Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Biology

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Summary

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada convencional.

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).

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Abstract

Microscopía de fluorescencia permite la visualización directa de biomoléculas específicas dentro de las células. Sin embargo, para la microscopía de fluorescencia convencional, la resolución espacial está limitada por difracción a ~ 200 nm dentro del plano de la imagen y> 500 nm a lo largo del eje óptico. Como resultado, la microscopía de fluorescencia ha sido durante mucho tiempo muy limitada en la observación de características ultraestructurales de las células. El reciente desarrollo de métodos de microscopía súper resolución ha de superar esta limitación. En particular, el advenimiento de fluoróforos photoswitchable permite súper resolución microscopía basada en la localización, que proporciona el poder de resolución acercarse a la escala de longitud molecular. A continuación, describimos la aplicación de un método de resolución de la microscopía de súper tridimensional basado en una sola molécula de microscopía de localización y la interferometría de fases múltiples, llamado interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm). Este método proporciona una resolución casi isotrópica en elorden de 20 nm en las tres dimensiones. Los protocolos para visualizar el citoesqueleto de actina filamentosa, incluyendo la preparación de muestras y el funcionamiento del instrumento iPalm, se describen aquí. Estos protocolos son también fácilmente adaptable e instructivo para el estudio de otras características ultraestructurales de las células.

Introduction

La visualización de las estructuras celulares complejas ha sido durante mucho tiempo parte integral de conocimientos biológicos y descubrimiento. Aunque la microscopía de fluorescencia puede celdas de imagen con especificidad molecular alto, su poder de resolución está limitada por la difracción a ~ 200 nm en el plano de la imagen (x, y, o dimensión lateral) y> 500 nm a lo largo del eje óptico (z, o dimensión axial) 1,2. Por lo tanto, la observación de características ultraestructurales históricamente se ha limitado a la microscopía electrónica (EM). Afortunadamente, el reciente desarrollo de la resolución microscopía de súper ha eludido este límite, lo que permite una resolución espacial en el 10 - 100 nm rango de 1-6. En particular, súper resolución enfoques basados en la localización de una sola molécula, conocida por las siglas como el de palma (photoactivated localización Microscopy) 4, FPALM (Fluorescencia photoactivated localización Microscopy) 5 (d) STORM (directa estocástico óptico Reconstrucción Microscopía) 6,7, PAINT ( CorreosLa acumulación int for Imaging nanoescala Topografía) 8, GSDIM (estado fundamental Agotamiento Microscopía seguido por el retorno moleculares individuales) 9, o SMACM (Single-molécula activa-Control Microscopía) 10, así como sus implementaciones de 3 dimensiones (3D), como PALM interferométrica (iPalm) 11 o 3D-STORM 12, han sido valiosa para revelar nuevos conocimientos sobre la organización a nanoescala de numerosas estructuras biológicas, incluyendo los axones neuronales y las sinapsis 13, adhesiones focales, 14,15 célula-célula cruces 16, 17 poros nucleares centrosomas, y 18-20, para nombrar unos pocos.

Otra característica ultraestructural en células para las que la resolución microscopía Super es potencialmente útil es el citoesqueleto de actina. La malla complejo de (f) actina filamentosa en la corteza celular juega un papel esencial en el control de la forma celular y las propiedades mecánicas 21. La organización of f-actina se encuentran activa y dinámicamente regulado, aunque numerosas proteínas reguladoras que influyen fuertemente en la polimerización, reticulación, la facturación, la estabilidad y la topología de la red 22. Sin embargo, a pesar de la caracterización de la arquitectura de malla de actina F es importante para conocimientos mecánicos en una amplia gama de procesos celulares, el pequeño tamaño (~ 8 nm) de los filamentos de actina F dificulta su observación por microscopía de luz de difracción limitada convencional; Por lo tanto, la visualización de la estructura fina de la actina hasta ahora se ha realizado exclusivamente por EM. A continuación, describimos los protocolos para la visualización del citoesqueleto de actina F en células de mamíferos adherentes, utilizando la técnica de microscopía de súper resolución iPalm para aprovechar su capacidad muy alta precisión en 3D 11,23. Aunque el instrumento iPalm está altamente especializado, instrucción sobre la creación de un instrumento de este tipo ha sido descrito recientemente 23, mientras que el acceso al microscopio iPalm organizada por el Howard Hughes Medical Institute también se ha puesto a disposición de la comunidad investigadora con un costo mínimo. Además, los métodos de preparación de muestras descritos en este documento son directamente aplicables a enfoques alternativos 3D Super Resolution, tales como los basados en desenfoque astigmática de la función de dispersión de punto (PSF) 12 o biplano de detección 24, que son más ampliamente disponible.

Observamos que un ingrediente necesario para la resolución de la microscopía de súper basada en la localización de una sola molécula, en general, es el fluoróforo photoswitchable 25, que permite que los tres requisitos críticos para la microscopía de súper resolución basada en la localización de una sola molécula de cumplirse: i) alta sola molécula brillo y el contraste con respecto a las señales de fondo; ii) la distribución dispersa de moléculas individuales en un marco de imagen dada; y iii) la densidad espacial alta de etiquetado suficiente para captar el perfil de la estructura subyacente (también conocido como Nyquist-Shacriterio de muestreo nnon) 26. Por lo tanto, para obtener resultados satisfactorios, se debe hacer hincapié por igual en ambos la preparación adecuada de las muestras para optimizar photoswitching fluoróforo y para preservar la ultraestructura subyacente, así como en los aspectos de instrumentación y adquisición de los experimentos.

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Protocol

1. Preparación de las muestras de imagen

  1. Dado que las señales de fluorescencia de fondo interfieran con la fluorescencia de las etiquetas de fluoróforos, limpiar los cubres por primera enjuagarlos en agua desionizada (ddH2O) y luego secarlas con aire usando aire comprimido. Posteriormente, lleve a cabo el grabado por plasma en un limpiador de plasma durante 15 s, o más si es necesario.
  2. Para habilitar la corrección de la deriva y calibración iPalm, utilice # 1.5 redonda (de 22 mm de diámetro) cubres pre-limpiado con nanopartículas fluorescentes incrustados como puntos de referencia, que sirven como altamente fotoestables fiduciales para la calibración fiable y corrección de la deriva. Debido al tiempo de adquisición largo requerido para acumular suficiente densidad de fluoróforo (> 15 - 30 min), la deriva de la muestra es inevitable.
  3. Coloque cada cubreobjetos fiducialed en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Esterilizarlos por radiación ultravioleta (UV) en una campana de flujo laminar durante 15 min.
  4. En una campana de flujo laminar estéril, prepare fibrosolución nectin para el recubrimiento cubreobjetos mediante la dilución de 1 mg solución madre / ml de fibronectina en solución salina tamponada con fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) a una concentración final 2 - 10 mg / ml. Enjuague cada cubreobjetos tres veces con DPBS y se incuban con 2 ml de la solución de fibronectina durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, aspirar la solución de fibronectina y se lava una vez con DPBS.
  5. Enjuagar las células brevemente con DPBS. Incubar con 1 - 2 ml de tripsina durante unos pocos minutos a 37 ° C hasta que las células se separan y se apaga con 10 ~ ml de medio de cultivo celular que contenía suero fresco. Por ejemplo, para las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), el uso de grandes medio de cultivo suplementado con endoteliales de los vasos grandes factores endoteliales de los vasos y la penicilina o estreptomicina.
    1. Replate las células sobre cubreobjetos recubiertos de fibronectina (por densidad escasa, placa de <50.000 células por cubreobjetos) y mantener el cultivo en una incubadora a 95% de humedad, 5% de CO 2, y 37 & #176; C.
  6. Para una buena conservación de las estructuras finas del citoesqueleto de actina F, utilizar soluciones tampón a base de reactivos tampón 27 de Good.
    1. Por ejemplo, preparar tampón PHEM como una solución 2x de la (tubos de 120 mm, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, 4 mM MgCl 2, pH 7,0 con KOH) por disolución de 6,5 g de HEPES, 3,8 g de EGTA y 190 mg de MgCl 2 en ~ 300 ml de ddH 2 O, con el pH ajustado a 7,0 mediante la adición gota a gota de una solución de KOH concentrada; a continuación, añadir ddH 2 O para llevar el volumen a 500 ml. Esterilizar el buffer usando un filtro de 0,22 micras-, almacenarlo a 4ºC, y se diluye 1: 1 con ddH2O antes de su uso.
  7. Para obtener los mejores resultados con el etiquetado de alta densidad de F-actina, el uso faloidina conjugada con fluoróforos orgánicos, tales como Alexa Fluor 647. En el punto de tiempo deseado después de replating celular, fijar las células como sigue:
    1. Aspirar los medios de cada pocillo de cultivo que contienen el ceespécimen ll. Suavemente pero rápidamente dispensar 2 ml de cálidos fijadores de extracción (37 ° C) que contienen 0,25% de glutaraldehído en tampón PHEM con 0,25% de Triton X-100. Incubar a temperatura ambiente durante 1 - 2 min. Para los pasos siguientes, utilizar 2 ml de fijador o tampón de enfriamiento por cubreobjetos, a menos que se indique lo contrario.
    2. Vuelva a colocar el fijador de extracción con un fijador de glutaraldehído al 2,5% en tampón PHEM y dejar que las muestras se incuban durante 10 - 12 min. Esto y siguientes pasos se lleven a cabo a temperatura ambiente.
    3. Aspirar los fijadores y suavemente los reemplazan con tampón PHEM. La inclinación y agitar suavemente y, a continuación, lavar de nuevo con PHEM. Repetir dos veces.
    4. Para saciar la autofluorescencia de glutaraldehído, que puede abrumar a las señales de los fluoróforos deseados, incubar las muestras con un tampón de temple recién preparada que contenía NaBH4 a una concentración en masa de 0,1% en PHEM. Se observaron burbujas profusas. De vez en cuando toque en el plato de la muestra suavemente para DISLodge las burbujas. Déjelo incubado durante 5 - 10 minutos a.
    5. Aspirar el búfer de enfriamiento rápido y suavemente lo reemplazan con tampón PHEM. Enjuagar varias veces para eliminar las burbujas. Pipeta en 2 ml de tampón PHEM y se deja incubar en la oscuridad durante 5 min. Repetir dos veces y dejar que el resto de muestras en tampón PHEM cuando haya terminado.
    6. Preparar una cámara de humedad para faloidina incubación utilizando un gran placa de Petri de plástico rellena con un trozo de toalla de papel generosamente humedecido con 5 - 10 ml de ddH 2 O. Coloque una hoja grande de Parafilm limpia en la parte superior de la toalla de papel húmeda.
    7. Debido a la relativamente alto costo de faloidina marcada, utilice un pequeño volumen de cada etiqueta. Para el etiquetado de alta densidad, comenzar con una concentración de 0,3 mM. Preparar ~ 60 l por cubreobjetos usando faloidina-Alexa Fluor 647 en tampón PHEM.
    8. Pipetear 55 - 60 l de la solución faloidina sobre la lámina de Parafilm en la cámara de humedad. Con unas pinzas finas, retire con cuidado la muestra de covergmuchacha. Tenga cuidado de observar la cara que contiene células correcta.
    9. De forma rápida y golpear suavemente el exceso de tampón tocando el borde del cubreobjetos con un trozo de papel doblado absorbente delicada, y luego coloque el lado celular cubre objetos hacia abajo sobre la gota de la solución faloidina en el Parafilm. Asegúrese de que no hay burbujas atrapadas por el cubreobjetos.
    10. Coloque la tapa en la cámara de humedad. Envolver la cámara en papel de aluminio para protegerlo de la luz ambiente, y dejar que la muestra se incuba durante la noche a 4 ° C. La muestra se puede mantener en esta condición durante varios días. Asegúrese de que la cámara de humedad se mantiene húmeda cuando se haya previsto un almacenamiento prolongado.
  8. Antes de las imágenes, colocar suavemente el lado celular cubre objetos arriba sobre una nueva placa de 6 pocillos que contiene 2 ml de tampón PHEM por pocillo.
  9. Preparar los tampones de imágenes basados ​​en tiol rescatados de oxígeno usando las siguientes soluciones madre: 1 M de glucosa, M cisteamina 1 y mixto de la enzima glucosa oxidasa 100x / catalasaUre (4 mg de catalasa y 10 mg de oxidasa de glucosa en 100 l de tampón de PHEM, mezcladas adecuadamente por agitación) 28. Justo antes de exponer, mezclar 75 l de solución 1 M de glucosa, 30 l de solución 1 M cisteamina, y 3 l de 100x mezcla de enzima. Ajuste el volumen a 300 l con tampón PHEM y utilizar inmediatamente después de la mezcla para montar la muestra.
  10. Para iPalm, preparar la muestra de imágenes usando un pre-limpiado # 1.5 cubreobjetos (22 mm de diámetro).
    1. Alternativamente, utilizar un portaobjetos de vidrio (3 "x 1") con un espaciador adhesivo de doble cara para ayudar en el montaje si a base de astigmatismo 3D-STORM 12 se va a utilizar en su lugar.
    2. Para el montaje de la muestra de imágenes, utilizar unas pinzas finas para eliminar suavemente el cubreobjetos ejemplar de la memoria intermedia también. Entonces, rápidamente y golpear suavemente el exceso de tampón tocando el borde del cubreobjetos con papel absorbente plegada.
    3. Coloque el lado de células cubreobjetos hacia arriba en un pedazo de papel de la lente limpia. Enjuagar la muestramediante la colocación de 30 - 50 l de tampón de formación de imágenes sobre la muestra, y eliminar el exceso de tampón por la inclinación y tocando con papel absorbente plegada.
    4. Repetir la etapa de aclarado un par de veces, y luego colocar 30 - 50 l de buffer de imágenes sobre la muestra. Secar con el borde del cubreobjetos y colocar varios puntos muy pequeños de epoxi de curado rápido a la zona de secado.
    5. Lentamente baje otro pre-limpiado # 1.5 cubreobjetos (normal, cubreobjetos redondo, diámetro 18 mm) en el centro de la 22-mm cubreobjetos que contiene células. Deje que el tampón de imagen moje las dos cubreobjetos por acción capilar. Los pequeños puntos de epoxi de curado rápido deben adherirse a los dos cubreobjetos.
    6. Presione suavemente sobre la muestra montada con papel absorbente plegada para distribuir la presión uniformemente. Use una presión suficiente para hacer que la célula delgada de la muestra e incluso (<15 micras), pero no tanto como para aplastar las células. Medir el espesor adecuado mediante la observación del patrón de anillos de Newton. Además, asegúrese de llevar a cabo este ptep suavemente para minimizar las burbujas de aire. Si es necesario, practicar con cubres vacíos varias veces de antemano.
  11. Sellar la muestra con vaselina fundida de lanolina, parafina (valap, Stock prepara a partir de 100 g cada una de vaselina, lanolina y parafina derretida juntos) 29, enjuagar la muestra sellada con ddH2O, y secar con aire comprimido. La muestra está ahora lista para el montaje en el microscopio para obtener imágenes.

2. Colocación de la muestra y alineación iPalm

  1. Mover la lente del objetivo superior cargado por resorte hacia arriba para permitir la extracción del soporte de la muestra. Colocar la muestra sellados preparados en la etapa 1.10 en el soporte de la muestra y asegurar con varios pequeños imanes de tierras raras. Aplicar aceite de inmersión en ambos lados de la muestra de imágenes. Colocar el soporte de muestra de nuevo en la trayectoria óptica y baje suavemente la lente objetivo superior.
  2. Encienda el láser de excitación. Encienda el dispositivo de carga acoplada multiplicador de electrones (EMCCD) de la cámara en el modo de transferencia de fotogramas.
    1. Girar en los filtros de emisión adecuadas. Activar un obturador mecánico para bloquear la trayectoria del haz superior (Figura 1A) y abrir el camino del haz inferior. Llevar la lente de objetivo inferior en el foco por la traducción en pequeños incrementos utilizando el actuador piezoeléctrico.
    2. Una vez que el fiducial está en foco, abrir la trayectoria del haz superior, mientras que el bloqueo de la trayectoria del haz de fondo y llevar la lente de objetivo superior en el foco de una manera similar. Monitor de la anchura de la fiducial en la pantalla del ordenador para el enfoque óptimo.
  3. Para el centrado adecuado, abierto tanto a la parte superior y trayectorias de los rayos de fondo. Para ajustar manualmente la lente del objetivo superior, mientras que el objetivo inferior se mantiene constante utilizando un par de tornillos de ajuste micro-finas, hasta que las imágenes fiduciales se solapan tanto como sea posible, idealmente dentro de un píxel.
    1. Posteriormente, realizar ajustes finos para que las imágenes de referencia en el paso 2.3 se superponen dentro de un décimo de un pixel EMCCD. Ajustar la parte superior2 ejes espejos piezoeléctricos montados a través del software de control mientras mantiene ambas lentes del objetivo y el reflejo inferior espejos constante. Comparación de los centros de las marcas de alineación de la parte superior y las opiniones objetivas de fondo a través de la pantalla del ordenador para guiar el proceso.

3. Calibración de la instalación de iPalm

NOTA: Como la emisión de fluorescencia es incoherente, para la interferencia que se observa en iPalm, la longitudes de trayecto a través de la parte superior y los objetivos de fondo debe estar cerca uno del otro, dentro de unas pocas micras. Esto se puede lograr de la siguiente manera:

  1. Con los láseres de, las cámaras de streaming de forma continua, y tanto las trayectorias de los rayos superior e inferior abierta, oscilar el soporte de muestra z-piezo usando una forma de onda de voltaje sinusoidal generada por el software de control para una oscilación del eje z continua sobre una magnitud de 400 nm .
  2. Aprovechando el hecho de que, cuando fuera de la alineación óptima, la intensidad fiducial varía poco con tél oscilación, traducir manualmente el conjunto divisor de haz motorizado arriba o hacia abajo hasta que la intensidad de los fiduciales oscila debido al efecto de interferencia de fotón único deseado. Esto significa la estrecha coincidencia de las longitudes de camino óptico. Una proporción de pico a valle de> 10 se puede lograr en los casos óptimos (Figura 1D).
  3. Para asegurarse de que tanto la amplitud y la fase en cada superficie son lo más uniforme posible en todo el campo, ajustar el espejo inferior del conjunto divisor de haz en pequeños pasos para poner a punto la brecha y los ángulos de inclinación. Realizar divisor de haz alineación fina mediante la traducción de la muestra en 8 nm z pasos de más de 800 nm.
    1. Seguimiento de la intensidad fiducial entre cámaras # 1 - 3. Ajuste la altura, la posición y la inclinación del espejo inferior dentro del conjunto divisor de haz en pequeños pasos, de manera que la fase de oscilación de la cámara # 1 con respecto a la cámara # 2 se maximiza, lo ideal a 120 ° (Figura 1B-D).
    2. Una vez que el inicialalineación es completa, traducir la muestra para buscar un campo adecuado de vista que contiene tanto células a imagen y múltiples marcas de alineación en las inmediaciones. Colocar un cerramiento alrededor del sistema para bloquear la luz dispersa y perturbaciones ambientales. Una vez que se encuentra la superficie de imágenes, llevar a cabo el procedimiento en el paso 3.4 de nuevo, y registrar la curva de calibración para su uso en posteriores extracciones coordenada z con el comando "Adquirir calibración Scans vs Posición Piezo de ejemplo" en la interfaz principal.

4. Adquisición de Datos

  1. Una vez que se encuentra un área deseada y se obtiene la curva de calibración, introduzca los nombres de los archivos correspondientes en el software. Abra la tapa y trayectorias de los rayos de fondo. Aumentar la potencia de excitación del láser de 642 nm en el máximo. Para Alexa Fluor 647, un período inicial de fluoróforo desconexión puede ser necesaria (Figura 2A).
    1. Exponer con una constante de excitación 642 nm durante 5 minutos, o más si es necesario, hasta simolécula ngle parpadear se observa (Figura 2B). El software permite un aumento automático de la activación del foto-405 nm durante el transcurso de la adquisición. Un gran número de marcos de adquisición suelen ser necesarios para las características filamentosa era claramente visible (> 50.000 marcos). Cuando esté listo, comience la adquisición de conjuntos de imágenes en bruto con el comando "Inicio iPalm Adquisición" en la interfaz principal.
  2. Durante la adquisición, ajustar el nivel de la fotoactivación mediante el ajuste de la intensidad del láser de 405 nm para mantener la densidad de parpadear adecuado según sea necesario (ver ejemplos en la Figura 2B).
    NOTA: Una vez que se ha completado la adquisición, el software convierte automáticamente los archivos de imagen en el formato binario adecuado. El repositorio de datos en el servidor de cómputo se monta como una unidad de red, lo que permite que los datos se copian directamente allí para su posterior procesamiento.

5. Procesamiento de Datosy análisis

  1. Realizar un análisis de la localización utilizando un software desarrollado a medida para extraer los parámetros de ajuste óptimo para todas las moléculas individuales, así como para los fiduciales 11,15,23. Esto produce no sólo las x, y-coordenadas, sino también la intensidad que se utiliza para análisis de la curva de calibración.
    1. Importar los datos de calibración primas adquiridas en el paso 3.5 utilizando el comando "Extraer valores máximos múltiples etiquetas" en el menú "Archivo" para llevar a cabo la localización de una sola molécula. Tras el análisis inicial de localización, coordenadas obtenidas de las cámaras # 1 - 3 son presente en canales rojo, verde y azul, respectivamente, y se pueden guardar para su posterior análisis mediante el comando "Guardar procesa como IDL (.sav)" en el " "menú archivo.
  2. Para llevar los datos de las cámaras # 1 - 3 dentro de registro con las marcas de alineación fluorescentes incrustados en los cubreobjetos, seleccionar varios fiduciales brillantes para dar cobertura a la imagen central (por ejemplo,Figura 1B) con el comando "puntos de anclaje de referencia" en el menú "transformaciones de imagen". Usa los conjuntos triples de coordenadas de localización de las cámaras # 1 - 3 obtenida a partir de los fiduciales brillantes en el paso 5.1 para calcular la rotación y de la matriz de escala que traerá cámaras # 1 y # 3 en el registro con la cámara # 2. Con un número suficientemente grande de fiduciales, de orden superior polinomio de deformación se puede realizar para un mejor ajuste.
  3. Una vez que se calcula la matriz de transformación, transformar los datos en bruto de las cámaras # 1 - 3 en conjunto para obtener los datos en bruto se suma. Realice otra ronda de análisis de localización para producir una más precisas x, y de la coordenada y para determinar la contribución relativa de cada canal de la cámara a los datos en bruto resumió; utilice el comando "Transform Raw, Guardar y Guardar Sum (.dat)" en el menú "transformaciones de imagen". Esta relación de intensidad contiene la información de coordenada z.
  4. Seleccionar un fiducial brillante y realizar Z-calibración ajustada mediante la función "Prueba de la punta del viento 3D" en el diálogo emergente, haga clic en "Z-coordinar las operaciones" en el menú "Funciones especiales". Esto encajar funciones 3-sinusoidales a las intensidades de los canales de la cámara 3 para determinar la curva de calibración. El archivo de calibración se guarda a continuación, para su posterior utilización en las principales bases de datos.
  5. Para probar la calidad de la curva de calibración, realice la extracción de la coordenada z, como se ha descrito previamente 23. Para fiduciales buen comportamiento en un sistema bien calibrado, la coordenada z se debe ampliar de forma lineal, ya que los conjuntos de datos de calibración se toman con un barrido lineal en la posición z. Además, el Z-posiciones de todos los fiduciales deben escalar con una pendiente similar.
  6. Una vez que se obtiene una calibración satisfactoria, lleve a cabo la localización y análisis de transformación de los conjuntos de datos de imágenes en bruto adquiridos en el paso 4 siguiente mismo procedimiento descrito en los pasos 5.1-5.3. Cuando haya terminado, cargue el archivo de calibración desde el paso 5.4 y realizar la extracción de coordenada z utilizando las funciones de "Pick WND Archivo" y "Extraer coordenada Z" en el diálogo emergente, haga clic en "Z-coordinar las operaciones" en el menú "Funciones especiales".
    NOTA: Como el tiempo de adquisición es> 15 min, la deriva mecánica es de esperar.
  7. Para realizar la corrección de la deriva de x, y, seleccione un fiducial brillante partir de las coordenadas de localización. Este fiducial debe estar presente en todos los marcos. A continuación, el terminal x, coordenada y la deriva de la fiduciaria para alinear todas las otras coordenadas dentro del mismo marco de nuevo en el registro (Figura 3A-B) usando la función "Prueba / escritura Estrella Guía" en el menú "transformaciones de imagen". el registro de la coordenada Z se puede realizar de manera similar mediante el acceso a la "Prueba de Estrella Guía" y "Escribir Estrella Guía" funciones en el cuadro de diálogo emergente, haga clic en "Z-coordinar las operaciones" en el menú "Funciones especiales".
  8. A medida que la muestra puede presentar una ligera inclinación, realizar la corrección de inclinación, proporcionando las x, y, z las coordenadas de 3 puntos de referencia que define el plano que se debe establecer el nivel de uso de la función "Eliminar XYZ inclinación" en el diálogo emergente, haga clic en " Z-coordinar las operaciones "en el menú" Funciones especiales ".
  9. Con posterioridad a las correcciones de deriva y de inclinación, guardar las coordenadas de localización. Reconstruir una imagen de súper resolución para su posterior análisis (Figura 4A-D) utilizando el comando "Render" en la interfaz principal. El color puede ser usado para indicar la coordenada z. Alternativamente, una vista lateral de la zona seleccionada también se puede representar. Las coordenadas de localización se pueden exportar como archivos de texto para su posterior cuantificación, o la imagen reconstruida se pueden guardar como un archivo .tif.

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Representative Results

requisitos críticos para iPalm son la alineación, registro y calibración de los sistemas ópticos. Estos son necesarios para garantizar la interferencia adecuada dentro del requisito de 3 vías divisor de haz para la coordenada z de extracción. Para habilitar la supervisión continua, fuentes puntuales constantes de fluorescencia son necesarios. Esto se puede lograr usando fluorescente Au o nanopartículas bimetálicas 23 cuya fotoluminiscencia surgir de resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR). Actúan como un solo dipolo estable tras la iluminación y por lo general pueden ser localizados con 5 - 10 nm precisión. Estas nanopartículas disponibles comercialmente emiten un nivel de brillo dentro de la gama de la mayoría de los fluoróforos de una sola molécula, de modo que tanto los fluoróforos y los fiduciales se pueden obtener imágenes con similares intensidades de excitación y ajustes de ganancia en las cámaras EMCCD, sin saturación (Figura 1B). Por otra parte, estos fiduciales también en gran medida facilitate de enfoque, lo que la anchura aparente de los fiduciales se puede monitorizar durante el ajuste del enfoque. Además, la limpieza rigurosa de la superficie de cubreobjetos, como por Piranha ataque químico o limpieza con plasma, también se requiere, ya que el fondo de fluorescencia espuria de cubreobjetos sin limpiar o mal limpiado puede abrumar fácilmente señales de una sola molécula, como se describió anteriormente.

iPalm se basa en la interferometría de múltiples fases para permitir la medición de alta precisión de la coordenada z de forma simultánea con la palma (para x, y). En el instrumento iPalm, cada fotón de fluorescencia emitida se puede considerar para propagar a través de ambas trayectorias ópticas, que luego auto-interfieren en un divisor de haz de 3 vías a medida fabricadas. La coordenada z se cifrados en la fase del fotón interferida. Las diferencias de fase mutuo de ~ 120 ° de los haces de salida del resultado divisor de haz de 3 vías en la variación de la intensidad de las imágenes de una sola molécula entre el 3 camercomo, permitiendo z - coordinar extracción a partir de una curva de calibración. Basado en esto, el conjunto de soporte de la muestra iPalm es un componente esencial, ya que está equipado con un par de actuadores piezoeléctricos que permiten traducción nm precisión en z que se puede utilizar para la alineación y calibración.

En el enfoque y la alineación correcta, la traducción de la muestra a lo largo del eje z generará un efecto de interferencia. Esto se manifiesta como la oscilación de la intensidad fiducial entre los tres canales de la cámara (Figura 1C-D). Estas oscilaciones también indican que tanto la parte superior y trayectorias de los rayos ópticos inferiores son casi coincidentes, lo que permite la interferencia de un solo fotón. Por lo general, al encender el instrumento, las fases iniciales de cada cámara no será óptima y se necesita la exploración de z-posición como una herramienta de diagnóstico para la calibración y alineación. Para llegar a las fases óptimas, el espejo inferior del divisor de haz(Figura 1A) se puede ajustar mediante la etapa de punta-tilt piezoeléctrico. La exploración de calibración de la posición z se toma después de cada pequeño 10 - 20 nm de ajuste. La intensidad de la fiducial en cada canal se determina entonces mediante análisis de la localización (es decir, encajando con una función de 2D-Gaussian). La intensidad normalizada por intensidad total se puede aproximar por una forma de onda sinusoidal, permitiendo que el término de fase que se calcula; Por lo tanto, la fase correspondiente a cada cámara se puede determinar, como se ve en la Figura 1C. Observamos que el principio de interferencia de fotón único utilizado en iPalm también se puede demostrar utilizando un divisor de haz 2-manera mucho más simple. Sin embargo, un divisor de haz de 2 vías es poco práctico para la resolución de 3D microscopía súper ya en o cerca del límite de interferencia destructiva, la señal en un canal es mínimo, lo que resulta en estimaciones ruidosas de la intensidad y localización de coordenadas, que restringen eficazmente la coordenada z determinación de la range donde ambas cámaras tienen considerable intensidad (<100 nm). El número mínimo de canales necesarios para superar este efecto es de tres, y de 3 y 4 vías sistemas de proyección se han descrito en la literatura 11,30.

En condiciones óptimas, por un divisor de haz de 3 vías, las diferencias de fase entre las 3 cámaras debe ser aproximadamente 120 °. El divisor de haz de 3 vías para iPalm contiene 3 interfaces reflectantes, como se esquematiza en la Figura 1A. El divisor de haz está posicionado por encima de un espejo dieléctrico plano, con una separación fina llena de aceite índice de coincidencia de refracción, para permitir el ajuste fino de longitudes de trayecto en el divisor de haz y para conseguir diferencias de fase óptimas. Como se muestra en la Figura 1C-D, en la alineación adecuada para iPalm, las cámaras están cerca de una diferencia de fase mutua 120 °. En la práctica, una diferencia de fase mayor que 105 ° es generalmente aceptable. Dicha calibración tanto indica que el sistema está bien alineado y que será utilizada para la posterior extracción de coordenada z. También es útil para evaluar la curva de calibración generada utilizando diferentes fiduciales. La mayoría de los fiduciales con un brillo moderado en general, emiten como un dipolo simple, obteniéndose curvas de calibración de buen comportamiento. Sin embargo, los agregados ocasionales de fiduciales (a menudo aquellos con brillo extremo) pueden comportarse de una manera anómala, obteniéndose curvas de calibración no fiables. También es aconsejable elegir fiduciales cerca del centro del campo de la imagen y de la zona de interés biológico (Figura 1B), en particular desde la lente de alta objetivos NA utilizado en la configuración de iPalm no es corregida de campo plano. El campo de visión efectivo se limita a la zona central, evidentes a partir de las anchuras mayores fiduciales hacia el borde del campo.

Con posterioridad a la alineación inicial, la opinión de los campos-de-que contiene células con mo deseablerphology y múltiples marcas de alineación para asegurar una buena calibración se eligen para la imagen. Esto se puede lograr mediante la traducción lentamente el soporte de muestra el uso de unidades de servomotores 2 ejes. La traducción de la muestra, se obtienen algunos desenfoque, ya que la muestra no siempre es perfectamente plana. Por lo tanto, el enfoque debe ajustarse continuamente durante la traducción. Una vez que el campo de la imagen ha sido elegido, otra ronda de calibración para optimizar la curva de calibración se utilizó a continuación para ajustar la alineación del sistema y para obtener la curva de calibración real. Es importante destacar que las zonas bajo el núcleo o cerca de las regiones con índice de refracción heterogénea (por ejemplo, burbujas de aire) deben ser evitados en general, ya que pueden provocar una alteración significativa de la ruta relativa longitudes, lo que distorsiona la coordenada z.

Con el etiquetado de alta densidad, las señales de fluorescencia de los fluoróforos orgánicos tales como Alexa Fluor 647 pueden ser extremadamente brillante. Como se muestra in la Figura 2A, con la preparación adecuada de tampón que contiene una alta concentración de grupos tiol (-SH) 31, el fluoróforo debe ser cambiado rápidamente fuera bajo alta iluminación de excitación. Esto resulta en la supresión de las señales de fluorescencia de la mayoría de las moléculas. En un caso dado, una muy pequeña minoría de fluoróforos estocásticamente volver al estado de "encendido". Estos se espera que sean escasamente distribuido y por lo tanto puede ser visualizado como moléculas individuales para uno o unos pocos fotogramas antes de cambiar de "apagado". La dinámica photoswitching dependen en gran medida de la intensidad de excitación y la concentración de -SH, y por lo tanto, para un sistema dado, se debe tener cuidado para optimizar la densidad de etiquetado adecuado, en particular desde una intensidad relativamente alta de excitación (640 a 647 nm) se necesaria para apagar una mayoría de Alexa Fluor 647 moléculas. Si la excitación no es suficientemente fuerte, una fracción significativa de Alex Fluor 647 voluntadpermanecer en el estado "encendido" y hay una gran fondo, dificultades para observar la fluorescencia de una sola molécula, y, en última instancia, la mala calidad de una sola molécula resultados de la localización. Bajo una condición adecuadamente equilibrada, de una sola molécula datos en bruto debe contener un número suficientemente grande de moléculas (cientos) por cuadro (Figura 2B), mientras que cada molécula es lo suficientemente escasa para permitir la detección inequívoca y análisis de localización. También vale la pena señalar que, para iPalm, los principios de photoswitching son idénticas a las de la palma o una tormenta, y por lo tanto, las muestras adecuadamente preparados para iPalm se puede utilizar directamente en los sistemas de 3D o 3D-PALM-STORM más simples. Para adquirir una densidad suficientemente alta de moléculas de satisfacer de muestreo de Nyquist, por lo general se requieren 50.000 o más cuadros de datos en bruto (es decir, 150.000 fotogramas totales para las 3 cámaras). A medida que progresa la adquisición, una fracción creciente de fluoróforos se podría agotar por photobleaching destructiva, lo que resulta en mástilSer densidad sola molécula. Para compensar esto, breves pulsos de luz azul 405 nm (405 nm) pueden ser iluminados sobre la muestra a intervalos para promover la activación fluoróforo.

Debido al largo tiempo de adquisición es necesario, para obtener resultados óptimos iPalm (o de una sola molécula de microscopía de localización en general) requieren baja deriva de la muestra y / o buena corrección de la deriva. Por ejemplo, usando el tiempo de exposición de 50 mseg en el modo de transferencia de marco (velocidad de cuadro 20 Hz), el tiempo total de adquisición de 50.000 marcos es de 42 min. Durante este período, se espera que la deriva mecánica largo de decenas de nm. De hecho, además de la alta precisión de localización y de alta densidad de etiquetado, la resolución también depende de la calidad corrección de la deriva. Existen múltiples orígenes a estas derivas con oscilación térmica siendo una causa importante. Debido a esta consideración, cuando sea posible, las partes iPalm están mecanizadas personalizado utilizando invar, una aleación de baja expansión térmica, o de acero inoxidable,ambos de los cuales tienen características de expansión térmica mucho más bajos que latón o aluminio. Desafortunadamente, esto también impone costo adicional con respecto a aluminio, que es un metal más comúnmente usado para los componentes óptico-mecanicos, siendo mucho más barato y más fácil de mecanizar. Otras fuentes de la deriva pueden ser vibraciones mecánicas de los equipos periféricos, entornos ambientales, o las corrientes de aire. Estos deben minimizarse colocando el sistema en una caja adecuada y mediante la reorientación de la dirección del flujo de aire en la zona de microscopio. La configuración debe ser construido sobre una mesa óptica con alta precisión y, si es posible, que contiene componentes de abanico deben colocarse fuera de la mesa óptica. Sin embargo, a pesar de todas las precauciones, alguna cantidad de deriva se mantendrá. Fundamentalmente, estas derivas deben reducirse al mínimo tal que la imagen permanece en foco a lo largo del tiempo de adquisición. En nuestros sistemas, estos métodos pasivos son suficientes para minimizar la deriva a niveles aceptables. Sin embargo, debe ser posible implementar com deriva activométodos de compensación para permitir a largo plazo y de imagen de alta precisión 32.

Tras el procesamiento de los datos en bruto, las coordenadas de localización 3D se pueden obtener con es normalmente de 5 - 10 millones de picos de una sola molécula por conjunto de datos. Como se muestra en la Figura 3, la deriva como función de tiempo se puede visualizar a partir de las coordenadas de localización de los fiduciales. Múltiples fiduciales se pueden utilizar para calcular la trayectoria media corrección de deriva (Figura 3A-B). Además, es habitual para filtrar los picos que se ajustan pobremente a la función de 2D-Gaussian durante el análisis de la localización. Esto podría ser debido a los ruidos espurios o picos de una sola molécula que se superponen parcialmente y puede ser diferenciado por el gran error cuadrático residual calculado durante el proceso de adaptación. Peaks con bajo brillo (como se indica por el número de fotones) y, por lo tanto, mayor incertidumbre (es decir, más grande que ~ 25 nm) también se filtran, unas estos probablemente surgen de la fluorescencia de fondo no específica. Del mismo modo, los picos para el que las intensidades de los canales de la cámara 3 se ajustan pobremente a la curva de calibración también se rechazan, ya que las coordenadas z obtenidos no son fiables. Cabe señalar que el contenido de la información completa de iPalm (y microscopía de localización en general) es enorme, ya que los resultados del análisis, no sólo en las coordenadas fluoróforo, sino también en varios parámetros adicionales tales como la intensidad, la anchura, el brillo, etc. Sin embargo, en la práctica, dado que pocos de herramientas computacionales están actualmente disponibles para el análisis en el espacio de coordenadas, las coordenadas de localización suelen ser prestados o reconstruidas en imágenes basadas en píxeles para su posterior análisis.

El enfoque utilizado comúnmente para la reconstrucción de la imagen iPalm es representar cada coordenada de localización con una función gaussiana normalizada 2D, con la incertidumbre de localización establecido como el Gaussian anchura de 33. Por lo tanto, las coordenadas de alta precisión (por lo general los picos de una sola molécula con alto brillo contra un fondo bajo) aparecen como picos afilados y estrechos, mientras que las coordenadas de baja precisión (normalmente bajo brillo o un fondo elevado picos de una sola molécula) aparecen como más tenue y más amplia picos. De esta manera, cada molécula contribuye la misma cantidad de intensidad de la imagen. Para un conjunto de datos 3D, la coordenada z se puede representar el uso del color, por lo general basado en una escala de tonalidad (Figura 4C-D). Alternativamente, las imágenes se pueden mostrar como una vista lateral (x, z o y, z) de proyección o como volúmenes. Una serie de software a disposición del público se puede utilizar para visualizar dichos datos 34.

Como se muestra en las figuras 4-6, las imágenes iPalm producen una mejora significativa sobre la microscopía de fluorescencia de difracción limitada. La arquitectura de F-actina en células HUVEC se puede visualizar con mucho reso espacial mejoradalución. En las regiones de la corteza, las redes de filamentos distintos pueden ser vistos, mientras que en las fibras de estrés, haces, y lamellipodia, las redes de F-actina densamente empaquetadas se observa que tienen una textura filamentosa, aunque los filamentos individuales no son distinguibles. Esto es probablemente debido a las limitaciones tanto en el brillo de los fluoróforos y la precisión de localización. La presencia de filamentos corticales distintas sugiere que la ultraestructura de la red de actina F es suficientemente bien conservado; Por lo tanto, iPalm podría ser una herramienta útil para la caracterización de la arquitectura cortical. En la Figura 5, una sub-región de un celular HUVEC se muestra con los perfiles de un filamento de actina cuantificado. Se puede observar que el z-histograma de un filamento es de aproximadamente 15 nm de anchura, relativamente pequeña en comparación con ~ 45 nm para la transversal (x, y) vista, mostrando que iPalm produce una mejora significativa de resolución en z-resolución en relación con x, y plano, como se esperaba. Sin embargo, ya que la actual diámetro de F-actina es de ~ 8 nm, no está claro si el filamento observado es un solo filamento o un haz de unos filamentos. De formación de imágenes usando correlativa iPalm y EM podría ser una estrategia útil para la caracterización adicional de la arquitectura de F-actina, aunque este enfoque no se ha aplicado para estudiar la F-actina todavía 23.

Figura 1
Figura 1: Diagrama esquemático de iPalm 3-D Super Resolution Microscopía. A) Esquema de la óptica iPalm. Las lentes del objetivo dual (Nikon, NA 1.49 60X) permiten que cada fotón fluorescencia emitida se propague a través de la parte superior e inferior trayectorias de los rayos ópticos, y se les redirige a interferir en el divisor de haz por un par de espejos orientados a 22,5 °. La fase del fotón auto-interferido es directamente proporcional a Delta Z, que codifica así la coordenada z del fluoróforo, y puede ser nos mideing un divisor de haz de 3 vías con diferencias de fase mutuo de ~ 120 ° entre los tres haces de salida. Ellos son enfocados por las lentes de tubo (L1-L3, f = 400 nm) y se filtran por el filtro de emisión (F1 - F3). Por consiguiente, cada molécula individual aparece con diferentes intensidades entre cámaras (EMCCD1-3) pero en x similares, coordenadas y. (A) se reproduce y modificado a partir de Ref. 11. (B) Imagen de difracción limitada de las células HUVEC etiquetados para la actina F con Alexa Fluor 647. Los puntos brillantes denotan fiduciales Au nanopartículas. Los ángulos de fase para las cámaras # 1-3 están representados por líneas de color rojo, verde, y azul, respectivamente, centrada en cada fiducial, con la diferencia de fase entre las cámaras # 1-3 se indica. Barra de escala:. 5 micras (C) Fiduciales imágenes que muestran los efectos de interferometría. Imágenes de un fiducial de nanopartículas de Au para cada cámara (CCD1-3) o total (suma), tomada como la posición z (en nm, en el corredor de fondo) y se analizan en busca de la calibración. La intensidad dentro each cámara se puede ver a oscilar con una relación de fase, como se muestra en (B). curva de calibración (D) iPalm. La muestra se traslada a lo largo del eje z. Las intensidades de un fiducial de nanopartículas de Au para la EMCCD1-3 son mostrados como líneas rojas, verdes, y azules, respectivamente (arriba). Estos se normalizan y se adaptan para determinar las diferencias de fase (abajo). Durante la alineación, el sistema se ajusta para conseguir las diferencias de fase máxima entre las tres cámaras. La curva de calibración se toma en cada sitio de imágenes para utilizar en la extracción de la coordenada z de cada molécula individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Imagen de una sola molécula de Photoswitching AlEXA Fluor 647-faloidina como etiquetas de actina. (A) paso photoswitching inicial. F-actina en células fijadas se etiqueta con una densidad elevada por faloidina conjugada con Alexa Fluor 647. iluminación de alta intensidad en unos resultados que contienen tiol buffer de imágenes en una rápida desconexión de la mayoría de los fluoróforos. (B) fotogramas representativos de prima única molécula marcos. En el parpadeo de estado estacionario, el activado Alexa Fluor 647 debe ser lo suficientemente escasa que las moléculas individuales individuales aparecen como una aplicación local PSF tamaño. Las imágenes de las mismas células se muestran en (A), que se muestra con contraste inverso. Las barras de escala en A y B:. 5 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: corrección de la deriva utilizando Multip. Le Fiduciales localización coordenadas de cuatro fiduciales (A, coordenada x; B, coordenada y) se utilizaron para calcular la deriva el empleo de dispositivos de polinomios (5º orden, parámetros de ajuste en la esquina superior derecha). La trayectoria media de la deriva permite la corrección de la deriva con la sub-5 nm de precisión (x: 3.085 nm, y: 3.606 nm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Visualización de 3-D F-actina Arquitectura por iPalm. (A) Imagen de difracción limitada de las células HUVEC con F-actina marcadas por Alexa Fluor 647-faloidina (correspondiente a las subáreas de la celda en la Figura 2). El punto brillante se debe a los fiduciales Au nanopartículas. (C) imagen reconstruida iPalm, con cada localización de coordenadas proporcionados por un 2D-gaussiana con la anchura que corresponde a la incertidumbre de la localización. La coordenada z es de color de acuerdo a la barra de colores. Áreas de características filamentosos densos y dispersos se pueden ver. Las barras de escala (AC): 1 m (D) Zoom-en vista del área de caja en C que muestra la topología filamentosos actina cortical.. Barra de escala:. 250 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: nanoescala Dimensión de F-actina se visualizaron mediante iPalm. (A) imagen reconstruida iPalm células HUVEC con F-actina marcada b y Alexa Fluor 647-faloidina. El color indica la coordenada z de acuerdo a la barra de colores. Barra de escala:. 1 m (B) transversal de sección transversal histograma de x, y-coordenadas de localización a lo largo del eje largo de la zona de caja en (A). Para obtener el histograma, las coordenadas se proyectan sobre el eje longitudinal de la caja y binned con un cubo de tamaño 5 nm. La curva gris indica un mejor ajuste de Gauss para el histograma, con una anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de 43,88 nm. (C) Histograma de la posición z de coordenadas de localización en el área de caja en (A). El Z-posiciones se han agrupado con un tamaño de caja de 1 nm. La curva gris indica un mejor ajuste de Gauss al histograma, con un FWHM de 17.50 nm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6:. Comparación de iPalm Imaging de F-actina utilizando diferentes reactivos de marcaje imágenes reconstruidas iPalm de F-actina marcada usando Alexa Fluor faloidina 647 conjugado (A), Alexa Fluor faloidina 568 conjugado (B), o por transfección con actina vector de expresión de la proteína de fusión -mEos2 (C). Las barras de escala (AC):. 1 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El sistema óptico de iPalm se basa en un diseño de doble objetivo opuesto 4-π, como se muestra en la Figura 1A. La configuración se construye con piezas mecanizadas tanto a medida y comerciales opto-mecánico, como se ha descrito anteriormente 23 y que figuran en la Tabla 1. Además de nuestra configuración, el Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) aloja un sistema que es accesible a la comunidad científica en el Centro de Imagen Avanzada en el Campus de Investigación Janelia. Para los dibujos llenos mecánicos, esquemas de control y software, se anima a los lectores a consultar con Harald Hess en HHMI para más información. Una ventaja principal para el uso de iPalm, así como otros métodos de microscopía de localización de una sola molécula para la visualización de la F-actina es la relativa facilidad de preparación de la muestra en comparación con las técnicas de EM, que generalmente requieren el procesamiento de muestras duras, laboriosa preparación y profesionales altamente cualificados 3,23 . Additionally, la fluorescencia es naturalmente susceptible de formación de imágenes de múltiples canales, que sigue siendo difícil para EM. Sin embargo, como se describe más adelante, hay varias limitaciones actuales para el enfoque, tanto en términos de preparación de la muestra y el proceso de formación de imágenes. En primer lugar, como es el caso de la preparación de muestras EM, se debe tener cuidado para asegurar una buena conservación ultraestructural de los especímenes 35, ya que un protocolo adecuado para un nivel de difracción limitada de la resolución puede causar perturbaciones graves a nivel de nanoescala. Para imágenes de actina, la fijación adecuada de las células es un factor importante que afecta a la calidad de la muestra. El glutaraldehído es un fijador preferido ya que preserva el citoesqueleto y la membrana muy bien, aunque en casos de co-tinción con anticuerpo, los sitios de epítopos podrían verse afectados. En tales casos, paraformaldehído puede ofrecer un compromiso aceptable, ya que tiende a conservar mejor los sitios de epítopos de anticuerpos. Es importante destacar que para una sola molécula de microscopía de localización, estos fijadores tiendenpara generar autofluorescencia de fondo; Por lo tanto, después de la fijación de temple por borohidruro es necesario, en particular en el caso de glutaraldehído.

Además, la selección adecuada de los fluoróforos y estrategias de etiquetado son algunos de los factores más importantes para experimentos exitosos. Debido a la dimensión a nanoescala de F-actina, se requieren altas densidades de etiquetas para capturar las redes subyacentes filamentosos, según lo estipulado por el teorema de muestreo de Nyquist 36. Para actina, faloidina permite el etiquetado de muy alta densidad, con una amplia variedad de fluoróforos orgánicos disponibles de muchos fabricantes. Sin embargo, desde faloidina es tóxico, se requiere la fijación y permeabilización celular. Estrategias alternativas para el etiquetado de células vivas actina compatibles incluyen el uso de la fusión de las proteínas fluorescentes (FP), ya sea con la actina monomérica o con pequeños polipéptidos se unen a actina. Sin embargo, hemos encontrado que estos tienden a proporcionar una densidad de etiquetado menor en comparación con faloidina ( 37, pero se espera que este enfoque es costoso y laborioso. En términos de los fluoróforos, Alexa Fluor 647 en general se ha encontrado para ofrecer consistentemente un buen rendimiento para la microscopía de localización. Esto puede ser descrito en términos de la relación de la diferencia de cociente de brillo entre el pico de una sola molécula y la fluorescencia de fondo 38. Una densidad de etiquetado superior requiere una mayor relación de contraste, ya que el fondo podría acumulativamente degradar la precisión de la localización. En nuestra experiencia, varios otros fluoróforos, tales como ATTO488, ATTO520, y Alexa Fluor 568 (Figura 6B), se puede utilizar para visualizar el F-actina, aunque con resultados menos consistentes en comparación con Alexa Fluor 647, que ofrece sólido rendimiento photoswitching través una amplia gama de condiciones de tampón de formación de imágenes.

39. Esto se aplica igualmente a las ventajas y limitaciones de iPalm. En comparación con otras técnicas de resolución de microscopía súper 3 dimensiones, iPalm se ha mantenido el enfoque óptico de más alta resolución de hasta la fecha, particularmente a lo largo del eje z, con el z-resolución casi 2 veces mejor que la x, y-resolución 11. Sin embargo, la dependencia de iPalm en interferometría de un alto z-resolución también impone una restricción de la profundidad de formación de imágenes, ya que la curva de calibración es periódica. En otras palabras, las coordenadas z repiten cada 250 nm o menos (~ 700 para longitudes de onda de emisión nm de Alexa Fluor 647). En la práctica, esto puede resolverse mediante el uso de iluminación TIRF, que limita la zona de excitación de dentro de la profundidad de campo evanescente de <200 nm del cubreobjetos. Por lo tanto, fluoróforos más profundamente en la muestra no se excitan y permanecen invisibles. Sin embargo, esto también limita las estructuras biológicas que se pueden obtener imágenes de los que están en las proximidades de la cubreobjetos, como adhesiones focales, citoesqueleto cortical, y la membrana plasmática ventral, mientras que las estructuras más interiores están fuera de su alcance. Para muestra fija, es un remedio para realizar cryosectioning 40. Sin embargo, este enfoque es muy laborioso y requiere conocimientos especializados que no es de acceso común.

Alternativamente, iPalm se puede adaptar para una z de autonomía extendida mediante la combinación de interferometría con el esquema de desenfoque astigmática 12 utilizado en 3D-STORM. Este enfoque proporciona doble coordenada z lecturas, la primera de interferometría, que es de alta precisión, pero periódica, y la segunda por el desenfoque de astigmatismo, que es menos preciso pero no periódica. El último luego se puede utilizar para "desenvolver" o romper la degeneraciónlos interferométricas coordenadas z, lo que permite que la triplicación de la profundidad de formación de imágenes iPalm a ~ 750 nm, acercándose eficazmente la profundidad focal intrínseca de lentes de objetivo de alta NA. Con desenrollado de fase, iPalm se ha utilizado para estructuras de la imagen en lo profundo de las muestras, tales como las mitocondrias, aunque con un poco reducida precisión en las 3 dimensiones debido a desenfoque el adicional 40.

Otra limitación intrínseca de iPalm es la velocidad de formación de imágenes. Dado que se requieren un gran número de tramas para obtener una alta densidad de coordenadas de localización, la velocidad de la cámara es por lo general el límite de la velocidad de adquisición. Con las cámaras actuales EMCCD funcionando a 10 - 20 MHz tasas de lectura, se requieren decenas de minutos para un número suficiente de tramas. Tales escalas de tiempo largas requieren que la muestra de fijarse. Aquí, los recientes avances en la tecnología de la cámara, como la cámara mucho más rápido científica Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS), pueden permitir un rápido aumento de imenvejecimiento de la velocidad 41, aunque esto no se ha implementado para iPalm todavía. Para algunas corrientes de microscopía de localización de una sola molécula, un campo de una sola molécula densa puede ser analizado utilizando un algoritmo modificado 42 o 43 comprimidos de detección. La adaptación de estas estrategias también puede acelerar iPalm al permitir que las imágenes de una sola molécula más densas y, por lo tanto, un menor número de fotogramas.

Con las limitaciones en la velocidad y la imagen rango y fortalezas en la resolución espacial, una aplicación importante para iPalm es como un método ultraestructural que aprovecha las ventajas de marcaje fluorescente para dar a conocer la organización a nanoescala de proteínas específicas 14,15,44. Nuevas mejoras, tanto en términos de tecnologías ópticas y de fluoróforos, debería permitir una mejora adicional de la resolución espacial iPalm. Por ejemplo, el procesamiento de imágenes iPalm actualmente emplea un enfoque de aproximación de primer orden relativamente simple, con cada molécula individual modelado por una función de 2D-gaussiana y comoconsumida ser un isotópicamente promediado dipolo. Esto podría ser aumentado con métodos recientes, que emplean un modelo más preciso de la función de punto-propagación y la orientación del dipolo, o tratamiento explícito de las aberraciones ópticas en todo el campo de visión para mejorar significativamente la resolución espacial. Del mismo modo, photocaging ha informado, lo que mejora el brillo fluoróforo en órdenes de magnitud 45. De hecho, ya han sido bien caracterizado elementos clave de su organización ultraestructural, el citoesqueleto de actina F podría ser un sistema modelo altamente valiosa para probar nuevos desarrollos metodológicos en iPalm. Se espera que la capacidad de analizar la organización de proteínas mediante microscopía de luz con una potencia verdadera EM-nivel resolver para mejorar en gran medida nuestra comprensión de aspectos diversos de su estructura y función celular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

YW y PK agradecen el apoyo financiero de la Fundación de Investigación Nacional de Singapur, adjudicado a PK (NRF-NRFF-2011-04 y NRF2012NRF-CRP001-084). Agradecemos también a los abiertos instalaciones de laboratorio y de núcleo microscopía MBI para apoyo a la infraestructura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
optical table Newport, CA RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table Newport, CA S-2000
laser-642 Newport, CA 1185055 output power=100 mw
laser-561 Newport, CA 1168931 output power=200 mw
laser-488 Newport, CA 1137970 output power=200 mw
laser-405 Newport, CA 1142279 output power=100 mw
broadband dielectric mirrors Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA 05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4) Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF

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References

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