रूप में 30 और हर्बल औषधि 32-36 में इस्तेमाल किया गया है। एसईसी एल से प्राप्त clavatum बीजाणुओं और पराग। 2 प्रसंस्करण के बाद की अन्य प्रजातियों से एसईसी से प्रसंस्करण के लिए और अधिक लचीला होना दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एसईसी उनके जटिल microridge संरचनाओं और उच्च रूपात्मक एकरूपता जबकि encapsulation के लिए एक बड़ी आंतरिक गुहा उपलब्ध कराने बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। 7 अध्ययन से संकेत मिलता है कि एल clavatum एसईसी दवाओं, 10,13 टीके, 11 प्रोटीन, 7,14 कोशिकाओं, 8 तेलों, 5-7,9 और भोजन की खुराक के encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 5,15 मनाया एसईसी लोडिंग क्षमता पारंपरिक की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक होती है encapsulation सामग्री। 7 वहाँ भी सूचना दी लाभ का एक नंबर रहे हैंएसईसी encapsulation के लिए इस तरह, स्वाद मुखौटा करने के लिए 6,10 और ऑक्सीकरण के खिलाफ प्राकृतिक संरक्षण के कुछ डिग्री प्रदान करते हैं। 12 मौजूदा अध्ययनों में क्षमता, एल के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया एसईसी निकासी विधि के रूप में clavatum चार मुख्य चरण पर आधारित है। एक कदम 50 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 12 घंटे के लिए एसीटोन में विलायक refluxing बीजाणुओं defat है। 11 कदम दो 120 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 12 घंटे के cytoplasmic और प्रोटीन सामग्री को हटाने के लिए 6% पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड में क्षारीय refluxing है। 11 कदम तीन cellulosic intine सामग्री हटाने के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 7 दिनों के लिए 85% फॉस्फोरिक एसिड में एसिड refluxing है। 11 कदम चार सभी शेष गैर exine सामग्री हटाने के लिए पानी, सॉल्वैंट्स, एसिड होता है, और ठिकानों का उपयोग कर एक व्यापक धोने की प्रक्रिया है और रासायनिक अवशेषों।

मुख्य encapsulation अनुप्रयोगों के संबंध में एसईसी निकासी के लक्ष्यों, कैप्सूल जो cytoplasmic सामग्री के खाली हैं का उत्पादन करने के लिए स्वतंत्र हैं इधर-उधरसंभावित allergenic प्रोटीन हूँ, और आकृति विज्ञान बरकरार। 2,37 हालांकि, एक औद्योगिक उत्पादन के दृष्टिकोण से, यह भी इस तरह के रूप में, ऊर्जा दक्षता, उत्पादन अवधि, सुरक्षा, और जिसके परिणामस्वरूप बेकार अतिरिक्त आर्थिक और पर्यावरणीय कारकों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। साथ ऊर्जा दक्षता के लिए संबंध है, दोनों उच्च तापमान और लंबे प्रसंस्करण बार उत्पादन लागत के साथ-साथ पर्यावरण पदचिह्न प्रभावित करते हैं। उत्पादन की अवधि और बदलाव का समय प्रसंस्करण लाभप्रदता प्रभावित महत्वपूर्ण कारक हैं। विशेष चिंता का है कि उच्च तापमान फॉस्फोरिक एसिड प्रसंस्करण सुरक्षा के मुद्दों को बढ़ाता है और संक्षारक स्केलिंग जो बैच प्रतिवर्तन समय में बुनियादी ढांचे के रखरखाव में काफी बढ़ जाती है और देरी की ओर जाता है में परिणाम के लिए जाना जाता है। 38-40 जहां संभव हो, नेतृत्व कर सकते हैं के लिए आवश्यक कदम की संख्या कम काफी अपशिष्ट उत्पादन को कम करने के लिए। हालांकि, आमतौर पर एल के चार कदम प्रक्रिया का इस्तेमाल किया clavatum एसईसी निकासी बस EV हैअनुसंधान के दशक से olved और कम वास्तविक प्रक्रिया अनुकूलन पड़ा है। हाल ही में, Mundargi एट अल।, 41 को इस क्षेत्र में चल रहे काम करने के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान व्यवस्थित मूल्यांकन और सबसे अधिक रिपोर्ट एसईसी निष्कर्षण तकनीकों में से एक के अनुकूलन के द्वारा की गई।

इस अध्ययन के पहले खंड में: बीजाणु Defatting 6 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन प्रसंस्करण के उपयोग का प्रदर्शन किया जाता है; sporoplasm और intine हटाने की प्रक्रिया 30 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 85% फॉस्फोरिक एसिड प्रसंस्करण का उपयोग प्रदर्शन कर रहे हैं; पानी, सॉल्वैंट्स, एसिड, और आधार के साथ व्यापक धोने अवशिष्ट sporoplasmic सामग्री को हटाने के प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है; और एसईसी सुखाने संवहन सुखाने और वैक्यूम ओवन सुखाने का उपयोग प्रदर्शन किया है। तीसरे खंड में, सेकंड वैक्यूम लोड हो रहा है एक मॉडल प्रोटीन के निर्वात लोड हो रहा उपयोग प्रदर्शन किया है, गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), द्वारा पीछा बीएसए से भरी हुई-एसईसी धोने और lyophilization। चौथे खंड में, determinबीएसए encapsulation दक्षता के व्यावहारिक centrifugation का उपयोग होता है का प्रदर्शन किया, sonication जांच, और यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोमेट्री।

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Protocol

1. Sporopollenin Exine कैप्सूल की निकासी (एसईसी) एल से clavatum बीजाणु

नोट: एसईसी निकालने की प्रक्रिया एक ज्वलनशील पाउडर (एल clavatum), गर्म संक्षारक एसिड होता है, और ज्वलनशील सॉल्वैंट्स, इसलिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (काले चश्मे, फेस मास्क, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट), के उपयोग पर मंजूरी दे दी जोखिम मूल्यांकन, और निपटान के शामिल अधिकृत प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा रसायन आवश्यक है।

  1. बीजाणु Defatting
    1. एक गिलास कंडेनसर, पानी परिसंचरण तंत्र, और पानी के स्नान (चित्रा 1) का उपयोग करके एक धूआं हुड में एक भाटा सेट-अप तैयार करें।
    2. वजन 100 ग्राम एल धूल बनाने और किसी भी प्रज्वलन स्रोत से दूर बिना clavatum बीजाणुओं।
      नोट: बीजाणुओं यहां इस्तेमाल व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया (सामग्री सूची देखें)।
    3. एक 1 एल polytetrafluoroethylene (PTFE) एक चुंबकीय सरगर्मी छड़ी के साथ दौर नीचे कुप्पी के लिए स्थानांतरण बीजाणुओं धीरे धीरे।
    4. में बीजाणुओं को 500 मिलीलीटर एसीटोन जोड़ेPTFE फ्लास्क और धीरे कुप्पी हिला एक सजातीय निलंबन के रूप में।
    5. 50 डिग्री सेल्सियस पर पानी से स्नान सेट में PTFE कुप्पी की जगह और भाटा कंडेनसर से कनेक्ट।
    6. 200 rpm पर सरगर्मी के साथ 6 घंटे के लिए एसीटोन में refluxing प्रदर्शन और फिर आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
    7. निलंबन के तहत निर्वात फिल्टर पेपर का उपयोग फ़िल्टर और बड़े (15 सेमी व्यास) कांच पेट्री डिश में defatted बीजाणुओं इकट्ठा।
    8. विलायक वाष्पीकरण के लिए छेद के साथ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा कमरे के तापमान (धूआं हुड) पर बीजाणुओं सूखी।
  2. Acidolysis
    1. 85% (वी / वी) विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ फॉस्फोरिक एसिड को तैयार है और एक 1 एल PTFE फ्लास्क defatted सूखी बीजाणुओं हस्तांतरण।
    2. defatted बीजाणुओं को फॉस्फोरिक एसिड (85% वी / वी) के 500 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 70 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान सेट में PTFE कुप्पी की जगह और भाटा कंडेनसर से कनेक्ट।
    4. 30 घंटे के लिए फॉस्फोरिक एसिड में कोमल refluxing (70 डिग्री सेल्सियस) प्रदर्शन और फिर करने की अनुमतिकमरे के तापमान पर शांत।
    5. 500 मिलीलीटर गर्म डि पानी का उपयोग करके निलंबन पतला और फिल्टर पेपर का उपयोग वैक्यूम निस्पंदन द्वारा एसईसी इकट्ठा।
    6. एक 3 एल कांच बीकर एसईसी स्थानांतरण धोने की एक श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए।
  3. एसईसी धुलाई
    1. 3 एल गिलास एक धूआं हुड में सेकेंड युक्त बीकर रखें।
    2. 10 मिनट के लिए कोमल सरगर्मी के साथ सेकेंड के लिए 800 मिलीलीटर गर्म (50 डिग्री सेल्सियस) डि पानी जोड़ें।
    3. फिल्टर पेपर और एक निर्वात निस्पंदन सेट-अप का उपयोग करके निलंबन फ़िल्टर।
    4. एक साफ 3 एल कांच बीकर में सेकेंड लीजिए।
    5. दोहराएँ 1.3.1 कदम। 1.3.4 करने के लिए। पांच गुना।
    6. 10 मिनट के लिए कोमल सरगर्मी के साथ सेकेंड के लिए 600 मिलीलीटर गर्म (45 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन जोड़ें।
    7. वैक्यूम के अंतर्गत निस्पंदन द्वारा एसईसी लीजिए और एक साफ 3 एल कांच बीकर एसईसी हस्तांतरण।
    8. दोहराएँ 1.3.6 कदम। और 1.3.7। गर्म 600 मिलीलीटर (50 डिग्री सेल्सियस) 2 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग।
    9. दोहराएँ 1.3.6 कदम। और 1.3.7। 600 मिलीलीटर ho का उपयोग करटी (50 डिग्री सेल्सियस) 2 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड।
    10. दोहराएँ 1.3.1 और 1.3.4 आठ बार दोहराएँ।
    11. दोहराएँ 1.3.6 कदम। और 1.3.7। गर्म 600 मिलीलीटर (45 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन का उपयोग कर।
    12. दोहराएँ 1.3.6 कदम। और 1.3.7। गर्म 600 मिलीलीटर (45 डिग्री सेल्सियस) इथेनॉल का उपयोग।
    13. दोहराएँ 1.3.6 कदम। और 1.3.7। गर्म 800 मिलीलीटर (50 डिग्री सेल्सियस) डि पानी का उपयोग कर।
    14. 24 घंटे के लिए आरटी पर एक धूआं हुड में छह बड़े गिलास पेट्री डिश और सूखे के लिए स्वच्छ एसईसी स्थानांतरण सब पानी की सामग्री हटा दें।
    15. 60 डिग्री सेल्सियस और 1 मिलीबार 10 घंटे के लिए या जब तक लगातार वजन निर्वात में एक वैक्यूम ओवन में सेकेंड सूखी।
    16. सूखे एसईसी लीजिए और एक polypropylene बोतल के लिए स्थानांतरण।
    17. एक सूखी कैबिनेट में सेकेंड स्टोर।

2. सेकेंड के लक्षण

  1. बीजाणुओं और सेकेंड विभिन्न चरणों में उत्पादन का उपयोग कर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण के 41 प्रदर्शन करना।
  2. बीजाणुओं और सेकेंड विभिन्न चरणों में उत्पादन का उपयोग कर मौलिक विश्लेषण 41 प्रदर्शन करना। डीRY मौलिक विश्लेषण से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों और 6.25 की एक गुणा कारक के साथ प्रतिशत नाइट्रोजन का उपयोग प्रोटीन सामग्री की गणना। 11 प्राप्त प्रत्येक नमूना के लिए तीन प्रतियों माप का उपयोग कर परिणाम है।
  3. आचरण micromeritic गुण विश्लेषण एक गतिशील छवि कण विश्लेषक का उपयोग कर। 41
  4. Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग, असंसाधित स्कैन संसाधित, और FITC-बीएसए लोड सेकेंड। 41

3. वैक्यूम लोड हो रहा है तकनीक द्वारा Biomacromolecule एन्कैप्सुलेशन

  1. 125 मिलीग्राम की 1.2 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान के लिए एक 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब के लिए डि पानी और हस्तांतरण का उपयोग कर तैयार करें।
  2. सेकेंड के 150 मिलीग्राम वजन और बीएसए समाधान के लिए स्थानांतरण।
  3. 10 मिनट के लिए ट्यूब भंवर एक सजातीय समाधान के रूप में।
  4. ट्यूब फिल्टर पेपर का उपयोग कवर।
  5. 1 मिलीबार पर वैक्यूम के साथ 4 घंटे के लिए एक फ्रीज ड्रायर फ्लास्क और सूखी करने के लिए ट्यूब स्थानांतरण।
  6. प्रदर्शन करना कदम 3.13.5। तीन स्वतंत्र बैचों के लिए।
  7. बीएसए से भरी हुई एसईसी लीजिए और एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करके agglomerates को हटा दें।
  8. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को बीएसए लोड सेकेंड के स्थानांतरण और अवशिष्ट बीएसए को हटाने के लिए 2 मिलीलीटर डि पानी जोड़ें।
  9. 5 मिनट के लिए 4704 XG पर centrifugation द्वारा एसईसी लीजिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  10. एक बार डि पानी से धोने दोहराएँ।
  11. फिल्टर पेपर का उपयोग बीएसए से भरी हुई एसईसी युक्त ट्यूब को कवर किया।
  12. एक फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) के लिए एसईसी स्थानांतरण और 1 घंटे के लिए फ्रीज।
  13. 24 घंटा और आगे लक्षण वर्णन जब तक एक फ्रीजर में स्टोर के लिए एसईसी सूखी रुक।
  14. कदम 3.1 में के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर बीएसए बिना प्लेसबो एसईसी तैयार करें। 3.13 करने के लिए।
  15. 3.1 कदम के रूप में ही प्रक्रिया का उपयोग कर FITC-बीएसए लोड एसईसी तैयार करें। 3.13 करने के लिए।

4. एन्कैप्सुलेशन क्षमता का निर्धारण

  1. 2 मिलीलीटर polypropylene ट्यूबों में बीएसए लोड सेकेंड के 5 मिलीग्राम वजन।
  2. 1.4 मिलीलीटर phospha जोड़ेते 5 मिनट के लिए खारा 7.4 पीएच (पीबीएस) और भंवर बफर।
  3. जांच 10 सेकंड के 3 चक्र के लिए 40% आयाम पर निलंबन sonicate।
  4. समाधान के लिए एक 0.45 माइक्रोन polyethersulfone (पी इ एस) फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर।
  5. कदम 4.1 में के रूप में एक ही प्रक्रिया को पूरा करें। 4.4। प्लेसबो एसईसी का उपयोग कर।
  6. 280 एक खाली के रूप में प्लेसबो का उपयोग कर एनएम पर absorbance के उपाय।
  7. यों बीएसए की राशि पीबीएस में एक बीएसए मानक वक्र (200 से 1000 माइक्रोग्राम / एमएल) का उपयोग करते हुए समझाया। 42

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Representative Results

Sporopollenin Exine कैप्सूल के लिए सुव्यवस्थित निष्कर्षण प्रक्रिया

एल clavatum एसईसी निकासी के तीन मुख्य चरणों द्वारा प्राप्त किया गया था: (1) एसीटोन का उपयोग कर Defatting; (2) का उपयोग कर Acidolysis फॉस्फोरिक एसिड 85% (वी / वी); और (3) व्यापक एसईसी धोने सॉल्वैंट्स का उपयोग कर। सुव्यवस्थित एसईसी निकालने की प्रक्रिया का प्रवाह चित्रा 1 ए में प्रस्तुत किया है -। मैं संक्षेप में, इस प्रक्रिया को एक Defatting 50 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए एसीटोन refluxing के साथ कदम शामिल है और defatted बीजाणुओं तो एक धूआं हुड में रात भर सूख रहे थे अवशिष्ट दूर करने के लिए एसीटोन। defatted बीजाणुओं 30 घंटे के लिए फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग acidolysis के अधीन थे। acidolysis दौरान sporoplasmic सामग्री के बहुमत को भंग कर दिया और उसके बाद वैक्यूम निस्पंदन चरण के दौरान हटा रहे हैं। सॉल्वैंट्स का उपयोग अवशिष्ट sporoplasmic सामग्री धोने कदम की एक व्यापक श्रृंखला को दूर करने, एसिड आदेश में, आधार है, और पानी में किया जाता है। एसईसी शुरू में 24 घंटे के लिए आरटी पर सूख रहे थे और 10 घंटा अवशिष्ट सॉल्वैंट्स और नमी को दूर करने के लिए आगे 60 डिग्री सेल्सियस और 1 मिलीबार निर्वात में सूख गया।

जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, सभी एसईसी निकासी कदम एक खतरा नोटिस के साथ एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया गया। एसईसी निकासी के दौरान लगभग 70% जन हानि की वजह से sporoplasmic सामग्री को हटाने के लिए प्रारंभिक Defatting कदम से मनाया जाता है और हमारे डेटा स्वच्छ और बरकरार सेकेंड के उत्पादन की मौजूदा रिपोर्ट के अनुरूप है। 7, 19,20,29 सुव्यवस्थित प्रक्रिया अंतिम उत्पाद के लिए लगभग 5 दिनों में पूरा हो गया है और इस प्रक्रिया को आसानी से उचित सुरक्षा नियंत्रण के साथ एक 1 किलो प्रयोगशाला पैमाने बैच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Involvin के बिना किया जा रहा है सरल कदम के कारण एम, इन फायदेमंद हैं - एसईसी उपयोग एन्कैप्सुलेशन कदम चित्रा 1 जम्मू में प्रस्तुत कर रहे हैंजी कठोर कार्बनिक सॉल्वैंट्स या यांत्रिक कतरनी बलों की जरूरत पड़ेगी। 7 हमारा encapsulation प्रयोगों सेकेंड के 150 मिलीग्राम और एक लोडिंग समाधान मात्रा एसईसी द्वारा तेज के लिए पर्याप्त शामिल है। इन सेकेंड में लोडिंग चयनित जलीय या कार्बनिक सॉल्वैंट्स में यौगिक घुलनशीलता द्वारा सीमित है, और लदान तीन लोड हो रहा है तरीकों में से किसी के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है: निष्क्रिय, संपीड़न, और वैक्यूम लोड हो रहा है। हालांकि, निर्वात लोड हो रहा है यौगिकों के अपेक्षाकृत उच्च encapsulation प्रदान करता है। 7, 19,20

Sporopollenin Exine कैप्सूल की भौतिक अभिलक्षण

चित्रा 1 में प्रस्तुत सुव्यवस्थित प्रक्रिया का उपयोग करके उत्पादन सेकेंड के साफ-सफाई का निर्धारण करने के लिए, सतह और पार के अनुभागीय आकृति विज्ञान, micromeritic गुण, और मौलिक रचना एसईसी निकालने की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में जांच की गई। के रूप में दिखाया गयाचित्रा 2, SEM छवियों को एक अद्वितीय microstructure के साथ बरकरार बीजाणुओं का संकेत मिलता है, और प्रसंस्करण से पहले, माइक्रोन पैमाने sporoplasmic अंगों पार के अनुभागीय छवि में मनाया गया। बीजाणु Defatting और क्षार उपचार के साथ कोई रूपात्मक और संरचनात्मक परिवर्तन sporoplasmic अंगों की rupturing से अलग मनाया गया।

चित्रा 3 5 घंटा से 30 घंटा के लिए विभिन्न बिंदुओं पर समय फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग acidolysis के बाद सेकेंड के SEM छवियों से पता चलता है। इन परिणामों का समर्थन है कि अप करने के लिए 30 घंटे के लिए acidolysis sporoplasmic सामग्री से रहित बरकरार है और साफ एसईसी प्रदान करता है। आदेश अवशिष्ट प्रोटीन सामग्री पुष्टि करने के लिए, सी एच एन मौलिक विश्लेषण 29 प्रदर्शन किया गया था और डेटा चित्रा 4 में प्रस्तुत किया है ये परिणाम स्वच्छ और बरकरार सेकेंड के लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे अच्छा प्रसंस्करण हालत को चुनने के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं। defatted और क्षार इलाज किया सेकेंड के मामले में, कोई पर्याप्त प्रोटीनसामग्री हटाने मनाया जाता है। हालांकि, acidolysis फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग के साथ, प्रोटीन सामग्री के बहुमत के 30 घंटे में निकाल दिया जाता है और आगे कोई कमी 120 मानव संसाधन के लिए प्रक्रिया में समय को बढ़ाने के साथ मनाया जाता है। मौलिक डेटा एसईसी 7,11 की विस्तारित प्रसंस्करण पर और वाणिज्यिक एसईसी के साथ पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है।

Micromeritic गुण गतिशील छवि कण विश्लेषण (दीपा) द्वारा विश्लेषण किया गया और परिणाम 31.0 ± 2.2 माइक्रोन का एक आकार के साथ चित्रा 5 में प्रस्तुत कर रहे हैं इन परिणामों के लिए 30 घंटे के लिए acidolysis के बाद सेकेंड के समान आकार वितरण समर्थन करते हैं। इसके विपरीत, एसईसी संरचनात्मक अखंडता लंबे समय तक acidolysis के साथ कम हो जाती है और 30 घंटा के उपचार durations परे सेकेंड के महत्वपूर्ण विखंडन पैदा करने के लिए शुरू होता है।

चित्रा 6 के साथ ही acidolysis समर्थक उत्पादित सेकेंड के लिए SEM और दीपा आंकड़ों से पता चलता30 घंटे के लिए फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग cessing। इन परिणामों पुष्टि करते हैं कि Defatting कदम के बाद, 32.5 ± 2.7 माइक्रोन के एक समान आकार के वितरण के साथ स्वच्छ और बरकरार एसईसी उत्पादित acidolysis। Acidolysis केवल एसईसी केवल 0.15 ± 0.0% की एक अवशिष्ट प्रोटीन सामग्री,% नाइट्रोजन सामग्री के लिए निर्धारित रिश्तेदार, 11 जो क्षार और acidolysis उपचार द्वारा उत्पादित सेकेंड के लिए तुलनीय है, जैसा कि ऊपर और पिछली रिपोर्टों के साथ चर्चा के रूप में की है। 7

Sporopollenin Exine कैप्सूल का उपयोग कर Microencapsulation

आदेश एल के उपयोग के प्रदर्शन करने के लिए clavatum acidolysis केवल प्रक्रिया का उपयोग कर उत्पादन सेकेंड, Microencapsulation प्रयोगों एक मॉडल प्रोटीन के रूप में बीएसए का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। एसईसी में लोड हो रहा है एक निर्वात लोडिंग तकनीक का उपयोग कर 150 मिलीग्राम एसईसी और 125 मिलीग्राम / एमएल BSA के 1.2 मिलीलीटर का उपयोग करके हासिल की थी। चित्रा 7 CLSM im पता चलता हैपहले और acidolysis केवल प्रसंस्करण के बाद और FITC-बीएसए encapsulation के साथ सेकेंड के उम्र। डेटा बीजाणु गुहा के अंदर sporoplasm घटक की उपस्थिति के कारण है कि इलाज एसईसी प्रदर्शनी autofluorescence इंगित करता है। हालांकि, acidolysis केवल प्रसंस्करण के बाद, सभी sporoplasmic सामग्री एक खाली भीतरी गुहा में जिसके परिणामस्वरूप हटा रहे हैं। आश्चर्यजनक, FITC-बीएसए के encapsulation के बाद, हरी प्रतिदीप्ति सेकेंड के अंदर मनाया जाता है, सेक्टर में मॉडल प्रोटीन के encapsulation की पुष्टि। 19,20,41

इसके अलावा, रूपात्मक परिवर्तन और बीएसए से भरी हुई सेकेंड, SEM और दीपा विश्लेषण का आयोजन किया गया और डेटा चित्रा 8 में प्रस्तुत किया है। SEM छवियों बीएसए लदान के बाद बरकरार है और साफ microridges की उपस्थिति की पुष्टि micromeritic गुणों की जांच करने के लिए। इसके अलावा, कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन एसईसी में बीएसए लदान के बाद व्यास, घेरा, और पहलू अनुपात में मनाया गया। इन आंकड़ों consiste हैंNT एसईसी का उपयोग कर दवाओं के encapsulation पर पिछली रिपोर्टों के साथ। 7,10

समझाया बीएसए की राशि यों, बीएसए बीएसए से भरी हुई सेकेंड के 5 मिलीग्राम से निकाला गया था, और डेटा तालिका 1 में प्रस्तुत किया है। डेटा इंगित करता सेकेंड के ग्राम प्रति बीएसए लोडिंग के 0.170 ± 0.01 छ। कुल मिलाकर, SEM, दीपा, CLSM, और spectrographic विश्लेषण द्वारा बीएसए की मात्रा का ठहराव, एल में बीएसए के सफल encapsulation पुष्टि clavatum एसईसी और एसईसी रूपात्मक स्थिरता।

आकृति 1
चित्रा एल के लिए 1. सुव्यवस्थित निष्कर्षण प्रक्रिया clavatum Sporopollenin Exine कैप्सूल (एसईसी)। (ए) अनुपचारित बीजाणुओं। (बी) के बीजाणु 6 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एक refluxing सेट-अप का उपयोग कर Defatting। (सी) विलायक निस्पंदन और इकट्ठा defatted बीजाणुओं के आयन। (डी) कमरे के तापमान पर defatted बीजाणुओं की सुखाने। (ई) 30 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 85% (वी / वी) फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग PTFE फ्लास्क में बीजाणु acidolysis। (एफ) एसिड निस्पंदन वैक्यूम निस्पंदन का उपयोग कर सेट-अप। (G) एसईसी धोने के पानी, अम्ल, क्षार की एक श्रृंखला का उपयोग, और सॉल्वैंट्स धोने कदम। (एच) एसईसी सुखाने 60 डिग्री सेल्सियस और 1 मिलीबार 10 घंटे के लिए वैक्यूम वैक्यूम ओवन का उपयोग कर। (मैं) बरकरार, स्वच्छ और (कश्मीर) के लिए एक अंतिम उत्पाद के रूप में एसईसी सूख गया। (जे) एसईसी और बीएसए समाधान का मिश्रण। एसईसी और बीएसए समाधान के homogenization। (एल) वैक्यूम एसईसी में बीएसए की लोडिंग। (एम) बीएसए लोड सेकेंड। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

54768 / 54768fig2.jpg "/>
एल के चित्रा 2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण पूर्व एसिड उपचार के विभिन्न चरणों के दौरान clavatum बीजाणुओं। (ए) अनुपचारित sporoplasmic सेलुलर organelles और biomolecules दिखा बीजाणुओं। (बी) एसीटोन में इलाज बीजाणुओं sporoplasmic सामग्री बाधित दिखा रहा है। (सी) एवं (घ) क्षार इलाज किया sporoplasmic सामग्री को हटाने के दिखा बीजाणुओं और झुर्रियों आंतरिक cellulosic intine परत। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एल के चित्रा 3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण एसिड के विभिन्न चरणों के दौरान clavatum बीजाणु5 से 30 घंटा के लिए उपचार (ए - डी)। क्रमशः, 5, 10, 20, और 30 घंटा के एसिड का इलाज किया बरकरार बाहरी microstructure और स्वच्छ आंतरिक गुहा दिखा बीजाणुओं। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. बीजाणु और Sporopollenin Exine कैप्सूल (एसईसी)। उपचार के विभिन्न चरणों के बाद प्रोटीन सामग्री के प्रोटीन सामग्री। का प्रतिनिधित्व डेटा मानक विचलन के साथ तीन प्रतियों माप के एक औसत है (एन = 3)। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा च।

चित्रा 5
बीजाणुओं की चित्रा 5. गतिशील इमेजिंग कण विश्लेषण (दीपा) और Sporopollenin Exine कैप्सूल उपचार के विभिन्न चरणों में (एसईसी) कॉलम (एक - सी)। क्रमश: पूर्व एसिड उपचार, एसिड उपचार, और बरकरार एसईसी हैं। भूखंड एसईसी व्यास, घेरा, पहलू अनुपात, और बढ़त ढाल के प्रतिनिधि रेखांकन कर रहे हैं। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और 30 घंटा के गतिशील इमेजिंग कण विश्लेषण (दीपा) Acidolyबहन-केवल Sporopollenin Exine कैप्सूल (एसईसी)। (ए) बरकरार बाहरी microstructure और स्वच्छ आंतरिक गुहा दिखा सेकेंड। (बी) एसईसी व्यास, घेरा, और पहलू अनुपात के प्रतिनिधि रेखांकन। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. Confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर (CLSM) से पहले और उपचार और बीएसए एन्कैप्सुलेशन के बाद Sporopollenin Exine कैप्सूल (एसईसी) का विश्लेषण। पहली पंक्ति sporoplasmic सेलुलर organelle और बायोमोलिक्यूल autofluorescence दिखा इलाज बीजाणुओं को दर्शाया गया है। दूसरी पंक्ति में एक खाली भीतरी गुहा के साथ 30 घंटा के acidolysis केवल एसईसी को दर्शाया गया है। तीसरी पंक्ति को दर्शाया गया है FITC-बीएसए भरी हुई30 घंटा के acidolysis केवल एसईसी में। (स्केल सलाखों 10 माइक्रोन) कर रहे हैं। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और गतिशील इमेजिंग कण विश्लेषण (दीपा) बीएसए से भरी हुई Sporopollenin Exine कैप्सूल (एसईसी) की विशेषता। बीएसए लोड सेकेंड के (ए) SEM छवियों। (बी) बीएसए से भरी हुई एसईसी व्यास, घेरा, पहलू अनुपात, और बढ़त ढाल के प्रतिनिधि रेखांकन। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सामग्री प्रति बैच बीएसए लोड हो रहा है (125 मिलीग्राम / एमएल) 5 मिलीग्राम सेकेंड में बीएसए (एमजी) बीएसए की राशि भरी हुई (प्रति सेकेंड के छ छ) इलाज बीजाणुओं 0.6 मिलीलीटर 0.654 ± 0.05 0.131 ± 0.01 एसईसी 1.2 मिलीलीटर 0.831 ± 0.05 0.170 ± 0.01

तालिका 1 गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अनुपचारित बीजाणु और सेकेंड में के encapsulation। बीएसए समाधान की मात्रा प्रति 'इलाज बीजाणुओं' या 'एसईसी' की 150 मिग्रा बैच लोड करने के लिए इस्तेमाल किया। का प्रतिनिधित्व डेटा मानक विचलन के साथ तीन प्रतियों बैचों के एक औसत है (एन = 3)। 41 से अनुकूलित और वैज्ञानिक रिपोर्ट से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया।

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Discussion

इस काम के, एल से एसईसी निकासी का एक व्यवस्थित विश्लेषण में clavatum बीजाणुओं प्रस्तुत किया जाता है और इस रिपोर्ट से पता चलता है कि यह जबकि यह भी एक उच्च तापमान प्रक्रिया (180 डिग्री सेल्सियस) की आवश्यकता होती है मौजूदा प्रोटोकॉल के विपरीत 11 पूर्व मौजूदा आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की। एक महत्वपूर्ण व्यवस्थित बनाने को प्राप्त करने के लिए उच्च गुणवत्ता के कैप्सूल का उत्पादन संभव है और एक लंबी प्रक्रिया की अवधि (7 दिन), 11 मौजूदा एसईसी निकासी प्रसंस्करण अनुकूलन मुख्य रूप से तापमान और acidolysis कदम की अवधि को कम करने पर ध्यान केंद्रित किया गया था।

Defatting और क्षार उपचार बीजाणुओं से sporoplasmic सामग्री के न्यूनतम हटाने प्रदान करते हैं। हालांकि, 5 घंटा से acidolysis 120 मानव संसाधन sporoplasmic सामग्री की अधिकतम राशि को हटा दिया। परिणाम संकेत दिया है कि कुल प्रोसेसिंग अवधि और तापमान काफी पारंपरिक तकनीक, 11 से कम किया जा सकता है और कहा कि मध्यम तापमान में सिर्फ 30 घंटा (70डिग्री सेल्सियस) फॉस्फोरिक एसिड इष्टतम गुणवत्ता कैप्सूल प्रदान की है। इसके अलावा, 30 घंटा के acidolysis से परे है, यह पाया गया कि एसईसी सुझाव है कि सेकेंड के पूरे बैच समग्र संरचनात्मक अखंडता में कमी का प्रदर्शन किया जा सकता है फ्रैक्चर के लिए शुरू किया और कण टुकड़े में उल्लेखनीय वृद्धि मनाया गया। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एल clavatum अपेक्षाकृत मजबूत sporopollenin, 2 शामिल करने के लिए माना जाता है और इस तरह के रूप में, एसिड एकाग्रता, तापमान, और / या हाइड्रोलिसिस अवधि विशिष्ट प्रसंस्करण की स्थिति इस प्रोटोकॉल में शामिल है, अन्य पराग प्रजातियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

यह दिखाया गया था कि acidolysis केवल फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग (85% वी / वी) 30 घंटा के पैदावार स्वच्छ और बरकरार सेकेंड के लिए। 41 डेटा कि acidolysis एसईसी उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम है इस बात की पुष्टि द्वारा सेकेंड के उत्पादन। अंत में, एसिड केवल एसईसी बीएसए के encapsulation के लिए इस्तेमाल किया गया और लदान के एक उच्च डिग्री मनाया गया। लोड हो रहा है wएक निर्वात, जिससे आंतरिक एसईसी गुहा दबाव जबरदस्ती खाली कैप्सूल में बीएसए समाधान आकर्षित करने के लिए बदल दिया है के आवेदन के साथ हासिल की है। Nanochannels (व्यास 15 -। 20 एनएम) है, जो पहले से एल के exine दीवारों में पहचान की गई clavatum, 7 समाधान बड़ी आंतरिक गुहा में प्रवेश करने की अनुमति देते हैं। लोड करने के बाद, कैप्सूल धोया और एक फ्रीज सुखाने की मशीन में सूख एक मुक्त बह पाउडर उपज के लिए किए गए थे।

आकार एकरूपता और लक्षण एक सफल encapsulation सामग्री की गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। मनाया आकार एकरूपता और बीएसए से भरी हुई सेकेंड के बरकरार आकृति विज्ञान Microencapsulation अनुप्रयोगों के लिए acidolysis केवल संसाधित सेकेंड के संभावित उपयोग की पुष्टि की।

इन परिणामों के सेकेंड के बड़े पैमाने पर औद्योगिक उत्पादन के लिए और दवाओं के Microencapsulation में सेकेंड के संभावित अनुप्रयोगों में अधिक से अधिक ब्याज उत्तेजक के लिए महत्वपूर्ण हैं,प्रोटीन, पेप्टाइड्स, खाद्य आपूर्ति करता है, Nutraceuticals, और सौंदर्य प्रसाधन।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

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References

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