Mikroenkapsülasyon Uygulamaları için Ekstraksiyon Tesisi tabanlı Kapsüller

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol / Eser Lycopodium clavatum sporlar Sporopollenin ekzin kapsüller (sn) üretimi için, bu saniye hidrofilik bileşiklerin yüklenmesi için düzenlenmiş bir işlem açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bitki bazlı sporlar veya polen elde edilen mikrokapsüller mikroenkapsülasyon uygulamaları çeşitli bir yelpazede için sağlam bir platform sağlar. İç sporoplasmic içeriğini kaldırmak üzere sporlar ve polen işlenirken Sporopollenin ekzin kapsüller (sn) elde edilir. Elde edilen içi boş mikro kapsüller Mikromeritik muntazamlık yüksek derecede sergilerler ve özellikle bitki türlerine ilişkin karmaşık mikro özelliklerini korumaktadır. Burada, Lycopodium clavatum sporlar saniye üretimi için, bu saniye hidrofilik bileşiklerin yüklenmesi için düzenlenmiş bir işlemi gösterilmektedir. Geçerli SEC izolasyon prosedürü son zamanlarda önemli ölçüde geleneksel SEC izolasyon kullanılan işleme gereksinimlerini azaltmak için, ve bozulmamış mikrokapsüllerin üretimini sağlamak için optimize edilmiştir. Doğal L. clavatum sporlar fosforik asit ile muamele edilmiş, aseton ile yağdan arındırılmış, ve büyük ölçüde sporoplasmi uzaklaştırmak için yıkanırc içeriği. aseton yağların yok sonra% 85 fosforik asit kullanılarak tek bir işlem adımı, tüm sporoplasmic içeriğini çıkarmak için gösterilmiştir. 30 saat asit işlem süresini sınırlayarak, temiz saniye izole etmek ve uzun süreli işlem süresi ile meydana gösterilmiştir SEC kırılma önlemek mümkündür. su ile iyice yıkamak, asitler seyreltik bazlar seyreltilmiş ve solvenler her sporoplasmic madde ve kimyasal artıklar yeterli kaldırılır sağlar. vakum yükleme tekniği Hidrofilik bileşik olarak bir model proteini (Sığır Serumu Albümini) yüklemek için kullanılır. Vakum yükleme genellikle diğer mikro kapsül protokollerinde gerekli olan sert solventler veya istenmeyen kimyasallar için gerek kalmadan çeşitli bileşikler yüklemek için basit bir teknik sağlar. Bu izolasyon ve yükleme iletişim kurallarına göre, SEC sn bir mikrokapsülleme gibi uygulamalar, terapötik, gıda, kozmetik çok çeşitli kullanım için umut verici bir madde, ve kişisel bakım eşya teminfuarları.

Introduction

Orada mikrokapsülleme uygulamalarında kullanılmak üzere bitki sporlarının ve polenlerin elde edilen doğal bitki bazlı kapsüller önemli ilgi. Olan Doğada 1-15, sporlar ve polen sert çevre koşullarına karşı duyarlı genetik malzemeler için koruma sağlar. Bitki sporlar ve polen temel yapısı tipik olarak bir dış kabuk tabaka (ekzin), bir iç muhafaza tabakası (intine), ve iç sitoplazmik malzeme içerir. Ekzin sporopolleninin olarak ifade edilen bir kimyasal sağlam bir biyopolimerin 1,9,10,13,16 oluşur ve intine, öncelikle, selülozik malzeme oluşur. 16-18 boş kapsüller çeşitli işlemler 7,9 ile izole edilebilir sitoplazmik malzemenin çıkarılması için proteinler ve intine katmanı. 2,12,16 Bu Sporopollenin ekzin kapsüller (sn) nedeniyle dar bir büyüklük dağılımı ve homojen morfolojisi sentetik enkapsülantların için çekici bir alternatif sağlar. 7,9,13,19,20Bu Lycopodium clavatum gibi çeşitli bitki türlerinden saniye elde etmek üzere standart işlemlerinin geliştirilmesi, ilaç verme, gıda ve kozmetik alanlarında mikrokapsülleme geniş bir uygulama yelpazesi için potansiyel açmaktadır. 6,10-13,21

Sn elde etmek amacıyla, araştırmacılar, ilk organik çözücüler ile sporlar ve polen muamele edilmiş ve sitoplazmik içeriğini çıkarmak için alkalin çözeltiler içinde geri akışa alınmıştır. 22-25 Ancak, geride kalan kapsülün yapısı hala selülozik intine tabaka ihtiva ettiği belirlendi. Bu çıkarmak için, araştırmacılar, SEC intine çıkarılması tercih edilen bir yöntem haline fosforik asit, birkaç gün boyunca 22-25 hidroklorik asit, sıcak sülfürik asit, ya da sıcak fosforik asit ile uzun asidik hidroliz işlemi araştırdık. 2 Bununla birlikte, devam eden yılda araştırma, çeşitli sporlar ve polenler beni işleme sert karşı direnç de¤iflik derecelerde olduğunu göstermiştirthods yaygın olarak kullanılan. 26,27 Bazı sporlar ve polenler tamamen bozulmuştur ve kuvvetli alkali çözeltiler içinde tüm yapısal bütünlüğünü kaybeden veya ağır güçlü asidik çözeltiler içinde hasar. yapan 16 işleme koşulları SEC yanıt olarak değişkenlik kimyasal önemsiz varyasyonlar nedeniyle yapı ve türler arasındaki Sporopollenin ekzin malzemenin ekzin morfolojisi. 28 nedeniyle Sporopollenin ekzin kapsüller (sn) sağlamlığına değişkenlik nedeniyle, spore ve polen her tür için işleme koşullarını optimize etmek için gereklidir.

L. türünden bitki sporlar clavatum saniyelik en çok çalışılan tek kaynağı haline gelmiş. . Bunun nedeni yaygın kullanılabilirlik, düşük maliyet, monodispersiteye ve kimyasal dayanıklılık öncelikle olduğu önerilmiştir 9,29 sporların rahatlıkla 1 gruplaşmaların şeklinde sporoplasmic içeriği hasat ve ihtiva edilebilir - 2 mikron hücre organellerinin ve biomolecules. 11 L. clavatum sporlar terapötik geniş bir uygulama yelpazesi için doğal bir toz yağlama maddesinin, kozmetikler için 30,31 bir baz olarak 30 ve bitkisel ilaç 32-36 kullanılmıştır. L. elde SEC sn clavatum sporlar ve işlendikten sonra polen. 2 diğer türlerden saniyeden daha fazla işleme karşı daha dayanıklı olduğu gösterilmiştir, elde edilen SEC sn Komplike microridge yapıları ve yüksek morfolojik düzenlilik kapsüllenmesi için büyük bir iç boşluğu sağlarken korumak için gösterilmiştir. 7 çalışmalar göstermektedir L. clavatum SEC sn ilaçlar, 10,13 aşılar, 11 protein, 7,14 hücreleri, 8 yağlar, 5-7,9 ve gıda takviyeleri kapsüllenmesi için kullanılabilir. 5,15 Gözlemlenen SEC yükleme verimleri, geleneksel ile karşılaştırıldığında nispeten yüksektir kapsülleme malzemeleri. 7 de rapor faydaları vardırSEC kapsülleme böyle, 6,10 zevke maskelemek için ve oksidasyona karşı doğal bir koruma bir dereceye sağlamak. Mevcut çalışmalarda 12 yetenek, L. için en sık kullanılan SEC ekstraksiyon yöntemi olarak clavatum dört ana adımlar dayanmaktadır. Birinci adım sporlar yağdan arındırmak için, 50 ° C 'de en fazla 12 saat boyunca, aseton solvent geri akan. 11 adım sitoplazma ve proteinli maddelerin çıkarılması için 120 ° C'ye kadar 12 saat boyunca% 6, potasyum hidroksit, alkalin geri akan. 11 Adım üç 180 ° C'de en fazla 7 gün boyunca,% 85 fosforik asit içinde asit geri akış selülozik intine malzeme kaldırmaktır. 11 Dördüncü adım kalan olmayan ekzin malzemeyi çıkarmak için, su, çözücü maddeler, asitler ve bazlar kullanılarak kapsamlı yıkama işlemi olup ve kimyasal artıklar.

kapsülleme uygulamalara ilişkin SEC çıkarma ana hedefleri, ücretsiz fro sitoplazmik malzemenin boş kapsül üretmek için vardırPotansiyel alerjik proteinler m ve morfolojik olarak bozulmamış. 2,37 Ancak, sanayi üretim açısından, tür enerji verimliliği, üretim süresi, güvenlik, ve ortaya çıkan atık gibi ek ekonomik ve çevresel faktörleri dikkate almak da önemlidir. enerji verimliliği ile ilgili olarak, yüksek sıcaklıklar ve uzun işlem süreleri hem üretim maliyetlerini yanı sıra çevresel ayak izi etkiler. Üretim süresi ve gerçekleştirme süresi işleme karlılığı etkileyen en önemli faktörlerdir. Özellikle kaygı yüksek sıcaklık fosforik asit işleme güvenlik sorunları artırır ve toplu dönüş zamanlarında önemli altyapı bakım artışları ve gecikmelere yol açan aşındırıcı ölçekleme neden olduğu bilinmektedir olmasıdır. 38-40 Mümkünse, yol açabilir gerekli adımların sayısını en aza indirmek önemli ölçüde üretilen atık azaltılması. Ancak, yaygın L. dört aşamalı süreç kullanılan clavatum SEC çıkarma sadece EV vardırAraştırmanın on yıllardır olved ve küçük gerçek proses optimizasyonu olmuştur. Son zamanlarda, Mundargi ve ark., 41 sistematik değerlendirilmesi ve en sık bildirilen SEC çıkarma tekniklerinden biri optimize ederek bu alanda devam eden çalışmalara önemli bir katkı yaptı.

Bu çalışmada ilk bölümünde: spor yağsızlaşma 6 saat 50 ° C'de aseton işleme kullanılarak gösterilmiştir; sporoplasm ve intine kaldırma işlemleri 30 saat boyunca 70 ° C'de% 85 fosforik asit işleme kullanılarak gösterilmiştir; Su, çözücüler, asit ve baz ile geniş bir yıkama bakiye sporoplasmic içeriğinin kaldırılması göstermek için kullanılır; ve SEC kurutma konveksiyon kurutma ve vakum kurutma fırını kullanılarak gösterilmiştir. Üçüncü bölümde, SEC vakum yükleme, bir model protein vakum yükleme kullanılarak araştınlır, ardından bovin serum albümini (BSA), yıkama ve liyofilizasyon BSA-sek yüklendi. Dördüncü bölümde, determinBSA kapsülleme verimlilik ation sonication soruşturma, santrifüj kullanılarak ve UV / Vis spektrometresi gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L. Sporopollenin ekzin Capsule'lerden 1. Ekstraksiyon (sn) clavatum Sporlar

Not: SEC çıkarma işlemi bir yanıcı toz (L. clavatum), sıcak aşındırıcı asitler ve yanıcı solventler, dolayısıyla uygun kişisel koruyucu donanımlar (gözlük, yüz maskesi, eldiven, laboratuvar önlüğü), kullanım onaylanan risk değerlendirmesini ve bertaraf gerektirir yetkili laboratuvar personeli tarafından kimyasallar esastır.

  1. Spore yağları azaltır
    1. Bir cam kondenser, su dolaşım sistemi ve su banyosu (Şekil 1) kullanarak bir davlumbaz bir reflü set-up hazırlayın.
    2. 100 g L. tartılır uzakta herhangi bir ateşleme kaynağından toz oluşturarak olmadan clavatum sporlar.
      Not: Ticari olarak elde edildi Burada kullanılan sporların (Malzeme Listesi).
    3. Manyetik bir karıştırma çubuğu ile 1 L'lik bir politetrafloroetilen (PTFE) yuvarlak dipli bir şişeye yavaş yavaş Aktarım sporlar.
    4. sporlar için 500 ml aseton eklePTFE şişesi ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için hafifçe çalkalanır.
    5. 50 ° C'de su banyosu grubu PTFE içine yerleştirilir ve geri akış yoğunlaştırıcısı bağlanabilir.
    6. 200 rpm'de karıştırılarak 6 saat aseton içinde geri gerçekleştirmek ve daha sonra oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
    7. vakum altında filtre kağıdı kullanılarak süspansiyon filtre edin ve büyük (15 cm çapında) bir cam Petri kapları içinde yağdan arındırılmış sporlar toplar.
    8. Çözücü buharlaştırma için delikli alüminyum folyo ile kaplayarak oda sıcaklığında (davlumbaz) de sporlar kurutun.
  2. asidoliz
    1. % 85 deiyonize (Di) su (h / h) fosforik asit hazırlamak ve 1 L'lik bir PTFE şişeye yağsız kuru sporların aktarın.
    2. yağı alınmış sporların fosforik asit (% 85 h / h) 500 ml ilave edilir.
    3. 70 ° C'de bir su banyosu grubu PTFE içine yerleştirilir ve geri akış yoğunlaştırıcısı bağlanabilir.
    4. 30 saat süre ile fosforik asit içinde hafif bir geri akış (70 ° C) gerçekleştirmek ve daha sonra izinOda sıcaklığında soğutulur.
    5. 500 ml ılık distile su kullanılarak süspansiyon sulandırmak ve filtre kağıdı kullanılarak vakumla süzme ile saniye toplamak.
    6. bir dizi yıkamaya tabi gerçekleştirmek için 3 L cam behere saniye aktarın.
  3. SEC Yıkama
    1. Davlumbaz saniye içeren 3 L cam behere koyun.
    2. 10 dakika için hafifçe karıştırılarak sn 800 ml sıcak (50 ° C), DI su ilave edilir.
    3. filtre kağıdı ve bir vakum filtrasyonu kurulumu kullanılarak süspansiyon filtre.
    4. Temiz 3 L cam beher saniye toplayın.
    5. Yineleyin 1.3.1 adımları. 1.3.4 için. Beş kere.
    6. 10 dakika için hafifçe karıştırılarak sn 600 ml sıcak (45 ° C) aseton ekleyin.
    7. Vakum altında süzme ile saniye toplamak ve temiz bir 3 L'lik bir cam behere saniye aktarın.
    8. Yineleyin 1.3.6 adımları. ve 1.3.7. Sıcak 600 ml (50 ° C), 2 M hidroklorik asit kullanılarak.
    9. Yineleyin 1.3.6 adımları. ve 1.3.7. ho 600 ml kullanılarakt (50 ° C), 2 M sodyum hidroksit.
    10. Tekrarlayın 1.3.1 ve 1.3.4 sekiz kez yineleyin.
    11. Yineleyin 1.3.6 adımları. ve 1.3.7. Sıcak 600 ml (45 ° C) aseton kullanılmıştır.
    12. Yineleyin 1.3.6 adımları. ve 1.3.7. Sıcak 600 ml (45 ° C) etanol kullanılmıştır.
    13. Yineleyin 1.3.6 adımları. ve 1.3.7. Sıcak 800 ml (50 ° C) DI suyun kullanımı.
    14. su içeriği kaldırmak için 24 saat boyunca oda sıcaklığında bir çeker ocak içinde altı büyük cam Petri kapları ve kuru temiz sn aktarın.
    15. 60 ° C ve 10 saat süre ile ya da sabit bir ağırlığa kadar, 1 mbar vakumda bir vakumlu fırın içinde saniye kurutulur.
    16. kurutulmuş saniye toplayın ve bir polipropilen şişe aktarın.
    17. kuru kabine saniye saklayın.

SECS 2. Karakterizasyonu

  1. Farklı aşamalarında üretilen sporları ve Secs kullanarak taramalı elektron mikroskobu analizi 41 gerçekleştirin.
  2. Farklı aşamalarında üretilen sporları ve Secs kullanarak element analizi 41 gerçekleştirin. DRy element analizi önce en az 1 saat süre ile 60 ° C 'de, tüm örnekler ve 6.25 bir çarpma faktörü ile, yüzde azot kullanılarak protein içeriğini hesaplamak. 11, her numune için üç kez ölçümleri kullanılarak sonuçlar elde edilir.
  3. Bir dinamik görüntü parçacık analizörü kullanılarak Mikromeritik özellikleri analiz yapmak. 41
  4. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak, işlenmemiş Tarama işlenir ve FITC-BSA-yüklü SEC sn. 41

Vakum Yükleme Tekniği ile 3. biyomakromolekülün Enkapsulasyon

  1. 50 ml'lik bir polipropilen tüpü içine distile su ve transferi ile 125 mg, 1.2 ml / ml bovin serum albümini (BSA) çözeltisi hazırlayın.
  2. Saniye 150 mg tartılır ve BSA solüsyonuna aktarın.
  3. homojen bir çözelti meydana getirmek üzere, 10 dakika boyunca tüp vorteksleyin.
  4. filtre kağıdı kullanılarak tüp örtün.
  5. 1 mbar'da vakumla 4 saat dondurularak kurutma şişesine ve kuru tüp aktarın.
  6. 3.1 adımları gerçekleştirin3.5. üç bağımsız gruplar için.
  7. BSA yüklü saniye toplayın ve bir havan kullanarak topakların kaldırın.
  8. 50 ml'lik bir tüp BSA yüklü saniye aktarın ve artık BSA kaldırmak için 2 ml DI su ekleyin.
  9. 5 dakika boyunca 4704 xg santrifüj yoluyla saniye toplayın ve supernatant atın.
  10. bir zamanlar DI suyla yıkamayı tekrarlayın.
  11. Filtre kağıdı kullanarak BSA yüklü saniye içeren tüp örtün.
  12. bir dondurucu (-20 ° C) saniye aktarın ve 1 saat dondurmak.
  13. Daha fazla karakterizasyon kadar dondurucuda 24 saat ve mağaza için saniye kurumaya dondurun.
  14. adımlarda 3.1 aynı prosedürü kullanarak BSA olmadan plasebo Secs hazırlayın. 3.13 için.
  15. 3.1 adımlarda aynı prosedürü kullanarak FITC-BSA yüklü saniye hazırlayın. 3.13 için.

Kapsülleme Etkinliğinin Belirlenmesi 4.

  1. 2 ml polipropilen tüplerde BSA yüklü saniye 5 mg tartılır.
  2. 1.4 mi fosfataz takımı için Phospha eklemeTe, 5 dakika boyunca salin pH 7.4 (PBS) ve vorteks tamponlu.
  3. Sonda 10 sn 3 döngüleri için% 40 genlik süspansiyon sonikasyon.
  4. 0.45 mikron Polyethersulfone (PES) filtre kullanarak çözüm Filtre.
  5. adımlarda 4.1 prosedürün aynısını. 4.4'e. plasebo Secs kullanarak.
  6. boş olarak plasebo ile 280 nm'de absorbansı ölçülür.
  7. BSA miktarı, PBS içinde BSA standart bir eğrisi (200 ila 1000 ug / ml) ile kapsüllenmiş ölçmek. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sporopollenin ekzin Kapsülleri için Aerodinamik Ekstraksiyon Süreci

L. clavatum SEC ekstraksiyon üç ana aşamalar ile elde edildi: (1) aseton kullanılarak yağlarını; (2) asidoliz fosforik asit% 85 ile (h / h); ve (3) Kapsamlı SEC yıkama solventler kullanılarak. Akıcı SEK ekstraksiyon işleminin akış Şekil 1, bir sunulmuştur -. Kısaca, işlem 50 ° C 'de 6 saat süre ile geri akış aseton ile yağ tabakasının aşamasını içermektedir ve yağsız sporlar daha sonra artık ayrılması için bir davlumbaz gece boyunca kurutulmuştur aseton. yağı alınmış sporlar 30 saat boyunca, fosforik asit kullanılarak asitolisiz'ine tabi tutuldu. asidoliz sırasında sporoplasmic malzemelerin çoğunluğu çözüldü ve daha sonra vakumlu süzme aşaması esnasında ayrılmaktadır. Asit çözücüler kullanılarak tortusal sporoplasmic malzemeler, yıkama adımları geniş bir dizi kaldırmak içinBaz, ve su gerçekleştirilir. SEC sn ilk 24 saat boyunca oda sıcaklığında kurutuldu ve 10 saat kalıntı çözücüler ve nemi çıkarmak için daha 60 ° C ve 1 mbar vakumda kurutulmuştur.

Şekil 1'de gösterildiği gibi, tüm SEC ekstraksiyon adımları tehlike fark ile bir duman başlığı içinde yapıldı. SEC ekstre sırasında yaklaşık% 70 kütle kaybı sporoplasmic maddelerin yok edilmesi nedeniyle görülmektedir ve veri temiz ve bütün halde saniye üretimi mevcut raporlar ile uyumludur. 7, 19,20,29 akıcı bir süreç, ilk yağ ayırma aşamasından nihai ürüne yaklaşık 5 gün içinde tamamlanır ve işlem kolaylıkla uygun güvenlik kontrolleri ile 1 kg'lık laboratuar ölçekli toplu kadar ölçeklendirilebilir.

Nedeniyle involvin olmadan olmanın basit adımda M, bu avantajlıdır - Secs kullanan Kapsülleme adımları Şekil 1'de J sunulmaktadırg sert organik çözücüler veya mekanik kesme kuvvetleri gerektiren. 7 Bizim kapsülleme deneyleri 150 sn mg ve saniye ile alımı için yeterli bir yükleme çözüm hacmi içerir. Bu saniye yükleme seçilen sulu ya da organik çözücüler içinde bileşiğin çözünürlüğüne ile sınırlıdır, ve yükleme üç yükleme yöntemlerin herhangi biri ile elde edilebilir: Pasif, sıkıştırma, ve vakum yükleme. Bununla beraber, vakum yükleme bileşiklerinin nispeten yüksek bir kapsülleme sağlar. 7, 19,20

Sporopollenin ekzin Capsules fizikokimyasal Karakterizasyonu

Şekil 1 'de sunulmuştur akıcı bir işlem kullanılarak üretilen saniye temizlik belirlemek için yüzey ve kesit morfolojisi, Mikromeritik özellikleri, temel bileşim SEC ekstraksiyon işleminin farklı aşamalarında incelenmiştir. Da gösterildiği gibiŞekil 2, SEM görüntüleri benzersiz mikroyapıya sahip sağlam sporlar gösterir ve işlemeden önce mikron çaplı sporoplasmic organelleri kesit görüntüde gözlenmiştir. spor yağ tabakasının kurumasına ve alkali tedavi ile hiçbir morfolojik ve yapısal değişikliklerin sporoplasmic organellerin kopma dışında gözlendi.

Şekil 3, 5 saat 30 saat için çeşitli zaman noktalarında, fosforik asit kullanılarak asidoliz sonra saniye SEM görüntülerini göstermektedir. 30'a kadar saat girdiği asidoliz Bu sonuçlar desteği sporoplasmic malzemelerin yoksun sağlam ve temiz saniye sağlar. Kalıntı proteinli malzemenin teyit etmek amacıyla, CHN element analizi 29 uygulandı ve veri Bu sonuçlar, temiz ve bütün halde saniye elde etmek için en iyi işlem durumu seçmek için bir kılavuz sağlar Şekil 4'te sunulmuştur. yağsız ve alkali tedavi saniye durumunda, hiç önemli proteinlikazıma görülmektedir. asidoliz fosforik asit ile, ancak, proteinli maddelerin çoğunluğu 30 saat çıkarılır ve ayrı bir indirme 120 saat proses süresi arttıkça görülmektedir. Elemental veri Secs 7,11 uzatılmış işleme ve ticari saniye ile önceki raporlar ile uyumludur.

Mikromeritik özellikler dinamik görüntü partikül analizi (DIPA) ile analiz edildi ve sonuçlar 31.0 ± 2.2 um bir boyuta sahip, Bu sonuçlar, en fazla 30 saat boyunca asidoliz sonra saniye arasında üniform bir boyut dağılımı destek Şekil 5'te sunulmuştur. Buna karşılık, SEC yapısal bütünlük uzun süreli asidoliz azalır ve 30 saat tedavi sürelerinin ötesinde Secs önemli parçalanma neden başlar.

Şekil 6 sadece asidoliz yanlısı üretilen saniye için SEM ve DIPA verileri gösterir30 saat süre ile, fosforik asit kullanılarak sert atmosfer. Bu sonuçlar yağ tabakasının kurumasına aşamasından sonra, 32.5 ± 2.7 mikron muntazam bir boyut dağılımı ile temiz ve bozulmamış saniye üretilen asidoliz teyit etmektedir. Asidoliz sadece SEC sn üzerinde ve daha önceki raporlar ile ele alındığı gibi, alkali ve asidoliz muamelesi tarafından üretilen saniye ile karşılaştırılabilir% azot içeriğine göre göreceli 11 sadece 0.15 ±% 0.0 bir artık protein içeriğine sahiptir. 7.

Sporopollenin ekzin kapsüller kullanılarak Mikrokapsülleme

L. kullanımını göstermek için, asidoliz sadece bir işlem kullanılarak üretilen clavatum SEC sn, mikrokapsülleme deneyleri, bir model protein olarak BSA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saniye yüklemeden Şekil 7. 150 mg saniye ve 125 mg / ml BSA ve 1.2 ml kullanılarak vakum yükleme tekniği kullanılarak elde CLSM im gösterir edildiöncesi ve asidoliz sadece işleme sonra ve FITC-BSA kapsülleme ile sn yaşları. veri nedeniyle spor boşluğunun içine sporoplasm bileşenlerinin varlığı bu işlenmemiş SEC sn sergi otofloresansı gösterir. Bununla birlikte, asidoliz sadece işlemden sonra, her sporoplasmic içeriği boş iç boşluğu ile sonuçlanan kaldırılır. Çarpıcı, FITC BSA kapsülleme sonra, yeşil floresan Secs içine modeli protein enkapsülasyonu teyit saniye içinde görülmektedir. 19,20,41

Ayrıca, SEC sn, SEM ve DIPA analizleri yapılmıştır BSA yüklü ve veri Şekil 8'de sunulmuştur. SEM görüntüleri BSA yüklemeden sonra sağlam ve temiz microridges varlığını doğrulamak morfolojik değişiklikler ve Mikromeritik özelliklerini incelemek. Buna ek olarak, önemli değişiklikler saniye içine BSA yüklemeden sonra çapı, dairesellik ve boy oranı gözlendi. Bu veriler consiste olannt saniye kullanan ilaçların kapsülleme önceki raporlarla. 7,10

Kapsüllenmiş BSA miktarını ölçmek için, BSA BSA yüklü saniyelik 5 mg ekstre edilmiş ve veriler Tablo 1 'de sunulmuştur. Verileri saniye gramı başına BSA yükleme 0.170 ± 0.01 g gösterir. Genel olarak, SEM, DIPA, CLSM ve spektrografik analizi ile BSA miktar, L. BSA başarılı kapsülleme teyit clavatum SEC sn ve SEC morfolojik kararlılık.

Şekil 1
L. Şekil 1. Aerodinamik Ekstraksiyon Süreci clavatum Sporopollenin ekzin Kapsüller (sn). (A) muamele edilmemiş sporlar. (B), Spore 6 saat 50 ° C'de geri akış düzeneğini kullanarak yağ tabakasının. (C), çözücü filtre toplamak yağı alınmış sporların iyonu. (D), oda sıcaklığında yağsız sporların kurutulması. (E), 30 saat boyunca 70 ° C'de% 85 (h / h) fosforik asit kullanılarak PTFE şişede Spore asidoliz. (F) asit filtrasyon, vakum filtrasyonu kullanılarak kurulum. (G) sn su, asit, baz, bir dizi kullanarak yıkanması ve çözücüler yıkama aşamaları. (H) sec kurutma, 60 ° C'de ve 10 saat süre ile 1 mbar vakumda vakumlu fırın kullanılarak. (I) 'Bozulmamış temiz ve (K). SEC sn ve BSA çözeltisi karıştırma. bir nihai ürün olarak (J) saniye kurutulmuş SEC sn ve BSA çözeltisi Homojenizasyon. secs içine BSA (L) Vakum yükleme. (M) BSA yüklü saniye. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

54768 / 54768fig2.jpg "/>
L. Şekil 2. Taramalı Elektron Mikroskobik Analizi Ön asit Tedavi Farklı Aşamaları sırasında clavatum Sporları. (A) sporoplasmic hücresel organellere ve biyomoleküllerin gösteren Tedavi edilmeyen sporlar. (B) Aseton tedavi sporlar sporoplasmic içeriği bozulmuş göstermeyen. (C) (D) Alkali sporoplasmic içeriklerin kaldırılmasını gösteren sporlar tedavi ve buruşuk iç selülozik intine katmanı. 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
L. Şekil 3. Taramalı Elektron Mikroskobik Analizi Asit Farklı Aşamaları sırasında clavatum Sporları5 ila 30 saat tedavi (A - D). Sırasıyla, bozulmamış dış mikroyapı ve temiz iç boşluğu gösteren 5, 10, 20, ve 30 saat asitle muamele edilmiş sporlar. 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Sporlar ve Sporopollenin ekzin Kapsüller (sn). Tedavinin çeşitli aşamalarında sonra protein içeriğinin Şekil 4. Protein içeriği. temsil veriler standart sapma ile üç ölçümden ortalama (n = 3). 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Daha büyük bir versiyon o görmek için lütfen buraya tıklayınızBu rakam f.

Şekil 5,
Sporlarının Şekil 5. Dinamik Görüntüleme Parçacık Analizi (DIPA) ve Sporopollenin ekzin Kapsül Tedavisi Çeşitli Aşamalarında (sn) Kolonlar (A - C). Sırasıyla ön-asit tedavisi, asit tedavisi ve sağlam SEC sn vardır. Arsalar SEC çapı, dairesellik, boy oranı ve kenar degrade temsilcisi grafiklerdir. 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Dinamik Görüntüleme Parçacık Analizi (DIPA) 30 saat içinde Acidolybozulmamış dış mikroyapı ve temiz iç boşluğu gösteren sis sadece Sporopollenin ekzin Kapsüller (sn). (A) SEC sn. (B) SEC çapı, dairesellik ve boy oranı Temsilcisi grafikleri. 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7. Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi öncesi ve Tedavi ve BSA Kapsülleme sonra Sporopollenin ekzin Kapsüller (sn) ve (CLSM) analizi. Ilk satır sporoplasmic hücresel organel ve biyomolekül otofloresans gösteren işlenmemiş sporlar göstermektedir. ikinci satır boş iç boşluğu ile 30 saat asidoliz sadece saniye göstermektedir. üçüncü sıra FITC-BSA yüklü gösteriyor30 saat asidoliz sadece saniye içine. (Ölçek çubuklar 10 mikron vardır). 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Şekil 8. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve BSA yüklü Sporopollenin ekzin Kapsüller (sn) Dinamik Görüntüleme Parçacık Analizi (DIPA) karakterizasyonu. BSA yüklü saniye (A) SEM görüntüleri. (B) BSA yüklü SEC çapı, dairesellik, boy oranı ve kenar degrade Temsilcisi grafikleri. 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Malzeme Grup başına BSA yükleme (125 mg / ml) 5 mg saniye içinde BSA (mg) BSA miktarı yüklenir (sn gramı başına g) Tedavi edilmeyen sporlar 0.6 mi 0.654 ± 0.05 0.131 ± 0.01 SEC sn 1.2 mi 0.831 ± 0.05 0.170 ± 0.01

İşlenmemiş sporlar ve saniye, sığır serum albümin (BSA) Tablo 1. Kapsülleme. BSA çözeltisi hacmi 'işlenmemiş sporların' ya da 'SECS' 150 mg toplu iş başına yükleme için kullanılır. temsil veriler standart sapma, üçlü gruplar arasında bir ortalama (n = 3). 41 uyarlanmıştır ve Bilimsel Raporlar izni ile kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, L. SEC çıkarıldığı sistematik analizinde clavatum sporlar sunulmaktadır ve bu rapor ayrıca, yüksek işlem sıcaklığına (180 ° C) gerektiren, mevcut protokolü aksine, önceden var olan, yaygın olarak kullanılan protokol. 11, bir önemli ölçüde kolaylaştırılmasını gerçekleştirirken daha kaliteli kapsüller üretmek mümkün olduğunu göstermektedir ve uzun bir süreç süresi (7 gün), 11 mevcut SEC çıkarma işleme optimizasyonu öncelikle asidoliz adımı sıcaklığını ve süresini azaltarak üzerinde duruldu.

yağ tabakasının alkali tedaviler sporlarından sporoplasmic malzemenin çok az kaldırma sağlar. 120 saat sporoplasmic maksimum miktarda malzemeyi kaldırıldı için Bununla birlikte, 5 saat ila girdiği asidoliz. Sonuçlar toplam işlem süresi ve sıcaklıkları büyük ölçüde geleneksel teknikler, 11 düşürüldü ve orta sıcaklık sadece 30 saat olduğunu olabileceğini belirtti (70° C) fosforik asit optimum kalite kapsül sağladı. Ayrıca, 30 saat asidoliz ötesinde, SEC sn saniye tüm toplu genel yapısal bütünlük içinde bir azalma sergileyen olabilir düşündüren, kırılma başladı ve partikül fragmanları önemli bir artış gözlenmiştir olduğu tespit edilmiştir. Buna ek olarak, not edilmelidir L. clavatum nispeten sağlam sporopolleninin, 2 içerdiği kabul edilir ve bu asit konsantrasyonu, sıcaklık ve / veya hidroliz süresi, bu protokolde yer alan spesifik işlem koşulları, başka bir polen türler için ayarlanması gerekebilir.

Bu gösterilmiştir ki asidoliz sadece kullanılarak fosforik asit (% 85 v / v) 30 saat verimleri temiz ve bozulmamış sn. 41 veri asidoliz SEC üretiminde önemli bir adım olduğunu doğrular tarafından saniye üretimi. Son olarak, asit salt SEC sn BSA kapsüllenmesi için kullanılan ve bir yükleme yüksek derecede gözlenmiştir. yükleme wİç SEC kavite basıncı zorla boş kapsüllere BSA çözüm çekmek için değiştirilmiş sayede vakum, uygulanması ile elde olarak. Nanochannels (çap 15 -. 20 nm), daha önce L. ekzin duvarlarında tanımlanmıştır clavatum, 7 çözüm geniş iç boşluğuna girmesine izin. Yüklemeden sonra, kapsül yıkandı ve bir serbest akan tozu vermek üzere dondurularak kurutucuda kurutulmuştur.

Boyut tekdüzelik ve morfolojik özellikleri, başarılı bir kuşatma malzeme kalitesini değerlendirmek için önemli faktörlerdir. BSA yüklü saniye gözlenen boyut düzgünlüğü ve bozulmamış morfoloji mikrokapsülleme uygulamaları için asidoliz sadece işlenmiş saniye potansiyel kullanımını doğruladı.

Bu sonuçlar, saniye büyük ölçekli sanayi üretimi için ve ilaçların mikrokapsülleme de saniye potansiyel uygulamalarda daha fazla ilgi uyarılması için önemli olan,proteinler, peptidler, gıda takviyeleri, nutrasötikler ve kozmetik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17, (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45, (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43, (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21, (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21, (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22, (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1, (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6, (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31, (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2, (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12, (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26, (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461, (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148, (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5, (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12, (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109, (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47, (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21, (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698, (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57, (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3, (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6, (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190, (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. CRC press. 182 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics