Högupplöst Optisk Kartläggning av mus sinusknutan

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för optisk kartläggning av elektrisk aktivitet från musen högra förmaket och särskilt den sinusknutan, vid en hög rumslig och temporal upplösning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH Pub. Nr 80-23). Alla metoder och protokoll som används i dessa studier har godkänts av University of Wisconsin Djurvård och användning protokoll kommittén efter riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur som publicerats av NIH (publikation nr 85-23, reviderad 1996). Alla djur som används i denna studie fick human vård i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur.

1. Hjärta borttagning och Langendorff perfusion

  1. Före hjärt isolering, varm Tyrode-lösning till 37 ° C genom användning av ett vattenbad och en vattenmantel.
  2. Söva musen med 5% isofluran / 95% O2.
  3. Säkerställa en lämplig nivå av anestesi genom att kontrollera förlusten av smärta reflex.
  4. Utföra torakotomi. Öppna kistan med krökta 5,5 "Mayo sax och 5,5" Kelly BLODS förCEPS att göra en 1 cm snitt på framsidan av bröstkorgen.
    1. Snabbt extrahera hjärtat från bröstet (inom 30 sek). Använd 4 "böjd Iris pincett för att ta tag i lungvävnaden och klipp ut lunga, bräss och hjärtat tillsammans med hjärtsäcken med hjälp av 4.3" Iris sax. Inte ta hjärtat direkt.
    2. Tvätta den i syresatt (95% O2 / 5% CO2), konstant temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modifierad Tyrodes lösning. Använda följande lösning sammansättning (i mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl2, 1,3 CaCl2, 20,0 NaHCOg 3, och 11,1 glukos (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Medan badade i samma lösning, identifiera lunga, tymus och fettvävnad. Noggrant dissekera dem från hjärtat. Använd böjd 3 "Vannas-Tübingen sax och 4,3" # 5 pincett.
  6. Sedan identifiera aortan och cannulate det på en skräddarsydd 21 G kanyl. Använd två böjda 4,3 "# 5B kraftps.
  7. Efter kanylering, samtidigt BEGJUTA (genom kanylen vid en flödeshastighet av ~ 5 ml / min; detta bör justeras baserat på den aortatrycket, se nedan) och superfuse (i badet vid en flödeshastighet av ~ 50 ml / min) hjärtat med uppvärmda och filtrerade Tyrode-lösning under hela experimentet. Passera perfusion lösningen genom en in-line 11 | im nylonfilter för att förhindra igensättning av koronarcirkulation.
  8. Med användning av en tryckomvandlare (eller en tryckmätare) som är ansluten via en 3-vägs kran Luer-lås till perfusionsledningen, övervaka aortatrycket och bibehålla den mellan 60 och 80 mmHg. Justera perfusion hastighet vid behov för att hålla aortatrycket inom detta område.

2. Optisk Kartläggning av SAN från Langendorff-perfusion hela hjärtat

  1. Instrumentation
    1. Placera hjärtat horisontellt och nåla den ventrikulära apex till kiselbelagda botten av kammaren med hjälp av 0,1 mm stift diameter för att pRevent ström-inducerad rörelse under experimentet. 12
    2. Sätt en liten (0,012 "ID x 0,005") silikonröret i den vänstra kammaren (LV) via lungvenen, vänster förmak (LA) och mitralisklaffen (MV). Fixera röret med en silkessutur (4-0) till sounding bindväv.
    3. Placera hjärtat med sin bakre sidan uppåt (Figur 1A, vänstra panelen).
    4. Stift kanten av RA bihang (RAA) till kisel botten av kammaren med hjälp av 0,1 mm diameter minutien stift. Justera dess nivå, för att göra den bakre ytan av RA platt och tillåta den att vara belägen kamerans fokalplan. Detta kommer att göra det möjligt för optiska mätningar från den maximala ytarean hos förmaket.
    5. Snaran överlägsen (SVC) och sämre (IVC) hålvenen genom en silkessutur (4-0), sträcka och stift den andra änden av suturen till botten av en kiselbelagd kammare (se figur 3A). Se till att suturerna inte blockeraoptiska synfält.
    6. Placera skräddarsydd stimuleringselektrod på kanten av RAA. För att göra elektroderna, användning kiselbelagda 0,25 mm diameter silvertrådar, med 0,5 mm avståndet mellan elektroderna och saknar kisel för en längd av 1 mm vid stimulerings änden. Placera sedan två EKG 12 mm nål (29 gauge) monopolära elektroder nära basen av höger och vänster kammare. Placera marken EKG-elektrod nära spetsen av ventriklarna.
  2. färgning
    1. Eftersom både fluorescerande färgämnen och elektromekaniska frikopplare blebbistatin är ljuskänslig, utföra alla procedurer som beskrivs nedan i ett mörkt rum. Först framställa spänningskänsliga färgämnet RH-237 eller di-4-ANNEPS som en stamlösning, 1,25 mg / ml i dimetylsulfoxid (2,5 mM), alikvot den (30 pl vardera) och lagra alikvoter vid -20 ° C.
    2. Späd 5-10 | il av färgämne stamlösning i 1 ml värmt (37 ° C) Tyrode-lösning och sedan injicerar den in i krans perfusionsledningenöver en period av 5-7 min med användning av en in-line Luer injektionsporten.
    3. Förbered blebbistatin som en stamlösning (2 mg / ml i dimetylsulfoxid, 6,8 mM) i förväg och förvaras vid 4 ° C.
    4. Efter 20 min av stabilisering, tillsätt 0,5 ml uppvärmd (37 ° C) blebbistatin i perfusatet och späd 0,1 ml blebbistatin i 1 ml värmt (37 ° C) Tyrode-lösning. Sedan injicera in i krans perfusionsledningen under en period av 5-7 min med användning av en in-line Luer injektionsporten.

3. Optisk kartläggning av SAN från isolerade Atrial Förberedelse

  1. Instrumentation
    1. För den isolerade förmaks förberedelse, isolera och cannulate hjärtat som beskrivs ovan i steg 1,1-1,5 för hel-hjärta förberedelse.
    2. Dissekera ventriklarna bort från den främre sidan. Se figur 1A, högra panelen, skär # 1 för mer information.
    3. Öppna RA genom att skära genom tricuspid vaLVE (TV) längs TV-SVC-axeln. Se figur 1A, högra panelen, klippa # 2 för mer information.
    4. Skär den mediala delen av crista termin att öppna RAA. Se figur 1A, högra panelen, skär # 3.
    5. Öppna den främre förmaks fria väggen genom att utföra ett snitt från mittlinjen av den tidigare snittet # 3 till kanten av den högra nedre hörnet av RAA, platta och stift förmaks fria väggen till botten av en kiselbelagd kammare. Se den riktning som visas av den ihåliga pilen i figur 1 A, skär # 4. Bevara en kant av kammar vävnad för fastlåsning preparatet för att förhindra skador på förmaken.
    6. På liknande sätt, öppen LA genom att skära genom MV längs MV-övre hörnet av LA bihang (LAA).
    7. Att öppna LAA, skuren från mitten av den öppnade LAA, genom den främre förmaks fria väggen tills nära en mitten kanten av LAA.
    8. Öppna den främre förmaks fria väggen along samma riktning, sedan platta och stift den till botten av en Sylgard-belagda kammare.
    9. Delvis avlägsna den interatrial septal vävnad. Detta kommer att minska spridning av den optiska signalen från vävnad som inte är i fokus. Därför både LA och RA samt SAN och atrioventrikulär korsning (AVJ) är tillgängliga i denna beredning (Figur 1B).
    10. Lyft upp det slutliga preparatet med ca 0,5 mm från botten av den kiselbelagda kammaren för att tillåta superfusion från båda epikardiella och endokardiala ytorna.
    11. Superfuse beredningen med värmd (37 ° C) Tyrode-lösning vid en konstant hastighet av ~ 12 ml / min för en fokuserad flödes ligger nära SVC och ~ 30 ml / min för ett bad superfusion.
    12. Placera skräddarsydd pacing Ag / AgCl 2 elektrod (0,25 mm diameter) på kanten av den dissekerade RAA. Placera sedan två EKG 12 mm nål (29G) elektroder (monopolära) nära RAA och LAA, respektive. Placera marken EKG utvaldared nära AVJ.
  2. färgning
    1. Utför en direkt tillämpning av spänningskänsliga färgämne (RH-237 eller di-4-ANNEPS). För detta, späd 1-2 ul av färgämnesstamlösning i 1 mm av uppvärmd (37 ° C) Tyrode-lösning och långsamt frisätta den utspädda färgämnet på ytan av preparatet med hjälp av en 1 mm pipett.
    2. Alternativt utför förmaks färgning med den spänningskänsliga färgämnet genom en koronar perfusion av Langendorff-perfusion hjärtat liknande den som beskrivits ovan för hela-heart preparatet (steg 2.2.1-2.2.2).
      1. Efter koronar perfusion färgning, isolera den atriella preparat såsom beskrivits. Utför ytterligare yta färgning när det behövs för att nå en tillfredsställande fluorescensnivån. Snabb förmaks isolering inte bleka färgen och påverkar inte kvaliteten på färgningen.
    3. Immobilisera preparatet med den elektromekaniska kopplare, blebbistatin. Späd 3-5 pl blebbistatin stamlösning i det uppvärmda (37 ° C) Tyrode-lösning och långsamt frigöra den utspädda blebbistatin på ytan på produkten och omgivande lösningen. Eftersom blebbistatin har visat sig vara ljuskänslig, 13,14 undvika långa exponering för ljus under beredning och färgning.
    4. Utföra ytterligare blebbistatin ansökan så mycket som behövs för att undertrycka kontraktionen. Normalt upp till ytterligare 3 applikationer (3-5 pl per varje program) kan användas för att undertrycka rörelseartefakt tillräckligt för att exakt rekonstruera SAN och förmaksaktivering.
    5. Lägg till ytterligare 0,5 ml uppvärmd blebbistatin i perfusatet. Under denna procedur pausa superfusion under 30 sekunder för att tillåta färgämnet / blebbistatin att färga den atriella vävnaden.

4. Optisk Kartläggning Konfigurera

OBS:. En detaljerad beskrivning av det optiska kartläggningssystem tillhandahålls på annat håll 12

  1. Använda en kamera med en temrala upplösning på 2000 bilder / sek eller högre, och en serie av kondensorlinser för att nå rumslig upplösning på 100 | j, m / pixel eller högre. Detta krävs för att rekonstruera SAN aktivering och intranodal förökning.
  2. För att minska rörelseartefakt från vibrerande lösning, fixa ett litet täckglas på ytan av lösningen över hjärtat / isolerad atrial beredning.
  3. Använd excitationsljus (520 ± 45 nm våglängd) som tillhandahålls av en konstant ström, lågt brus halogenlampa. Rikta filtrerade ljusstråle mot preparatet med hjälp av en flexibel förgrenad ljusledare.
  4. Filtrera den emitterade fluorescensen av en lång-passfilter (> 715 nm). Samla, digitalisera och spara den förvärvade fluorescerande signal på en dator med hjälp av programvara som tillhandahålls av kameratillverkare.

5. Data Processing

OBS: Optisk kartdata samlas in och lagras som en serie av matriser av fluorescensintensitet vid olika tidpunkter. Varje pixel represeNTS ett mått på fluorescensintensiteten som samlats in från en viss plats på vävnadspreparat vid en viss tidpunkt. Bakgrundsfluorescens avlägsnas automatiskt per pixel för att möjliggöra bättre visualisering av fluorescensförändringar som produceras av membranspänningsförändringar och inverterade att motsvara aktionspotentialer (APS) mätt med mikroelektrodsystem. Närmare uppgifter om de olika stegen i att bearbeta optiska bilddata, inklusive bildsegmentering, spatial filtrering, temporal filtrering och baslinjedrift bort, finns i den fokuserade översyn. 15

  1. Manuellt eller med hjälp av särskild algoritm (exempelvis en tröskel eller kantavkänning) 15 för att bestämma vävnadsgränser, skapa en binär mask 1 (ingår pixlar) och 0 (uteslutna pixlar) och applicera masken till varje bildruta i sekvensen. Denna process skapar en binär bild som belyser områden av intresse för vidare bearbetning.
  2. För att förbättra signal-brusförhållande i optical data filtrera signalerna inom de valda områdena av intresse. För detta använder spatial (dvs. utjämning av angränsande fluorescerande pixlar som definieras av en önskad faltning bin eller kärna, till exempel 3 x 3, eller för bullriga data, 5 x 5) och / eller temporal filtrering (t.ex. Butterworth, Chebyshev typ 1, Chebyshev typ 2, elliptiska etc.) (Figur 2). Tänk på möjligheten att filtrerade-artefakter vid tolkning av data. För mer information, se översyn. 15
  3. Ta drift av baslinjen i optiska inspelningar vid behov (med hjälp av högpassfiltrering eller polynom montering på originalsignalen) och sedan normalisera varje pixel signal från 0 (minimum fluorescens) till en (maximal fluorescens).
  4. Välj ett tidsfönster som omfattar aktiveringstider för alla pixlar för en enda AP förökning. Tilldela varje pixel sin aktiveringstid som tidpunkten för maximal uppåtslaget derivat (DF / dt max, där F är fluorescence intensitet). Använda alla pixel aktiveringstider, rekonstruera isokronisk aktiveringskartan. Varje isochron kommer därmed att visa pixlarna aktiveras samtidigt.
  5. Att rekonstruera AP varaktighet (APD) utbredningskarta, för varje pixel beräkna varaktigheten mellan aktiveringstiden och tiden på en viss nivå av repolarisering (t ex vid 80% av repolarisering, APD 80). Använda alla pixel APD värden rekonstruera APD distributionen isokronisk karta. Varje isochron kommer därmed visa pixlar med samma APD.
  6. För att beräkna ledningshastighet för AP förökning, passar en yta av preparatet till aktiveringstidsdata som beräknats i 5,4. För detta använder polynom yta montering eller lokal kärna yta utjämning och sedan beräkna lokala ledningshastighetsvektorerna från lutning monterade ytan.
  7. Att skapa repolarisation kartan, tilldela varje pixel sin repolarisation tid, definierad som den maximala andra derivatan (d2 F / dt2) av den optiska signalen vid slutet av OAP, eller tiden för 90% repolarisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optisk Kartläggning av den intakta SAN från Langendorff-perfusion hjärta
Ett typiskt exempel på en RA aktiveringsnivåkarta rekonstrueras för spontan sinusrytm visas i figur 3 för en Langendorff-perfusion mus hjärta. Den tidiga aktiveringspunkten ligger inom intercaval regionen nära SVC där SAN är anatomiskt definierad. 3,16 Två RA aktiveringskonturkartor som förvärvats på 1,0 och 0,5 ms samplingshastigheten visas i figur 3B.

För att utvärdera SAN funktion, mätte vi SAN återhämtningstid (SANRT). 9 Efter RAA-stimulering under minst 1 min vid 10 till 12 Hz, var den elektriska stimuleringen stoppats och SANRT beräknades som tidsintervallet mellan den senast tagna AP: n och första spontana AP (fig 3C). Den SANRT korrigerades till hjärtfrekvensen (dvs. SANRT <sub> c) genom att beräkna skillnaden mellan SANRT och grunden cykellängd. Dessutom var platsen för den första post-stimulerings pacemaker identifieras. För detta exempel, den SANRTc var ca 49 msek.

Isolerade Atria och SAN aktivering
Aktiveringen av isolerad atrial beredningen under spontan sinusrytm visas i figur 4A. Den har sitt ursprung i anatomiskt definierade SAN nära SVC med en bred vågfront som spred anisotropt hela RA, med två företrädesrätt lednings riktningar nära de överlägsna och underlägsna SAN kanter och komplett block till septal riktningen (markerat med aktivering kartorna i figur 4A) . Aktiveringskartan förvärvades 1 ms samplingsfrekvens visar ett vidsträckt område av tidig aktivering. En ökning av samplingshastigheten till 0,5 ms och 0,3 ms tillåter oss att identifiera den exakta området av de ledande pacemaker plats. We observerade en typisk, beat-to-slå stabil monofokal position ledande pacemaker som motsvarade den primära pacemakern område som tidigare kännetecknas elektrofysiologiskt med glasmikroelektroder 17 och optisk kartläggning 8-11,18,19 samt genom immunmärkningen för connexin45 och HCN4 . 6,16

Som demonstrerats tidigare, SAN optiska aktionspotentialen består av en två-fas-signal, som innefattar två distinkta komponenter: den långsamt stigande SAN komponenten och den snabbt stigande uppåtslaget av den atriella myokardiet (förmaks komponent) (Figur 4B) 20 På grund av ljusspridning. processer, representerar OAP en medelvärdes elektrisk aktivitet som uppstår genom flera skikt av celler i vävnaden. Spridnings djup och bredd styrs av ett utrymme konstant som bestäms av ljusspridning och absorption egenskaper och kan nå upp till 1,5-2 mm. På grund av SAN conduInsatser dröjsmål SAN AP föregår alltid förmaksaktivitet under fysiologiska aktiveringen (Figur 4B). Att beräkna övergången från SAN till förmaket (dvs. SAN ledningstiden, SANCT), använde vi antingen tiden punkt där dubbelkomponent SAN signalen når 50% av den SAN komponenten amplitud eller den första toppen av den två-topp OAP första derivatan (dF / dt). Den SANCT från området tidigaste SAN aktivering till RA var ~ 5 ms, liknande det som mäts genom glasmikroelektroder.

SAN Återhämtningstid
På samma sätt var SANRT uppmätt i isolerad atrial preparatet (Figur 4D). För detta har förmaks preparat stimuleras vid 12 Hz genom en stimuleringselektrod som ligger i hörnet av RAA under minst en minut. 9 I detta exempel SANRTc var cirka 34 msek, vilket är jämförbart med det uppmätta trycket i Langendorff-perfunderad heart (Figur 3C). Dessutom var platsen för den första post-stimulerings pacemaker identifieras.

Hjärtrytm och fluorescerande signal stabilitet över tid
Om kirurgi och färglastningsförfaranden lämpligt följs, bör det inte finnas någon väsentlig förändring av de fysiologiska egenskaperna hos atrium. I figur 5, presenterar vi hjärtrytmen mättes före och efter den atriella isoleringsförfarandet och under 3 h perfusion. Inga väsentliga förändringar i hjärtfrekvens observerades antingen under atrium isolering eller efter färg lastning.

Även om arteriell färgning kan kräva en större mängd färgämne, visas stabiliteten av den fluorescerande signalen i SAN-området vävnad för att bli bättre genom att använda denna laddningsmetod. I Figur 6 presenterar vi signalintensitet avklingning över tiden för både koronar och ytfärgning. i t han SAN vävnad, IC 50 (som indikerar den period då signalintensiteten har avlidit till 50%) är ca 107 min efter koronar färgning, nästan dubbelt så lång som för ytfärgning.

Figur 1
Figur 1:. Isolering av mus Atrial preparatet (A) Kirurgiska ingrepp utförs för att isolera mus förmaks förberedelse. Den bakre vy av hjärtat visas. Alla nedskärningar visas med streckade röda linjer och märkt med siffror i den ordning som utförs. Se detaljer i text. (B) Den schematisk skiss av den isolerade mus förmaks preparat som visar de viktigaste anatomiska funktioner, inklusive det trabekulära strukturen av vänster och höger förmak bihang liksom placeringen av sinusknutan (SAN, märkt av en grå oval). Alla förkortningar förklaras i figuren.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Råvaror och bearbetade signaler inspelade på 0,3, 0,5 och 1 ms / ram Rå signaler samlas in från en enda pixel. Efter 3 x 3 binning signalerna filtreras genom att använda låg-pass Butterworth algoritm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Hela-heart Optisk Kartläggning av SAN (A) Vänster, foto av en typisk beredning som används för kartläggning av SAN från intakta hjärtat.. Den blå kvadrat visar den optiska områdetutsikt (6 mm x 6 mm). Höger, optiskt synfält fångas genom kameran och överlagras med anatomiska landmärken. SVC och IVC: överlägsen och nedre hålvenen; RAA: höger förmak; RV och LV: höger och vänster kammare; PV: lungvenerna. (B) Color kontur aktiveringskartor förvärvats med 1,0 msek (vänster) och 0,5 msek (höger) samplingshastighet. Till höger om varje karta, motsvarande färgtidsskalan indikerar förmaksaktiveringstiden (från den tidigaste aktiveringspunkten visas i blått, till den senaste aktiveringspunkten visas i rött) visas. Den tidigaste förmaksaktiveringsstället är märkt med en asterisk. (C) SAN återhämtningstid (SANRT) mätt i hela-heart förberedelse. Representativa exempel på förmaksaktiveringskonturkartor rekonstruerade för sista stimulerings stimulus (S1) och för första efter pacing atriellt slag (A1) visas för beats som valts ut på representativa OAP spår på toppen.Ställena i den tidigaste förmaksaktivering är märkta med en asterisk. BCL. Grundläggande cykellängd klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Högupplöst Optisk kartläggning av mus sinusknutan (SAN) från den endokardiala ytan av den isolerade Atria (A) Fotografi av en typisk mus SAN beredning (6 mm x 6 mm) och dess motsvarande aktiveringskonturkartor. erhålls vid 1,0 ms, 0,5 ms, och 0,3 ms samplingsfrekvens. SAN och en granne blocket zon visas med pilar. Färgtidsskalor indikerar förmaks aktiveringstid. Asterisken anger placeringen av den ledande pacemaker. RAA: höger förmak, SVC och INC: överlägsen och nedre hålvenen, RV: höger kammare, AVJ: atrio-ventricul ar korsning, CT: crista termin, IAS: inter-atrial septum. (B) Mekanism av de dubbla komponenter i OAP inspelning från musen SAN området. Se detaljer i text. . (C) ålderspensionärer som spelats in från mitten av SAN-området (blå), den tidigaste förmaks excitation plats (grön) och den senaste RA aktiveringsstället (röd) inlägg: övergång från nodal till förmaks vågform med en total ledningstiden lika med 5 msek. Jämför det med tidsfördröjning för total RA aktivering lika med 11 ms. (D) SAN återhämtningstid (SANRT) mätt i den isolerade förmaks beredningen. Representativa exempel på förmaksaktiveringskonturkartor rekonstruerade för sista stimulerings stimulus (S1) och för första efter pacing atriellt slag (A1) visas. En sida av den tidigaste förmaksaktivering är märkt med en asterisk. BCL - grundläggande cykellängd.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Heart Rhythm mätas före och efter den atriella isoleringsförfarandet (A) och under 3 h Perfusion (B). (A) Spontan slå puls visas före och efter förmaks isolering för två typer av förmaks färgning: ytan färgning efter isolering (ingen tidigare koronar färgning) och koronar färgning före förmaks isolering. (B) Spontan slå hjärtrytmstabiliteten på tre timmar perfusion visas för icke-färgade förmakspreparat och för fluorescerande färgämne och blebbistatin färgade förmakspreparat. Data visas som genomsnitt ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6:. Signalstyrka Decay över tiden intensiteten hos signalerna från de båda last metoder (koronar belastning markerade med rött, och ytbelastning anges i blått) mättes och ritas över tiden. Signalintensiteterna i genomsnitt från en 7 av 7-pixelområde på fyra typiska platser i höger förmak: trabecula (TRAB), sinusknutan (SAN), höger förmak bihang (RAA) och koronarsinus (CS). IC 50-värden beräknades sedan och märks i alla sönderfallskurvor. Signalstyrkan förfall från båda lastmetoder var likartad i TRAB och RAA. IC 50 av arteriell lastning i CS var omkring 20 min längre. I SAN, detta värde för arteriell laddas nästan tvåfaldigt större än ytbelastning, vilket tyder på att arteriell lastmetoder lett till bättre stabilitet av färgämnet i SAN tissue över tiden. Data visas som genomsnitt ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterade vi två typer av mus SAN preparat: 1) intakt SAN i Langendorff-perfusion hela hjärtat, och 2) SAN i den isolerade, öppnade förmaks förberedelse. Dessa två typer av preparat tjänar olika experimentsyfte. I Langendorff-perfusion hela hjärtat förberedelse är intakt förmaks struktur bevaras som gör det möjligt att studera komplexa förmaksarytmier såsom förmaksflimmer samt interaktioner mellan SAN och atrium under inåtgående takyarytmier. 6 Däremot i den isolerade förmaks preparatet , förmaket öppnas och plattas till en pseudo tvådimensionell struktur där de tredimensionella anatomiska buntar störs. Detta kan påverka anatomi inåtgående vägar vilket gör den isolerade förmaks preparatet inte idealisk för att studera förmaks arrhythmogenesis. Men att använda denna typ av preparat, platsen för den ledande pacemaker (s) platser, intranodal ledning, och AP förökning pattern exakt kan visualiseras och undersökas i detalj. Dessutom intakta förmaken verkar vara begränsad av en bakre vy medan den isolerade beredningen är tillgänglig för optisk kartläggning hela förmaks ytan.

Dessutom, isolerad atrial beredning möjliggör strukturell funktionella kartläggning av förmaket genom att lösa den komplexa mikrostrukturen hos det trabekulära nätverket såsom visas i fig 4. För detta, hög rumslig (100 | j, m / pixel eller högre) och tidsmässiga (2000 fps eller högre) upplösningar ska användas eftersom det är kritiskt att FRAMSTÄLLA i DETALJ både förmaks- och SAN aktiveringsmönster, som skulle kunna överlappas ytterligare med motsvarande strukturer. Medan 1000 fps tidsupplösning kan vara ett minimum för att rekonstruera förmaksaktivering (som varar i 10-20 ms), bör 2000 bps betraktas som ett minimum tidsupplösning för intranodal ledning (som varar i ~ 5 ms och därmed kunde missas vid lägre resolutioner) och SAN handlingivation mätningar som framgår av figur 4. Detta kan möjliggöra lokalisering av arytmogena "hot spots" (t.ex. ektopisk foci eller förankrade återinträde) under förmaksflimmer / fladder som skulle kunna uppstå från överlagring av regionerna i betydande funktionell ombyggnad med de förhöjda fibros och / eller minskad cell-till-cell koppling. 21,22 Dessutom kan det beskrivna tillvägagångssättet användas för att studera elektrofysiologiska mekanismer för SAN avvikelser, inklusive San exit block, pauser, takykardi-bradykardi arytmier, sick sinus syndrom osv.

Genom att införa en andra (eller till och med en tredje) fluorescerande sond, kommer det att vara möjligt att utföra multi-parametrisk optisk kartläggning av elektrisk aktivitet i association med kalciumhantering samt metaboliska och andra förändringar. Olika kombinationer av färgämnen kan användas för samtidig spänning-kalcium, ratiometrisk spänning / kalcium eller mitokondriell potential avbildning.

För hög tidsupplösning optisk kartläggning, på grund av den kortare fluoroforen uppsamlingsperioden, kan signalerna från en svagare signal-till-brus-förhållandet att uppskattas. Därför är ett förfarande medelvärdes bearbetning tillämpas på sinushjärtrytmen signaler eller stimuleringsseriesignaler som behövs. DF / dt max detekteras för varje signal i en lång period inspelning. Dessa aktiverings tidpunkter därefter i linje. En period av inspelning centrerad vid dessa tidpunkter inställning skärs och medelvärdet från hela eller valda Aps, efter behov.

Genom noggrann användning av instrumentering och korrekt färgningsproceduren är förmakselektrofysiologiska parametrar inklusive ledningshastighet (jämför figurerna 3C och 4D för S1 aktivering kartor), spontan SAN rytm och livslängden för SAN preparatet (Figur 5) påverkas inte, som förblir stabil under 3 eller fler timmar. Viktigare, den kontinuerliga monitoring av EKG bör utföras under hela färgningsproceduren för att säkerställa normal elektrisk funktion i hjärtat. Tillämpningen av blebbistatin kan framkalla en övergående puls sakta, men annat än att det inte framkallar några förändringar i ledande pacemaker platser eller förändringar i AP morfologi som också beskrivits tidigare. 13

Ytfärgning av den isolerade förmaks preparatet är ett kritiskt steg. För detta, bör snabb tillämpning av den utspädda färgämnet på ytan av vävnaden undvikas; istället färgämnet bör falla på förberedelserna fritt på grund av den högre täthet av DMSO, som används för både färg och blebbistatin utspädningar. Lämplig totala belastningen belopp och hastighet bör justeras så att inte framkalla dramatiska förändringar hjärtfrekvens. Färgningsproceduren kan tillämpas flera gånger tills signalen når en rimlig nivå. Det bör noteras att en direkt tillämpning av färgämne kan skada SAN vävnaden och påverka dess pacemÖRA. Därför bör färgen spädas och det sökta beloppet bör kontrolleras noga. Lämplig yta färgning bör inte skada beredning eller SAN 23 som utvärderas av jämförbar hjärtfrekvens och ledningshastighet.

Alternativa färgningsprotokoll bör också övervägas. Dessa kan bestå av antingen en 10-15 min superfusion av SAN / förmaks beredning med spänningskänsliga färgämne (RH-237 eller di-4-ANEPPS) vid 35 ± 1 ° C 10,19 eller 30 minuters inkubation av preparatet vid rumstemperatur (20-22 ° C) i en Tyrode-lösning innehållande den spänningskänsliga indikator. 11

För optisk kartläggning av SAN från Langendorff-perfusion hela hjärtat, viktiga instrument steg omfattar införandet av den lilla röret i LV och stängningen av SVC och IVC. Den förra förhindrar en tryckökning från lösning trängsel under långtidsförsök samt efterföljande ischemia utveckling efter undertryckandet av ventrikulära sammandragningar av blebbistatin och försurning av perfusion lösning. Det senare gör det möjligt för RA att hålla en viss nivå av intraatriell tryck därmed fylla atrium med perfusion lösning och tillplattning av intercaval regionen i syfte att avslöja hela SAN område för optisk kartläggning.

Slutligen, koronar färgning, förutom att ytan färgämne lastning, skulle avsevärt kunna förbättra intensiteten i SAN ålderspensionärer som kan varar längre i jämförelse med ren ytfärgning använts i tidigare studier. 8,9

Användning av blebbistatin har flera fördelar jämfört med andra elektromekaniska uncouplers inklusive låg toxicitet, mindre uttalade biverkningar, och wash-out motstånd när den används med försiktighet. Blebbistatin faller ut när det är upplöst vid temperaturer lägre än 37 ° C. 14 Blebbistatin kristaller kan avbryta den normala vaskulära flödet och därmed framkalla lokalischemi och framkalla arytmier händelser. 24 Dessutom, i studier som använder GFP eller andra gröna / gula färgämnen, kan blebbistatin nederbörd förväxlas med märkta celler som bör beaktas. Förhindra blebbistatin nederbörd är enkel, det vill säga, måste man lösa blebbistatin i en förvärmd (37 ° C och högre) och kraftfullt omrörda media.

För att analysera APD, en hög koncentration av blebbistatin (upp till 10 ^ M) skulle kunna användas. 13,14,25. På samma sätt, om någon drog som ökar kontraktion används, är ytterligare tillämpning av blebbistatin rekommenderas.

Som en alternativ teknik för att studera mus SAN elektrisk aktivitet, låg upplösning multi-elektroduppsättningen (64 separata elektroder i en fyrkantig 8 x 8, konfiguration med en inter-elektrodavståndet av 0,55 mm) 26 och på varandra följande glasmikroelektrod inspelningar som gjorts på kort avstånd mellan impalements vs upp till 50 | j, m / pixel för optisk kartläggning) och kan inte användas för att analysera AP morfologi eller flera parametrisk avbildning (såsom kalcium optisk kartläggning samtidig spänning och). Även glasmikroelektrod inspelningar ge mer information om AP morfologi, inklusive absoluta värden för AP amplitud och vilopotential, är det också begränsas av en låg rumslig upplösning. Därför kan det endast användas för stabil placering av de ledande pacemaker och är inte tillämplig för att fånga beat-to-beat förändringar i ledande pacemaker plats. Samtidigt, som tidigare visats 3,20 och lyfts fram i den aktuella studien, SAN OAP consists av en två-fas signal whichincludes både SAN och förmakshjärtmuskeln AP komponenter (Figur 4B). Det gör det således svårt att extrahera en ren SAN signal och exakt uppskatta AP morfologi i SAN. För detta ändamål bör glasmikroelektroder 17 eller strömtång strategi för isolerade SAN myocyter övervägas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110, (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47, (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36, (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133, (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121, (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593, (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464, (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73, (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52, (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36, (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44, (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60, (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48, (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, (7), H1510-H1523 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics