Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Biology

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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

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Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

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Abstract

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung Nr. 80-23) durchgeführt. Alle Methoden und Protokolle in diesen Studien verwendet wurden von der University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Protokoll Ausschuss nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren veröffentlicht von NIH (Veröffentlichung Nr 85-23, überarbeitet 1996) genehmigt. Alle Tiere in dieser Studie verwendeten erhielt humane Pflege im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Herzentfernung und Langendorff-Perfusion

  1. Vor der Herzisolierung, warm Tyrode-Lösung auf 37 ° C durch ein Wasserbad und einen Wassermantel verwendet wird.
  2. Anesthetize die Maus mit 5% Isofluran / 95% O 2.
  3. Stellen Sie sicher, angemessene Höhe der Anästhesie durch den Verlust der Schmerzreflex zu überprüfen.
  4. Führen Sie Thorakotomie. Öffnen Sie die Brust durch die Verwendung gekrümmter 5,5 "Mayo Schere und 5,5" Kelly hämostatische fürCEPS ein 1 cm an der Vorderseite des Brustkorbs zu schneid machen.
    1. Schnell extrahieren das Herz aus der Brust (innerhalb von 30 Sekunden). Verwenden Sie 4 "gekrümmten Iris Zange das Lungengewebe zu greifen und die Lunge, Thymus und Herz ausgeschnitten zusammen mit dem Herzbeutel mit 4.3" Iris Schere. Nicht direkt das Herz zu greifen.
    2. Waschen Sie es in oxygeniertem (95% O 2/5% CO 2), konstanter Temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modifizierte Tyrode-Lösung. Verwenden Sie die folgende Lösungszusammensetzung (in mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3 und 11,1 Glukose (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Während in der gleichen Lösung getaucht, identifizieren die Lunge, Thymus und Fettgewebe. sezieren sie vorsichtig aus dem Herzen. Verwenden gebogen 3 "Vannas-Tübingen Schere und 4.3" # 5 Pinzette.
  6. Dann die Aorta identifizieren und kanülieren es auf einem maßgeschneiderten 21 G Kanüle. Verwenden Sie zwei gekrümmten 4.3 "# 5B Kraftps.
  7. gleichzeitig perfundieren nach Kanülierung (durch die Kanüle mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 5 ml / min, das auf der Grundlage der Aortendruck eingestellt werden sollte, siehe unten) und superfuse (in dem Bad bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 50 ml / min) das Herz mit erwärmtem und Tyrode-Lösung während des gesamten Experiments filtriert. Übergeben Sie die Perfusionslösung durch eine in-line 11 & mgr; m Nylonfilter zur Verstopfung der koronaren Zirkulation verhindern.
  8. Verwendung eines Druckwandlers (oder ein Manometer) verbunden ist über ein 3-Wege-Hahn Luer Lock mit dem Perfusionsleitung, überwachen den Aortendruck und halten es zwischen 60 und 80 mmHg. Passen Sie Ihre Geschwindigkeit Perfusion bei Bedarf die Aortendrucks in diesem Bereich zu halten.

2. Optische Kartierung des SAN aus dem Langendorff-perfundierten ganzes Herz

  1. Instrumentierung
    1. Legen Sie das Herz horizontal und stecken die Herzspitze an den silikonbeschichteten Boden der Kammer mit 0,1 mm Durchmesser Stifte prevent Strom-induzierte Bewegung während des Experiments. 12
    2. Legen Sie eine kleine (0,012 "ID x .005") Silikonschlauch in den linken Ventrikel (LV) über die Lungenvenen, die linken Vorhofs (LA) und die Mitralklappe (MV). Befestigen Sie das Rohr durch ein Seidenfaden (4-0) mit dem klingender Bindegewebe.
    3. Positionieren Sie das Herz mit seiner hinteren Seite nach oben (Abbildung 1A, linkes Feld).
    4. Pin der Kante des RA Anhängsel (RAA) mit dem Silizium Boden der Kammer unter Verwendung von 0,1 mm Durchmesser minutien Pins. Stellen Sie das Niveau, um die hintere Fläche des RA flach zu machen und ermöglichen es der Kamera Fokusebene befinden. Dies wird optischen Messungen aus der maximalen Fläche des Atriums ermöglichen.
    5. Noose superior (SVC) und inferior (IVC) Hohlvene durch einen Seidenfaden (4-0), strecken und stecken Sie das andere Ende des Fadens auf dem Boden einer silikonbeschichteten Kammer (siehe 3A). Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht blockieren dieoptische Sehfeld.
    6. Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulationselektrode, die auf dem Rand des RAA. Elektroden herzustellen, zu verwenden Silizium 0,25 mm Durchmesser Silberdrähte mit 0,5 mm Abstand zwischen den Elektroden und frei von Silizium für eine Länge von 1 mm an der Stimulations Ende beschichtet. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29-Gauge) monopolaren Elektroden in der Nähe der Basis des rechten und linken Ventrikels. Platzieren Sie den Boden EKG-Elektrode in der Nähe der Spitze der Ventrikel.
  2. Die Färbung
    1. Da beide Fluoreszenzfarbstoffe und elektromechanische Entkupplungsgleise blebbistatin lichtempfindlich sind, führen alle Verfahren unten in einem dunklen Raum beschrieben. Erste spannungsempfindlichen Farbstoff RH-237 oder Di-4-ANNEPS als Stammlösung, 1,25 mg / ml in Dimethylsulfoxid (2,5 mM) herzustellen, aliquoten es (30 & mgr; l pro Stück) und speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C.
    2. Verdünnen 5-10 ul Farbstoff-Stammlösung in 1 ml erwärmt (37 ° C) Tyrode-Lösung und dann spritzen sie in die Koronarperfusion Linieüber einen Zeitraum von 5-7 min ein Inline-Luer-Injektionsanschluss verwenden.
    3. Bereiten Sie blebbistatin als Stammlösung (2 mg / ml in Dimethylsulfoxid, 6,8 mM) im Voraus und lagern bei 4 ° C.
    4. Nach 20 min Stabilisierung, 0,5 ml erwärmter (37 ° C) blebbistatin im Perfusat und 0,1 ml blebbistatin in 1 ml erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt. Dann spritzen in die Koronarperfusion Linie über einen Zeitraum von 5-7 min unter Verwendung eines in-line Luer Injektionsöffnung.

3. Optische Kartierung des SAN aus dem isolierten Atrial Vorbereitung

  1. Instrumentierung
    1. Für die isolierten Vorhof Vorbereitung, zu isolieren und das Herz kanülieren wie in den Schritten 1.1-1.5 für Ganz Herz Vorbereitung oben beschrieben.
    2. Präparieren Sie die Ventrikel weg von der vorderen Seite. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 1 für weitere Einzelheiten.
    3. Öffnen Sie die RA durch Schneiden durch die tricuspid vaLVE (TV) entlang der TV-SVC-Achse. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 2 für weitere Einzelheiten.
    4. Schneiden Sie den medialen Teil des Crista terminalis die RAA zu öffnen. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 3.
    5. Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand durch einen Schnitt von der Mittellinie des vorigen Schnitt # 3 an den Rand des rechten unteren Ecke des RAA Durchführung, glätten und stecken die atriale freie Wand auf dem Boden eines silikonbeschichteten Kammer. Siehe die Richtung , die durch den hohlen Pfeil in 1A gezeigt ist , schneiden # 4. Bewahren Sie einen Rand von ventrikulären Gewebe für Pinning die Vorbereitung Schäden an den Vorhöfen zu verhindern.
    6. In ähnlicher Weise offen LA durch entlang der MV-oberen Ecke des LA Anhängsel (LAA) durch den MV zu schneiden.
    7. Zum Öffnen des LAA, aus der Mitte des geöffneten LAA geschnitten, durch die vordere atriale freie Wand, bis in der Nähe eines mittleren Rand des LAA.
    8. Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand aloin die gleiche Richtung ng, dann abflachen und an der Unterseite eines Sylgard beschichtet Kammer fixieren.
    9. entfernen teilweise die interatrial septalen Gewebe. Dadurch wird eine Streuung des optischen Signals von Gewebe zu reduzieren, die nicht im Fokus ist. Daher sind sowohl die LA und RA sowie die SAN und atrioventrikuläre Übergang (AVJ) zugänglich sind , in dieser Zubereitung (1B).
    10. Heben die Endzubereitung von etwa 0,5 mm von der Unterseite des Silizium-beschichteten Kammer auf, um zu ermöglichen Superfusions sowohl epikardialen und endokardialen Oberflächen.
    11. Superfuse die Herstellung mit erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung bei einer konstanten Rate von ~ 12 ml / min für eine gezielte Strömung in der Nähe der SVC und ~ 30 ml / min für ein Bad Superfusions.
    12. Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulations Ag / AgCl 2 Elektrode (0,25 mm Durchmesser) am Rande des seziert RAA. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29G) Elektroden (monopolare) in der Nähe des RAA und LAA sind. Legen Sie den Boden EKG wählenritt in der Nähe des AVJ.
  2. Die Färbung
    1. Durchführen einer direkten Anwendung der spannungsempfindlichen Farbstoff (RH-237 oder di-4-ANNEPS). Hierzu 1-2 ul der Farbstoffstammlösung in 1 mm erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt und lösen sich langsam die verdünnte Farbstoff auf der Oberfläche der Zubereitung durch eine 1 mm Pipette.
    2. Alternativ führen atrial Färbung mit dem spannungsempfindlichen Farbstoff durch eine koronare Perfusion des Langendorff perfundierten Herzen ähnlich der oben für die Vollherz Zubereitung beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.2).
      1. Nach der Koronarperfusion Färbung, isolieren die atriale Zubereitung wie beschrieben. Führen Färbung zusätzliche Oberfläche, wenn eine zufriedenstellende Fluoreszenzniveau zu erreichen benötigt. Schnellvorhof Isolation bleichen den Farbstoff nicht und wirkt sich nicht auf die Qualität der Färbung.
    3. Immobilisieren der Präparation mit dem elektromechanischen Entkoppler, blebbistatin. Verdünnen Sie 3-5 ul blebbistatin Stammlösung im wärmten (37 ° C) Tyrode-Lösung und lassen Sie langsam die verdünnte blebbistatin auf der Oberfläche der Zubereitung und der umgebenden Lösung. Da blebbistatin wurde Licht lichtempfindlich, 13,14 Vermeiden Sie lange Aussetzung während der Herstellung und Färbung gezeigt werden.
    4. Führen Sie zusätzliche blebbistatin Anwendung so viel wie nötig Kontraktion zu unterdrücken. Normalerweise können bis zu 3 zusätzliche Anwendungen (3-5 & mgr; l pro jede Anwendung) kann die Bewegungsartefakt ausreichend, um genau zu rekonstruieren, SAN und Vorhofaktivierung zu unterdrücken.
    5. Fügen Sie weitere 0,5 ml erwärmt blebbistatin im Perfusat. Während dieser Prozedur unterbrechen die Superfusions für 30 sec die Farbstoff / blebbistatin zu färben das Vorhofgewebe zu ermöglichen.

4. Optische Mapping einrichten

HINWEIS:. Eine detaillierte Beschreibung des optischen Abbildungssystems wird an anderer Stelle 12 vorgesehen ist

  1. Verwenden Sie eine Kamera mit einem Temporal Auflösung von 2000 Bildern / s oder höher, und eine Reihe von Kondensorlinsen räumlichen Auflösung von 100 & mgr; m / Pixel oder höher zu erreichen. Dies ist erforderlich, SAN-Aktivierung und Vermehrung intranodal zu rekonstruieren.
  2. Um Bewegungsartefakte aus der vibrierenden Lösung, fix ein kleines Deckglas auf der Oberfläche der Lösung über das Herz / isolierte atriale Vorbereitung reduzieren.
  3. Verwenden Sie Anregungslicht (520 ± 45 nm Wellenlänge), die durch einen Konstantstrom, Low-Noise-Halogenlampe. Richten Sie die gefilterten Lichtstrahl auf die Herstellung durch ein flexibles gegabelten Lichtleiter verwendet wird.
  4. Filtern Sie die emittierte Fluoreszenz durch ein Langpassfilter (> 715 nm). Sammeln, zu digitalisieren und das erworbene Fluoreszenzsignal auf einem Computer mit Software, die von der Kamera-Herstellers zu speichern.

5. Datenverarbeitung

Hinweis: Das optische Abbildungsdaten gesammelt und als eine Reihe von Matrizen von Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Zeitpunkten gespeichert. Jedes Pixel represengen ein Maß für die Fluoreszenzintensität von einer bestimmten Stelle auf der Gewebepräparation zu einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt. Die Hintergrundfluoreszenz wird automatisch pro Pixel entfernt zur besseren Visualisierung von Fluoreszenzänderungen durch Membranspannungsänderungen erzeugt zu ermöglichen und umgekehrt mit Aktionspotentiale (APs) von Mikroelektroden-Systeme gemessen entsprechen. Informationen über die verschiedenen Schritte bei der Verarbeitung von optischen Bilddaten, einschließlich Bildsegmentierung, räumliche Filterung, zeitliche Filterung und Basisliniendrift Entfernung, in der Schwerpunktprüfung zur Verfügung gestellt. 15

  1. Manuell oder durch den speziellen Algorithmus (beispielsweise eine Schwellwertbildung oder Kantendetektion) 15 Gewebegrenzen , um zu bestimmen, Erstellen einer binären Maske von 1 (eingeschlossen Pixel) und 0 (ausgeschlossen Pixel) und die Maske in der Sequenz zu jedem Rahmen. Dieser Prozess erzeugt ein binäres Bild, das Bereiche von Interesse für die weitere Verarbeitung hervorhebt.
  2. Zur Verbesserung der Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Optschen Daten, filtern die Signale innerhalb der ausgewählten Bereiche von Interesse. Hierzu verwenden räumliche (dh Mittelung von benachbarten fluoreszierenden Bildpunkte , wie durch einen gewünschten Faltungs bin oder kernel definiert, beispielsweise 3 x 3 oder, für verrauschte Daten, 5 x 5) und / oder zeitliche Filterung (beispielsweise Butterworth, Chebyshev - Typ 1, Chebyshev - Typ 2, Elliptic etc.) (Abbildung 2). Halten Sie die Möglichkeit, gefiltert induzierten Artefakte im Auge, wenn die Daten zu interpretieren. Weitere Informationen finden Sie Bewertung. 15
  3. Entfernen Drift der Basislinie in optischen Aufnahmen bei Bedarf (durch Hochpassfilterung oder Polynomanpassung zum ursprünglichen Signal verwendet wird) und dann normalisiert jedes Pixelsignal von 0 (minimaler Fluoreszenz) bis 1 (maximale Fluoreszenz).
  4. Wählen eines Zeitfensters, das die Aktivierungszeiten aller Pixel für einen einzelnen AP Ausbreitungs umfasst. Zuordnen jedes Pixel seine Aktivierungszeit als die Zeit der maximalen Aufwärtshub Derivat (dF / dt max, wobei F fluorescen istce Intensität). Unter Verwendung aller Pixelaktivierungszeiten, rekonstruieren die isochronen Aktivierungskarte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel zur gleichen Zeit aktiviert.
  5. Um die AP Dauer (APD) Verbreitungskarte rekonstruieren, für jedes Pixel die Dauer zwischen der Aktivierungszeit und der Zeit auf einer bestimmten Ebene der Repolarisation berechnen (beispielsweise bei 80% der Repolarisation, APD 80). Mit allen APD Pixelwerte, rekonstruieren die APD Verteilung isochronen Karte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel mit der gleichen APD.
  6. Um die Leitungsgeschwindigkeit für AP Ausbreitung berechnen, passen eine Oberfläche der Vorbereitung auf die Aktivierungszeit-Daten berechnet in 5.4. Verwenden Sie hierzu Polynomfläche Anprobe oder lokale Glättungskerns Oberfläche und dann Geschwindigkeit lokale Leitungsvektoren aus dem Gradienten der angepassten Oberfläche berechnen.
  7. Um die Repolarisation Karte zu erstellen, so dass jedes Pixel seine Repolarisation Zeit zuweisen, wie das Maximum der zweiten Ableitung definiert (d 2 F / dt2) des optischen Signals am Ende des OAP, oder die Zeit von 90% Repolarisation.

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Representative Results

Optische Kartierung des Intact SAN aus dem Langendorff-Herz perfundiert
Ein typisches Beispiel für eine RA Aktivierungskonturkarte für spontane Sinusrhythmus rekonstruiert wird in Figur 3 für eine Langendorff perfundierten Herzen der Maus gezeigt. Die frühe Aktivierungspunkt innerhalb des intercaval Region in der Nähe des SVC befindet , wo die SAN ist anatomisch definiert. 3,16 Zwei RA Aktivierung Umrißkarten bei 1,0 und 0,5 ms Abtastrate erfasst werden in 3B gezeigt.

Um SAN Funktion bewerten wir die SAN - Recovery - Zeit (SANRT) gemessen. 9 Nach dem RAA - Stimulation für mindestens 1 min bei 10 bis 12 Hz, wurde die elektrische Stimulation gestoppt und SANRT wurde als das Zeitintervall zwischen dem letzten erfassten AP berechnet und die erste spontane AP (3C). Die SANRT wurde auf die Herzfrequenz korrigiert (dh SANRT <sub> c) durch die Differenz zwischen dem SANRT Berechnung und der Basis - Zykluslänge. Außerdem wurde die Position des ersten Poststimulationsschrittmacher identifiziert. Für dieses Beispiel war die SANRTc etwa 49 msec.

Isolierte Atria und SAN - Aktivierung
Die Aktivierung der isolierten atrialen Zubereitung während der spontanen Sinusrhythmus ist in 4A gezeigt. Es entstand in der anatomisch definierten SAN in der Nähe der SVC mit einem breiten Wellenfront , die anisotrop in der gesamten RA, mit zwei Vorzugsleitungsrichtungen in der Nähe der oberen und unteren SAN Kanten und kompletten Block in die Septumsrichtung verteilt (in Aktivierungskarten in 4A markiert) . Die Aktivierungskarte auf 1 ms Abtastrate erworben zeigt einen weiten Bereich des frühen Aktivierung. Eine Erhöhung der Abtastrate auf 0,5 msec und 0,3 msec ermöglicht es uns, den genauen Bereich der Vorderschrittmacher Standort zu identifizieren. We beobachtet eine typische, stabile monofocal Position des führenden Schrittmacher Beat-to-Beat , die durch Glasmikroelektroden aus elektrophysiologisch vorher mit dem primären Schrittmacherbereich entsprach 17 und der optischen Abbildungs 8-11,18,19 sowie durch Immunmarkierung für connexin45 und HCN4 . 6,16

Wie zuvor gezeigt, besteht das SAN optische Aktionspotential eines Zweiphasensignals , das zwei getrennte Komponenten: den langsam ansteigenden SAN - Komponente und der schnell ansteigenden Aufwärtshub des atrialen Myokards (atrial Komponente) (4B) 20 Aufgrund der Lichtstreuung. Prozesse, OAP stellt eine gemittelte elektrische Aktivität von mehreren Schichten von Zellen innerhalb des Gewebes entstehen. Die Streu Tiefe und Breite wird durch eine Raumkonstante bestimmt, die durch Lichtstreuung und Absorptionseigenschaften bestimmt und kann auf 1,5-2 mm reichen. Aufgrund der SAN conduction Verzögerung geht die SAN AP immer atriale Aktivität während der physiologischen Aktivierung (4B). Um den Übergang von dem SAN zum Atrium berechnen (dh SAN Leitungszeit, SANCT) verwendeten wir entweder den Zeitpunkt , zu dem das Zweikomponenten - SAN - Signal 50% des SAN Komponentenamplitude erreicht hat , oder den ersten Peak der zwei-peak OAP ersten Ableitung (dF / dt). Die SANCT aus dem Bereich der frühesten SAN Aktivierung der RA betrug ~ 5 msec, ähnlich der von Glasmikroelektroden gemessen.

SAN - Erholzeit
In ähnlicher Weise wurde die SANRT in der isolierten Präparation atrial (4D) gemessen. Hierzu wurden atrial Präparationen bei 12 Hz durch eine Schrittmacherelektrode an der Ecke des RAA für mindestens 1 min. 9 In diesem Beispiel befindet geschrittenen war die SANRTc etwa 34 msec, die mit dem in der Langendorff perfundierten gemessen vergleichbar Herz (3C). Außerdem wurde die Position des ersten Poststimulationsschrittmacher identifiziert.

Herz - Rhythmus und Fluoreszenz - Signal Stabilität über die Zeit
Wenn die Operation und Farbstoffbeladung Verfahren in geeigneter Weise befolgt werden, sollte es keine wesentliche Änderung der physiologischen Eigenschaften des Atriums sein. In Figur 5 stellen wir den Herzrhythmus , gemessen vor und nach dem atrialen Isolierungsverfahren und während der 3 Stunden Perfusion. Keine wesentlichen Änderungen der Herzfrequenz wurden entweder während Atrium Isolierung oder nach Farbstoffbeladung beobachtet.

Obwohl arterielle Färbung eine grßere Menge an Farbstoff erfordern kann, wird die Stabilität des Fluoreszenzsignals in dem SAN Bereich Gewebe besser zu sein, indem dieses Ladeverfahren. In 6 stellen wir Signalintensitätsabfall im Laufe der Zeit sowohl für koronare und Oberflächenfärbung. in t er SAN Gewebe, IC 50 (die die Periode anzeigt , wenn die Signalintensität auf 50% gestorben) beträgt etwa 107 min nach koronarer Färbung, fast doppelt so lang wie die der Oberflächenfärbung.

Abbildung 1
Abb . 1: Die Isolierung der Maus Atrial Vorbereitung (A) Chirurgische Eingriffe durchgeführt Maus Vorhof Vorbereitung zu isolieren. Die hintere Ansicht des Herzens gezeigt. Alle Schnitte werden durch die gepunkteten roten Linien und gekennzeichnet durch Zahlen in der Reihenfolge durchgeführt gezeigt. Details finden Sie in Text. (B) Die schematische Darstellung der isolierten Maus - atrial Vorbereitung die wichtigsten anatomischen Merkmale zeigt, einschließlich der Trabekelstruktur der linken und rechten Vorhof Anhängsel sowie die Lage des sinuatrialer Knoten (SAN, mit einem grauen Oval beschriftet). Alle Abkürzungen werden in der Figur erläutert.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Roh und verarbeitet Signale aufgezeichnet bei 0,3, 0,5 und 1 ms / Frame - Raw - Signale werden von einem einzigen Pixel gesammelt. Nach 3 x 3 Binning werden die Signale gefiltert durch den Tiefpassbutter Algorithmus. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Whole-heart Optical Mapping des SAN (A) links, Foto einer typischen Präparation für die Abbildung des SAN von der intakten Herzen verwendet.. Das blaue Quadrat zeigt das optische Bereich derAnsicht (6 mm x 6 mm). Rechts, optische Sichtfeld durch die Kamera eingefangen und mit anatomischen Orientierungspunkten überlagert. SVC und IVC: obere und untere Hohlvene; RAA: rechtes Herzohr; RV und LV: rechten und linken Ventrikel; PVs: Lungenvenen. (B) Farbe Kontur Aktivierungskarten mit 1,0 ms erworben (links) und 0,5 ms (rechts) Abtastrate. Auf der rechten Seite jeder Karte, die entsprechende Farbe Zeitskala atriale Aktivierungszeit anzeigt (von der frühesten Aktivierungspunkt in blau dargestellt, auf die neueste Punkt Aktivierung in rot dargestellt) gezeigt. Die früheste atriale Aktivierungsstelle ist mit einem Stern markiert. (C) SAN Erholzeit (SANRT) , gemessen in der Ganz Herz Vorbereitung. Repräsentative Beispiele für die atriale Aktivierung Konturkarten für den letzten Stimulus rekonstruiert (S1) und zum ersten Post-Pacing Vorhofschlag (A1) für die Schläge auf dem repräsentativen OAP Spur oben ausgewählt gezeigt.Seiten der frühesten atriale Aktivierung sind mit einem Stern markiert. BCL:. Grundzykluslänge Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten (SAN) von der endokardialen Oberfläche des isolierten Atria (A) Fotografie einer typischen Maus SAN - Präparat (6 mm x 6 mm) und ihre entsprechenden Aktivierungs Umrißkarten. bei 1,0 ms, 0,5 ms und 0,3 ms Abtastraten erhalten. SAN und ein Nachbarblock Zone sind durch Pfeile dargestellt. Farbzeitskalen zeigen atriale Aktivierungszeit. Das Sternchen zeigt die Position des führenden Schrittmacher. RAA: rechtes Herzohr, SVC und INC: obere und untere Hohlvene, RV: rechte Ventrikel, AVJ: Atrio-ventricul ar Kreuzung, CT: Crista terminalis, IAS: inter-atriale Septum. (B) Mechanismus der Doppel Komponenten des OAP Aufnahme von der Maus SAN-Bereich. Details finden Sie in Text. . (C) OAPs vom Zentrum des SAN - Bereich aufgezeichnet (blau), die früheste atriale Erregungsstelle (grün) und die neuesten RA Aktivierungsstelle (rot) Einschübe: Übergang von Knoten zu Vorhofwellenform mit einer Gesamtleitungszeit gleich 5 msec. Vergleichen Sie es mit der Zeitverzögerung für die gesamte RA Aktivierung gleich 11 ms. (D) SAN Erholzeit (SANRT) in der isolierten Vorhof Vorbereitung gemessen. Repräsentative Beispiele für die atriale Aktivierung Konturkarten für den letzten Stimulus rekonstruiert (S1) und zum ersten Post-Pacing Vorhofschlag (A1) gezeigt. Ein Ort der frühesten atriale Aktivierung wird durch ein Sternchen gekennzeichnet. BCL - Grundzykluslänge.k "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Herz - Rhythmus vor und nach dem Atrial Isolierungsverfahren (A) und während der 3 Stunden Perfusion (B) gemessen. (A) spontane Schlagherzfrequenz angezeigt wird vor und nach der Vorhof Isolierung für zwei Arten von Vorhof Färbung: Oberflächenfärbung nach der Isolierung (keine vorherige Koronar - Färbung) und koronare Färbung vor Vorhof Isolation. (B) spontane Schlagherzrhythmusstabilität auf 3 Stunden Perfusion ist für nicht-gefärbten Vorhofpräparate gezeigt und für Fluoreszenzfarbstoff und blebbistatin gefärbten Vorhofpräparate. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6:. Signalintensität Decay im Laufe der Zeit sind die Intensitäten der Signale von beiden Lademethoden (koronare Belastung in rot angezeigt, und Oberflächenbelastung angegeben in blau) wurden gemessen und aufgetragen über die Zeit. Trabekel (TRAB), Sinusknoten (SAN), rechten Vorhof Anhängsel (RAA) und Koronarsinus (CS): Die Signalintensitäten wurden bei vier typische Stellen in den rechten Vorhof von einer 7 um 7-Pixelbereich gemittelt. IC 50 -Werte wurden dann berechnet und in allen Abklingkurven gekennzeichnet. Die Signalintensität Zerfall von beiden Lademethoden war ähnlich in TRAK und RAA. Die IC 50 der arteriellen Beladung in CS war etwa 20 min länger. Im SAN lag dieser Wert für die arterielle Laden fast zweifach größer im Vergleich zu Flächenbelastung, was zu einer besseren Stabilität des Farbstoffs in den SAN tiss ergab, dass arterielle Lademethoden zeigtue über die Zeit. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Hier präsentierten wir zwei Arten von Maus SAN Vorbereitungen: 1) intakte SAN in der Langendorff-perfundierten ganzen Herzen, und 2) SAN in der isolierten, geöffnet Vorhof Vorbereitung. Diese beiden Arten der Vorbereitung dienen unterschiedlichen experimentellen Zwecken. In der Langendorff perfundierten ganze Herz Herstellung wird das intakte atrial Struktur erhalten , welche es ermöglicht , komplexe atrialen Arrhythmien wie Vorhofflimmern sowie Wechselwirkungen zwischen dem SAN und Atrium während einspringenden Tachyarrhythmien zu studieren. 6 im Gegensatz dazu in dem isolierten Vorhof - Zubereitung wird das Atrium in eine pseudo zweidimensionalen Struktur, wo die dreidimensionalen anatomischen Bündel gestört werden geöffnet und abgeflacht. Dies kann die Anatomie von Reentry Wege beeinflussen, die das isolierte atriale Vorbereitung nicht ideal für das Studium Vorhof Arrhythmogenese macht. Jedoch mit dieser Art der Zubereitung, die Position des führenden Schrittmacher (s) -Stellen, intranodal Leitung und AP Ausbreitungs pattern genau im Detail visualisiert und untersucht werden. Außerdem scheinen intakte Atrien durch eine posteriore Ansicht beschränkt werden, während in der isolierten Präparation, die gesamte atriale Oberfläche für optische Abbildungs ​​verfügbar ist.

Außerdem isoliert Vorhof Vorbereitung ermöglicht Struktur-Funktions - Mapping des Atriums durch die komplexe Mikrostruktur des trabekulären Netzwerk zu lösen , wie in Abbildung 4 zu sehen. Dazu hohe räumliche (100 & mgr; m / Pixel oder höher) und zeitliche (2000 fps oder höher) Auflösungen sollte verwendet werden, da es wichtig ist, sowohl Vorhof- und SAN Aktivierungsmuster zu spezifizieren, die weiter mit entsprechenden Strukturen überlappt werden konnten. Während 1000 fps zeitliche Auflösung ein Minimum sein könnte Vorhofaktivierung (die für 10 dauert - 20 ms) zu rekonstruieren, 2000 fps sollten als Mindest zeitliche Auflösung für Intranodal Leitung in Betracht gezogen werden (was für ~ 5 ms dauert und somit zu niedrigeren verfehlt werden könnte Auflösungen) und SAN-Aktivation Messungen wie aus Figur 4 ersichtlich ist . Dadurch kann die Lokalisierung von arrhythmogenen "hot spots" (wie ektopischer Herde oder verankertes Reentry) während Vorhofflimmern / Flattern ermöglichen , die aus der Überlagerung von Bereichen von signifikanten funktionellen Remodeling mit denen der erhöhten fibrosis entstehen könnten und / oder reduzierte Zell-zu-Zell - Kopplung. 21,22 Darüber hinaus könnte der beschriebene Ansatz verwendet werden elektrophysiologische Mechanismen von SAN - Anomalien zu untersuchen, einschließlich SAN Ausgang blockiert, Pausen, Tachykardie-Bradykardie Arrhythmien, sick - Sinus - Syndrom , etc.

Durch die Einführung einer zweiten (oder sogar eine dritte) Fluoreszenzsonde, wird es möglich sein, multiparametrisches optische Abbildung der elektrischen Aktivität in Verbindung mit Calcium-Handling sowie metabolische und andere Veränderungen durchzuführen. Verschiedene Kombinationen von Farbstoffen kann zur gleichzeitigen spannungs Calcium, ratiometrisch Spannung / Calcium oder mitochondriale Potential Bildgebung verwendet werden.

Für hohe zeitliche Auflösung optische Abbildungs, aufgrund der kürzeren Fluorophor Sammelperiode, die Signale von einem schwächeren Signal-zu-Rausch-Verhältnis kann geschätzt. Daher wird ein Mittelungsverarbeitungsprozedur an die Sinusherzrhythmussignale angelegt oder die Stimulationsseriensignale nach Bedarf. Die dF / dt max wird für jedes Signal in einen langen Zeitraum Aufzeichnung festgestellt. Diese Aktivierungszeitpunkte werden dann ausgerichtet sind. Eine Einstellung Zeitraum der Aufzeichnung zu diesen Zeitpunkten zentriert wird geschnitten und gemittelt aus allen oder ausgewählten Aps, je nach Bedarf.

Durch die genaue Verwendung der Instrumentierung und der richtigen Färbeverfahren werden Vorhofelektro Parameter einschließlich Leitungsgeschwindigkeit (vergleiche 3C und 4D für S1 Aktivierungskarten), spontan SAN Rhythmus und Langlebigkeit des SAN - Vorbereitung (Abbildung 5) nicht betroffen, die stabil bleiben 3 oder mehr Stunden. Wichtig ist, dass die kontinuierliche monitoring von ECG sollte über die gesamte Färbeverfahren durchgeführt werden, normale elektrische Funktion des Herzens zu gewährleisten. Die Anwendung von blebbistatin kann eine vorübergehende Verlangsamung der Herzfrequenz induzieren, aber anders als das, es induziert keine Verschiebungen in führenden Schrittmacher Websites oder Änderungen der AP Morphologie als auch zuvor beschrieben wurde. 13

Oberflächenfärbung des isolierten atrial Zubereitung ist ein kritischer Schritt. Dazu sollte schnelle Anwendung des verdünnten Farbstoff auf die Oberfläche des Gewebes vermieden werden; stattdessen sollte der Farbstoff auf die Zubereitung frei fallen aufgrund der höheren Dichte von DMSO, die sowohl Farbstoff und blebbistatin Verdünnungen verwendet. Der entsprechende Gesamtbeladungsmenge und Geschwindigkeit sollte so eingestellt werden, um keine dramatischen Veränderungen der Herzfrequenz induzieren. Das Färbeverfahren kann mehrmals verwendet werden, bis das Signal ein angemessenes Niveau erreicht. Es sollte beachtet werden, dass die direkte Anwendung der Farbstoff die SAN Gewebe beschädigen könnte und seine pacem auswirkenaking. Daher sollte der Farbstoff verdünnt werden und die aufgebrachte Menge sorgfältig kontrolliert werden sollte. Geeignete Oberflächenfärbung sollte die Vorbereitung oder SAN nicht beschädigen 23 , die durch vergleichbare Herzfrequenz und Leitungsgeschwindigkeit ausgewertet wird.

Alternative Färbeprotokollen sollte auch in Betracht gezogen. Diese können entweder eine 10-15 min Superfusions des SAN / atrial Zubereitung mit der spannungsempfindlichen Farbstoff (RH-237 oder Di-4-ANEPPS) bei 35 ± 1 ° C 10,19 oder 30 min Inkubation des Präparates bei Raumtemperatur (20-22 ° C) in einer Tyrode - Lösung der spannungsempfindlichen Indikator enthält. 11

Für die optische Abbildung des SAN aus dem Langendorff-perfundierten ganzen Herzen, umfassen wichtige Instrumentierung Schritte, um das Einführen des Röhrchens in den LV und die Schließung von SVC und IVC. Erstere verhindert einen Druckanstieg von Lösung Staus während der Langzeitversuche sowie nachfolgende ischemia Entwicklung nach der Unterdrückung von ventrikulären Kontraktionen durch blebbistatin und Ansäuerung der Perfusionslösung. Letzteres ermöglicht die RA ein gewisses Maß an intra-atrialen Druck zu halten, damit das Atrium mit Perfusionslösung Füllen und Abflachen des intercaval Region, um die gesamte SAN Bereich für die optische Abbildungs ​​aufzudecken.

Schließlich koronare Färbung, zusätzlich Farbstoffbeladung zur Oberfläche könnte signifikant die Intensität der SAN OAPs verbessern , der länger dauern kann , wenn im Vergleich zu reinen Oberflächenfärbung in früheren Studien verwendet. 8,9

Die Verwendung von blebbistatin hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen elektromechanischen Entkupplern einschließlich geringer Toxizität, weniger ausgeprägte Nebenwirkungen und Abwaschbeständigkeit, wenn sie mit Vorsicht verwendet wird. Blebbistatin ausfällt , wenn es bei Temperaturen von weniger als 37 ° C. 14 blebbistatin Kristalle unterbrechen normalen vaskulären Strömung gelöst wird und somit lokale induzierenIschämie und provozieren Arrhythmien. 24 Darüber hinaus in Studien , die GFP oder andere grün / gelbe Farbstoffe verwenden, könnte blebbistatin Fällung für markierte Zellen verwechselt werden , die in Betracht gezogen werden sollte. Verhindern blebbistatin Fällung ist einfach, das heißt, hat man blebbistatin in einem vorgewärmten aufzulösen (37 ° C und höher) und kräftig gerührt Medien.

Um zu analysieren , APD, eine hohe Konzentration von blebbistatin (bis zu 10 & mgr; M) verwendet werden könnten. 13,14,25. In ähnlicher Weise, wenn eine Droge, die Kontraktion erhöht verwendet werden, zusätzliche Anwendung von blebbistatin wird empfohlen.

Als alternative Technik Maus SAN elektrische Aktivität, niedrige Auflösung Multi-Elektroden - Array (64 getrennten Elektroden in einem Quadrat 8 x 8, Konfiguration mit einem Abstand zwischen den Elektroden von 0,55 mm) 26 und in Folge Glasmikroelektroden - Aufnahmen in kurzer Entfernung gemacht zu studieren zwischen impalements vs. bis zu 50 & mgr; m / Pixel für optische begrenzt sind mapping) und AP Morphologie oder multiparametrische Bildgebung (wie beispielsweise die gleichzeitige Spannung und Calcium optische Abbildungs ​​werden nicht verwendet zu analysieren). Obwohl Glasmikroelektroden-Aufnahmen auf AP Morphologie mehr Informationen zur Verfügung stellen, einschließlich der absoluten Werte für AP Amplitude und Ruhepotential wird auch durch eine geringe räumliche Auflösung begrenzt. Es kann daher nur für eine stabile Lage des führenden Schrittmacher verwendet werden und ist nicht anwendbar in der führenden Schrittmacher Lage beat-to-beat Veränderungen zu erfassen. Zur gleichen Zeit, wie zuvor gezeigt und 3,20 in der vorliegenden Studie hervorgehoben, die SAN OAP consists eines Zweiphasensignal whichincludes sowohl SAN und atrialen Myokard AP Komponenten (4B). Es macht es so schwierig, ein reines SAN Signal zu extrahieren und genau AP Morphologie im SAN abzuschätzen. Zu diesem Zweck Glasmikroelektroden 17 oder die Stromzange Ansatz auf isolierte SAN Myozyten sollte in Betracht gezogen werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

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