Høj opløsning Optisk Kortlægning af musen sinusknuden

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til optisk kortlægning af elektrisk aktivitet fra musen højre atrium og især den sinusknuden, på et højt rumlig og tidsmæssig opløsning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH Pub. Nr 80-23). Alle metoder og protokoller, der anvendes i disse undersøgelser er blevet godkendt af University of Wisconsin Animal Care og brug Protokol Udvalg efter retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr offentliggjort af NIH (publikation nr 85-23, revideret 1996). Alle dyr, der anvendes i denne undersøgelse fik human måde i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Heart Fjernelse og Langendorff Perfusion

  1. Forud for hjerte isolation, varm Tyrode-opløsning til 37 ° C ved anvendelse af et vandbad og en vandkappe.
  2. Bedøver musen med 5% isofluran / 95% O 2.
  3. Sikre en passende grad af anæstesi ved at kontrollere tabet af smerte refleks.
  4. Udfør torakotomi. Åbne kisten ved hjælp buede 5.5 "Mayo saks og 5,5" Kelly hæmostatisk forCEPS til at gøre en 1 cm skåret på forsiden af ​​brystkassen.
    1. Hurtigt udtrække hjertet fra brystet (inden for 30 sek). Brug 4 "buede Iris pincet til at få fat i lungevævet og skåret ud i lungerne, thymus og hjerte sammen med hjertesækken hjælp 4.3" Iris saks. Må ikke få fat hjertet direkte.
    2. Vask det i oxygeneret (95% O2 / 5% CO2), med konstant temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modificeret Tyrodes opløsning. Brug følgende opløsning sammensætning (i mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCI, 1,19 NaH 2 PO4, 1,05 MgCl2, 1,3 CaCl2, 20,0 NaHCO3 og 11,1 glucose (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Mens badet i den samme opløsning, identificere lungen, thymus og fedtvæv. dissekere dem forsigtigt fra hjertet. Brug buet 3 "Vannas-Tübingen saks og 4,3" # 5 pincet.
  6. Så identificere aorta og kanyle det på en skræddersyet 21 G kanyle. Bruge to krumme 4.3 "# 5B kraftps.
  7. Efter kanylering, samtidigt perfundere (gennem kanylen med en strømningshastighed på ~ 5 ml / min; dette bør justeres på basis af den aortiske tryk, se nedenfor) og superfuse (i badet ved en strømningshastighed på ~ 50 ml / min) hjertet med varmet og filtreret Tyrode-opløsning i hele eksperimentet. Passere perfusion opløsning gennem et in-line 11 um nylonfilter at forhindre tilstopning af koronar cirkulation.
  8. Ved hjælp af en tryktransducer (eller en trykmåler) forbundet via en 3-vejs stophane Luer lås til perfusionsledning, overvåge aortatryk og opretholde den mellem 60 og 80 mmHg. Juster perfusion hastighed, hvis det kræves for at holde aortatryk inden for dette område.

2. Optisk Kortlægning af SAN fra Langendorff-perfunderet Whole Heart

  1. Instrumentering
    1. Placer hjertet vandret og pin den ventrikulære apex til silicium-coatede kammerets bund ved anvendelse af 0,1 mm diameter pins til pRevent stream-induceret bevægelse under eksperimentet. 12
    2. Indsæt en lille (.012 "ID x 0,005") silicium rør ind i venstre ventrikel (LV) via lungevenen, de venstre forkamre (LA) og mitralklappen (MV). Fastgør røret ved en silke sutur (4-0) til at lyde bindevæv.
    3. Placer hjerte med sin bageste opad (figur 1A, venstre panel).
    4. Pin kanten af ​​RA vedhæng (RAA) til silicium bunden af ​​kammeret ved hjælp af 0,1 mm diameter minutien ben. Justere sin plan for at gøre den bageste overflade af RA flade og tillader den at være placeret kameraets brændplan. Dette vil gøre det muligt optiske målinger fra den maksimale overfladeareal af atrium.
    5. Løkke overlegen (SVC) og ringere (IVC) vena cava med en silkesutur (4-0), strække og pin den anden ende af suturen til bunden af en silicium-coatede kammer (se figur 3A). Sørg suturerne ikke blokereroptisk synsfelt.
    6. Placer specialfremstillet pacing elektrode på kanten af ​​RAA. For at gøre elektroder, brug silicium overtrukket 0,25 mm sølv diameter ledninger, med 0,5 mm mellem elektrodeafstand og blottet for silicium til en længde på 1 mm ved pacing ende. Derefter placere to EKG 12 mm kanyle (29 gauge) monopolære elektroder nær bunden af ​​højre og venstre ventrikler. Placer jorden EKG elektrode nær spidsen af ​​hjertekamrene.
  2. Farvning
    1. Da både fluorescerende farvestoffer og elektromekaniske afkobler Blebbistatin er lysfølsomme, udføre alle de procedurer, der er beskrevet nedenfor i et mørkt rum. Forbered først spændingsfølsomme farvestof RH-237 eller di-4-ANNEPS som en stamopløsning, 1,25 mg / ml i dimethylsulfoxid (2,5 mM), alikvot det (30 pi hver) og gemme alikvoter ved -20 ° C.
    2. Fortynd 5-10 pi af farvestof stamopløsning i 1 ml opvarmet (37 ° C) Tyrode opløsning og derpå injicere den ind i den koronare perfusionsledningover en periode på 5-7 min ved anvendelse af en in-line Luer injektionsport.
    3. Forbered Blebbistatin som en stamopløsning (2 mg / ml i dimethylsulfoxid, 6,8 mM) i forvejen og opbevare det ved 4 ° C.
    4. Efter 20 min på stabilisering, tilsættes 0,5 ml opvarmet (37 ° C) Blebbistatin i perfusatet og fortyndes 0,1 ml Blebbistatin i 1 ml opvarmet (37 ° C) Tyrode-opløsning. Derefter injiceres ind i koronar perfusion linje over en periode på 5-7 min ved anvendelse af en in-line Luer injektionsport.

3. Optisk kortlægning af SAN fra det isolerede Atrial Fremstilling

  1. Instrumentering
    1. For det isolerede atrial forberedelse, isolere og kanyle hjertet som beskrevet ovenfor i trin 1,1-1,5 for hel-hjerte præparat.
    2. Dissekere hjertekamrene væk fra den forreste side. Se figur 1A, højre panel, klippe # 1 for yderligere oplysninger.
    3. Åbn RA ved at skære gennem tricuspid valve (TV) langs TV-SVC-aksen. Se figur 1A, højre panel, klippe # 2 for detaljer.
    4. Skær den mediale del af det crista terminalis at åbne RAA. Se figur 1A, højre panel, skåret # 3.
    5. Åbn forreste atrial frie væg ved at udføre et snit fra midterlinjen af ​​tidligere snit # 3 til kanten af ​​den højre nederste hjørne af RAA, flade og pin den atriale frie væg til bunden af ​​en silicium-belagt kammer. Se retningen vist med den hule pil i figur 1A, skåret # 4. Bevare en rand af ventrikulær væv til pinning præparatet for at forhindre beskadigelse af atrierne.
    6. Tilsvarende åben LA ved at skære gennem MV langs MV-øverste hjørne af LA vedhænget (LAA).
    7. For at åbne LAA, skåret fra midten af ​​den åbnede LAA, gennem den forreste atrial fri væg indtil nær en midterste kant af LAA.
    8. Åbn forreste atrial frie væg along samme retning, derefter udjævner og fastgøre den til bunden af ​​en Sylgard-belagte kammer.
    9. Delvist fjerne interatriale septal væv. Dette vil reducere spredning af det optiske signal fra væv, der ikke er i fokus. Derfor er både LA og RA samt SAN og atrioventrikulær motorvej (AVJ) er tilgængelige i dette præparat (figur 1B).
    10. Løft endelige præparat ved omkring 0,5 mm fra bunden af ​​silicium-coatede kammer for at tillade superfusion fra både epikardielle og endokardiale overflade.
    11. Superfuse præparatet med warmed (37 ° C) Tyrode-opløsning ved en konstant hastighed på ~ 12 ml / min for en fokuseret strømning beliggende nær SVC og ~ 30 ml / min til et bad superfusionssystem.
    12. Placer skræddersyet pacing Ag / AgCl 2 elektrode (0,25 mm diameter) på kanten af det dissekerede RAA. Derefter placere to EKG 12 mm kanyle (29G) elektroder (monopolære) i nærheden af ​​RAA og LAA hhv. Placer jorden EKG udvalgtered nær AVJ.
  2. Farvning
    1. Udfør en direkte anvendelse af spændingsfølsomme farvestof (RH-237 eller di-4-ANNEPS). Til dette, fortyndes 1-2 pi af farvestoffet stamopløsning i 1 mm opvarmet (37 ° C) Tyrode opløsning og langsomt frigive den fortyndede farvestof på overfladen af ​​præparatet ved anvendelse af en 1 mm pipette.
    2. Alternativt udføre atrial farvning med spændingsfølsomme farvestof gennem en koronar perfusion af Langendorff-perfunderet hjerte svarende til den beskrevet ovenfor for hele-hjertet forberedelse (trin 2.2.1-2.2.2).
      1. Efter koronar perfusion farvning, isolere atrial præparatet som beskrevet. Udfør yderligere overflade farvning når det er nødvendigt for at nå et tilfredsstillende fluorescens niveau. Hurtig atrial isolation ikke blege farvestoffet og påvirker ikke kvaliteten af ​​farvning.
    3. Immobilisere forberedelse med elektromekaniske afkobler, Blebbistatin. Fortynd 3-5 pi blebbistatin stamopløsning i den opvarmede (37 ° C) Tyrode opløsning og langsomt frigive den fortyndede Blebbistatin på overfladen af ​​præparatet og omgivende opløsning. Da Blebbistatin har vist sig at være lysfølsomme, 13,14 undgå lange udsættelse for lys under forberedelse og farvning.
    4. Udføre yderligere Blebbistatin ansøgning så meget som nødvendigt for at undertrykke kontraktion. Normalt indtil 3 yderligere anvendelser (3-5 pi pr hver ansøgning) kan anvendes til at undertrykke bevægelsesartefakt tilstrækkeligt for nøjagtigt rekonstruere SAN og atrial aktivering.
    5. Tilføje yderligere 0,5 ml opvarmet Blebbistatin i perfusatet. Under denne procedure pause superfusion i 30 sekunder for at tillade farvestoffet / Blebbistatin at plette atrialt væv.

4. Optisk Mapping Set Up

BEMÆRK:. En detaljeret beskrivelse af det optiske kortlægning systemet leveres andre steder 12

  1. Brug et kamera med en temporal opløsning på 2.000 frames / sek eller højere, og en række kondensatormikrofoner linser til at nå rumlig opløsning på 100 um / pixel eller højere. Dette er nødvendigt for at rekonstruere SAN aktivering og intranodalt formering.
  2. For at reducere bevægelsesartefakter fra den vibrerende opløsning, fastsætte en lille dækglas på overfladen af ​​opløsningen over hjertet / isolerede atrial præparat.
  3. Brug excitation lys (520 ± 45 nm bølgelængde) tilvejebragt af en konstant strøm, støjsvage halogenlampe. Dirigere det filtrerede lysstråle på fremstilling ved hjælp af en fleksibel togrenet lysleder.
  4. Foretage udsendte fluorescens ved en lang-pass filter (> 715 nm). Indsamle, digitalisere og gemme den erhvervede fluorescerende signal på en computer med software leveret af producenten af ​​kameraet.

5. Databehandling

BEMÆRK: Optisk mapping data indsamles og lagres som en serie af matricer af fluorescensintensiteten ved forskellige tidspunkter. Hver pixel represents et mål for fluorescensintensitet indsamlet fra et bestemt sted på vævspræparatet på et specifikt tidspunkt. Baggrundsfluorescens fjernes automatisk per pixel for at muliggøre bedre visualisering af fluorescensændringer produceret af membranen spændingsændringer på hovedet til at svare til aktionspotentialer (APS) målt ved mikroelektrode systemer. Nærmere oplysninger om de forskellige trin i behandlingen af optiske billeddata, herunder billedsøgning segmentering, rumlig filtrering, tidsmæssig filtrering, og baseline afdrift fjernelse, findes i den fokuserede gennemgang. 15

  1. Manuelt eller ved hjælp af særlig algoritme (for eksempel en tærskling eller kant detektion) 15 for at bestemme væv grænser, skabe en binær maske af 1 (inkluderet pixels) og 0 (udelukkede pixel) og anvende masken til hver ramme i sekvensen. Denne proces skaber et binært billede, der fremhæver områder af interesse for yderligere behandling.
  2. For at forbedre signal-til-støj-forholdet for optgiske data, filtrere signaler inden for de udvalgte områder af interesse. Til dette brug rumlige (dvs. gennemsnit af tilstødende fluorescerende pixels som defineret af en ønsket foldning bin eller kerne, fx 3 x 3 eller, for støjende data, 5 x 5) og / eller tidsmæssig filtrering (f.eks Butterworth, Chebyshev typen 1, Chebyshev type 2, elliptisk osv) (figur 2). Husk muligheden for filtrerede-induceret artefakter ved fortolkning af data. For flere detaljer, se gennemgang. 15
  3. Fjern afdrift af baseline i optiske optagelser efter behov (ved hjælp af høj-pass filtrering eller polynomium montering på det oprindelige signal) og derefter normalisere hver pixel signal fra 0 (minimum fluorescens) til 1 (maksimal fluorescens).
  4. Vælg et tidsvindue, der omfatter de aktiveringstider for alle pixels for en enkelt AP formering. Tildel hver pixel dens aktivering tid som tiden for maksimal upstroke derivat (dF / dt max, hvor F er fluorescence intensitet). Ved hjælp af alle pixel aktiveringstider, rekonstruere isokronalt aktiveringskort. Hver isochron vil således vise pixlerne aktiverede samtidigt.
  5. For at rekonstruere AP varighed (APD) fordeling kort, for hver pixel beregne varigheden mellem aktivering tid og tiden på et bestemt niveau af repolarisering (for eksempel ved 80% af repolarisering, APD 80). Brug alle pixel APD-værdier, rekonstruere APD distributionen isokronalt kort. Hver isochron vil således vise pixels med samme APD.
  6. For at beregne ledningshastighed for AP formering, passer til en overflade af præparatet til aktivering time data beregnet i 5.4. Til dette skal du bruge polynomium overflade montering eller lokal kerne overflade udjævning og derefter beregne lokale ledningshastighed vektorer fra gradienten af ​​monteret overflade.
  7. For at oprette repolarisering kortet, tildele hver pixel sin repolarisering tid, defineres som den maksimale anden afledede (d 2 F / dt2) af det optiske signal ved enden af den operationelle eller tidspunktet for 90% repolarisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optisk Kortlægning af den intakte SAN fra Langendorff-perfunderet Heart
Et typisk eksempel på en RA aktivering konturkort rekonstrueres for spontan sinusrytme er vist i figur 3 for en Langendorff-perfunderet muse hjerte. Den tidlige aktivering punkt er beliggende inden for intercaval region nær SVC hvor SAN er anatomisk defineret. 3,16 To RA aktivering konturkort erhvervet på 1,0 og 0,5 ms sampling rate er vist i figur 3B.

For at evaluere SAN funktion, målte vi SAN restitutionstid (SANRT). 9 Efter RAA pacing i mindst 1 minut ved 10-12 Hz, blev den elektriske stimulation stoppet og SANRT blev beregnet som tidsintervallet mellem den sidste erobrede AP og første spontane AP (figur 3C). Den SANRT blev rettet til hjertefrekvensen (dvs. SANRT <sub> c) ved at beregne forskellen mellem SANRT og grundlaget cykluslængde. Derudover var placeringen af ​​den første post-pacing pacemaker identificeret. For dette eksempel SANRTc var omkring 49 msek.

Isoleret Atria og SAN Aktivering
Aktiveringen af den isolerede atriel forberedelse under spontan sinusrytme er vist i figur 4A. Det opstod i anatomisk definerede SAN nær SVC med en bred bølgefront, der spredes anisotropt hele RA, med to præferentielle ledningsforstyrrelser retninger nær den overlegne og underlegne SAN kanter og komplet blok til septal retning (markeret i aktivering kort i figur 4A) . Aktiveringskortet overtaget 1. msek samplingfrekvens viser et stort område af tidlig aktivering. En stigning i samplingfrekvens til 0,5 ms og 0,3 ms giver os mulighed for at identificere den præcise areal af de førende pacemaker placering. We observeret et typisk, beat-to-beat stabil monofokal position af den forreste pacemaker, som svarede til den primære pacemaker området tidligere karakteriserede elektrofysiologisk ved glasmikroelektroder 17 og optisk kortlægning 8-11,18,19 samt ved immunolabeling for connexin45 og HCN4 . 6,16

Som tidligere demonstreret, SAN optiske aktionspotentiale består af en to-faset signal, som omfatter to særskilte elementer: den langsomt stigende SAN komponent og den hastigt stigende opadgående slag af den atriale myokardie (atrial komponent) (figur 4B) 20 På grund af lysspredning. processer, OAP betegner et midlet elektrisk aktivitet som følge af flere lag af celler i vævet. Spredningen dybde og bredde reguleres af et rum konstant, som bestemmes ved lysspredning og absorptionsegenskaber og kan nå op til 1,5-2 mm. Grund af SAN conduktion forsinkelse, SAN AP forud altid atrial aktivitet under fysiologiske aktivering (figur 4B). For at beregne overgangen fra SAN til atrium (dvs. SAN overledningstiden, Sanct), anvendte vi enten tidspunkt, hvor dobbelt-komponent SAN signal når 50% af SAN komponent amplitude, eller den første top af to-peak OAP første afledede (dF / dt). Den Sanct fra området tidligste SAN aktivering til RA var ~ 5 msek, svarende til den, målt ved glasmikroelektroder.

SAN Recovery Time
Tilsvarende blev SANRT målt i den isolerede atrial forberedelse (figur 4D). Til dette blev der atrielle præparater paced ved 12 Hz gennem en pacing elektrode placeret på hjørnet af RAA i mindst 1 min. 9 I dette eksempel, den SANRTc var omkring 34 msek, hvilket er sammenligneligt med det, der måles i Langendorff-perfunderet hjerte (figur 3C). Derudover var placeringen af ​​den første post-pacing pacemaker identificeret.

Heart Rhythm og Fluorescent Signal Stabilitet over tid
Hvis lastning procedurerne for kirurgi og farvestof følges korrekt, bør der ikke være nogen betydelig ændring i de fysiologiske egenskaber atrium. I figur 5 præsenteres hjerterytmen målt før og efter den atriale isolation procedure og under 3 hr perfusion. Der blev ikke observeret signifikante ændringer i hjertefrekvensen enten under atrium isolation eller efter farvestof lastning.

Selv arteriel farvning kan kræve en større mængde farvestof, vises stabiliteten af ​​det fluorescerende signal i SAN området væv at være bedre ved at bruge denne loading metode. I figur 6 præsenterer vi signalintensiteten henfald over tid for både koronar og overfladefarvning. i t han SAN væv, IC50 (som angiver den periode, hvor signalet intensitet er afgået ved døden til 50%) er omkring 107 min efter koronar farvning, næsten dobbelt så lang som for overflade farvning.

figur 1
Figur 1:. Isolering af Mouse Atrial Forberedelse (A) Kirurgiske procedurer udføres for at isolere musen atrial forberedelse. Den bageste billede af hjertet er vist. Alle udskæringer er vist med stiplede røde linjer og mærket med tal i det udførte rækkefølge. Se detaljer i teksten. (B) Den skematiske oversigt over den isolerede mus atrial præparat viser de vigtigste anatomiske træk, herunder det trabekulære struktur venstre og højre atriale vedhæng samt placeringen af sinusknuden (SAN, mærket med en grå oval). Alle forkortelser er forklaret i figuren.tp_upload / 54.773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Rå og forarbejdede Signaler Optaget på 0,3, 0,5 og 1 ms / ramme Raw signaler er indsamlet fra en enkelt pixel. Efter 3 x 3 Binning, er de signaler filtreres ved hjælp af low-pass Butterworth algoritme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Hele hjerte Optisk Kortlægning af SAN (A) Venstre, foto af en typisk præparat, der anvendes til kortlægning af SAN fra den intakte hjerte.. Den blå firkant viser det optiske felt afvisning (6 mm med 6 mm). Right, optisk synsfelt fanget gennem kameraet og overlejret med anatomiske kendetegn. SVC og IVC: overlegne og inferior vena cava; RAA: højre atrium vedhæng; RV og LV: højre og venstre ventrikler; Solceller: pulmonale vener. (B) Farve kontur aktivering maps erhvervet med 1,0 msek (venstre) og 0,5 ms (til højre) samplingfrekvens. På højre side af hvert kort, den tilsvarende farve tidsskala angiver atrial aktivering tid (fra den tidligste aktivering punkt vist med blåt, til den sidste aktivering punkt vises med rødt) er vist. Den tidligste atrial aktiveringsstedet er mærket med en stjerne. (C) SAN restitutionstid (SANRT) målt i hel-hjerte forberedelse. Repræsentative eksempler på de atriale aktivering konturkort rekonstrueret for sidste pacing stimulus (S1) og for den første post-pacing atrial beat (A1) er vist for de valgte på det repræsentative OAP spor på toppen beats.Lokaliteter af de tidligste atrial aktivering er mærket med en stjerne. BCL:. Grundlæggende cyklus længde Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Høj opløsning Optisk kortlægning af Mouse sinusknuden (SAN) fra den endokardiale overflade af det isolerede Atria (A) Fotografi af en typisk muse SAN præparat (6 mm x 6 mm) og dens tilsvarende aktivering konturkort. fås ved henvendelse til 1,0 ms, 0,5 ms, og 0,3 ms sampling satser. SAN og en nabo blok zone er vist med pile. Farve tidsskalaer angiver atrial aktivering tid. Stjernen angiver placeringen af ​​de førende pacemakeren. RAA: højre atrium vedhæng, SVC og INC: overlegne og inferior vena cava, RV: højre hjertekammer, AVJ: atrio-ventricul ar krydset, CT: crista terminalis, IAS: inter-atrial septum. (B) Mekanisme af de dobbelte komponenter af OAP optagelse fra muse SAN området. Se detaljer i teksten. . (C) OAPs registreret fra centrum af SAN-området (blå), den tidligste atrial excitation websted (grøn) og senest RA aktiveringsstedet (rød) åbninger: overgangen fra nodal til atrial bølgeform med en samlet ledningstid lig med 5 msek. Sammenligne det med tidsforsinkelsen for total aktivering RA svarer til 11 ms. (D) SAN restitutionstid (SANRT) målt i den isolerede atrial forberedelse. Repræsentative eksempler på de atriale aktivering konturkort rekonstrueret for sidste pacing stimulus (S1) og for den første post-pacing atrial beat (A1) er vist. Et websted af de tidligste atrial aktivering er mærket med en stjerne. BCL - grundlæggende cyklus længde.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Heart Rhythm målt før og efter den Atriel Isolation Procedure (A) og i løbet af 3 timer Perfusion (B). (A) Spontan bankende puls vises før og efter atrial isolation for to typer af atrial farvning: overfladen farvning efter isolation (ingen forudgående koronar farvning) og koronar farvning før atrial isolation. (B) Spontan bankende hjerte rytme stabilitet over 3 timer perfusionen er vist for ikke-farvede atriale forberedelser og for fluorescerende farvestof og Blebbistatin farvede atrial præparater. Data er vist som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6:. Signal Intensitet Decay Over Time Intensiteten af signaler fra begge lastning metoder (koronar belastning angivet med rødt, og overfladen belastning angivet i blåt) blev målt og afbildet over tid. De signalintensiteter blev midlet fra en 7 med 7-pixel område på fire typiske steder i højre atrium: trabecula (Trab), sinus node (SAN), højre atrium vedhæng (RAA) og koronar sinus (CS). IC50-værdier blev derefter beregnet og mærket i alle henfaldskurver. Signalet intensitet forfald fra både lastning metoder var ens i TRAB og RAA. IC 50 af arteriel lastning i CS var omkring 20 min længere. I SAN, denne værdi for arteriel loading var næsten to gange større end overfladen lastning, hvilket indikerer, at arteriel fyldningsmetoder medførte bedre stabilitet af farvestoffet i det San Tissue over tid. Data er vist som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterede vi to typer af mus SAN præparater: 1) intakt SAN i Langendorff-perfunderet hele hjerte, og 2) SAN i den isolerede, åbnede atrial forberedelse. Disse to typer af forberedelse tjener forskellige forsøg. I Langendorff-perfunderet hele hjertet præparat, er det intakte atrial struktur bevares som gør det muligt at studere komplekse atrieflimmer såsom atrieflimren samt vekselvirkninger mellem SAN og atrium under reentrant takyarytmier. 6 I modsætning i den isolerede atrial forberedelse , atriet åbnes og udflades til en pseudo todimensional struktur, hvor de anatomiske bundter tredimensionale forstyrres. Dette kan påvirke anatomi indadgående veje, som gør det isolerede atrial forberedelse ikke ideel til at studere atrial arrhythmogenesis. Men ved hjælp af denne type præparat, placeringen af ​​de førende pacemaker (r) sites, intranodalt ledning, og AP formering pattern kan præcist visualiseres og undersøgt i detaljer. Endvidere synes at være begrænset af en posterior view intakte atrier mens i isolerede præparation, hele atrial overfladen er tilgængelig for optisk kortlægning.

Endvidere isoleret atrial præparat muliggør strukturel-funktionel kortlægning af atrium ved at løse den komplekse mikrostruktur det trabekulære netværk, som det ses i figur 4. For dette, høj rumlig (100 um / pixel eller højere) og tidsmæssige (2.000 bps eller højere) opløsninger bør anvendes, fordi det er kritisk at uddybe både atrielle og SAN aktiveringsmønstre, som kunne yderligere overlappede med tilsvarende strukturer. Mens 1000 fps tidsopløsning kan være et minimum for at rekonstruere atrial aktivering (som varer i 10 - 20 ms), bør 2000 fps betragtes som et minimum tidsmæssig opløsning for intranodalt ledning (der varer ~ 5 ms og dermed kunne blive savnet ved lavere resolutioner) og SAN handlingivation målinger som fremgår af figur 4. Dette kan tillade lokalisering af arrytmogene "hot spots" (såsom ektopisk foci eller forankret reentry) under atrieflimmer / flagren, som kunne komme ud af superposition af områder af væsentlig funktionel remodeling med de forhøjede fibrose og / eller nedsat celle-til-celle kobling. 21,22 Desuden kan den beskrevne metode bruges til at studere elektrofysiologiske mekanismer SAN abnormiteter, herunder San exit blokke, pauser, takykardi-bradykardi arytmier, syg sinus-syndrom osv.

Ved at indføre en anden (eller endda en tredjedel) fluorescerende probe, vil det være muligt at udføre flere parametrisk optisk kortlægning af elektrisk aktivitet i association med calcium håndtering samt metaboliske og andre ændringer. Forskellige kombinationer af farvestoffer kan anvendes til samtidig spænding-calcium, ratiometrisk spænding / calcium eller mitokondriepotentialet billeddannelse.

For høj tidsopløsning optisk kortlægning, på grund af den kortere fluorofor opsamlingsperioden, kan signalerne fra en svagere signal-til-støj-forhold blive værdsat. Derfor er proceduren en gennemsnitsberegning behandling påføres rytme signaler de sinus hjerte eller pacing serie signaler efter behov. DF / dt max registreres for hvert signal i en lang periode optagelse. Disse aktivering tidspunkter derefter justeret. En indstilling periode optagelse centreret ved disse tidspunkter er skåret og gennemsnittet fra alle eller udvalgte Aps, efter behov.

Ved nøjagtig anvendelse af instrumentering og korrekt farvning procedure, er atrielle elektrofysiologiske parametre, herunder ledningshastighed (sammenlign figur 3C og 4D til S1 aktivering maps), spontan SAN rytme og levetiden af SAN præparat (figur 5) ikke påvirket, som forbliver stabile i 3 eller flere timer. Vigtigt er det, den kontinuerlige monitoring af EKG bør udføres over hele farvningsprocedure at sikre normale elektriske funktion af hjertet. Anvendelsen af Blebbistatin kan fremkalde en forbigående puls langsommere, men bortset fra at, det ikke fremkalde nogen forskydninger i førende pacemaker sites eller ændringer i AP morfologi som også tidligere beskrevet. 13

Overfladefarvning af det isolerede atrial præparatet er et kritisk trin. Til dette bør hurtigt anvendelse af den fortyndede farvestof på overfladen af ​​vævet undgås; stedet farvestoffet bør lægges på fremstillingen frit grund af den højere tæthed af DMSO, som anvendes til både farvestoffet og Blebbistatin fortyndinger. Den passende samlede belastning beløb og hastighed skal tilpasses således, at fremprovokere dramatiske ændringer hjertefrekvens. Pletningsproceduren kunne anvendes flere gange, indtil signalet når et rimeligt niveau. Det skal bemærkes, at en direkte anvendelse af farvestof kan beskadige SAN væv og påvirke dens pacemaking. Derfor bør farvestoffet fortyndes og det ansøgte beløb skal styres omhyggeligt. Passende overflade farvning bør ikke skade præparatet eller SAN 23 som evalueres af sammenlignelig hjertefrekvens og ledningshastighed.

Alternative farvningsprotokoller bør også overvejes. Disse kan omfatte enten en 10-15 min superfusionssystem af SAN / atrial præparat med spændingsfølsomme farvestof (RH-237 eller di-4-ANEPPS) ved 35 ± 1 ° C 10,19 eller en 30 minutters inkubation af præparatet ved stuetemperatur (20-22 ° C) i en Tyrode opløsning indeholdende spændingsfølsomme indikator. 11

Til optisk kortlægning af SAN fra Langendorff-perfunderet hele hjertet, vigtige instrumentering skridt omfatter indsættelsen af ​​lille rør ind i LV og lukningen af ​​SVC og IVC. Den tidligere forhindrer en trykstigning fra løsning trafikbelastning i langvarige eksperimenter samt efterfølgende ischemia udvikling efter undertrykkelsen af ​​ventrikulære kontraktioner ved Blebbistatin og forsuring af perfusion løsning. Sidstnævnte gør det muligt for RA til at holde en vis grad af intra-atrial pres dermed fylde atrium med perfusion løsning og udfladning intercaval regionen for at afdække hele SAN område for optisk kortlægning.

Endelig koronar farvning, ud til overfladen farvestof lastning, i væsentlig grad kan forbedre intensiteten af SAN OAPs som kan vare længere, når sammenlignet med ren overflade farvning anvendt i tidligere undersøgelser. 8,9

Anvendelse af Blebbistatin har flere fordele i forhold til andre elektromekaniske uncouplers herunder lav toksicitet, mindre udtalte bivirkninger, og udvaskning modstand, når det anvendes med forsigtighed. Blebbistatin udfældes, når det er opløst ved temperaturer under 37 ° C. 14 Blebbistatin krystaller kan afbryde normal vaskulær flow og dermed fremkalde lokaliskæmi og provokere arytmiske begivenheder. 24 Desuden, i undersøgelser, der bruger GFP eller andre grønne / gule farvestoffer, kunne Blebbistatin nedbør forveksles med mærkede celler, som bør tages i betragtning. Forebyggelse Blebbistatin nedbør er ligetil, dvs man skal opløse Blebbistatin i en forvarmet (37 ° C og højere) og kraftigt omrørt medier.

At analysere APD, en høj koncentration af Blebbistatin (op til 10 uM) kan anvendes. 13,14,25. Tilsvarende, hvis et lægemiddel, som øger sammentrækning anvendes, anbefales yderligere anvendelse af Blebbistatin.

Som alternativ teknik til at studere mus SAN elektrisk aktivitet, lav opløsning multi-elektrode array (64 separate elektroder i en firkant 8 x 8, konfiguration med en inter-elektrode afstand på 0,55 mm) 26 og fortløbende glas mikroelektrode optagelser foretaget med kort afstand mellem impalements vs. op til 50 um / pixel til optisk kortlægning) og kan ikke bruges til at analysere AP morfologi eller for multi-parametrisk billeddannelse (såsom samtidig spænding og calcium optisk kortlægning). Selvom glas mikroelektrode optagelser give flere oplysninger om AP morfologi, herunder absolutte værdier for AP amplitude og hvilende potentiale, er det også begrænset af en lav rumlig opløsning. Derfor kan den kun anvendes til stabil placering af de førende pacemakeren og ikke finder anvendelse til at fange beat-to-beat ændringer i det førende pacemaker placering. Samtidig, som demonstreret tidligere 3,20 og fremhævet i den foreliggende undersøgelse, SAN OAP consists af en tofaset signal whichincludes både SAN og atrial myocardium AP komponenter (figur 4B). Det gør det således vanskeligt at udtrække en ren SAN signal og præcist estimere AP morfologi i SAN. Til dette formål bør overvejes glas mikroelektroder 17 eller den nuværende clamp tilgang på isolerede SAN myocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110, (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47, (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36, (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133, (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121, (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593, (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464, (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73, (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52, (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36, (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44, (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60, (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48, (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, (7), H1510-H1523 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics