-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Biology

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Summary

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

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Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

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Abstract

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Pub. No. 80-23). Todos los métodos y protocolos que se utilizan en estos estudios han sido aprobados por la Universidad de Wisconsin Cuidado de Animales y el empleo Comité de Protocolo siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por el NIH (publicación No. 85-23, revisada en 1996). Todos los animales utilizados en este estudio recibieron atención humanitaria de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Eliminación del corazón y la perfusión de Langendorff

  1. Antes del aislamiento del corazón, la solución de Tyrode caliente a 37 ° C utilizando un baño de agua y una camisa de agua.
  2. Anestesiar al ratón con isoflurano 5% / 95% de O2.
  3. Garantizar el nivel adecuado de anestesia mediante la comprobación de la pérdida del reflejo del dolor.
  4. Realizar una toracotomía. Abre el cofre mediante el uso de curvas 5.5 "tijeras de Mayo y 5.5" hemostática para Kellyceps para hacer un corte de 1 cm en la parte frontal del tórax.
    1. extraer rápidamente el corazón del pecho (a menos de 30 segundos). Utilice 4 "Iris fórceps curvos para agarrar el tejido pulmonar y cortar el pulmón, el timo y el corazón junto con el pericardio mediante 4.3" tijeras iris. No agarre directamente el corazón.
    2. Lavar en oxigenada (95% O 2/5% de CO 2), a temperatura constante (36,8 ± 0,4 ° C) modificado solución de Tyrode. Utilice la siguiente composición de la solución (en mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3, y 11,1 glucosa (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Mientras bañado en la misma solución, identificar el pulmón, el timo y el tejido graso. Con cuidado, diseccionar ellos desde el corazón. Utilice curva 3 "tijeras Vannas-Tübingen y 4,3" # 5 pinzas.
  6. Luego identificar la aorta y canular que en un 21 G cánula a medida. Utilice dos curvas "fuerza # 5B 4.3PD.
  7. Después de la canulación, perfundir simultáneamente (a través de la cánula a una velocidad de flujo de ~ 5 ml / min, lo que debe ajustarse en base a la presión aórtica, ver más abajo) y superfuse (en el baño a una velocidad de flujo de ~ 50 ml / min) el corazón con una solución de Tyrode calentado y se filtró a través de todo el experimento. Pasar la solución de perfusión a través de un filtro de nylon de 11 micras en línea para evitar la obstrucción de la circulación coronaria.
  8. El uso de un transductor de presión (o un indicador de presión) conectado a través de una de 3 vías de bloqueo de la llave de paso Luer a la línea de perfusión, monitorizar la presión aórtica y mantenerla entre 60 y 80 mmHg. Ajustar la velocidad de perfusión, si es necesario para mantener la presión aórtica dentro de este rango.

2. Mapeo óptico de la SAN de todo el corazón Langendorff perfundidos

  1. Instrumentación
    1. Colocar el corazón en posición horizontal y el pin de la punta del ventrículo a la parte inferior revestida de silicio de la cámara usando 0,1 mm de diámetro a pasadores prevenir corriente inducida por el movimiento durante el experimento. 12
    2. Introduzca un pequeño ( "x ID 0,005" 0,012) tubo de silicona en el ventrículo izquierdo (VI) a través de la vena pulmonar, la aurícula izquierda (LA) y la válvula mitral (MV). Fijar el tubo mediante una sutura de seda (4-0) en el tejido conectivo de resonancia.
    3. Coloque el corazón con su cara posterior hacia arriba (Figura 1, panel izquierdo).
    4. Pin el borde del apéndice RA (RAA) a la parte inferior de silicio de la cámara usando diámetro pasadores minutien 0,1 mm. Ajustar su nivel con el fin de hacer que la superficie posterior de la RA plana y permitir que se encuentra el plano focal de la cámara. Esto permitirá que las mediciones ópticas de la superficie máxima de la aurícula.
    5. Soga superior (VCS) e inferior (IVC) de la vena cava por una sutura de seda (4-0), estirar y fijar el otro extremo de la sutura a la parte inferior de una cámara revestida de silicio (véase la Figura 3A). Asegúrese de que las suturas no bloqueen elcampo de vista óptico.
    6. Coloque el electrodo de estimulación a medida en el borde de la RAA. Para hacer electrodos, el uso de silicio recubierto alambres de plata diámetro de 0,25 mm, con 0,5 mm de distancia entre electrodos y carente de silicio para una longitud de 1 mm en el extremo de estimulación. A continuación, coloque dos ECG de 12 mm de aguja (calibre 29) electrodos monopolares cerca de la base de los ventrículos derecho e izquierdo. Coloque el ECG electrodo de tierra cerca del vértice de los ventrículos.
  2. tinción
    1. Dado que los dos tintes fluorescentes y blebbistatin desacoplador electromecánico son sensibles a la luz, realice todos los procedimientos descritos a continuación en un cuarto oscuro. En primer lugar preparar colorante sensible al voltaje RH-237 o di-4-ANNEPS como una solución madre, 1,25 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (2,5 mM), que alícuota (30 l cada una) y almacenar las alícuotas a -20 ° C.
    2. Diluir 5-10 l de solución de colorante de valores en 1 ml de solución de Tyrode calentado (37 ° C) y luego inyectarla en la línea de perfusión coronariadurante un período de 5-7 min usando un puerto de inyección en línea Luer.
    3. Preparar blebbistatin como una solución madre (2 mg / ml en dimetilsulfóxido, 6,8 mM) por adelantado y almacenarlo a 4ºC.
    4. Después de 20 min de estabilización, añadir 0,5 ml de calentado (37 ° C) blebbistatin en el perfundido y diluir 0,1 ml de blebbistatin en 1 ml de (37 ° C) solución de Tyrode calentado. A continuación, inyectar en la línea de perfusión coronaria durante un periodo de 5-7 min usando un puerto de inyección en línea Luer.

3. mapeo óptico de la SAN desde el auricular aislada Preparación

  1. Instrumentación
    1. Para la preparación atrial aislado, aislar y canular el corazón como se describió anteriormente en los pasos 1.1-1.5 para la preparación de todo el corazón.
    2. Diseccionar los ventrículos lejos de la cara anterior. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 1 para más detalles.
    3. Abra la RA cortando a través de la VA tricúspideLVE (TV) a lo largo del eje de TV-SVC. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 2 para más detalles.
    4. Corte la rama medial de la cresta terminal para abrir el RAA. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 3.
    5. Abrir la pared libre de la aurícula anterior mediante la realización de un corte de la línea media de la corte anterior # 3 hasta el borde de la esquina inferior derecha de la RAA, aplanar y el pin de la pared libre de la aurícula hasta el fondo de una cámara revestida de silicio. Ver la dirección mostrada por la flecha hueca en la Figura 1A, corte # 4. Preservar un borde de tejido ventricular para fijar la preparación para evitar daños en las aurículas.
    6. Del mismo modo, abierta LA cortando a través de la MV a lo largo de la esquina MV-superior del apéndice LA (LAA).
    7. Para abrir la LAA, cortado desde la mitad de la LAA abierto, a través de la pared libre de la aurícula anterior hasta cerca de un borde medio de la LAA.
    8. Abrir la pared libre de la aurícula alo anteriorendo la misma dirección, y luego aplanar y el pin a la parte inferior de una cámara recubierta con Sylgard.
    9. Retire parcialmente el tejido del tabique interauricular. Esto reducirá la dispersión de la señal óptica a partir de tejido que no está en el foco. Por lo tanto, tanto el LA y RA, así como la SAN y la unión aurículo-ventricular (AVJ) son accesibles en esta preparación (Figura 1B).
    10. Levante la preparación final en alrededor de 0,5 mm desde la parte inferior de la cámara de silicio recubierto con el fin de permitir superfusión desde ambas superficies epicárdicos y endocárdicos.
    11. Superfuse la preparación con calentado (37 ° C) solución de Tyrode a una velocidad constante de 12 ~ ml / min para un flujo de centrado situado cerca de la SVC y ~ 30 ml / min para una superfusión baño.
    12. Coloque el Ag / AgCl 2 electrodo de medida de estimulación (0,25 mm de diámetro) en el borde de la RAA diseccionado. A continuación, coloque dos ECG de 12 mm de aguja (29G) electrodos (monopolar) cerca de la RAA y LAA, respectivamente. Coloque la planta ECG elegidosmontó cerca de la AVJ.
  2. tinción
    1. Realizar una aplicación directa del colorante sensible al voltaje (RH-237 o di-4-ANNEPS). Para esto, diluir 1-2 l de la solución de colorante de valores de 1 mm de solución de Tyrode calentado (37 ° C) y liberar lentamente el colorante diluido en la superficie de la preparación mediante el uso de un 1 mm de la pipeta.
    2. Alternativamente, lleve a cabo la tinción de la aurícula con el colorante sensible al voltaje a través de una perfusión coronaria del corazón perfundido Langendorff similar a la descrita anteriormente para la preparación de todo el corazón (pasos 2.2.1-2.2.2).
      1. Después de la tinción de la perfusión coronaria, aislar la preparación atrial como se describe. Realizar tinción de la superficie adicional cuando sea necesario para alcanzar un nivel de fluorescencia satisfactorio. aislamiento auricular rápido no blanquear el tinte y no afecta a la calidad de la tinción.
    3. Inmovilizar la preparación con el electro-mecánico de desenganche, blebbistatin. Diluir 3-5 l blebbistatin solución madre en la solución de Tyrode calentado (37 ° C) y liberan lentamente el blebbistatin diluida sobre la superficie de la preparación y la solución circundante. Desde blebbistatin ha demostrado ser sensible a la luz, de 13,14 a evitar una larga exposición a la luz durante la preparación y tinción.
    4. Realizar la aplicación blebbistatin adicional tanto como sea necesario para suprimir la contracción. Normalmente hasta 3 aplicaciones adicionales (3-5 l por cada aplicación) se puede utilizar para suprimir el artefacto de movimiento suficientemente con el fin de reconstruir con precisión SAN y activación auricular.
    5. Añadir 0,5 ml adicionales de blebbistatin calentado en el perfundido. Durante este procedimiento, una pausa en la superfusión durante 30 segundos para permitir que el tinte / blebbistatin para teñir el tejido auricular.

4. Mapeo óptico configurar

NOTA:. Una descripción detallada del sistema de mapeo óptico se proporciona en otra parte 12

  1. Utilizar una cámara con una temresolución poral de 2.000 cuadros / seg o superior, y una serie de lentes de condensador para llegar a una resolución espacial de 100 m / pixel o superior. Esto es necesario para reconstruir la activación y propagación SAN intranodal.
  2. Para reducir los artefactos de movimiento de la solución de vibración, fijar un pequeño vidrio de cubierta en la superficie de la solución sobre el corazón / aislados preparación auricular.
  3. Utilice una luz de excitación (520 ± 45 nm de longitud de onda) proporcionado por una corriente constante, lámpara halógena de bajo ruido. Dirigir el haz de luz que se filtra en la preparación mediante el uso de una guía de luz bifurcada flexible.
  4. Se filtra la fluorescencia emitida por un filtro de paso largo (> 715 nm). Recoger, digitalizar y guardar la señal fluorescente adquirida en un software de ordenador utilizando proporcionada por el fabricante de la cámara.

5. Procesamiento de Datos

Nota: Los datos de mapeo óptico se recoge y se almacena como una serie de matrices de intensidad de fluorescencia en diferentes puntos temporales. Cada píxel represeNTS una medida de la intensidad de fluorescencia recogida de una ubicación específica en la preparación del tejido en un punto de tiempo específico. La fluorescencia de fondo se elimina automáticamente por píxel para permitir una mejor visualización de los cambios de fluorescencia producidos por cambios de voltaje de membrana y de arriba abajo para que se corresponda con los potenciales de acción (AP) medidos por los sistemas de microelectrodos. Los detalles de los diferentes pasos en el procesamiento de datos de imágenes ópticas, incluyendo la segmentación de imágenes, filtrado espacial, filtrado temporal, y la eliminación deriva de referencia, se proporcionan en la revisión enfocada. 15

  1. Manualmente o mediante el algoritmo especial (por ejemplo, un umbral o el borde de detección) 15 para determinar los límites del tejido, crear una máscara binaria de 1 (píxeles incluidas) y 0 (píxeles excluidos) y aplicar la máscara para cada trama de la secuencia. Este proceso crea una imagen binaria que pone de relieve las áreas de interés para su posterior procesamiento.
  2. Para mejorar la relación señal-ruido de la opciónlos datos de iCal, filtran las señales dentro de las áreas de interés seleccionadas. Para ello, utilice espacial (es decir, un promedio de píxeles fluorescentes vecinos según la definición de un contenedor de convolución deseado o kernel, por ejemplo 3 x 3 o, para los datos ruidosos, 5 x 5) y / o filtrado temporal (por ejemplo, Butterworth, tipo Chebyshev 1, Chebyshev tipo 2, elíptica etc.) (Figura 2). Tenga en cuenta la posibilidad de artefactos inducidos filtrados-hora de interpretar los datos. Para más detalles, véase la revisión. 15
  3. Retire la deriva de la línea de base en las grabaciones ópticas cuando sea necesario (mediante el uso de filtración de paso alto o ajuste polinómico a la señal original) y luego normalizar cada señal de píxel desde 0 (fluorescencia mínimo) a 1 (fluorescencia máxima).
  4. Seleccionar una ventana de tiempo que abarca los tiempos de activación de todos los píxeles para una única propagación AP. Asignar a cada pixel de su tiempo de activación como el tiempo de derivado de máxima carrera ascendente (dF / dt max, donde F es fluorescenintensidad ce). El uso de todos los tiempos de activación de píxeles, reconstruir el mapa de activación isócrono. Cada isócrona será por lo tanto mostrar los píxeles activados al mismo tiempo.
  5. Para reconstruir el mapa de distribución de la duración del PA (APD), para cada pixel calcular la duración entre el tiempo de activación y el tiempo en un nivel específico de la repolarización (por ejemplo, al 80% de la repolarización, APD 80). El uso de todos los valores de píxel de APD, reconstruir la distribución Mapa isócrono APD. Cada isócrona será por lo tanto mostrar los píxeles con la misma APD.
  6. Para el cálculo de la velocidad de conducción para la propagación AP, adaptarse a una superficie de la preparación de los datos de tiempo de activación calculados en 5.4. Para ello, utilice polinomio superficie de ajuste o local suavizado superficie del núcleo y luego calcular los vectores de velocidad de conducción locales a partir del gradiente de la superficie ajustada.
  7. Para crear el mapa de la repolarización, asignar a cada pixel de su tiempo de repolarización, definida como la segunda derivada máxima (D 2 F / dt2) de la señal óptica en el extremo de la OAP, o el tiempo de 90% de repolarización.

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Representative Results

Mapeo óptico de la avería SAN desde el corazón Langendorff perfundidos
Un ejemplo típico de un mapa de contornos activación de la AD reconstruida por el ritmo sinusal espontánea se muestra en la Figura 3 para un corazón de ratón Langendorff perfundidos. El punto de activación temprana se encuentra dentro de la región intercaval cerca del SVC en la red SAN se define anatómicamente. 3,16 Dos RA mapas de contorno de activación adquirido en el 1,0 y 0,5 ms frecuencia de muestreo se muestran en la Figura 3B.

Para evaluar SAN funcionamiento, se midió el tiempo de recuperación SAN (SANRT). 9 Después de la estimulación RAA durante al menos 1 min a 10-12 Hz, la estimulación eléctrica se detuvo y SANRT se calculó como el intervalo de tiempo entre la última y la AP capturado primero AP espontánea (Figura 3C). El SANRT se corrigió a la frecuencia cardíaca (es decir SANRT <sub> c) mediante el cálculo de la diferencia entre el SANRT y la longitud del ciclo base. Además, se identificó la localización de la primera marcapasos post-estimulación. Para este ejemplo, la SANRTc fue de aproximadamente 49 mseg.

La activación aislado Atria y SAN
La activación de la preparación atrial aislado durante el ritmo sinusal espontánea se muestra en la Figura 4A. Se originó en el anatómicamente definido SAN cerca de la SVC con una amplia frente de onda que se propagan anisotrópicamente a lo largo de la RA, con dos de conducción direcciones preferenciales cerca de los bordes superior e inferior de SAN y de bloques completos a la dirección septal (marcado en mapas de activación en la figura 4A) . El mapa de activación adquirido en 1 tasa de muestreo mseg muestra una extensa área de activación temprana. Un aumento en la frecuencia de muestreo de 0.5 ms y 0,3 ms nos permite identificar el área precisa de la localización que lleva marcapasos. We observó una típica, latido a latido posición estable monofocal del marcapasos que lleva lo que correspondía a la zona primaria de marcapasos previamente caracterizado por electrofisiológica microelectrodos de vidrio 17 y mapeo óptico 8-11,18,19 así como por immunolabeling para connexin45 y HCN4 . 6,16

Como se ha demostrado anteriormente, el potencial de acción óptica SAN consiste en una señal de dos fases que incluye dos componentes distintos: el componente de SAN lentamente ascendente y el rápido aumento de la carrera ascendente del miocardio auricular (componente auricular) (Figura 4B) 20 Debido a la dispersión de luz. procesos, OAP representa una actividad eléctrica promediado derivado de múltiples capas de células dentro del tejido. La profundidad y la anchura de dispersión se rige por una constante de espacio, que se determina por las propiedades de dispersión y absorción de luz y puede alcanzar hasta 1,5-2 mm. Debido a la Condu SANcción de retardo, la AP SAN siempre precede a la actividad auricular durante la activación fisiológica (Figura 4B). Para el cálculo de la transición de la SAN a la aurícula (es decir, el tiempo de conducción SAN, SANCT), se utilizó ya sea el punto de tiempo en que la señal de doble componente SAN alcanza 50% de la amplitud componente SAN, o el primer pico de los dos-pico OAP primera derivada (df / dt). El SANCT de la zona de activación más precoz SAN a la RA fue de ~ 5 mseg, similar a la medida por microelectrodos de vidrio.

SAN Tiempo de recuperación
Del mismo modo, la SANRT se midió en la preparación atrial aislado (Figura 4D). Para esto, preparaciones auriculares se estimula a 12 Hz a través de un electrodo de estimulación situado en la esquina de la RAA durante al menos 1 min. 9 Para este ejemplo, la SANRTc estaba a punto de 34 mseg, que es comparable a la medida en el Langendorff perfundidos corazón (Figura 3C). Además, se identificó la localización de la primera marcapasos post-estimulación.

Ritmo Cardiaco y fluorescente señal estabilidad en el tiempo
Si los procedimientos de carga de cirugía y colorantes son seguidos adecuadamente, no debería haber ningún cambio significativo en las características fisiológicas del atrio. En la Figura 5, se presentan el ritmo cardíaco medido antes y después del procedimiento de aislamiento auricular y durante la perfusión de 3 hr. No se observaron cambios significativos de la frecuencia cardíaca, ya sea durante el aislamiento atrio o después de la carga de colorante.

Aunque la tinción arterial puede requerir una mayor cantidad de tinte, la estabilidad de la señal fluorescente en el tejido del área de San parece ser mejor mediante el uso de este método de carga. En la Figura 6, se presentan decaimiento intensidad de la señal en el tiempo tanto para la tinción coronaria y la superficie. en t que el tejido SAN, IC 50 (que indica el período en el que la intensidad de la señal ha fallecido a 50%) es de aproximadamente 107 minutos después de la tinción coronaria, casi dos veces más que el de la tinción de la superficie.

Figura 1
Figura 1:. El aislamiento del auricular Preparación del ratón (A) procedimientos quirúrgicos realizados para aislar ratón preparación auricular. Se muestra la vista posterior del corazón. Todos los cortes se muestran con líneas de puntos rojos y etiquetados por los números en el orden realizado. Consulte los detalles en el texto. (B) El plan esquemático del aislado del ratón preparación auricular que muestra las principales características anatómicas, incluyendo la estructura trabecular de las izquierdas y derechas apéndices auriculares, así como la ubicación del nodo sinoauricular (SAN; marcada por un óvalo gris). Todas las abreviaturas se explican en la figura.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Señales de señales en bruto y procesado registrado en el 0,3, el 0,5 y el 1 ms / marco crudo se recogen de un solo píxel. Después de 3 x 3 hurgar en la basura, las señales son filtradas utilizando el algoritmo de paso bajo Butterworth. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Mapeo óptico entero corazón de la SAN (A) Izquierda, foto de una preparación típica utilizada para el mapeo de la red SAN desde el corazón intacto.. El cuadrado azul muestra el campo óptico deVer (6 mm x 6 mm). Derecha, campo óptico de vista capturada a través de la cámara y se superponen con los puntos de referencia anatómicos. VCS y VCI: la vena cava superior e inferior; RAA: apéndice auricular derecho; RV y LV: ventrículos derecho e izquierdo; PV: venas pulmonares. Mapas (B) Color de activación contorno adquiridos con 1,0 mseg (izquierda) y 0,5 mseg (derecha) de frecuencia de muestreo. A la derecha de cada mapa, la escala de tiempo del color correspondiente que indica el tiempo de activación auricular (desde el punto de activación más rápida muestra en azul, hasta el punto de activación más reciente se muestra en rojo) se muestra. El sitio de activación auricular más temprana está marcado por un asterisco. El tiempo de recuperación (C) SAN (SANRT) medida en la preparación de todo el corazón. Los ejemplos representativos de los mapas de contorno de activación auricular reconstruidos para el estímulo de la última estimulación (S1) y para el primer tiempo de la aurícula-estimulación post (A1) se muestran para los latidos seleccionados en la traza senior representante en la parte superior.Sitios de la activación auricular más temprana se marcan con un asterisco. BCL:. La duración del ciclo básico Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Conexión de alta resolución de mapeo óptico del ratón nodo sinoauricular (SAN) de la superficie endocárdica del aislado Atria (A) Fotografía de una preparación SAN típica del ratón (6 mm x 6 mm) y sus mapas de contorno de activación correspondiente. obtenido en 1,0 ms, 0,5 ms, y 0,3 mseg tasas de muestreo. SAN y una zona de bloque vecino se muestran mediante flechas. escalas de tiempo de color indican el tiempo de activación auricular. El asterisco indica la ubicación del marcapasos que lleva. RAA: apéndice auricular derecho, y SVC INC: superior y la vena cava inferior, RV: ventrículo derecho, AVJ: aurículo-ventricul ar unión, CT: cresta terminal, la NIC: tabique interauricular. (B) Mecanismo de los componentes dobles de la grabación senior del área de San ratón. Consulte los detalles en el texto. . (C) OAPs grabados desde el centro de la zona de SAN (azul), el sitio de excitación auricular más temprana (verde) y el sitio de activación más tardía AR (rojo) Inserciones: transición de ganglionar a forma de onda auricular con un tiempo total de conducción igual a 5 mseg. Compararlo con el tiempo de retardo para la activación total de la AR igual a 11 ms. El tiempo de recuperación (D) SAN (SANRT) medida en la preparación de la aurícula aislada. se muestran ejemplos representativos de los mapas de contorno de activación auricular reconstruidos para el estímulo de la última estimulación (S1) y para el primer tiempo de la aurícula-estimulación post (A1). Un sitio de la activación auricular más temprana está marcado por un asterisco. BCL - longitud del ciclo básico.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Ritmo Cardiaco midió antes y después del procedimiento de aislamiento auricular (A) y durante la perfusión de 3 horas (B). (A) de la frecuencia cardíaca latido espontáneo se muestra antes y después del aislamiento auricular para dos tipos de tinción auricular: tinción de la superficie después del aislamiento (sin tinción coronaria previa) y tinción coronaria antes del aislamiento auricular. (B) espontánea corazón que late la estabilidad del ritmo en lugar de la perfusión de 3 horas se muestra para los preparados no manchado auricular y para el tinte fluorescente y blebbistatin preparaciones auriculares manchados. Los datos se muestran como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6:. Intensidad de la señal de decaimiento con el tiempo el intensidades de las señales de ambos métodos de carga (carga coronaria indica en rojo; y la carga de superficie indicada en azul) se midieron y se representa en el tiempo. Las intensidades de señal se promediaron a partir de un área de 7 por 7 píxeles en cuatro lugares típicos en la aurícula derecha: trabécula (TRAB), nodo sinusal (SAN), apéndice del atrio derecho (RAA) y el seno coronario (CS). Los valores de IC50 se calcularon entonces y etiquetados en todas las curvas de caída. La decadencia intensidad de la señal de los dos métodos de carga fue similar en TRAB y RAA. El IC 50 de carga arterial en CS fue de alrededor de 20 minutos más. En el SAN, este valor para la carga arterial era casi dos veces mayor en comparación con la carga de la superficie, lo que indica que los métodos de carga arterial resultaron en una mejor estabilidad del colorante en los TISS SANue con el tiempo. Los datos se muestran como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

A continuación, presentamos dos tipos de preparaciones de ratón SAN: 1) SAN intacto en el corazón entero perfundido Langendorff, y 2) en el SAN aislado, abrimos la preparación de la aurícula. Estos dos tipos de preparación sirven para diferentes propósitos experimentales. En la preparación todo el corazón perfundido Langendorff, la estructura de la aurícula intacto se conserva lo que hace posible el estudio de arritmias complejas auriculares como la fibrilación auricular, así como las interacciones entre el SAN y el atrio durante taquiarritmias reentrantes. 6 En contraste, en la preparación atrial aislado , el atrio se abre y se aplana en una estructura de dos dimensiones seudo caso de perturbación del tridimensionales paquetes anatómicos. Esto puede afectar a la anatomía de las vías de reentrada que hace la preparación de la aurícula aislada no es ideal para el estudio de arrhythmogenesis auricular. Sin embargo, el uso de este tipo de preparación, la ubicación del marcapasos líder (s) sitios, la conducción intranodal, y AP propagación pattern se puede visualizar con precisión y se investigó en detalle. Además, aurículas intactas parecen estar limitados por una vista posterior, mientras que en la preparación aislada, toda la superficie de la aurícula está disponible para el mapeo óptico.

Por otra parte, aislado preparación auricular permite mapeo estructural-funcional de la aurícula mediante la resolución de la compleja microestructura de la red trabecular como se ve en la Figura 4. Para esto, alta resolución espacial (100 m / pixel o superior) y temporal (2.000 fps o más) resoluciones se debe utilizar, ya que es fundamental para particularizar los dos patrones de activación auricular y SAN, lo que podría ser aún más solapaban con las estructuras correspondientes. Mientras 1.000 fps resolución temporal puede ser un mínimo para reconstruir la activación auricular (que tiene una duración de 10 a 20 ms), 2000 fps debe ser considerada como una resolución temporal mínima para la conducción intranodal (que tiene una duración de ~ 5 ms y de este modo podría perderse a menor resoluciones) y actuar SANmediciones ivation como se ve en la Figura 4. Esto puede permitir la localización de arritmógenas "puntos calientes" (tales como focos ectópicos o reingreso anclada) durante la fibrilación auricular / aleteo que podría surgir de la superposición de las regiones de remodelación funcional significativa con los de la fibrosis elevada y / o la reducción de acoplamiento célula a célula. 21,22 Además, el método descrito también podría ser usado para estudiar los mecanismos electrofisiológicos de anomalías SAN, incluidos los tacos de salida, SAN pausas, arritmias taquicardia-bradicardia, síndrome del seno enfermo etc.

Mediante la introducción de un segundo (o incluso tercera) sonda fluorescente, será posible realizar mapeo óptico multi-paramétrico de la actividad eléctrica en asociación con el manejo del calcio, así como metabólico y otros cambios. Las diferentes combinaciones de colorantes se podrían utilizar para la administración simultánea de tensión de calcio, radiométrica tensión / calcio, o formación de imágenes potencial mitocondrial.

Para mapeo óptico de alta resolución temporal, debido al periodo de recogida de fluoróforo más corto, las señales de una relación más débil de señal a ruido pueden ser apreciados. Por lo tanto, un procedimiento de procesamiento de promediado se aplica a las señales de latidos de corazón del seno o las señales de la serie de estimulación según sea necesario. El dF / dt máximo se detecta para cada señal en una grabación a largo plazo. Estos puntos de tiempo de activación son entonces alineados. Un período de ajuste de grabación con centro en estos puntos de tiempo se corta y se promedió a partir de la totalidad o selecciona Aps, según sea necesario.

Mediante el uso preciso de la instrumentación y el procedimiento de tinción adecuada, los parámetros electrofisiológicos auricular incluyendo la velocidad de conducción (comparar las Figuras 3C y 4D para los mapas de activación S1), el ritmo SAN espontánea y la longevidad de la preparación SAN (Figura 5) no se ven afectadas, que permanecen estables durante 3 o más horas. Es importante destacar que, el monit continuooring de ECG debe realizarse sobre todo el procedimiento de tinción para asegurar la función eléctrica normal del corazón. La aplicación de blebbistatin puede inducir una disminución de la frecuencia cardíaca transitoria, pero aparte de eso, no induce cambios en los principales sitios de marcapasos o cambios en la morfología de AP como también se ha descrito anteriormente. 13

tinción de la superficie de la preparación de la aurícula aislada es un paso crítico. Para ello, la aplicación rápida del colorante diluido sobre la superficie del tejido debe evitarse; en lugar del colorante debe caer en la preparación libremente debido a la densidad más alta de DMSO, que utiliza tanto para tinte y diluciones blebbistatin. La cantidad total de carga adecuada y la velocidad deben ser ajustados a fin de no inducir cambios dramáticos de la frecuencia cardíaca. El procedimiento de tinción se puede aplicar varias veces hasta que la señal llega a un nivel razonable. Cabe señalar que la aplicación directa de colorante podría dañar el tejido SAN y afectar su pacemaking. Por lo tanto, el colorante debe ser diluido y la cantidad aplicada debe ser cuidadosamente controlado. Tinción de la superficie adecuada no debe dañar la preparación o SAN 23 que es evaluado por la frecuencia cardiaca comparable y la velocidad de conducción.

protocolos de tinción alternativos deben ser considerados también. Estos pueden incluir, ya sea un 10 a 15 min de superfusión de la / preparación fibrilación SAN con el colorante sensible al voltaje (RH-237 o di-4-ANEPPS) a 35 ± 1 ° C 10,19 o un 30 min de incubación de la preparación a temperatura ambiente (20-22 ° C) en una solución de Tyrode que contiene el indicador sensible al voltaje. 11

Para el mapeo óptico de la SAN desde el corazón entero perfundido Langendorff, importantes medidas de instrumentación incluyen la inserción del tubo pequeño en la LV y el cierre de la VCS y VCI. El primero impide un aumento de presión de la congestión solución durante los experimentos a largo plazo, así como la posterior ischemia desarrollo después de la supresión de las contracciones ventriculares por blebbistatin y la acidificación de la solución de perfusión. Este último permite al RA para mantener un cierto nivel de la presión intra-auricular llenando así el atrio con una solución de perfusión y el aplanamiento de la región intercaval el fin de descubrir toda la zona de SAN para el mapeo óptico.

Finalmente, la tinción coronaria, además de la carga de colorante superficial, podría mejorar significativamente la intensidad de los OAPs SAN que pueden durar más tiempo en comparación con la tinción de superficie puro utilizado en estudios previos. 8,9

El uso de blebbistatin tiene múltiples ventajas en comparación con otros desacopladores electromecánicos, incluyendo baja toxicidad, efectos secundarios menos pronunciados, y la resistencia de lavado cuando se utiliza con precaución. Blebbistatin precipita cuando se disuelve a temperaturas inferiores a 37 ° C. 14 cristales blebbistatin puede interrumpir el flujo vascular normal y por lo tanto inducir locales. isquemia y provocar eventos arrítmicos 24 Además, en los estudios que utilizan GFP u otros tintes verde / amarillo, la precipitación blebbistatin podrían confundirse con células marcadas que deben ser tenidos en cuenta. La prevención de blebbistatin precipitación directa, es decir, uno tiene que disolver blebbistatin en un pre-calentado (37 ° C y los medios de comunicación más altas) y se agitó vigorosamente.

Para analizar APD, una alta concentración de blebbistatin (hasta 10 mM) podría ser utilizado. 13,14,25. Del mismo modo, si cualquier fármaco que aumenta la contracción se utilizan, se recomienda la aplicación adicional de blebbistatin.

Como una alternativa técnica para estudiar la actividad eléctrica del ratón SAN, baja resolución matriz multi-electrodo (64 electrodos separados en un cuadrado de 8 x 8, la configuración con una distancia entre electrodos de 0,55 mm) 26 y grabaciones consecutivas de microelectrodos de vidrio hechas a corta distancia entre impalements vs. hasta 50 m / pixel para óptico mapping) y no puede ser utilizado para analizar la morfología de AP o para formación de imágenes multi-paramétrico (como tensión simultánea y mapeo óptico de calcio). Aunque las grabaciones de microelectrodos de vidrio proporcionan más información sobre la morfología de AP, incluyendo los valores absolutos de AP amplitud y potencial de reposo, sino que también está limitada por una resolución espacial baja. Por lo tanto, sólo se puede utilizar para la localización estable del marcapasos que lleva y no es aplicable para capturar alteraciones latido a latido en la ubicación principal marcapasos. Al mismo tiempo, como se ha demostrado previamente 3,20 y destacó en el presente estudio, el senior co SANnsists de una señal de dos fases whichincludes tanto SAN y los componentes de miocardio auricular AP (Figura 4B). Por lo tanto, hace que sea difícil extraer una señal de SAN puro y estimar con precisión la morfología de AP en el SAN. Para este propósito, los microelectrodos de vidrio 17 o el enfoque de fijación de corriente en miocitos aislados SAN deben ser considerados.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

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