De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

Biology

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para o mapeamento óptico da atividade elétrica do átrio direito do mouse e, especialmente, o nó sino-atrial, em uma alta resolução espacial e temporal.

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Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

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Abstract

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Pub. No. 80-23). Todos os métodos e protocolos utilizados nestes estudos foram aprovados pela Universidade de Wisconsin Animal Care e do Comitê Use Protocolo seguindo as Diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo NIH (publicação No. 85-23, revista em 1996). Todos os animais utilizados neste estudo receberam cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Remoção Coração e Langendorff Perfusão

  1. Antes do isolamento do coração, a solução de Tyrode quente a 37 ° C usando um banho de água e uma camisa de água.
  2. Anestesiar o rato com 5% de isoflurano / 95% de O 2.
  3. Assegurar um nível adequado de anestesia, verificando a perda do reflexo dor.
  4. Execute toracotomia. Abra o peito usando curvas 5.5 "tesoura Mayo e 5,5" hemostática Kelly paraceps para fazer um corte de 1 cm na parte dianteira do tórax.
    1. Rapidamente extrair o coração contra o peito (dentro de 30 seg). Use 4 "forceps Iris curvas para agarrar o tecido pulmonar e cortar o pulmão, timo e coração juntamente com o pericárdio usando 4.3" tesoura Iris. Não pegue o coração diretamente.
    2. Lavá-lo em oxigenada (95% O2 / 5% de CO 2), a temperatura constante-(36,8 ± 0,4 ° C) modificada solução de Tyrode. Utilize a seguinte composição de solução (em mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 de MgCl2, 1,3 de CaCl2, 20,0 de NaHCO3 e 11,1 de glucose (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Enquanto mergulhando na mesma solução, identificar o pulmão, timo, gordura e tecido. Cuidadosamente dissecar-los a partir do coração. Use curva 3 "Vannas-Tübingen tesoura e 4,3" # 5 fórceps.
  6. Em seguida, identificar a aorta e canular-lo em um 21 G cânula feitos sob medida. Usar duas curvas 4.3 "força # 5Bps.
  7. Após a canulação, perfundir simultaneamente (através da cânula, a uma taxa de fluxo de ~ 5 ml / min, o que deve ser ajustado com base na pressão aórtica, ver abaixo) e superfuse (no banho a uma taxa de fluxo de ~ 50 mL / min) o coração com solução de Tyrode aquecido e filtrou-se ao longo de toda a experiência. Passar a solução de perfusão através de um filtro de nylon de 11 ^ M em-linha para evitar o entupimento da circulação coronária.
  8. Utilizando um transdutor de pressão (ou um medidor de pressão), ligado através de um bloqueio de 3 vias torneira de Luer para a linha de perfusão, monitorizar a pressão aórtica e mantê-lo entre 60 e 80 mmHg. Regule a velocidade de perfusão, se necessário para manter a pressão aórtica dentro desta gama.

2. Mapeamento óptica do SAN do coração inteiro perfusão-Langendorff

  1. Instrumentação
    1. Colocar o coração na horizontal e fixar o ápice ventricular para o fundo revestido de silicone da câmara utilizando 0,1 mm pinos de diâmetro para prevent movimento durante o experimento induzida por fluxo. 12
    2. Inserir um ( "ID x 005" .012) pequeno tubo de silicone para o ventrículo esquerdo (VE) através da veia pulmonar, os átrios esquerdo (AE) e da válvula mitral (VM). Fixar o tubo por um fio de seda (4-0) para o tecido conjuntivo soar.
    3. Posicione o coração com o seu lado posterior virado para cima (Figura 1A, painel esquerdo).
    4. Pin a borda do apêndice RA (RAA) para a parte inferior da câmara de silicone de 0,1 mm de diâmetro usando pinos minutien. Ajustar o seu nível, a fim de tornar a superfície posterior da RA plana e permitir que ele seja localizado plano focal da câmara. Isto irá permitir que as medições ópticas a partir da área de superfície máxima do átrio.
    5. Soga superior (VCS) e inferior (IVC) da veia cava por um fio de seda (4-0), esticar e fixar a outra extremidade do fio de sutura para a parte inferior de uma câmara revestida de silicone (ver Figura 3A). Certifique-se de que as suturas não bloqueiam acampo de vista óptico.
    6. Coloque o eletrodo de estimulação feito por encomenda na beira da RAA. Para fazer com que os eléctrodos, a utilização de silício revestidas de prata fios de diâmetro 0,25 mm, com distância inter-eléctrodo de 0,5 mm e desprovida de silício para um comprimento de 1 mm na extremidade de estimulação. Em seguida, coloque dois milímetros agulha ECG 12 (29 gauge) eletrodos monopolar perto da base dos ventrículos direito e esquerdo. Coloque o eletrodo ECG chão, perto do ápice dos ventrículos.
  2. coloração
    1. Desde ambos os corantes fluorescentes e blebbistatin desacoplador electro-mecânica são sensíveis à luz, execute todos os procedimentos descritos a seguir em um quarto escuro. Em primeiro lugar preparar corante sensível à tensão RH-237 ou di-4-ANNEPS como uma solução estoque, 1,25 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (2,5 mM), que aliquota (30 mL cada) e armazenar as alíquotas a -20 ° C.
    2. Dilui-se 5-10 uL de solução de corante em 1 ml de solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e em seguida injectá-lo na linha de perfusão coronáriaao longo de um período de 5-7 min utilizando um Luer porta de injecção em-linha.
    3. Prepare blebbistatin como uma solução-mãe (2 mg / ml em sulfóxido de dimetilo, 6,8 mM) com antecedência e armazená-lo a 4 ° C.
    4. Depois de 20 min de estabilização, adicionar (C 37 °) blebbistatin 0,5 ml de aquecido no perfusado e diluir 0,1 ml de blebbistatin em 1 ml de solução (37 ° C) de Tyrode aquecido. Em seguida, injectar na linha de perfusão coronária ao longo de um período de 5-7 min utilizando um Luer porta de injecção em-linha.

3. mapeamento óptico da SAN a partir da Preparação atrial isolada

  1. Instrumentação
    1. Para a preparação atrial isolada, isolar e canular o coração, tal como descrito acima nos passos 1,1-1,5 para a preparação de todo o coração.
    2. Dissecar os ventrículos para longe do lado anterior. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 1 para detalhes.
    3. Abra o RA, cortando através da va tricúspidelve (TV) ao longo do eixo TV-SVC. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 2 para mais detalhes.
    4. Cortar o membro medial da crista terminal para abrir o RAA. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 3.
    5. Abrir a parede livre do átrio anterior através da realização de um corte a partir da linha média do corte anterior # 3 para a aresta de canto inferior direito da RAA, achatar e fixar a parede livre do átrio ao fundo de uma câmara revestida de silicone. Ver a direcção indicada pela seta oca na Figura 1A, cortar # 4. Preservar um rebordo de tecido ventricular para fixar a preparação para evitar danos às aurículas.
    6. Da mesma forma, aberta LA cortando o MV ao longo do canto MV-superior do apêndice LA (LAA).
    7. Para abrir o LAA, cortado a partir do meio do AAE aberta, através da parede anterior livre do átrio até perto de uma borda do meio de AAE.
    8. Abra a fibrilação alo parede livre anteriorng no mesmo sentido, em seguida, achatar e fixá-lo para a parte inferior de uma câmara de Sylgard revestido.
    9. Parcialmente remover o tecido do septo interatrial. Isto irá reduzir a dispersão do sinal óptico a partir de tecido que não está em foco. Portanto, tanto a LA e RA, bem como a SAN e da junção atrioventricular (AVJ) são acessíveis nesta preparação (Figura 1B).
    10. Levanta a preparação final de cerca de 0,5 mm a partir do fundo da câmara revestida de silicone, a fim de permitir que a superfusão de ambas as superfícies do epicárdio e endocárdio.
    11. Superfuse com a preparação aquecido (37 ° C) solução de Tyrode a uma taxa constante de ~ 12 mL / min para um fluxo concentrado localizado perto do VPC e ~ 30 mL / min para um banho de superfusão.
    12. Coloque a estimulação feita por medida de Ag / AgCl 2 eléctrodo (0,25 mm de diâmetro) na extremidade do RAA dissecados. Em seguida, coloque dois milímetros agulha ECG 12 (29G) eletrodos (monopolar) perto da RAA e LAA, respectivamente. Coloque no chão ECG eleitosmontou perto da AVJ.
  2. coloração
    1. Executar uma aplicação directa do corante sensível à tensão (RH-237 ou di-4-ANNEPS). Para isso, dilui-se 1-2 mL da solução stock de corante em 1 mm de solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e, lentamente, libertar o corante diluída sobre a superfície da preparação usando uma pipeta de 1 mm.
    2. Alternativamente, fibrilação realização da coloração com o corante sensível à tensão através de uma perfusão coronária do coração de Langendorff-perfundidos semelhante ao descrito acima para a preparação de todo o coração (passos 2.2.1-2.2.2).
      1. Após a coloração de perfusão coronária, isolar a preparação fibrilação tal como descrito. Realização da coloração de superfície adicional, quando necessário para atingir um nível satisfatório de fluorescência. isolamento atrial rápido não branquear o corante e não afeta a qualidade da coloração.
    3. Imobilizar a preparação com o eletro-mecânico desacoplador, blebbistatin. Diluir 3-5 ul blebbistatin solução estoque na solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e, lentamente, libertar o blebbistatin diluída sobre a superfície da preparação e da solução circundante. Desde blebbistatin tem sido mostrado para ser leve, 13,14 evite exposição longa sensível à luz durante a preparação e coloração.
    4. Executar aplicativo blebbistatin adicional, tanto quanto necessário para suprimir a contração. Normalmente até 3 aplicações adicionais (3-5 ul por cada aplicação) pode ser utilizado para suprimir o artefacto de movimento suficiente a fim de reconstruir com precisão SAN e de activação do átrio.
    5. Adicionar mais 0,5 ml de blebbistatin aquecido no perfusado. Durante este procedimento, a pausa de superfusão durante 30 segundos para permitir que o corante / blebbistatin para corar o tecido atrial.

4. Mapeamento óptica Configurar

NOTA:. Uma descrição detalhada do sistema de mapeamento óptico é proporcionado noutro local 12

  1. Use uma câmera com um TEMporal resolução de 2.000 frames / seg ou superior, e uma série de lentes de condensador para chegar a resolução espacial de 100 mm / pixel ou superior. Isso é necessário para reconstruir a ativação SAN e propagação intranodal.
  2. Para reduzir o movimento artefato a partir da solução de vibração, corrigir uma pequena tampa de vidro sobre a superfície da solução sobre o coração / preparação atrial isolada.
  3. Use luz de excitação (520 ± 45 nm de comprimento de onda) fornecido por um-corrente constante, lâmpada de halogéneo de baixo ruído. Direcionar o feixe de luz filtrada para a preparação usando um guia de luz flexível bifurcada.
  4. Filtra-se a fluorescência emitida por um filtro passa longo (> 715 nm). Recolha, digitalizar e salvar o sinal fluorescente adquirida em um software de computador usando fornecido pelo fabricante da câmera.

5. Processamento de Dados

Nota: Os dados de mapeamento óptico é recolhido e armazenado como uma série de matrizes de intensidade de fluorescência em diferentes pontos de tempo. Cada represe pixelsnts uma medida da intensidade de fluorescência recolhido de um local específico na preparação de tecido em um ponto de tempo específico. fluorescência de fundo é automaticamente removido por pixel para permitir uma melhor visualização das mudanças de fluorescência produzidos por variações de tensão de membrana e invertida para corresponder com potenciais de ação (APs) medidos por sistemas de microeletrodos. Os detalhes dos diferentes passos no processamento de dados de imagens ópticas, incluindo segmentação de imagens, filtragem espacial, filtragem temporal e remoção de desvio da linha de base, são fornecidos na revisão focada 15.

  1. Manualmente ou usando o algoritmo especial (por exemplo, uma detecção de limiar ou a borda) 15 para determinar limites de tecido, criar uma máscara binária de 1 (pixels incluído) e 0 (pixels excluídos) e aplicar a máscara para cada quadro na seqüência. Este processo cria uma imagem binária que destaca as áreas de interesse para posterior processamento.
  2. Para melhorar a relação sinal-ruído do optdados do iCal, filtrar os sinais dentro das áreas de interesse seleccionados. Para isso, use espacial (ou seja, a média de pixels fluorescentes vizinhos, tal como definido por um bin convolução desejado ou kernel, por exemplo, 3 x 3, ou, para os dados ruidosos, 5 x 5) e / ou filtro temporal (por exemplo, Butterworth, tipo Chebyshev 1, Chebyshov tipo 2, elíptico, etc.) (Figura 2). Tenha em mente a possibilidade de artefatos induzida por filtrados na interpretação dos dados. Para mais detalhes, veja o comentário. 15
  3. Remover desvio da linha de base em gravações ópticas quando necessário (usando a filtragem passa-alta ou ajuste polinomial ao sinal original) e, em seguida, normalizar a cada sinal de pixel de 0 (fluorescência mínimo) a 1 (fluorescência máxima).
  4. Selecione uma janela de tempo que abrange os tempos de ativação de todos os pixels para um único propagação AP. Atribuir cada pixel seu tempo de activação como o tempo máximo de derivado movimento ascendente (df / dt max, onde F é fluorescenintensidade ce). Usando todos os tempos de ativação pixel, reconstruir o mapa de activação isócrono. Cada isocrônica mostrará assim os pixels activados ao mesmo tempo.
  5. Para reconstituir o mapa de distribuição de duração do PA (DPA), para cada pixel calcular a duração entre o momento de activação e o tempo a um nível específico de repolarização (por exemplo, a 80% de repolarização, APD 80). Usando todos os valores de pixel de APD, reconstruir a distribuição Mapa isócrono de APD. Cada isochron vai mostrar, assim, os pixels com o mesmo APD.
  6. Para calcular a velocidade de condução para a propagação AP, se ajustar à superfície da preparação dos dados de tempo de activação calculados em 5.4. Para isso, utilizar polinomial superfície de adaptação ou local alisamento da superfície do kernel e, em seguida, calcular os vectores de velocidade de condução do local a partir do gradiente da superfície equipada.
  7. Para criar o mapa repolarização, atribua cada pixel seu tempo de repolarização, definida como a segunda derivada máxima (d 2 F / dt2) do sinal óptico no final do OAP, ou o tempo de 90% de repolarização.

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Representative Results

Mapeamento óptica do SAN Intact do coração perfundido-Langendorff
Um exemplo típico de um mapa de contorno activação RA reconstruída para o ritmo sinusal espontânea é mostrado na Figura 3 para um coração de rato perfundido de Langendorff-. O ponto de activação precoce está localizada dentro da região perto do intercaval SVC onde o SAN é definido anatomicamente. 3,16 mapas de contorno activação Dois RA adquiridos a 1,0 e 0,5 ms taxa de amostragem são mostrados na Figura 3B.

Avaliar SAN funcionamento, medimos o tempo de recuperação SAN (SANRT). 9 Após a estimulação RAA durante pelo menos 1 min a 10-12 Hz, a estimulação elétrica foi interrompido e SANRT foi calculada como o intervalo de tempo entre a última AP capturado eo primeiro AP espontânea (Figura 3C). O SANRT foi corrigido para a frequência cardíaca (ie SANRT <sub> C) através do cálculo da diferença entre o SANRT e o comprimento do ciclo de base. Além disso, identificou-se a localização do primeiro marcapasso pós-estimulação. Para este exemplo, o SANRTc foi de cerca de 49 mseg.

Ativação Atria e SAN isolado
A activação da preparação atrial isolada durante o ritmo sinusal espontânea é mostrado na Figura 4A. Originou-se na anatomicamente definido SAN perto da SVC com uma frente de onda grande que se espalhou anisotropicamente todo o RA, com dois sentidos de condução preferenciais perto das bordas SAN superiores e inferiores e bloqueio completo para a direção do septo (marcadas em mapas de ativação na Figura 4A) . O mapa de activação adquiridos em 1 taxa de amostragem ms mostra uma extensa área de ativação precoce. Um aumento na taxa de amostragem de 0,5 ms e 0,3 ms permite identificar a área exacta da localização levando pacemaker. We observou-se uma típica, beat-to-beat posição monofocal estável do pacemaker líder, que correspondeu à região do marcapasso primário previamente caracterizados eletrofisiologicamente por microeletrodos de vidro 17 e mapeamento óptico 8-11,18,19, bem como por imunomarcação para connexin45 e HCN4 . 6,16

Como demonstrado anteriormente, o potencial de acção óptica SAN consiste num sinal de duas fases que inclui dois componentes distintos: o componente SAN subindo lentamente e o movimento ascendente rapidamente crescente do miocárdio auricular (componente atrial) (Figura 4B) 20 Devido à dispersão de luz. processos, OAP representa uma actividade eléctrica média resultante a partir de múltiplas camadas de células no interior do tecido. A profundidade e a largura de espalhamento é regida por uma constante de espaço, que é determinada pela luz e propriedades de dispersão e de absorção pode atingir até 1,5-2 mm. Devido à Condu SANatraso cção, a SAN AP sempre precede a atividade atrial durante a ativação fisiológica (Figura 4B). Para calcular a transição do SAN para o átrio (isto é, SAN tempo de condução, Sanct), utilizou-se quer o ponto de tempo em que o sinal de duplo componente SAN atinge 50% do componente de amplitude SAN, ou o primeiro pico dos dois-pico primeira derivada senior (df / dt). O Sanct a partir da área de activação mais rapidamente SAN para a AR foi ~ 5 mseg, semelhante à medida por microeléctrodos de vidro.

SAN Tempo de recuperação
Da mesma forma, o SANRT foi medido na preparação atrial isolada (Figura 4D). Para isso, as preparações foram atriais estimulado e regulado a 12 Hz através de um eléctrodo de estimulação localizada no canto do RAA durante pelo menos 1 min. 9 Para este exemplo, o SANRTc foi de cerca de 34 ms, o que é comparável com o medido no Langendorff-perfundidos coração (Figura 3C). Além disso, identificou-se a localização do primeiro marcapasso pós-estimulação.

Heart Rhythm e fluorescente Signal estabilidade no tempo
Se os procedimentos de carregamento de cirurgia e corante são seguidos de forma adequada, não deve haver qualquer mudança significativa nas características fisiológicas do átrio. Na Figura 5, apresenta-se o ritmo cardíaco medido antes e depois do procedimento de isolamento de fibrilação e durante a perfusão de 3 horas. Nenhuma mudança significativa da frequência cardíaca foram observados tanto durante o isolamento átrio ou após o carregamento do corante.

Embora a coloração arterial pode necessitar de uma quantidade maior de corante, a estabilidade do sinal fluorescente no tecido da área de San parece ser melhor usando este método de carregamento. Na Figura 6, apresenta-se a intensidade de sinal deterioração ao longo do tempo, tanto para a coloração e a superfície coronária. em t ele tecido SAN, IC 50 (o que indica o período em que a intensidade do sinal tenha falecido a 50%) é de cerca de 107 min após a coloração coronária, quase duas vezes, enquanto que a coloração de superfície.

figura 1
Figura 1:. O isolamento do auricular Preparação rato procedimentos cirúrgicos (A) realizada para isolar rato preparação fibrilação. A vista posterior do coração é mostrado. Todos os cortes são mostrados por linhas a tracejado vermelhas e marcado por números na ordem executada. Veja detalhes no texto. (B) O esboço esquemático do isolado do rato preparação fibrilação mostrando as principais características anatómicas, incluindo a estrutura trabecular do lado esquerdo e direito apêndices atriais, bem como a localização do nó sino-atrial (SAN; rotulada por uma oval cinzenta). Todas as abreviaturas são explicados na figura.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Sinais Sinais crus e processados gravados em 0,3, 0,5 e 1 ms / frame Raw são recolhidos a partir de um único pixel. Depois de 3 x 3 binning, os sinais são filtradas usando a low-pass algoritmo de Butterworth. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Mapeamento óptica total do coração do SAN (A) Esquerda, foto de uma preparação típica utilizada para o mapeamento do SAN a partir do coração intacto.. O quadrado azul mostra o campo óptico deview (6 mm por 6 mm). Certo, campo óptico de vista capturada através da câmera e sobrepostos com marcos anatômicos. SVC e IVC: cava superior e inferior cava; RAA: aurícula direita; RV e LV: ventrículos direito e esquerdo; PVs: veias pulmonares. Mapas (B) Cor de ativação contorno adquirido com 1.0 ms (esquerda) e 0,5 ms (direita) taxa de amostragem. À direita de cada mapa, a escala de tempo de cor correspondente indicando o tempo de ativação atrial (a partir do ponto de ativação mais antigo mostrado em azul, com o último ponto de ativação mostrada em vermelho) é mostrado. O mais antigo local de activação do átrio é marcado por um asterisco. (C) SAN tempo de recuperação (SANRT) medida na preparação de coração inteiro. Exemplos representativos dos mapas de contorno de activação atriais reconstituídas para o estímulo última estimulação (S1) e para o primeiro batimento atrial pós-estimulação (A1) são apresentados para os batimentos seleccionados no rastreio OAP representante no topo.Sites dos primeiros ativação atrial são rotulados por um asterisco. BCL:. Comprimento do ciclo básico Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: De alta resolução de mapeamento óptico do mouse nó sino-atrial (SAN) a partir da superfície endocárdica do Isolated Atria (A) Fotografia de uma preparação SAN rato típico (6 mm x 6 mm) e seus mapas de contorno de ativação correspondente. obtido em 1,0 ms, 0,5 ms, 0,3 e taxas de amostragem mseg. SAN e uma zona de bloco vizinho são mostradas por setas. escalas de tempo de cor indicam o tempo de ativação atrial. O asterisco indica a localização do pacemaker líder. RAA: aurícula direita, SVC e INC: superior e da veia cava inferior, RV: ventrículo direito, AVJ: atrio-ventricul junção ar, CT: crista terminalis, IAS: septo inter-atrial. (B) Mecanismo de os componentes duplos da gravação OAP da área de rato SAN. Veja detalhes no texto. . (C) OAPs gravados a partir do centro da área de SAN (azul), o mais antigo local de excitação atrial (verde) e o mais recente ponto de activação de RA (vermelho) Inserções: transição de nodal a forma de onda atrial com um tempo total de condução igual a 5 mseg. Compará-lo com o tempo de atraso para a activação total de RA igual a 11 ms. (D) SAN tempo de recuperação (SANRT) medido na preparação atrial isolada. Exemplos representativos dos mapas de contorno de activação atriais reconstituídas para o estímulo última estimulação (S1) e para o primeiro batimento atrial pós-estimulação (A1) são mostrados. Um local das primeiras activação auricular é marcado por um asterisco. BCL - comprimento do ciclo básico.k "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Heart Rhythm medidos antes e depois do procedimento de isolamento atrial (A) e durante a perfusão de 3 horas (B). (A) da frequência cardíaca batimento espontâneo é mostrado antes e após o isolamento atrial para dois tipos de coloração atrial: coloração da superfície após o isolamento (sem coloração coronária prévia) e coloração coronariana antes do isolamento atrial. (B) Espontâneo coração batendo estabilidade ritmo sobre a perfusão de 3 horas é mostrada das preparações não coradas atrial e para corante fluorescente e blebbistatin preparações atriais manchadas. Os dados são apresentados como média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6:. A intensidade do sinal da deterioração com o tempo a intensidades de sinais de ambos os métodos de carregamento (carga coronária indicado em vermelho; e carregamento superficial indicada a azul) foram medidos e representados graficamente ao longo do tempo. As intensidades de sinal foram calculados a partir de uma área de 7 por 7-pixel em quatro locais típicos no átrio direito: trabecula (TREC), do nó sinusal (SAN), anexo átrio direito (RAA) e do seio coronário (SC). Os valores de IC50 foram calculados e rotulados em todas as curvas de decaimento. A decadência intensidade do sinal de ambos os métodos de carregamento foi semelhante em TRAB e RAA. O IC 50 de carregamento arterial no CS foi em torno de 20 min mais. No SAN, este valor para carregamento arterial foi quase duas vezes maior em comparação com a carga de superfície, o que indica que os métodos de carregamento arterial resultou em uma melhor estabilidade do corante nas tiss SANue ao longo do tempo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, nós apresentamos dois tipos de preparações do rato san: 1) SAN intacta no coração toda Langendorff-perfundidos, e 2) SAN no isolado, abriu preparação atrial. Estes dois tipos de preparação servem diferentes propósitos experimentais. Na preparação do coração inteiro de Langendorff-perfundidos, a estrutura fibrilação intacta é preservado o que torna possível estudar arritmias atriais complexos, tais como fibrilação atrial, bem como as interacções entre o SAN e o átrio durante taquiarritmias reentrantes. 6 Em contraste, na preparação atrial isolada , o átrio é aberta e achatada para uma estrutura tridimensional em que os pseudo dois feixes anatómicas tridimensionais são perturbados. Isto pode afectar a anatomia das vias reentrantes que torna a preparação atrial isolada não é ideal para estudar arritmogênese fibrilação. No entanto, o uso desse tipo de preparação, a localização do pacemaker líder (s) locais, condução intranodal e AP propagação pattern pode ser visualizado com precisão e investigada em detalhe. Além disso, átrios intactos parecem ser limitada por uma vista posterior, enquanto na preparação isolada, toda a superfície auricular está disponível para mapeamento óptico.

Além disso, a preparação isolada auricular permite o mapeamento estrutural-funcional do átrio, resolvendo o complexo microestrutura da rede trabecular, como visto na Figura 4. Para isso, alta espacial (100 um / pixel ou superior) e temporal (2000 fps ou superior) resoluções deve ser usado porque é crítica para particularizar ambos os padrões de activação atriais e SAN, que pode ser ainda mais sobrepostas com estruturas correspondentes. Embora a resolução temporal 1000 fps pode ser um mínimo para reconstruir activação auricular (que tem a duração de 10-20 ms), 2000 fps deve ser considerada como uma resolução mínima temporal, para a condução intranodal (que tem a duração de ~ 5 ms e, assim, poderia ser perdida a menor resoluções) e SAN actmedições ivation como visto na Figura 4. Isto pode permitir a localização de arritmogênicas "hot spots" (tais como focos ectópica ou reentrada ancorado) durante fibrilação atrial / flutter que poderiam surgir a partir da sobreposição de regiões de remodelação funcional significativa com os de fibrose elevada e ou redução acoplamento / célula a célula. 21,22 Além disso, a abordagem descrita poderia ser usado para estudar mecanismos eletrofisiológicos de anormalidades SAN, incluindo blocos SAN saída, pausas, arritmias taquicardia-bradicardia, síndrome do nódulo sinusal, etc.

Através da introdução de uma segunda (ou mesmo uma terceira) sonda fluorescente, será possível a realização de mapeamento óptico multi-paramétrico de actividade eléctrica em associação com o tratamento de cálcio, assim como outras alterações metabólicas e. Diferentes combinações de corantes pode ser utilizado para a tensão de cálcio-simultânea, raciométrica tensão / cálcio, ou imagiologia potencial mitocondrial.

Para mapeamento óptico de alta resolução temporal, devido ao período de recolha de fluoróforo mais curto, os sinais de uma proporção mais fraca sinal-para-ruído pode ser apreciado. Portanto, um processo de transformação de média ser aplicada aos sinais do ritmo cardíaco sinusal ou os sinais de estimulação série, conforme necessário. O dF / dt max é detectada para cada sinal em um longo período de gravação. são então alinhados Estes pontos no tempo de activação. Um período de ajuste da gravação centrada em todos esses momentos é cortado e média de todas ou selecionado Aps, conforme necessário.

Por utilização rigorosa da instrumentação e o procedimento de coloração adequada, parâmetros electrofisiológicos atriais, incluindo a velocidade de condução (comparar as Figuras 3C e 4D para mapas de activação S1), ritmo SAN espontânea e longevidade da preparação SAN (Figura 5) não são afectados, que permanece estável durante 3 ou mais horas. Importante, o monit contínuaORing de ECG devem ser realizados ao longo de todo o procedimento de coloração para assegurar a função eléctrica normal do coração. A aplicação de blebbistatin pode induzir uma diminuição da frequência cardíaca transitória, mas fora isso, não induz qualquer mudança na liderança de sites de marcapasso ou alterações na morfologia AP como também foi descrita anteriormente. 13

coloração da superfície da preparação atrial isolada é um passo crítico. Para isso, a aplicação rápida do corante diluída sobre a superfície do tecido deve ser evitada; em vez do corante deve cair sobre a preparação livremente, devido à densidade mais elevada de DMSO, que utilizado tanto para corante e diluições blebbistatin. A quantidade de carga total apropriada ea velocidade deve ser ajustada de modo a não induzir grandes mudanças de ritmo cardíaco. O processo de coloração pode ser aplicado várias vezes até que o sinal alcance um nível razoável. Deve notar-se que a aplicação directa da solução corante pode danificar o tecido e afectar a sua SAN pacemaking. Portanto, o corante deve ser diluído e a quantidade aplicada deve ser cuidadosamente controlada. Manchas na superfície apropriada não deve prejudicar a preparação ou SAN 23, que é avaliada pela freqüência cardíaca comparável e velocidade de condução.

protocolos de coloração alternativas também devem ser considerados. Estes podem incluir qualquer um de 10-15 min superfusão do / preparação fibrilação SAN com o corante sensível à tensão (RH-237 ou di-4-ANEPPS) a 35 ± 1 ° C 10,19 ou 30 minutos de incubação da preparação à temperatura ambiente (20-22 ° C) numa solução de Tyrode contendo o indicador de sensíveis à voltagem. 11

Para o mapeamento óptico do SAN a partir do coração de Langendorff todo-perfundido, instrumentação passos importantes incluem a inserção do pequeno tubo no VE e o fecho de VPC e VCI. O ex-impede um aumento de pressão de congestionamento solução durante experimentos de longa duração, bem como i subsequentedesenvolvimento de isquemia após a supressão das contracções ventriculares por blebbistatin e acidificação da solução de perfusão. Este último permite que o RA para manter algum nível de pressão intra-atrial preenchendo assim o átrio com uma solução de perfusão e achatamento da região intercaval a fim de descobrir toda a área de SAN para mapeamento óptico.

Finalmente, a coloração coronária, para além da superfície de carga de corante, pode melhorar significativamente a intensidade dos oaps SAN, que pode durar mais tempo quando comparada com a coloração da superfície pura utilizada em estudos anteriores. 8,9

Uso de blebbistatin tem várias vantagens em comparação com outros desacopladores electromecânicos incluindo baixa toxicidade, efeitos secundários menos pronunciada, e resistência à lavagem, quando ele é usado com precaução. Blebbistatin precipita quando é dissolvido a uma temperatura inferior a 37 ° C. 14 cristais blebbistatin pode interromper o fluxo vascular normal e, assim, induzir locaisisquemia e provocam eventos arrítmicos. 24 Além disso, em estudos que utilizam GFP ou outros corantes verde / amarelo, precipitação blebbistatin poderia ser confundido com células marcadas que devem ser tomadas em consideração. Prevenir blebbistatin precipitação é simples, isto é, tem de se dissolver em um blebbistatin pré-aquecido (37 ° C e media mais elevados) e vigorosamente agitada.

Para analisar APD, uma elevada concentração de blebbistatin (até 10 uM) poderia ser utilizado. 13,14,25. Da mesma forma, se qualquer substância que aumenta a contracção são usados, a aplicação adicional de blebbistatin é recomendado.

Como uma alternativa técnica para estudar a atividade elétrica do mouse SAN, array multi-eletrodo de baixa resolução (64 eletrodos separados em um quadrado de 8 x 8, configuração com uma distância inter-eletrodo de 0,55 mm) 26 e gravações de microeletrodos de vidro consecutivos feitos a curta distância entre impalements versus até 50 uM / pixel para óptica mapeamento) e não pode ser utilizado para análise da morfologia AP ou para geração de imagens multi-paramétrico (tais como tensão simultânea e mapeamento óptico de cálcio). Embora gravações microeletrodos de vidro fornecer mais informações sobre a morfologia AP, incluindo os valores absolutos da AP amplitude e potencial de repouso, ele também é limitado por uma resolução espacial baixa. Portanto, só pode ser usado para localização estável do pacemaker líder e não é aplicável para capturar alterações batimento a batimento no local levando pacemaker. Ao mesmo tempo, como demonstrado anteriormente 3,20 e destacadas no presente estudo, a senior co SANnsists de um sinal de duas fases whichincludes tanto SAN e componentes miocárdio AP atriais (Figura 4B). Assim, torna-se difícil extrair um sinal de SAN puro e estimar com precisão a morfologia AP no SAN. Para este efeito, microeléctrodos de vidro 17 ou a abordagem pinça de corrente em miócitos SAN isoladas devem ser considerados.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110, (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47, (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36, (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133, (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121, (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593, (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464, (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73, (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52, (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36, (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44, (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60, (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48, (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, (7), H1510-H1523 (2012).

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