طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Immunology and Infection
 

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لزراعة وتحليل الأغشية الحيوية البكتيرية على خيوط فطرية بواسطة المجهر متحد البؤر والإلكترون نوعيا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miquel Guennoc, C., Rose, C., Guinnet, F., Miquel, I., Labbé, J., Deveau, A. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e54771, doi:10.3791/54771 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأغشية الحيوية البكتيرية غالبا ما تتشكل على الأسطح الفطرية ويمكن أن تشارك في العديد من عمليات التفاعل البكتيرية للفطريات، مثل التعاون الأيض، والمنافسة، أو الافتراس. دراسة الأغشية الحيوية مهمة في العديد من المجالات الحيوية، بما في ذلك العلوم البيئية، وإنتاج الغذاء، والدواء. ومع ذلك، فقد ركزت بعض الدراسات على هذه الأغشية الحيوية البكتيرية، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة التحقيق معهم. معظم طرق بيوفيلم النوعي والكمي تحليلات وصفها في المؤلفات هي مناسبة فقط لالأغشية الحيوية تتشكل على الأسطح غير الحية أو على الأسطح الحيوية متجانسة ورقيقة، مثل أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية.

أثناء المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري (LSCM) غالبا ما تستخدم لتحليل في الموقع وفي الأغشية الحيوية الجسم الحي، وهذه التكنولوجيا أصبحت صعبة للغاية عندما يطبق على الأغشية الحيوية البكتيرية على خيوط فطرية، وذلك بسبب سماكة والأبعاد الثلاثة للأسماء الشبكات خوطيorks. للتغلب على هذا القصور، قمنا بتطوير بروتوكول الجمع بين المجهري مع طريقة للحد من تراكم طبقات خوطي في المستعمرات الفطرية. باستخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على تحقيق تنمية الأغشية الحيوية البكتيرية على خيوط فطرية على مستويات متعددة باستخدام كل من المجهر الإلكتروني الماسح LSCM و(SEM). ويصف هذا التقرير البروتوكول، بما في ذلك الثقافات الكائنات الحية الدقيقة، وظروف تشكيل التجمعات البكتيرية، وتلطيخ بيوفيلم، وLSCM وتصورات ووزارة شؤون المرأة.

Introduction

الفطريات والبكتيريا لديها العديد من الفرص للتفاعل مع بعضها البعض لأنها تتعايش في معظم البيئات الأرضية. نظرا لتنوعها و وجودهم، هذه التفاعلات مهمة في العديد من المجالات الحيوية، بما في ذلك التكنولوجيا الحيوية، والزراعة، وتجهيز الأغذية، والأدوية 1 و 2. تتطلب التفاعلات الجزيئية درجة معينة من القرب للسماح التبادلات بين الشركاء، وفي بعض الحالات، وهي جمعية الفيزيائية للشركاء ضرورية للتفاعل وظيفي 3. وجود ارتباط المادية المشتركة بين البكتيريا والفطريات هي تشكيل الأغشية الحيوية البكتيرية على الأسطح الفطرية 4. هذا الاتصال المباشر بين الخلايا البكتيرية والفطرية خيوط يسمح التفاعلات الحميمة التي تشارك في العمليات البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال، في الطب، ودراسة تشكيل بيوفيلم الزائفة الزنجارية على opportunistic الممرض الفطرية المبيضات البيض يمكن أن تساعد في فهم الصلة بين تشكيل بيوفيلم والفوعة 5. في الزراعة، وتشير الدراسات إلى أن المعززة للنمو النبات rhizobacteria والمكافحة الحيوية البكتيريا لديها زيادة كفاءة عندما يرتبط مع نوع من الفطريات في بيوفيلم مختلط. على سبيل المثال، قد عززت elkanii المجتذرة N 2 النشاط -fixing عندما يرتبط مع محاري شائع في بيوفيلم مختلط 6. وأخيرا، في المعالجة البيولوجية، وقد استخدمت الأغشية الحيوية مختلطة البكتيرية للفطريات لمعالجة المواقع الملوثة 7 و 8.

LSCM هو مناسبة خاصة لدراسة الأغشية الحيوية لأنه يسمح لمراقبة ثلاثية الأبعاد المعيشة الأغشية الحيوية رطب مع الحد الأدنى من المعالجة المسبقة، وبالتالي الحفاظ على هيكل بيوفيلم والتنظيم. وهكذا، والتحليل بيوفيلم بواسطة LSCM مفيدة للغاية، وخاصة لديتفرو القاقم على مدار الساعة من تشكيل بيوفيلم والكشف عن مراحل مميزة 10، من الخطوة التصاق لتطوير بيوفيلم ناضجة. كما تكييفها بشكل خاص لتصور هيكل بيوفيلم ومصفوفة 11، 12 أو لتحديد حجم بيوفيلم 13، 14. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو مناسبة لدراسة الأغشية الحيوية على السطوح الحيوية غير الحيوية أو رقيقة، دراسة التجمعات البكتيرية على مستعمرة الخيطية الفطرية لا تزال صعبة للغاية. والواقع أن معظم الفطريات الخيطية بناء شبكات ثلاثي الأبعاد سميكة ومعقدة في مجال الثقافة. حتى إذا كان من الممكن تصوير الأجسام الكثيفة بواسطة المجهر متحد البؤر، وتوهين للتغلغل الليزر وانبعاث مضان في كثير من الأحيان يقلل من جودة الصور النهائية على عمق 50 ميكرون 15. وعلاوة على ذلك، لأن المستعمرات الفطرية ليست جامدة، طر من الصعب التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة من دون إزعاج الأغشية الحيوية. نظرا لسماكة من العينات، وعادة ما تكون إجراء بعض التحليلات المجهرية الأغشية الحيوية البكتيرية على خيوط فطرية فقط على جزء صغير من مستعمرة الفطرية، وبالتالي لا يحتوي إلا على عدد قليل من خيوط 16 و 17 و 18. كل هذا يحد من قدرتنا على وصف توزيع بيوفيلم على مستعمرة الفطرية، وبالتالي يمكن أن يحقق التحيز في التحليل في حالة توزيع غيروي المنشأ من بيوفيلم داخل مستعمرة الفطرية.

للتغلب على هذه الصعوبات، ونحن التقرير وسيلة لنمو وتحليل التجمعات البكتيرية على خيوط فطرية. تم تطبيق هذا الأسلوب لدراسة تشكيل بيوفيلم في الزائفة المتألقة BBc6 على خيوط من basidiomycete ectomycorrhizal Laccaria ذو لونين S238N. وصفت هذين الكائنات الحية الدقيقة في التربة الغابات سابقا لتشكيل مختلطةهياكل بيوفيلم مثل 19 و 20. هذه الطريقة يمكن بسهولة زيادة تكييفها لأنظمة الفطرية / البكتيرية الخيطية أخرى. وتستند هذه الطريقة المعروضة هنا على الجمع بين طريقة ثقافة فطرية، مما يسمح لنمو المستعمرات الفطرية رقيقة جدا، مع LSCM والتصوير ووزارة شؤون المرأة. هذا يسمح لنا بالحصول الصغرى (المدى ميكرون)، وmeso- (المدى ملم) مقياس آراء التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة اثنين، والسماح لتوصيف نوعي لبيوفيلم. أظهرنا أيضا أن العينات يمكن ملاحظتها مع وزارة شؤون المرأة، والسماح التحليل البنيوي للبيوفيلم على مستوى مقياس النانو (المدى نانومتر).

Protocol

1. إعداد البكتيرية والفطرية الثقافات

  1. إعداد الثقافات الفطرية
    1. تحضير أغشية السيلوفان مع نفس القطر كما في أطباق بتري وسلقها في EDTA (1 جم / لتر في ماء منزوع الأيونات) لمدة 30 دقيقة. شطف الأوراق مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف لهم مرتين.
    2. إعداد الفطرية قبل الثقافة، فحقن الفطرية أجار المقابس على المدى المتوسط ​​أجار المناسب مغطاة EDTA قبل المعالجة غشاء السيلوفان. احتضان به في درجة الحرارة نمو الأمثل للحصول على المستعمرات حوالي 1 سم في القطر.
      1. لL. ذو لونين S238N، في احتضان 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام على Pachlewski P5 أجار المتوسطة، مصنوعة من 0.5 غرام من طرطرات diNH4، 1 غرام من KH 2 PO4، 0.5 غرام من MgSO 4 .7H 2 O، 5 غرام من المالتوز D + ، 20 غراما من الجلوكوز D +، 1 مل من 10٪ الثيامين، حمض الهيدروكلوريك، 1 مل من 1/10 المخفف المغذيات الدقيقة حل (6 جم / لتر كبريتات الحديدوز، 0.27 جم / لتر الموليبدينوم trioxyde، 8.45 جم / لتر حامض البوريك (5)؛ ز / L رجلكبريتات ganese. 5 جم / لتر سلفات نحاسي. جعلت 2.27 جم / لتر سلفات الزنك) تصل إلى 1 L مع الماء منزوع الأيونات. و 20 غراما من أجار. الرقم الهيدروجيني 5.5.
    3. من الفطرية قبل الثقافة، وتطعيم لوحة آغار جديدة مغطاة EDTA قبل المعالجة غشاء السيلوفان تحتوي على المتوسطة أجار منخفض الكربون لتعزيز التوسع شعاعي من المستعمرات.
      1. لتطعيم طبق بيتري، تخدش بلطف على المنطقة الخارجية (حيث توجد خلايا نفس الحالة الفسيولوجية) من مستعمرة فطرية من قبل الثقافة مع مشرط ونقل وخيوط لوحة آغار جديدة.
      2. احتضان عند درجة حرارة النمو الأمثل حتى مستعمرات جديدة هي حوالي 1 سم في القطر. لL. ذو لونين S238N، احتضان لهم عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام على المتوسط P20 أجار (0.25 غرام من دينه 4 طرطرات؛ 0.5 غرام من KH 2 PO 0.25 غرام من MgSO 4 .7H 2 O؛ 1 غرام من الجلوكوز D + ؛ 0.5 مل من 10٪ الثيامين، حمض الهيدروكلوريك؛ 0.5 مل من 1/10 حل المغذيات الدقيقة المخفف (راجع 1.1.2.1)، وتتكون ل1 L مع الماء منزوع الأيونات. و 20 غراما من أجار. درجة الحموضة 5.5).
        ملاحظة: نظرا لما قبل الثقافة على السيلوفان، فإن ثقافة الثانية لا تحتوي على وسائل الاعلام أجار في المقابس المركزية. يجب إزالة المقابس أجار لمزيد من التحليل للالأغشية الحيوية، لأن هذه المقابس إدخال أجار والمواد المغذية التي يمكن أن تخلق التحيز في التحليل. هذه الخطوة المخاوف فقط الفطرية الأنواع التي يتم الاحتفاظ بها ونشر على لوحات أجار، وأنه ليس من الضروري للفطريات التي تم نشرها من الجراثيم أو الأسهم المجمدة.
  2. إعداد الثقافات البكتيرية
    1. استخدام حلقة عقيمة لجمع 2-3 المستعمرات البكتيرية الفردية من ثقافة على المدى المتوسط ​​أجار المناسب وتطعيم 25 مل من لوريا، Bertani (LB) المتوسطة السائل (أو بأي وسيلة مناسبة أخرى، اعتمادا على سلالة المستخدمة). لالمتألقة P. BBc6، واحتضان ثقافة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية مع الهز لطيف (~ 150 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: استخدام سلالةالموسومة مع بروتين فلوري مثل GFP، هو الأفضل، لأن هذا يتجنب أداء تلطيخ مزدوج (الفطريات والبكتيريا) قبل الملاحظات المجهرية. توقيت وسرعة التحريك، ودرجة حرارة الحضانة تعتمد على السلالة المستخدمة، والهدف من ذلك هو الحصول على الثقافة في النمو المتسارع في وقت متأخر.

2. إعداد N في المختبر بيوفيلم البكتيريا الفطرية في مستعمرة

  1. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في 5000 x ج لمدة 3 دقائق وتعليق بيليه في 25 مل من معقم عازلة 0.1 M فوسفات البوتاسيوم (25 غ / ل KH 2 PO 4 و 2.78 غرام / لوقا 2 هبو ودرجة الحموضة 5.8). كرر هذه الخطوة مرة واحدة وضبط تركيز البكتيريا النهائي إلى 10 9 خلية / مل مع المخزن نفسه.
  2. ملء صفيحة 6 جيدا مع 5 مل من تعليق البكتيرية (أو العقيمة 0.1 M عازلة فوسفات البوتاسيوم لمراقبة سلبية).
  3. قطع غشاء السيلوفان من فونغآل ثقافة بشفرة حلاقة معقمة للحصول على الساحات من السيلوفان مع مستعمرة الفطرية واحدة على كل الغشاء. إزالة بعناية الساحات السيلوفان التي تحتوي على خيوط من وسط صلب باستخدام ملقط ونقل مربع من السيلوفان التي تحتوي على خيوط لبئر في صفيحة تحتوي على تعليق البكتيرية.
  4. هز بلطف صفيحة بينما المستعمرات الفطرية لا تزال تعلق على السيلوفان. ثم، وإزالة ورقة السيلوفان، وترك المستعمرات الفطرية في اللوحة.
  5. احتضان صفيحة مع الإثارة لطيف (~ 60 دورة في الدقيقة) عند درجة حرارة متكيفة مع الكائنات الحية التي درست.
    ملاحظة: المرة من الحضانة يعتمد على سرعة إنشاء بيوفيلم ومرحلة لتحليلها. لP. المتألقة BBc6 / L. ذو لونين، واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للحصول على الأغشية الحيوية في مرحلة مبكرة، وتصل إلى 16 ساعة للحصول على تنضج الأغشية الحيوية.

3. الليزر الضوئي متحد البؤر التحليل المجهري للتنسيق بيوفيلمأيون

  1. إعداد عينة
    1. لإزالة البكتيريا والبكتيريا العوالق كهربية المرفقة إلى خيوط، وشطف الفطر قبل نقله إلى الجديد صفيحة 6 جيدا مليئة 5 مل من محلول ملحي قوي (كلوريد الصوديوم، و 17 جم / لتر) 17؛ يهز بلطف لمدة 1 دقيقة.
    2. نقل الفطر إلى الجديد صفيحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل من العازلة الفوسفات 0.1 M البوتاسيوم العقيمة، يهز بلطف لمدة 2 دقيقة، ونقل الفطر إلى عازلة فوسفات البوتاسيوم النقي.
    3. قطع جزء من مستعمرة الفطرية للتصوير مع مشرط مع إبقائها في المنطقة العازلة فوسفات البوتاسيوم، مثل أن القسم حصلت يحتوي على حوالي نصف مستعمرة الفطرية.
    4. وصمة عار على عينة، ونقل إلى طبق بيتري مملوءة بالماء المعقم تحتوي على صبغة الفلورسنت المناسب (اعتمادا على الهدف من التحليل)، واحتضان في الظلام.
      1. لتصور شبكة الفطرية، استخدم، على سبيل المثال، أحمر الكونغو (شارك النهائي 0.1٪ncentration، 5 دقائق من الحضانة)، جنين القمح agglutin (WGA) كتين مترافق اليكسا فلور 633 (10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، و 10 دقيقة من الحضانة) أو FUN1 (10 ميكرومتر تركيز النهائي، و 10 دقيقة من الحضانة).
      2. في حالة استخدام نوع من البكتيريا غير الفلورسنت الموسومة، مباين الخلايا البكتيرية مع التحقيق الذي تجريه فلوري الحمض النووي محددة بين العديد من الأصباغ DNA الخلية نفيذ المتاحة تجاريا. على سبيل المثال، استخدام دابي (0.25 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، و 10 دقيقة من الحضانة).
      3. لتصور البروتينات المصفوفة، واستخدام وصمة عار البروتين 21.
    5. بعد التلوين، وشطف العينة تحويلها إلى غطاء طبق بتري تحتوي على 10 مل من معقم الفوسفات 0.1 M البوتاسيوم ويهز بلطف لمدة 1 دقيقة.
    6. نصف غمر الشريحة في طبق بتري غطاء وجلب بدقة قسم قطع لتطفو فوق الشريحة. ثم، وإزالة ببطء الشريحة من حل العازلة، والسماح للعينة ليستقر بلطف على الشريحة.
    7. أخيرا، إضافة 10 ميكرولتر من مكافحة يتلاشى المتوسطة المتزايدة للعينة، وتغطي مع ساترة الزجاج.
      ملاحظة: بعد الانتهاء من إعداد الشريحة، يجب إجراء تحليل مجهري في أقرب وقت ممكن (على الأغلب ضمن 30 دقيقة) لتجنب تعديل في هيكل بيوفيلم.
  2. التحليل المجهري متحد البؤر
    1. فحص الشرائح تحت المجهر ليزر متحد البؤر مع عدسة الهدف 10X أو 40X بالإضافة إلى برامج التصوير.
      ملاحظة: هنا، متعدد شعاع مجهر المسح مبائر مجهزة 405، 488، و 561 ليزر نانومتر الإثارة، وهو كاشف GaAsp PMT، و10X 0.3 NA و40X 1.2 أهداف NA تم استخدامها.
      1. أداء التصوير باستخدام المعلمات تكييفها وفقا لنوع البيانات المطلوبة وإلى القيود الوقت. استخدام الليزر موجات الإثارة / الانبعاثات وفقا لوصمة عار المستخدمة وrecommendati الشركة المصنعةالإضافات. استخدام مزيج من مسح البلاط وظائف Z كومة من الحصول على وجهات النظر 3D العالمية للمستعمرة الفطرية والأغشية الحيوية.
        ملاحظة: تم الحصول على الصور في الشكل (3) باستخدام المعلمات التالية: 8 بت / بكسل، المتوسط = 2، بكسل يسكن = 1.58 μsec، والبلاط مسح الصور 5X5 مع خياطة الإنترنت (تغطية 10٪، عتبة = 0.7)؛ Z-خطوة = 2 ميكرون.
    2. لتصور البيانات 3D، استخدم واحد من العديد من برامج مجانية أو تجارية (وهذه توفر العديد من الخيارات لتقديم 3D).
      1. على سبيل المثال، لعرض البيانات Z كومة كما 2D توقعات الحد الأقصى لكثافة، وطرح قناة مشرق الميدان، وضبط السطوع والتباين، ودمج القنوات لخلق صورة مركبة. إذا كانت موجودة، والقضاء على شرائح من دون إشارة إلى الحدود القصوى Z-المكدس. ثم، إجراء 2D أقصى قدر من الشدة الإسقاط وتحويل النتيجة إلى اللون RGB. استخدام وظيفة "Z مشروع" في برنامج ImageJ 22 للحصول على الصور عاستياء هنا 2D التوقعات الكثافة القصوى.

4. الكترون التحليل المجهري

  1. إعداد العينات كما هو موضح لLSCM، إلا في الخطوة 3.1.2، ونقل الأغشية الحيوية إلى الماء المعقم بدلا من العازلة فوسفات البوتاسيوم بعد خطوات الشطف. هذا يتجنب تشكيل بلورات الملح أثناء الخطوة الجفاف، والتي من شأنها أن التشويش SEM التصوير.
  2. نقل الأغشية الحيوية لصاحب العينة وإزالة المياه الزائدة. يسمح فقط جليدة صغيرة من الماء لتغطية العينة.
  3. نقل العينة إلى غرفة متغير الضغط المجهر الإلكتروني الماسح (SEM VP-)؛ تجميده إلى -50 درجة مئوية في مرحلة بلتيير التبريد. ويسمح لها تجميد الجافة ببطء، مباشرة في غرفة ووزارة شؤون المرأة، مع 100 با لضغط متغير المقررة يوم 15 ساعة.
  4. بعد الانتهاء من التجميد والتجفيف، استرداد العينة وتحويلها إلى نظام فيلم ترسب عالية فراغ. معطف العينة مع 2 نانومتر من platinuم (قياس الكوارتز) تحت البلازما الأرجون (2.5 × 10 -2 مليبار، 35 أمبير).
  5. مراقبة عينة المغلفة مع SEM مجهزة بندقية الانبعاثات الميدان (FEG) باستخدام عالية الدقة "في عدسة" كشف والتوتر الشديد الإلكترونية من 1 كيلو فولت.

Representative Results

يتم إعطاء الإجراء التخطيطي الشامل للثقافة فطرية وإعداد بيوفيلم في الشكل 1. مسموح الأسلوب ثقافة بنا للحصول المستعمرات الفطرية 20-50 ميكرومتر تحتوي سميكة عدد قليل من طبقات من خيوط، مما يسمح الصغرى ومتوسطة النطاق تحليلات بيوفيلم المعيشة المائية باستخدام LSCM. تطبيق أسلوب يسمح الاستحواذ على صور عالية الجودة من P. المتألقة الأغشية الحيوية BBc6 على L. ذو لونين خيوط على طول تشكيل بيوفيلم (الشكلان 2-4).

أظهر تحليل متوسطة النطاق من الأغشية الحيوية توزيع غيروي المنشأ من بيوفيلم من P. المتألقة BBc6 على خيوط من L. ذو لونين S238N (الشكلان 2 و 3). يسمح تحليل متوسطة النطاق أيضا لتتبع تشكيل بيوفيلم على مر الزمن (الشكل3) من الخطوات الأولى، والتي كانت تعلق فقط بعض البكتيريا لخيوط (الشكل 3A)، إلى تشكيل سميكة، بيوفيلم ناضجة (الشكل 3B). يسمح عالية الدقة للصور متوسطة النطاق لنا لإجراء تحليل الصغيرة الحجم على نفس الصور من أجل الحصول على أبنية مستعمرة (الشكل 3C - د).

تحليل الصغيرة الحجم جنبا إلى جنب مع وضع العلامات المحددة مكن لنا أن نذهب إلى أبعد من ذلك في توصيف بيوفيلم. هنا، SYPRO روبي 23، التي تصف معظم فئات من البروتينات تم تطبيقها، إلى عينات (الشكل 4)، ويدل على وجود البروتينات في المصفوفة.

وأخيرا، تم الحصول على مزيد من التفاصيل عن هيكل بيوفيلم بواسطة SEM التصوير من نفس العينة بعد الجفاف وطلاء (الشكل 5). تقدم SEM التصويرالوصول إلى مستوى النانو، وبالتالي إعطاء الوصول إلى هيكل المصفوفة.

شكل 1
الشكل 1: الإجراء التخطيطي الشامل للثقافة فطرية وإعداد بيوفيلم. يصف هذا الرقم الخطوات الرئيسية للطريقة، من ثقافات الكائنات الحية الدقيقة لأخذ عينات التحاليل. يتم إعطاء مزيد من التفاصيل في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: BBc6 إعادة تقسيم بيوفيلم على مستعمرة الفطرية. تم تصوير العينة بعد 18 ساعة من التفاعل في 10X التكبير. تم الحصول على صورة عبر 2D أقصى الإسقاط كثافة 3D الصور المجهري متحد البؤر. الشبكة رمادية على فيقوإعادة يصور مواقف الفسيفساء. هي ملطخة L. ذو لونين خيوط مع الكونغو الأحمر (الأحمر) والبكتريا هي GFP الموسومة (الخضراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): المراحل المبكرة والمتأخرة من تشكيل بيوفيلم BBc6 على L. ذو لونين خيوط. تم الحصول على هذه الصورة عبر 2D أقصى الإسقاط كثافة 3D الصور المجهري متحد البؤر. تم إجراء التصوير في 40X التكبير. (أ) الأغشية الحيوية إعادة تقسيم بعد 2 ساعة من التفاعل. (ب) إعادة تقسيم بيوفيلم بعد 14 ساعة من التفاعل. (ج) توسيع المستطيل الأبيض في الفقرة (أ). (د) توسيع المستطيل الأبيض في (ب). هي ملطخة خيوط فطرية مع الكونغو الأحمر (الأحمر) والبكتريا هي GFP تا gged (الخضراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مصفوفة تلطيخ BBc6 بيوفيلم على L. ذو لونين خيوط. (أ) الأغشية الحيوية بعد 16 ساعة من التفاعل. (ب) توسيع المستطيل الأبيض في الفقرة (أ). تم إجراء التصوير في 40X التكبير، وتم الحصول على هذه الصور عبر 2D أقصى الإسقاط كثافة 3D الصور المجهري متحد البؤر. البكتيريا هي GFP الموسومة (الخضراء)، وملطخة فطر مع Fun1 (الأخضر الداكن)، وهي ملطخة البروتينات مع S. روبي (الأحمر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الرقم 5
الرقم 5: SEM التصوير الأغشية الحيوية BBc6 على L. ذو لونين خيوط. تم تنفيذ SEM التصوير في 2360X، EHT: 1KV. قبل التصوير، وببطء مجمدة بجفاف-العينة في غرفة ووزارة شؤون المرأة والمغلفة مع البلاتين. تشير الأسهم الخضراء إلى الأغشية الحيوية البكتيرية والأسهم الصفراء تشير إلى خيوط فطرية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يتم استرداد الأغشية الحيوية البكتيرية في العديد من البيئات، وقد درست منذ 1950s، مما أدى إلى تطوير عدد من الطرق لتحليلها 24. الطرق التقليدية لقياس ورصد تشمل الأغشية الحيوية المقايسات عيار الصغير و، الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع، البنفسجي الكريستال (CV) تلطيخ. وهذه الأساليب هي سريعة ومنخفضة التكلفة، وسهلة للتعامل مع 25 ومفيدة بشكل خاص لقياس إجمالي الكتلة الحيوية بيوفيلم أو لأداء الجدوى وتقدير مصفوفة المقايسات. على الجانب الآخر، "OMICS" الأساليب هي أيضا مفيدة في الدراسات بيوفيلم، والسماح لالتحليلات الكمية وظيفية من الأغشية الحيوية 26، 27. على الرغم من المزايا من لوحة، عيار الصغيرة و"OMICS" الأساليب والعديد من الميزات الأساسية من الأغشية الحيوية لا يمكن الحصول عليها مع هذه التقنيات، مما يعوق فهم كامل لهذه العملية. وتشمل هذه الميزات هيكل المصفوفةالصورة، أبنية مستعمرة بكتيرية، والتفاعلات خلية / خلية، وأنماط الاستعمار، والتي هي بيانات أساسية لفهم كل من وظائف الأغشية الحيوية والديناميكية من تكوينها. وعلى الرغم من قدرة المجهر لالتقاط هذه الميزات، والتحليل المجهري الأغشية الحيوية البكتيرية على الفطريات الخيطية لا تزال شحيحة. ويرجع ذلك أساسا إلى نمو الفطريات الخيطية، والتي غالبا ما تشكل مستعمرات معقدة شبكات ثلاثي الأبعاد سميكة، و، هذا. تشكيل الأغشية الحيوية البكتيرية على الفطريات هو شائع في بيئات متنوعة وتشارك بشكل كبير في مختلف المجالات 4 (على سبيل المثال، والطب، والزراعة، والبيئة)؛ وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لتطوير أساليب جديدة لتسهيل التحقيق. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن معا طريقة لتوليد المستعمرات الفطرية رقيقة جدا مع التصوير المجهري للالأغشية الحيوية البكتيرية. وبالإضافة إلى ذلك، اقترحنا مجموعة من أدوات الفحص المجهري لتحليل نوعية تلك الأغشية الحيوية. نجاح الطريقة تعتمد علىالقدرة على إنتاج المستعمرات خوطي رقيقة جدا وتطبيق الأصباغ المناسبة. وتناقش هذه النقاط أدناه.

ويرجع ذلك إلى هياكل معقدة من الأغشية الحيوية، فهم وظيفتها يتطلب اتباع نهج متعدد النطاقات 28 و 29. ويتم تحليل أنماط توزيع الأغشية الحيوية، والهندسة المعمارية البكتيرية مستعمرة، وهيكل المصفوفة والتكوين على مختلف المستويات (أي والمتوسط على نطاق والصغيرة الحجم). وعلاوة على ذلك، يسمح قرار النانو الوصول إلى خلية / خلية التفاعلات المادية ونانو هيكل المصفوفة. وهكذا، فإن طريقة تم تطويرها تمكن بسهولة تحليل متعدد النطاقات من الأغشية الحيوية البكتيرية التي شكلت في مستعمرة الفطرية.

في معظم الدراسات، LSCM يحلل الأغشية الحيوية تقتصر على الصغيرة الحجم، وعلى نطاق والمتوسط عادة يؤديها البصرية تماسك التصوير المقطعي 30، 31، (الشكل 3). وهكذا، تجمع القضايا المرتبطة بيانات جمعتها على مختلف المستويات مع تفادي أساليب مختلفة هنا.

أعطى هذا المزيج من التحليلات وصول متزامن إلى إعادة تقسيم بيوفيلم على مستعمرة الفطرية، والهندسة المعمارية مستعمرة بكتيرية على طول بيوفيلم النامية، وهيكل المصفوفة. أظهر تحليل متوسطة النطاق توزيع غيروي المنشأ من الأغشية الحيوية البكتيرية على المستعمرات الفطرية (الشكلان 2 و 3). أن هذه الملاحظة لم يكن ممكنا مع البروتوكولات التي تسمح فقط تصوير جزء صغير من مستعمرة فطرية، وهي ليست بالضرورة ممثل مستعمرة بأكملها. وهكذا، في حينغالبا ما تهمل، وتحليل متوسطة النطاق يمكن أن تعطي معلومات قيمة عن أنماط توزيع بيوفيلم.

وأخيرا، فإن طريقة تم تطويرها يمكن استخدامها لتحليل العينات مع تقنيات المجهر مختلفة، بما في ذلك المجهر الإلكتروني. هنا، كان يستخدم SEM للوصول إلى مقياس النانو والحصول على التنظيم المكاني البكتيرية داخل بيوفيلم. ومن أداؤها جيدا جدا مع المستعمرات الفطرية رقيقة، في حين SEM يسمح فقط تصوير السطح. وعلى النقيض من LSCM، ووزارة شؤون المرأة، ومع ذلك، يتطلب عينة الجفاف و، في معظم الأحيان، طلاء مع معدن موصل. هذه العملية الجفاف قد يغير الهياكل البيولوجية عندما لا يتم تنفيذه بشكل صحيح وقد تتطلب التحسين. هنا، تم استخدام عينة الجفاف باستخدام تجفيد بطء 33. ومع ذلك، تطبيق كل LSCM ووزارة شؤون المرأة للعينات سيسمح أداء المجهر المتلازم في نفس الموقع من العينة.

على الرغم من المزاياالمذكورة أعلاه، بعض القيود موجودة. أولا، قد لا تكون قابلة للتطبيق على كل نوع من الفطريات. في الواقع، تم تطوير هذه الطريقة زراعة للفطريات نشر شعاعيا على سطح صلب وسائل الإعلام. هذه الطريقة قد لا تكون مناسبة لفطريات تشكيل خيوط أساسا الجوي (على سبيل المثال، الفيوزاريوم س.) أو الفطريات الدقيقة الهوائية نشر أساسا داخل أجار. وعلاوة على ذلك، قد تكون الفطريات مهينة السيلوفان مشكلة وكذلك (على سبيل المثال، الترايكوديرما س.). ثانيا، من المهم أن نلاحظ أن استراتيجية تلطيخ هي نقطة حرجة ويجب أن يتم اختيار وصمة عار بعناية، كما يجب على وصمة عار لا تزعج بيوفيلم. على سبيل المثال، لاحظنا أن Calcofluor الأبيض تسبب جزئي تعطل بيوفيلم (لا تظهر البيانات)، من المحتمل بسبب ارتفاع درجة الحموضة من هذا وصمة عار. أيضا، أنتجت بعض الأصباغ تلطيخ غير متجانسة (على سبيل المثال، الكونغو الأحمر)، في حين أنتجت الآخرين تلطيخ متجانس (على سبيل المثال، خلية جدار تلطيخ مع WGA كتين)، مما يعطي جودة الصورة غير المتجانسة.وعلاوة على ذلك، من المهم أن ندرك أن بعض الأصباغ قد لا تكون محددة تماما. على سبيل المثال، البقع WGA ليس فقط جدران الخلايا الفطرية ولكن حمض أيضا N-acetylneuraminic في جدران الخلايا البكتيرية إيجابية الجرام وadhesins التي تنتجها البكتيريا إيجابية الجرام و-سلبية خلال تشكيل بيوفيلم 34، 35. ولذلك، باستخدام بكتيريا الفلورسنت الموسومة البروتين و / أو ينصح الفطريات لتجنب تلطيخ متعددة. في حالة استخدام الأصباغ متعددة، يجب أن لا تتدخل كيميائيا، ويجب أن أطياف انبعاثاتها لا تتداخل.

يحلل المتوسط ​​على نطاق وتتطلب مساحة كبيرة الممسوحة ضوئيا، وبالتالي، قد يكون LSCM تستغرق وقتا طويلا (40 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على سمك العينة) وعنق الزجاجة تحليل عدد كبير من العينات. ومع ذلك، فإن التعديلات يمكن أن تكون تبعا لنوع البيانات المطلوبة. ومن الممكن أن ينخفض ​​اكتساب الوقت وحجم الصورة عن طريق تغيير جودة الصورة. على سبيل المثال، وارتفاع القرارليس من الضروري تحليل إعادة تقسيم العام بيوفيلم.

وأخيرا، لا بد من مراعاتها عند اختيار لعرض البيانات كومة Z- كما 2D أو 3D توقعات بعض القيود. توقعات ثنائي الأبعاد هي وسيلة جيدة لتلخيص البيانات، ولكن فقدت عمق المعلومات، والهياكل المتراكبة تصبح خفية. من ناحية أخرى، توقعات 3D تسمح التصور من وجهات نظر مختلفة، لكنهم غالبا ما تجعل ضعيفا في حالة من التعقيد المكاني.

في الختام، لقد ذكرت طريقة لتوصيف الأغشية الحيوية البكتيرية على خيوط على المستوى الهيكلي. ويمكن تمديد هذه المنهجية إلى تطبيقات أخرى. والواقع أن هذا الأسلوب يسمح للأداء توصيف وظيفي أو الكيميائي للالأغشية الحيوية البكتيرية تتشكل على خيوط فطرية. ويرجع ذلك إلى مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنظمة مراسل الفلورسنت الحالية وتحليل LSCM يمكن أن تستخدم لأغراض متعددة 29. على سبيل المثال، هيئة التصنيع العسكري مضانroscopy يمكن أن تستخدم لرصد درجة الحموضة التدرج 36 أو نشر جزيء في الأغشية الحيوية 37. بالإضافة إلى ذلك، يسمح للطريقة لتحليل المجتمع في الأغشية الحيوية المتعددة الأنواع. على سبيل المثال، مضان في الموقع التهجين التي تستهدف فئات محددة البكتيرية مفيد بشكل خاص لدراسة إعادة تقسيم البكتيريا محددة في الأنواع المتعددة الأغشية الحيوية 38، 39. مشاركة، الأصباغ الفلورية عديدة يمكن استخدامها لوصف تكوين مصفوفة من الأغشية الحيوية 21. هنا، تم استهداف البروتينات باستخدام Sypro، التي بقع مجموعة كبيرة من البروتينات، من بينها البروتينات المصفوفة (الشكل 4)، ولكن الأصباغ الأخرى تسمح التصور من مكونات المصفوفة الهامة الأخرى، مثل exopolysaccharides أو الحمض النووي خارج الخلية. ومن المثير للاهتمام، يمكن أن يؤديها كل هذه التحليلات على المستوى المتوسط ​​وباستخدام الطريقة الموصوفة. منذ لا يمكن أن يؤديها LSCM على عينات حية،ومن الممكن أيضا لتحقيق الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام، على سبيل المثال، coverwell غرف، ومناسبة خاصة بالنسبة للمستعمرات فطرية رقيقة. هذا الخيار المثير للاهتمام بشكل خاص، كما تشكيل بيوفيلم هو، عملية دينامية معقدة. وأخيرا، لغرض الكمي، وطريقة المبلغ عنها قد تحسين دقة التحليل الكمي التلقائي بجعل هذا الكمي ممكن على الصور المتوسط ​​الحجم. هذا قد تغلب على عدم التجانس بيوفيلم والقضايا الإحصائية 29.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well Falcon Tissue Culture Plates Fisher Scientific 08-772-33 Used in 2.2 & 3.1
Congo Red Fisher Scientific C580-25 Used in 3.1.4.1
FUN 1 Cell Stain Thermo Fisher Scientific F7030 Used in 3.1.4.1
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 Used in 3.1.4.1
DAPI solution Thermo Fisher Scientific 62248 Used in 3.1.4.2
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 Used in 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain Thermo Fisher Scientific F10318 Used in 3.1.4.4
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Used in 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1 Zeiss Used in 3.2.1
ZEN 2.1 lite black software  Zeiss Used in 3.2.1
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 Leica Used in 4
GeminiSEM-FEG Zeiss Used in 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75, (4), 583-609 (2011).
  2. Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
  3. Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, (34), 14558-14563 (2009).
  4. Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
  5. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296, (5576), 2229-2232 (2002).
  6. Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29, (3), 293-296 (2004).
  7. Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. 739-743 (2008).
  8. Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00, (0), 1-10 (2014).
  9. Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71, (11), 7301-7309 (2005).
  10. Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94, (1), 149-156 (2010).
  11. Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8, (9), 623-633 (2010).
  12. Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
  13. Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28, (1), 1-5 (2014).
  14. Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
  15. Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6, (12), 1399-1437 (2011).
  16. Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
  17. Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6, (10), (2011).
  18. Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. (2014).
  19. Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176, (1), 22-36 (2007).
  20. Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2, (4), 560-568 (2010).
  21. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
  22. Rasband, W. S. imagej. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  23. Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2, (5), 486-498 (2002).
  24. Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25, (1), 31-42 (2013).
  25. Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  26. Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31, (4), 477-485 (2009).
  27. Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10, (9), 4105-4119 (2011).
  28. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8, (3), 203-208 (2009).
  29. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23, (4), 233-242 (2015).
  30. Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11, (3), 34001 (2006).
  31. Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47, (7), 2531-2542 (2013).
  32. Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47, (6), 2085-2095 (2013).
  33. Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34, (1), 26-36 (2012).
  34. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, (1), 1-4 (2007).
  35. Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3, (4), 1-45 (2015).
  36. Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81, (4), 1267-1273 (2015).
  37. Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56, (6), 3349-3358 (2012).
  38. Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6, (3), (2011).
  39. Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, (8), 2603-2611 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics