معلومات الهيكلية من جزيء واحدة الحنق التجارب باستخدام سريع نانو لتحديد المواقع نظام

* These authors contributed equally
Biochemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

تحديد بنية جزيء حيوي هو شرط أساسي لفهم وظيفتها. طريقتين راسخة لتحديد هيكل هي المجهري البرد الإلكترون والأشعة السينية البلورات 1 و 2. اليوم، توفر كلتا الطريقتين عالية الدقة المعلومات الهيكلية مع قرار وصولا الى مستوى انجستروم. وقد استخدمت هذه الأساليب اثنين على نطاق واسع لتوضيح بنية الجزيئات الحيوية الكبيرة مثل المجمعات البروتين. على الرغم من أن الطرق الحالية وباستمرار قد تحسنت خلال العقود الماضية، وتعقيد الهياكل البيولوجية لا يزال يشكل تحديا كبيرا بالنسبة لعلم الأحياء الهيكلي، لا سيما عندما يتم التحقيق في المجمعات الكبيرة، ودينامية وعابرة 3.

من أجل دراسة ديناميكية الجزيئات المجمعات والعلاقة بين الهيكل وظيفة على وجه الخصوص، منهجيات جزيء واحد لها الأقليمعيديد معلومات مفيدة 4. وقد وضعت عدة استراتيجيات جديدة توفر نهجا متعامد على الحصول على المعلومات الهيكلية ودينامية. ومن الأمثلة على ذلك سرعة عالية AFM والتلاعب الميكانيكية مضان توطين المجهري وكذلك جزيء واحد نقل فورستر الرنين الطاقة (smFRET) 9. منذ وقت مبكر جدا على الحنق اصطلح على تسميته حاكما الجزيئي، ويرجع ذلك إلى اعتماد المسافة على مقياس طول الجزيئات الكبيرة الحيوية 10.

تطبيق واحد للاهتمام بشكل خاص من smFRET هو استخدام المعلومات بعد الحصول عليها من القياسات smFRET للاستدلال الهيكلية المعلومات 11، 12، 13، 14، 1516، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23. نظرا لدقة الوقت قد حان لsmFRET، والموقف من أجزاء متحركة من بنية البروتين يمكن أن يكون موضعيا. ومع ذلك، من أجل انتزاع معلومات كمية من البيانات smFRET المعلمات تصحيح هامة حول جزيئات الصبغة تحتاج إلى أن تحدد خلال قياس 24. مع هذه العوامل التصحيح، ويمكن حساب كفاءة الحنق E الحنق باستخدام الصيغة

المعادلة 1 ،


حيث أنا وأنا وD يو بي> هي شدة مضان من الجهات المانحة وجزيء متقبل، على التوالي (انظر الشكل 2). حسابات β-عامل عبر الحديث، وتسرب الانبعاثات المانحة في القناة متقبل ويحسب من قبل

المعادلة 2

حيث أنا وأنا و'D هي شدة مضان من الجهات المانحة وجزيء متقبل بعد التبييض صورة للجزيء متقبل.

وγ عامل تصحيح الفرق في الكفاءة كشف النسبية في القناتين، وكذلك الاختلاف في العائد مضان الكم من المتبرع وصبغ متقبل. ويتم حسابه من كل أثر الوقت الفردية من قبل

تيل = "مواءمة النصوص: مركز؛"> المعادلة 3

ملاحظة، أن هذا الوصف يتجاهل الإثارة المباشرة للجزيء متقبل، والتي تصبح أحيانا مهمة ويحتاج إلى تصحيح للكذلك. لتحديد هذه العوامل تصحيح فمن المفيد أن تثير كل من الجهات المانحة وكذلك متقبل في مخطط بالتناوب 25 من أجل التفريق بين التغيرات الصورة المادية وديناميات الهيكلية.

من أجل الحصول على الكفاءات smFRET الكمية ولكن أيضا المعلومات الهيكلية الكمية فحسب، تم إدخال نظام النانو لتحديد المواقع (NPS) في عام 2008 (26). وقد تم اختيار اسم على أساس التشابه لنظام تحديد المواقع العالمي القائم على الأقمار الصناعية (GPS). مصادر القدرة النووية هي تقنية هجينة تجمع بين smFRET والبيانات البلورات الأشعة السينية لتوطين الوظائف صبغة غير معروفة في المجمعات biomacromolecular. جيخدم بنية rystal كإطار مرجعي وتستخدم نتائج smFRET للحصول على معلومات المسافة بين موقف معروف fluorophore (هوائي) وموقف معروف من التركيب البلوري (الأقمار الصناعية). في تجارب متتالية يتم قياس المسافات بين الهوائي والعديد من الأقمار الصناعية ويتم تحديد الموقف من الهوائي عن طريق نظام تحليل دقيق إحصائيا على أساس تقدير المعلمة النظرية الافتراضية. ونتيجة لذلك، يتم احتساب ليس فقط الأكثر ترجيحا موقف الهوائي، ولكن كامل توزيع 3D عدم اليقين، ما يسمى الخلفي، تصور من قبل وحدات التخزين ذات مصداقية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع NPS للسماح لتحليل الشبكات smFRET كاملة 27.

تم استخدام NPS إلى حل عدد من المسائل الهامة في النسخ حقيقية النواة، وهي بالطبع من الحمض النووي المنبع، الحمض النووي غير القالب ومرنا الوليدة داخل استطالة شارك RNA البلمرة الثانيmplex 12، 28، أيضا مما يدل على تأثير بدء النسخ العوامل 26 و الهندسة المعمارية الديناميكية ل-PROMOTOR فتح مجمع 29. وعلاوة على ذلك، تم استخدام مصادر القدرة النووية لتوضيح هيكل archaeal RNA البلمرة مجمع مفتوح 30 وخاصة موقف من بدء النسخ عامل TFE، الذي يربط بشكل تنافسي لنفس الموقع كما عامل النسخ استطالة Spt4 / 5 31.

منذ ذلك الحين، تم نشر عدد من النهج الهيكلية smFRET أساس 15، 18، 21، 23. عند مقارنة أساليب مختلفة الهيكلية smFRET مقرها، يصبح من الواضح أن الدقة الواضحة للطريقة تعتمد بشكل كبير على اختيار معين من نماذج صبغ. ينبغي للمرء أن يلاحظ أنجزيئات الصبغة قد يحمل السلوك المكاني وتوجهي مختلفة اعتمادا على بيئتهم المحلية.

تحقيقا لهذه الغاية، وقدم سريعة NPS 32. يستخدم سريع NPS خوارزمية أخذ العينات المتقدمة لحد من الأوقات حساب بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، سريعة NPS يسمح احد لإجراء التحليل البنيوي ولكل جزيء صبغ يمكن للمستخدم الاختيار من بين مجموعة من خمسة نماذج صبغ المختلفة التي من شأنها أن يوصف المقبل. النموذج الأكثر محافظة، ودعا الكلاسيكية، ويفترض أن الصبغة تحتل واحدة فقط، ولكن غير معروف، موقف. في هذا الموقف، يمكن للfluorophore تدوير بحرية داخل مخروط، التي يتم تحديدها من المعنيين (التي تعتمد على الوقت) تباين مضان حجمها. توجه مخروط غير معروفة، الأمر الذي يؤدي إلى شكوك كبيرة عند تحويل الكفاءة smFRET قياسها إلى مسافات. في هذا الصدد، وهذا النموذج هو المحافظ، لأنه سوف يؤدي إلى أصغر الدقة مقارنة مع وضع صبغة أخرىليرة سورية. فقط لمسافات قصيرة جدا يجب أن الافتراضات التي وضعتها القيادة النموذج التقليدي لتحديد موقف غير صحيح بشكل ملحوظ. للقيم smFRET نموذجية، والموقف الصحيح ومرفق طيه دائما في حجم مصداقية كبيرة نسبيا.

ومع ذلك، منذ دقة أعلى أمر مرغوب فيه، فمن المهم لتطوير واختبار نماذج صبغ البديلة، التي يمكن أن تساعد على تحسين الدقة. إذا الصبغة تدور أسرع بكثير من عمر البطارية مضان الأصيل، يمكن تطبيق ما يسمى نموذج ايزو. هنا، فإن العامل التوجه κ 2 (حاجة لحساب مميزة الخواص فورستر دائرة نصف قطرها المعادلة 1 ومن المقرر) إلى 2/3. ونتيجة لذلك، وحدات تخزين ذات مصداقية حسابها هي ما يقرب من أوامر من حجم أصغر بالمقارنة مع تلك الموجودة في النموذج التقليدي 32. في حالة أن يتم العثور على fluorophore في بيئة تمكن ليس فقط reori سريعentation، ولكن الحركة السريعة بالإضافة إلى جميع أنحاء حجمه الوصول إليها، يجب استخدام نموذج meanpos-ايزو. في هذا النموذج، وصبغ تحتل فعال واحد فقط الموقف نفسه، حيث يتم احتساب المتوسط المكاني لمن تحويل المسافة متعدد الحدود 15. ينطبق هذا النموذج على سبيل المثال إذا تم توصيل (عادة مسعور) صبغ إلى المنطقة المائية، على سبيل المثال، الحمض النووي. تطبيق النموذج meanpos-ايزو يؤدي إلى مزيد من الانخفاض في حجم وحدات التخزين ذات مصداقية من قبل عامل ما يقرب من اثنين. ومع ذلك، صبغة مرتبطة البروتين قد ربط عكسية لعدة بقع مسعور في حجم الوصول sterically لها (AV). وfluorophore أن يتحول على الفور بين هذه المناطق، ولكن ضمن منطقة واحدة يخضع دوران حر والحركة المحلية بسرعة هو أفضل وصف من قبل نموذج فار-meanpos-ايزو. لوضع مماثل في الذي الصبغة ليست حرة لتدوير فار-meanpos ينطبق النموذج. المزيد د etails على حول هذه النماذج يمكن العثور عليها في موقعنا نشر مؤخرا 32.

وتوفر هذه النماذج بخيار واسع لحساب خصيصا لبيئات مختلفة قد تواجه صبغة وتطبيقها يحسن بحكمة دقة الترجمة لها. في الوجبات NPS كل جزيء صبغ تعلق على موقف محدد يمكن أن تسند إلى نموذج فردي، بحيث يتم السماح الحنق-الشركاء لدينا نماذج مختلفة. وهذا يتيح بلا حدود وثيق لطبيعة النمذجة. ومع ذلك، فمن المهم أن واحد يؤدي الاختبارات الإحصائية صارمة لضمان أن النتيجة التي تم الحصول عليها عن طريق الجمع بين النموذج النهائي لا يزال في اتفاق مع البيانات التجريبية. يتم تضمين هذه الاختبارات في البرنامج سرعة ومصادر القدرة النووية.

من أجل تطبيق سريع NPS على البيانات التجريبية مطلوب قياس (فقط) ثلاث معلمات الإدخال. أولا، صبغ زوج معين الخواص فورستر أنصاف أقطار (/54782/54782eq5.jpg "/>) ويتم تحديدها بعد. لذلك، فإن العائد الكم (QY) من الصبغة المانحة وأطياف الانبعاث مضان المانحة وأطياف امتصاص متقبل تحتاج إلى قياس. ويمكن إجراء هذه القياسات في الجزء الأكبر، وذلك باستخدام مطياف معيار ومقياس الطيف مضان القياسية. لكل زوج، وR 0 ثم يتم احتساب باستخدام PhotochemCAD مجانية، ويمكن استخدامها في تحليل NPS. وعلاوة على ذلك، (الزمان-حل) anisotropies مضان من جزيئات الصبغة تحتاج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الاستقطاب (والوقت) حساسة مضان مطياف. ومع ذلك، وإدخال المعلمات الأكثر أهمية بالنسبة للسرعة وNPS هي الكفاءة smFRET يقاس على إعداد مضان المجهري جزيء واحد، مثل مجموع الداخلية انعكاس مضان المجهر (TIRFM) .

هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة للحصول على بيانات smFRET وتطبيق سريعة NPS (الشكل 1).

Protocol

1. المتطلبات الأساسية ومعدات مختبر

ملاحظة: التجمع من غرفة القياس هو مبين في الشكل (3). وشطيرة تصميم غرفة قياس يضم ثلاثة عناصر رئيسية هي: أ زجاج الكوارتز (السيليكا تنصهر) الشرائح، وهو فيلم الختم وساترة أن يختم غرفة التدفق. هي التي شنت على غرفة القياس على صاحب العينة حسب الطلب. وتوجه أبعاد حجرة العينة وحامل معدني لتناسب على شريحة زجاجية مجهرية الكوارتز القياسية (76 ملم × 26 ملم).

  1. قطع الشرائح الزجاجية باستخدام الحفر الماس (0.75 ملم) في المناصب المشار إليها في الشكل (4) الكوارتز. تصميم الشرائح زجاج الكوارتز غير متماثل من أجل التفريق بين الجانبين من كل شريحة.
    ملاحظة: يمكن الشرائح الكوارتز إعادة استخدامها بعد قياس حتى يصبح سطح خدش.
  2. لتركيب غرف، استخدم أصحاب عينة معدنية مخصصة كما هو مبين في الشكل 5 </ قوي>. أصحاب العينة تحتوي على اثنين من الخيوط (M4) من أجل توصيل مدخل ومخرج أنابيب للغرفة التدفق. وعلاوة على ذلك، استخدم الخيوط (M3) لتركيب غرفة العينة على حامل معدني وكذلك المواضيع (M3) لتحديد صاحب المنشور على لالنصف السفلي من حامل معدني.
  3. إجراء قياسات smFRET على نوع منظور الكلي المجهر التأمل الداخلي مضان (TIRFM) (الشكل 6).
    ملاحظة: TIRFM يضم ثلاثة ليزر: والأخضر (532 نانومتر، والثانية: YAG ليزر) والليزر الأحمر (643 نانومتر، ليزر ديود) لإثارة المتبرع والجزيئات متقبل صبغ وكذلك استخدام الليزر الأزرق (491 نانومتر ، ليزر الحالة الصلبة الصمام الثنائي ضخ) لتبيض الشوائب الفلورسنت الخلفية في حجرة العينة السابقة لقياس smFRET. أشعة الليزر الثلاثة مجتمعة مكانيا ويمكن اختيار طريق تصفية الانضباطي صوتية البصرية (AOTF). ضوء مضان يتم جمعها من قبل هدف فتحة عالية، تنقسم إلى إحدى الجهات المانحة واستعرضأو قناة باستخدام مرآة مزدوج اللون والمتوقعة على اثنين من الكاميرات EM-CCD. ويرد حجرة العينة إلى مرحلة ميكرومتر السماح الحركة في X- و ص الاتجاه مع اثنين من المحركات السائر. ويستخدم المحرك بيزو الثالث جنبا إلى جنب مع الأشعة تحت الحمراء ليزر وجهاز للكشف عن حساسية الموقف لبناء نظام التركيز التلقائي لضمان التركيز الأمثل في كافة مراحل التجربة.
    1. استخدام بالتناوب الإثارة ليزر (ALEX) عندما لوحظت ديناميكية في مسارات وقت الحنق 25. يمكن أن يكون سبب هذه الديناميات إما عن طريق التغييرات متعلق بتكوين داخل جزيئات أو تقلبات في سطوع متقبل وامض متقبل.
      ملاحظة: ALEX يسمح للتمييز بين هذه الأسباب المحتملة اثنين ويمنع سوء تفسير مسارات الحنق ديناميكية. ومع ذلك، لأسباب من البساطة، ويقتصر الجزء بروتوكول لتحليل الأفلام المأخوذة دون ALEX.
      تحذير: يتم استخدام أشعة الليزر فئة 3B في الإعداد مضان جزيء واحد. تأكد من أن لا يكفياحتياطات السلامة سر، وفقا للوائح الحكومية المحلية، اتخذت قبل تشغيل النظام.
  4. إجراء قياس امتصاص المستخدمة لتحديد العائد الكم على الأشعة فوق البنفسجية-VIS الطيف (انظر المواد وطرق).
  5. إجراء قياس طيف الانبعاث مضان المانحة، وامتصاص الطيف متقبل وتباين مضان على مطياف مضان (انظر المواد وطرق).
  6. إعداد غرف عينة وفقا للإجراءات التي نشرت 33. بدلا من ذلك، ووصف الإجراء في [34] ويمكن استخدام.
  7. تسمية عينات التحقيق مع المانحين متقبل زوج صبغ جزيء ملاءمة لsmFRET وضمان وجود شاردة البيوتين اللازمة لتجميد على سطح حجرة العينة.
    ملاحظة: من أجل توطين وضع هوائي صبغة غير معروف مع برنامج سريعة NPS هناك حاجة إلى بنيات عينة مختلفة. كل بناء نeeds أن يكون تسمية واحدة في المجهول موقف الهوائي صبغ وتسمية واحدة في موقف الأقمار الصناعية المعروف من التركيب البلوري. هناك حاجة إلى ثلاث على الأقل بنيات مختلفة مع الأصباغ التي تعلق على موقف الهوائي وثلاثة مواقع السواتل مختلفة للحصول على نتائج دقيقة. القياسات بين الهوائيات وكذلك بين الأقمار الصناعية هي أيضا مفيدة لتحسين دقة، ولكن هذا يتطلب تبادل جزيئات الصبغة التي تحتاج إلى إدخالها بشكل صحيح في التحليل.

2. تركيب غرف التدفق في حامل مخصص

  1. سحب أنابيب السيليكون (ID 0.8 ملم، 2.4 ملم OD) إلى مسامير التبويب جوفاء (M4) وقطع أنابيب على طرفي ترك مباشرة فائض من 1 سم في كلا الجانبين باستخدام شفرة حلاقة حادة. ضبط تراكم من الأنابيب إلى حوالي 2 ملم على جانب واحد من المسمار التبويب.
  2. جبل غرفة التدفق إلى صاحب العينة بطريقة الفتحات الموجودة في شريحة زجاجية الكوارتز تطابق المواضيع في صاحب العينة. شدمدخل ومخرج مسامير بلطف للتأكد من أن مدخل ومخرج من حجرة العينة لا تزال للاختراق. تشديد بلطف المسامير الأربعة للحامل زجاج الاكريليك لتحديد موقف من غرفة التدفق.
  3. أنابيب قطع سيليكون (0.58 معرف مم، 0.96 مم OD) إلى 20 سم قطعة طويلة. إدراج واحدة من القطع إلى مدخل ومخرج المسمار من غرفة القياس. إغلاق مدخل ومخرج الأنابيب باستخدام المشبك.
    ملاحظة: يمكن تخزين غرف عينة تجميعها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين.

3. smFRET القياس على TIRF المجهر

  1. استخدام حقنة لغسل حجرة العينة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. منع فقاعات الهواء من دخول حجرة العينة في جميع الأوقات من خلال خلق قطرة في نهاية الأنبوب مدخل قبل تغيير إلى حل العازلة مختلفة.
  2. تدفق حجرة العينة مع 100 ميكرولتر neutravidin (0.5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) حل واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. غسلمن الحل neutravidin مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. المسمار حامل معدني لموشور على حجرة العينة.
  5. جبل حجرة العينة للمرحلة ميكرومتر من TIRF-المجهر. تأكد من تركيب حجرة العينة أفقيا كما مستقيم ممكن أمام الهدف لتجنب defocusing خلال عملية المسح الضوئي.
  6. بدء تشغيل برنامج مراقبة الكاميرات EM-CCD وبرنامج للسيطرة على بيزو المحركات المرحلة.
  7. ضبط بؤرة الهدف المجهر من خلال النظر في انعكاسات ليزر الأشعة تحت الحمراء.
  8. وضع منظور (PS991، ن = 1.52) على رأس صاحب موشور المعادن. ضبط الموقف الجانبي من منظور للتأكد من أن أشعة الليزر ضربت منظور ثم استخدام لاصقة واحتضان للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: موشور الخيالة يمكن إعادة استخدامها عن طريق تنظيف.
  9. في كاميرا مراقبة البرمجيات فوق "اكتساب الإعداد" وتحديد معايير اكتساب التالية: 100 مللي integratالوقت أيون، و 401 لقطة / فيلم (الكاميرا الخضراء)، 400 لقطة / فيلم (الكاميرا الحمراء)، مضاعف الإلكترون كسب 225، قبل مكبر للصوت 5X الربح وقراءات معدل 3 ميغاهيرتز في 14 بت.
  10. إنشاء مجلد على القرص الثابت المحلي للقياس. اختيار الاسم الذي تريده لملفات القياس، على سبيل المثال، السنة-شهر-يوم. في البرنامج الإعدادات انتقل إلى "لصناعة السيارات في حفظ" متسابق، تمكين "حفظ تلقائي" واختيار شكل ملف * .sif لشراء الفيلم. حدد مجلد على القرص الثابت. استخدام اسم المجلد مثل filestem.
  11. تمكين "AutoIncrement" (قيمة مجموعة بداية ل1) وظيفة. تمكين المرفق من مشغل إلى اسم الملف. استخدام "دون" و "ACC" على المتبرع والقناة متقبل، على التوالي. اختيار "_" كفاصل.
  12. في كاميرا مراقبة البرمجيات اضغط على "فيديو" لبدء صورة حية من كاميرا والخلفية التبييض مضان عن طريق مسح حجرة العينة باستخدام أقصى كثافة الليزر من جميع الليزر الثلاث (كومbined و≈3،000 واط / سم 2 لمدة 10 ثانية لكل مجال الرؤية).
  13. إيقاف تشغيل الليزر الأزرق. تقليل كثافة الليزر الأخضر لحوالي 200 واط / سم 2 وحوالي 40 ميغاواط / سم 2 ليزر أحمر إذا تم استخدام بالتناوب الإثارة ليزر (ALEX).
  14. تمييع عينة الفلورسنت المعقدة البيروكسيديز إلى تركيز من 50-100 م. تحميل 100 ميكرولتر من الحل. ويجمد العينة على سطح الغرفة على ملزمة.
    ملاحظة: تأكد من عدم التحميل الزائد للغرفة. يجب فصل الجزيئات المجاورة من بعضها البعض.
  15. إذا لزم الأمر، تحميل 100 ميكرولتر إضافية من 2X عينة أكثر تركيزا للغرفة.
  16. اغلاق مدخل ومخرج أنابيب من غرفة القياس باستخدام المشابك بعد اكتمال التحميل.
  17. إيقاف جميع أجهزة الليزر واستخدام بيزو المحركات لنقل غرفة تدفق حقلين نظر أبعد من ذلك.
  18. في برنامج كاميرا مراقبة انقر على "خذ إشارة" لبدء تسجيل فيلم والتبديلعلى الليزر في نفس الوقت. تأكد من أن أكثر من 80٪ من الجزيئات ابيض قبل نهاية الفيلم عن طريق ضبط قوة الليزر.
  19. كرر الخطوات من 3.17 و 3.18 لعينة prebleached المنطقة الغرفة بأكملها.

4. الاستحواذ على خريطة التحول ( "beadmap")

  1. إعداد غرفة التدفق كما هو موضح في الأقسام 1.1، 1.2 و 2.
  2. استخدام الخرز متعددة الأطياف الفلورسنت المغلفة أفيدين التي تظهر مضان الانبعاثات في المانحة والقناة متقبل. دوامة الأسهم لمدة 1 دقيقة، ثم تمييع 50 ميكرولتر من الأسهم في 50 ميكرولتر ده 2 O. دوامة مرة أخرى لمدة 1 دقيقة، يصوتن 1-2 دقيقة، ثم دوامة 10 ثانية أخرى.
  3. تنفيذ الخطوات الموضحة لقياس smFRET (القسم 3،5 حتي 3،10).
  4. تحميل 100 ميكرولتر (1 حجم الغرفة) من 1: 2 المخفف الخرز الفلورسنت في غرفة التدفق. انتظر 10 دقيقة لحبات الفلورسنت لربط إلى السطح.
  5. استخدام المعلمات الاستحواذ في 3.9 ولكن تشانجنرال الكتريك مدة الفيلم إلى 26 (الكاميرا الخضراء) و 25 (الكاميرا الحمراء)، والربح المضاعف الإلكترون إلى 10.
  6. تعيين كثافة الليزر الأخضر إلى قيمة 20 واط / سم 2.
  7. خذ فيلم واحد في مجال الرؤية مع ما يقرب من 50-100 الخرز.

5. معالجة وتحليل البيانات smFRET

  1. استخدام مخصصة مكتوبة برنامج SM الحنق لتحليل beadmap (انظر المواد وطرق) والأفلام المكتسبة. بدء تشغيل البرنامج viewPlot1.m.
  2. انقر على تحليل | تحليل دفعة، قم بإلغاء تحديد خيار "ALEX" إذا لم يتم استخدامه. للحصول على أفضل أداء اختيار عتبة لذروة النتيجة "عالية". اضغط موافق".
  3. اختيار "لا" عندما سئل عما اذا كان قد تم تحليلها في beadmap. تصفح المجلد الذي يحتوي على beadmap المكتسبة وتحديد * ملف .sif (عن طريق النقر المزدوج على ذلك). في الحوار نافذة الصحافة المقبل "موافق".
    ملاحظة: إذا حللت beadmap بالفعل في تدبير السابقمنة، اختر "نعم" هنا وحدد beadmap حفظها من خلال التصفح إلى المجلد الصحيح والنقر المزدوج على beadmap * ملف .MAP. تابع الخطوة 5.8.
  4. اختيار اثنين من الخرز واحد المتمركزة في عكس زوايا من مجال الرؤية. كثافة بكسل هي من اللون الأزرق الداكن (كثافة منخفضة) مرمزة إلى الأحمر الداكن (كثافة عالية).
  5. انقر على وسط حبة الأولى. إذا كان مركز جزيء يمكن أن يكون موجودا بشكل واضح في لون الترميز، اختر "نعم" أو آخر فوق "لا" واختيار زوج جزيء آخر.
  6. وضع التقاطع على بكسل تظهر أقصى كثافة ثم اضغط على "الاحتفاظ". كرر هذه العملية مع القناة الثانية.
  7. انقر على جزيء في الزاوية المقابلة وكرر الخطوات من 5.5 و 5.6.
    يتم عرض هذا التحول بكسل النسبي للقناتين في إطار الأوامر ويتم حفظ الخريطة تحول تلقائيا * ملف .MAP إلى المجلد الذي يحتوي على beadmap * .sif الملف <: ملاحظة./ لى>
  8. لتحميل المانحة ومتقبل الأفلام (* .sif) ل"تحليل دفعة"، استعرض للوصول إلى مجلد، حدد كافة الأفلام التي يتم تحليلها وانقر على "موافق". في إطار الحوار التالي، اضغط على "موافق".
    ملاحظة: يتم الانتهاء من التحليل دفعة عندما يبدأ الممر الماضي المعروضة في إطار الأوامر مع "تحليل تشطيب ...". يتم عرض الجزيئات المكتشفة في نافذة جديدة، مما يدل أيضا على التحول النسبي للالمانحة ومتقبل قناة تحديد من خريطة التحول.
  9. لتحميل ملفات الأفلام دفعات انقر على ملف | تحميل. قم بإلغاء تحديد خيار "ALEX" إذا لم يتم استخدامه. تعيين smoothwidth إلى 10 ثم انقر على "موافق". اختيار المجلد الذي يحتوي على ملفات .ttr * وانقر على "تحديد كافة" و "موافق" في قائمة السياق المقبلة.
  10. إذا يتميز التتبع عرض مراحل مميزة smFRET (الشكل 2) الصحافة على زر تبديل "ليس اختيار" و لأول مرةتحديد نقطة زمنية من بداية الحدث الحنق عن طريق تحريك خط مع مؤشر الماوس والنقر على زر الماوس الأيسر. بجانب تحديد نقطة زمنية من تبييض جزيء متقبل وأخيرا نقطة زمنية من تبييض جزيء المانحة.
  11. في الإطار التالي يتم رسم الحنق الكفاءة في الزرقاء. لتحديد الصحافة أثر على زر "نعم" على خلاف ذلك اختيار "لا". لإعادة الوصول-أثر الوقت انقر فوق الزر "السابق".
  12. كرر الإجراء حتى الجزيء الأخير من الفيلم.
  13. بعد تحليل جزيء الماضي في فيلم إنقاذ آثار مختارة من خلال النقر على "ملف | حفظ". إنقاذ آثار مختارة في نفس المجلد مثل ملفات .sif *.
  14. كرر الخطوات 5،10-5،13 لجميع الأفلام المكتسبة.
  15. تنفيذ combine_fret_results.m البرنامج. حدد المجلد الذي يحتوي على ملفات * .res وجميع الملفات * .FRETonly_trace. حفظ الحنق والإطار الحكمة ملفات الحنق جزيء من الحكمة كما MW.dat وFRW.dat، على التوالي.
    ملاحظة: يتم حفظ ملفات dat * كملفات ASCII. يحتوي الملف FRW.dat ستة أعمدة وصف واحد لكل الإطار الحنق. يحتوي العمود السادس على تصحيح الإطار الحكمة كفاءة الحنق. يحتوي الملف MW.dat 21 الأعمدة وصف واحد في الجزيء الحنق المحدد. يحتوي العمود الثالث الحنق الكفاءة جزيء الحكمة.

6. عرض بيانات smFRET في المدرج الإحصائي

ملاحظة: من أجل استخراج كفاءة smFRET يعني جميع البيانات smFRET سجلت يتم رسم البيانات الإطار الحكمة أو البيانات جزيء الحكمة في رسوم بيانية وتحليلها باستخدام التمويه يناسب (متعددة) القمم. في ما يلي، يستخدم بروتوكول برنامج تحليل البيانات التجارية (انظر قائمة المواد). ومع ذلك، أي برنامج آخر متوفر يمكن استخدام بدلا من ذلك.

  1. فتح برامج تحليل البيانات (انظر قائمة المواد). انقر على ملف | استيراد | ASCII متعددة. حدد المجلد الذي يحتوي على الملف FRW.dat. حدد الملف ثم اضغط على "موافق & #34 ؛. قبول خيار المدخلات مع "موافق" دون تغيير.
  2. حدد العمود الثالث C (Y) التي تحتوي على الكفاءات الحنق تصحيح، انقر بزر الماوس الأيمن على عمود وحدد قطعة أرض | الاحصائيات | الرسم البياني. في نافذة الرسم البياني انقر نقرا مزدوجا فوق على الأعمدة وإلغاء "binning التلقائي" وحدد المطلوب بن الحجم، على سبيل المثال، 0.05. أيضا اختيار بداية ونهاية القيم، على سبيل المثال، -0.025 و 1.025.
  3. حدد أعمدة الرسم البياني من قبل اليسار النقر عليها. ثم انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "الذهاب إلى بن ورقة عمل". حدد العمود "التهم" من قبل اليسار النقر عليها ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق وحدد قطعة أرض | العمود / بار / فطيرة | العمود.
  4. في شريط عمود مؤامرة الذهاب إلى تحليل | تركيب | غير الخطية منحنى صالح | الحوار فتح. اختيار "التمويه" تحت وظيفة ثم انتقل إلى المتسابق "معلمة". إلغاء السيارات المعلمة التهيئة. إصلاح قيمة الإزاحة (Y0) في 0. اضغط على "صالح".
    ملاحظة: وظيفة تناسب فضلا عن دي المناسبيتم عرض ذيول الآن في المؤامرة العمود. قيمة "اختراق الضاحيه" يعطي مركز وظيفة مناسبة، أي يعني الحنق الكفاءة التي هي بمثابة معلمة الإدخال للبرنامج NPS.

7. قياس الكم الغلة

  1. أداء تحديد العائد الكم مع أسلوب النسبي مماثل للإجراء وصفه وورث وآخرون. 35، وذلك باستخدام رودامين 101 المذاب في الإيثانول (QY = 91.5٪) كمعيار.
  2. سجل أطياف الامتصاص في مطياف الأشعة فوق البنفسجية-VIS باستخدام حجم 80 ميكرولتر في كوفيت امتصاص 1 سم طول المسار. الامتصاصية في الطول الموجي التي سيتم استخدامها لإثارة مضان لابد ≤ 0.05.
  3. أطياف الانبعاث سجل في مطياف معايرة مصباح تعمل في وضع الفوتون العد. إجراء القياسات مع المستقطبات جلان طومسون في الإثارة (0 درجة) والانبعاثات (54.7 درجة) مسار (شروط زاوية السحرية) باستخدام SPECTR عرض النطاق الترددي الله من حوالي 5 نانومتر و 2.5 نانومتر للالإثارة وانبعاث مستوحد اللون، على التوالي. عينات الإجراء إلا بعد نقلهم إلى كفيت مضان مع 3 ملم طول مسار الرعاية جني أن معدل عدد لا يتجاوز 10 6 ق -1.
    1. حساب العائد الكم وفقا ل

المعادلة 6

حيث n و n الأمراض المنقولة جنسيا هي مؤشرات الانكسار المذيب من العينة والمعايير، على التوالي. و (λ) وf_Std (λ) هي شدة مضان من العينة والمعايير في λ الطول الموجي. ألف (λ السابق) و A الأمراض المنقولة جنسياالسابق) هي امتصاص العينة والمرجعية في الطول الموجي الإثارة وΦ الأمراض المنقولة جنسيا هو العائد الكم من المعيار.

لو "> 8. حساب من الخواص فورستر الشعاع

  1. حساب نصف قطر الخواص فورستر ( المعادلة 5 ) من طيف الانبعاث للجزيء المانحة وطيف الامتصاص للجزيء متقبل، والعائد الكم من الجهات المانحة ومعامل الانكسار من الوسط. استخدام PhotochemCAD مجانية لحساب المعادلة 1 . لكن أي برامج أخرى متاحة يمكن استخدامها بدلا من 36.

9. قياس من Anisotropies

  1. تحديد anisotropies مضان ثابتة للدولة من تسجيلات لأطياف مضان مع مختلف البيئات المستقطب الإثارة / الانبعاثات (V / V، V / H، H / V، H / H) 36.
  2. حساب G-عامل، الذي يصحح التحف الاستقطاب الصك، لكل طول موجي مننسبة

المعادلة 9

واستخدامها لحساب قيمة تباين لكل طول موجي:

معادلة 10

حيث أنا XY يدل على شدة لإثارة الاستقطاب x و الاستقطاب الانبعاثات ذ.

  1. متوسط ​​القيم عبر النطاق الطيفي الانبعاثات لحساب مضان تباين ثابتة للدولة.

10. تركيب البرمجيات السريع NPS

  1. تحميل UCSF الوهم من http://www.cgl.ucsf.edu/chimera واتبع دليل التثبيت.
  2. انتقل إلى موقع "معهد الفيزياء الحيوية"في جامعة أولم: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. تحميل الإصدار الحالي من الوجبات NPS واستخراجها إلى مجلد في الاختيار. فتح فرعي "القابلة لإعادة التوزيع" وتثبيت ++ القابلة لإعادة التوزيع البصرية C الذي يتناسب مع النظام.

11. توسيط ملف PDB

  1. فتح ملف PDB (ق) من الفائدة في الوهم. تحديد كافة ذرات مجمع الجزيئات وحساب إحداثيات النقطه الوسطى (أدوات | تحليل هيكل | محاور / الطائرات / Centroids | تحديد النقطه الوسطى ... | طيب).
  2. فتح رد دخول (المفضلة | رد دخول) وأداة للتحول (أدوات | الحركة | تحويل الاحداثيات). إدخال إحداثيات النقطه الوسطى هو مبين في الرد دخول في مربع النص "التحول" من نافذة تحويل الإحداثيات وتغيير علامة على كل تنسيق. اضغط على "تطبيق" وحفظ الملف مع "حفظ فوسفات" (ملف | حفظ PDB).

12. إعدادحتى رؤساء أديرة الوظيفة

ملاحظة: تعتبر جميع القيم في انجستروم.

  1. بدء لغة الحوسبة التقنية وتغيير المجلد الحالي إلى المجلد السريع NPS المحلي. أدخل في إطار الأوامر: FastNPS.
  2. إنشاء jobfile جديدة في إدارة المشاريع (مشروع | جديد).
  3. إعداد موقف مسبق (أدوات | نموذج صبغ قبل).
  4. في لوحة "أساسيات السابقة" تحديد القرار المكانية للموقف قبل عن طريق إدخال قيمتها (2 مستحسن).
  5. استبعاد المناطق الداخلية من جزيء من خلال تفعيل مربع الاختيار والنقر على زر "تحميل فوسفات". اختيار وتحميل ملف PDB تركز على النحو المبين في المادة 11.
  6. تحديد قطرها التقريبي (ينصح 13 Å، انظر المناقشة) من الصبغة عن طريق إدخال قيمتها.
  7. أدخل مسافة skeletonization، أي المسافة جزيء صبغ قد تخترق جزيء (ينصح 2 أ).
  8. في اللوحة "الحد الأقصى لحجم مسبق" إدخال إحداثيات الحد الأدنى والقصوى للموقف مسبق (موصى به: x في [-150150]، ص في [-150150] و z في [-150150]).
  9. عند تعريف الأقمار الصناعية، وتفعيل مربع "مرفق عبر رابط مرونة" في لوحة "أساسيات السابقة" وأدخل في لوحة "رابط" إحداثيات ذرة (في ملف PDB تركزت) الذي يتم إرفاق جزيء صبغ. وعلاوة على ذلك، تحديد طول وقطر رابط عن طريق إدخال قيمها (يوصى 13 Å و 4.5 Å، انظر المناقشة). في حالة وجود هوائي تخطي هذه النقطة.
  10. اضغط على زر "حساب حجم يمكن الوصول إليها".
  11. انقاذ الموقف قبل اختياريا وتصديره لأغراض التصور باستخدام برنامج مثل الوهم.

13. تعريف الهندسة الشبكة

  1. فتح قياس النافذة (الوضع | تحرير الهندسة) تعريف.
  2. خلق جزيء صبغة جديدة عن طريق الضغط على بعقبعلى "الجديد" في "الأصباغ" لوحة.
  3. تعيين تباين مضان لها (المادة 9) عن طريق إدخال قيمة وتحديد نموذج صبغ ضمن القائمة المنسدلة "نموذج صبغ".
  4. اضغط على زر "تحميل"، حدد موقف المقابلة السابقة وتحقق من خانة الاختيار تنشيط للصباغة. كرر هذا الإجراء لجميع الأصباغ، أي لجميع الهوائيات وكذلك لجميع الأقمار الصناعية.
  5. بعد إنشاء كل الأصباغ، وتحديد القياسات. إنشاء قياس جديد بالنقر على "الجديد" في "القياسات" لوحة.
  6. اختيار شركاء الحنق في القوائم المنسدلة "Dye1" و "Dye2" أدناه.
  7. أدخل كفاءة smFRET مع الخطأ والخواص فورستر دائرة نصف قطرها من هذا الزوج صبغ.
  8. وأخيرا، تحقق من خانة الاختيار تنشيط القياس. كرر هذا الإجراء لكافة القياسات.
    ملاحظة: في كثير من الأحيان الشبكة تصبح معقدة على نحو متزايد، بحيث يمكن للمستخدم الحصول على الخلط. من أجل الحيلولة دونر الأخطاء، والتحقق من شبكة بصريا عن طريق الضغط على زر "التحقق من الشبكة". يعرض الرقم الأصباغ تنشيط وتشير القياسات عن طريق خطوط ربط الأصباغ الحنق.

14. حساب

  1. فتح نافذة حساب (الوضع | حساب).
  2. إذا كان كل الصبغة في شبكة لديه نموذج معين تعيينه، حدد "تعريف المستخدم" وبدء الحساب عن طريق الضغط على "حساب". لدينا جميع الأصباغ في نفس النموذج، اختر واحدا من النماذج الخمسة (الكلاسيكية، ايزو، meanpos-ايزو، فار-meanpos-ايزو وفار-meanpos) ومتابعة.
    ملاحظة: إن إطار الأوامر تشير إلى تقدم العملية الحسابية. سوف سريع NPS تفعل ذلك مع رسالة منبثقة، عندما تم الانتهاء من الحساب.

15. التصور النتائج

  1. من أجل تصدير كميات موثوقة من الأصباغ، وفتح نافذة عرض النتائج (نموذج | عرض النتائج).
  2. الكثافة تصدير صبغ:
    1. تصديرالأصباغ منفردة أو جميع في وقت واحد. من أجل تصدير صبغة واحدة تحديده في لوحة "الأصباغ المعروض" ثم اضغط على "الكثافة التصدير". يدخل قرار (ينصح 2) واختيار نوع الملف للتصدير. على اليمين تتم معاينة كثافة وتظهر بعض من خصائصها الرياضية.
    2. من أجل تصدير جميع الأصباغ دفع في وقت واحد "دفعة تصدير".
  3. فتح الملفات كثافة مما أدى إلى الوهم.

16. الاتساق تحقق من المختار نموذج الجمع

  1. فتح نافذة عرض النتائج (نموذج | عرض النتائج). وإذا كان في لوحة "حساب معلومات" مربع نص "الاتساق" يعرض قيمة أقل من 90٪ النموذج الحالي لا يمثل الكفاءة smFRET تقاس بما فيه الكفاية وبالتالي فهي غير متناسقة.
  2. في حالة وجود تعارض الضغط على زر "الاتساق مفصل". البحث عن القياسات التي لها قيمة أقل من 90٪. إذا واحد أو أكثر صبغويشارك في الغالب الصورة في هذه القياسات، من المرجح أن يتسبب في تضارب نماذجها. النظر في نماذج صبغ مختلفة لهذه الأصباغ ثم أعد تشغيل الحساب السريع NPS.

Representative Results

النسخ هو الخطوة الأولى في التعبير الجيني في جميع الكائنات الحية. في العتائق، ويتم النسخ من قبل البلمرة RNA واحد (RNAP). مقارنة حقيقيات النوى، وRNAP archaeal يشبه الهيكلي واضحا إلى نظرائهم حقيقية النواة في حين وجود آلية النسخي أبسط. وهكذا، العتائق يمكن استخدامها كنظام نموذج لدراسة حقيقية النواة بدء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الثاني (بول الثاني). في الآونة الأخيرة، وقد تم تحديد الهيكل الكامل للمجمع مفتوحة archaeal RNA البلمرة من جزيء واحد الحنق ومصادر القدرة النووية. تم استخدام البيانات من تحليل مصادر القدرة النووية لبناء نموذج كامل archaeal مجمع PROMOTOR المفتوح، الذي يوفر معلومات مفيدة في آلية بدء النسخ.

لتوضيح هذا الهيكل، تم قياس الكفاءة smFRET بين جزيئات الصبغة هوائي غير معروفة تقع ضمن كوم PROMOTOR مفتوحةالصفيف والعديد من المعروف جزيئات الصبغة الأقمار الصناعية التي أدرجت في خمسة مواقع مرجعية في RNAP، التي هي معروفة من الهياكل البلورات (PDB معرف: 2WAQ) مواقف 37. كانت تعلق الأصباغ الهوائي إلى أي واحد من مواقع مختلفة على الحمض النووي غير القالب، الأعشى، TBP أو TFE. شبكة كاملة المستخدمة في هذه الدراسة تتكون من أكثر من 60 مسافات محسوبة.

الرقم 7 يصور نموذج كامل archaeal مجمع مفتوح PROMOTOR بنيت من تحليل NPS. وتضم PROMOTOR المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (الضوء والأزرق الداكن)، وRNA البلمرة (الرمادي) وبدء النسخ عوامل TBP (الأرجواني)، الأعشى (الخضراء) وTFE (الصفراء). وفرضه هذا النموذج مع نتائج تحليل NPS، وحدات تخزين ذات مصداقية، والتي تم حسابها باستخدام النموذج التقليدي (A)، ونموذج ايزو (ب)، ونموذج meanpos-ايزو (C)، ونموذج فار-meanpos-ايزو (D) و-meanpos فار نموذج (E).

شكل 1
الشكل 1: سير العمل من اقتناء وتجهيز المعلمات اللازمة لحساب سريع NPS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: المثالية الوقت كثافة مضان أثر للحدث smFRET. شدة مضان من الجهات المانحة (الخضراء) وجزيء متقبل (الحمراء) التي تبين مراحل مميزة الثلاثة، وهي الأول: smFRET، الثاني: مضان المانحة بعد photobleaching من متقبل، والثالث: خلفية مضان بعد photobleaching من الجهات المانحة.g2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: توضيح تخطيطي لغرفة تدفق للتجارب smFRET. هي التي شنت على غرفة التدفق على حامل معدني مخصصة مع أصحاب زجاج الاكريليك. وشطيرة تصميم غرفة التدفق يتكون من زجاج الكوارتز (السيليكا تنصهر) الشريحة مع اثنين من الثقوب لربط مدخل ومخرج الأنابيب، وهو فيلم الختم وساترة أن يغلق غرفة التدفق. هي التي شنت منظور لTIRF الإضاءة على النصف السفلي من الغرفة التدفق. توفر مسامير التبويب جوفاء مدخل ومخرج للغرفة التدفق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بديل = "الشكل 4" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" />
الشكل 4: إعداد شريحة زجاجية الكوارتز وفيلم الختم. الرسم الميكانيكي الشريحة زجاج الكوارتز التي تشير إلى مناصب من الثقوب (بالنظر في ملليمتر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الرسم الميكانيكي للغرفة التدفق. وبالنظر إلى التدابير لصاحب موشور الألمنيوم، الاكريليك أصحاب الزجاج والإطار تصاعد الألومنيوم في ملليمتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

igure 6 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/>
الشكل 6: توضيح تخطيطي من الإعداد TIRF منظور نوع يستخدم للتجارب smFRET. اختصارات المكونات البصرية: A، الفتحة. DM، مرآة مزدوج اللون. F، مرشح الانبعاثات؛ L، عدسة، M، مرآة، O، الهدف؛ P، موشور. مديرية الأمن العام، موقف حساس الصورة الصمام الثنائي. S، عينة. PS، مرحلة تحديد المواقع. تي، وتلسكوب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: نتائج المحاكاة من الافتراضات نموذجا مختلفا. تظهر جميع الصور الحمض النووي الريبي البلمرة archaeal (PDB معرف: 2WAQ، رأي كبار) جنبا إلى جنب مع نموذج لالمروج الحمض النووي (tDNA وntDNA باللون الأزرق والسماوي، على التوالي)، TBP (الأرجواني)، الأعشى (الخضراء) وTFE (أصفر)في archaeal فتح معقد 30. يتم فرضه على كميات معقولة لنتائج المحاكاة مصادر القدرة النووية من (A) إلى النموذج التقليدي، (ب) نموذج ايزو، (ج) نموذج meanpos-ايزو، (د) نموذج فار-meanpos-ايزو و (E) وفار -meanpos نموذج. وتظهر كافة وحدات التخزين على 68٪ المصداقية. على شبكات فار-meanpos الكلاسيكية وتتفق مع البيانات smFRET. في المقابل، الشبكات حيث لجميع الأصباغ يتم اختيار ايزو، meanpos-ايزو أو نموذج فار-meanpos-ايزو تتعارض مع البيانات المقاسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نقدم إجراء الإعداد والتجريبية لتحديد بدقة الكفاءات الحنق بين الأصباغ تعلق عبر linkers مرنة لالجزيئات الكبيرة، أي الأحماض النووية و / أو البروتينات.

من أجل ضمان قياسات دقيقة smFRET (القسم 3)، لا بد من استبعاد الهواء من غرفة التدفق في أي وقت أثناء القياس. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن لا تفرط في غرفة التدفق مع fluorophores. وfluorophores يجب أن تكون مفصولة بشكل واضح لضمان التحليل الصحيح. كما smFRET أزواج، والتي لا تظهر تبيض المتبرع يجب أن تستبعد من التحليل، تأكد من أن> 80٪ من الجزيئات في مجال الرؤية وابيض في نهاية الفيلم. لحساب التجانس في العينة β-عامل وγ عامل، تصحيح عبر الحديث والنسبية الكفاءة الكشف عن قناة المانحة ومتقبل، على التوالي، وتحسب لكل الحنق زوج على حدة.

= "jove_content"> يجب تعيين إعدادات الكاميرا (الوقت التكامل، وزيادة مضاعف الإلكترون، وزيادة ما قبل مكبر للصوت ونسبة قراءات وصفها في القسم 3.9) إلى القيم إعطاء أفضل المفاضلة بين إشارة إلى نسبة الضوضاء، مجموعة ديناميكية ووقت القرار. أنها تحتاج إلى إعادة ضبط للتجارب مختلفة أو إذا تم استخدام أجهزة مختلفة. تحتاج أعداد الإطارات لتكون مرتفعة بما يكفي لضمان أن معظم الجهات المانحة الجزيئات التبييض ضمن الوقت المراقبة.

للقياسات على مطياف مضان (الأقسام 7-9) حلا وسطا جيدا بين كثافة إشارة والقرار الطيفي من البيانات المسجلة لديها التي يمكن العثور عليها. لتحقيق هذه الغاية الشقوق في الإثارة وانبعاث الطريق من مطياف مضان يجب أن تتكيف تعتمد على الأداة المستخدمة وتركيز العينة.

وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم أسلوب التحليل السريع NPS للحصول على معلومات الهيكلية للmacrom عابرة أو ديناميكيةالمجمعات olecular. وقد تم تطبيق NPS للكشف عن طريق الحمض النووي حبلا غير القالب والموقف من عوامل النسخ الشروع في الحمض النووي الريبي البلمرة مجمع مفتوح archaeal. باستخدام شبكة تضم أكثر من 60 قياسات المسافة مختلفة، وأظهرت أن الوجبات NPS، مجهزة بمحرك أخذ العينات تنفيذها حديثا (Eilert، T.، بيكرز، M.، دريكسلر، F.، وميخائيل، J. قيد الإعداد)، يقلل من الوقت اللازم لتحليل هذه الشبكة smFRET المعقدة التي ≈2 أوامر من حجم، بالمقارنة مع الأصلي طريقة NPS العالمي 27. متجذر قوة الخوارزمية في العينات متروبوليس داخل جيبس ​​جنبا إلى جنب مع خطة هدأ الموازي. يظهر سريع NPS استنساخ الدقيق لنتائج شبكة ويتفق مع النتائج التي نشرت في وقت سابق 30.

وقد نشرت العديد من الطرق المختلفة التي تهدف إلى استنتاج المعلومات الهيكلية من القياسات smFRET 11 تصل>، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18. كل من هذه الطرق توفير واحد فقط نموذج صبغ معين. وهكذا، والأصباغ، التي لا تفي الافتراضات التي وضعتها نموذج منها، لا يمكن أن تستخدم أو أن يؤدي إلى المعلومات الهيكلية كاذبة. سريع NPS، على العكس من ذلك، يسمح لتحديد لكل صبغ جزيء نموذجا مختلفا. وهذا يساعد على تمثل السلوك بتكوين مختلفة على حد سواء، جزيء صبغ نفسها، فضلا عن رابط المستخدمة لتمسكه. والمناطق المحيطة بها الجزيئية المحلية للجزيء صبغ، فضلا عن خصائصه الفيزيائية تحديد النموذج الذي هو الأكثر ملاءمة.

لشبكة smFRET تحليلها من مجمع بدء archaeal، وهو افتراض الخواص لجميع جزيئات الصبغة يؤدي إلى انخفاض حاد طن حجم وحدات التخزين ذات مصداقية بالمقارنة مع النموذج التقليدي. في توليفة مع موقف ديناميكي المتوسط لجميع صبغ الجزيئات المتوسط من جميع الأحجام حجم موثوقة (في 95٪) يقلل إلى أقل من 0.5 نانومتر 3. ومع ذلك، هذه مؤخرات صبغ جزيء لم تعد تنسجم مع قياسات smFRET بهم، مشيرا إلى أن الافتراضات التي تؤدي إلى المعلومات الهيكلية كاذبة. في المقابل، فإن مؤخرات المحددة في النموذج التقليدي تتفق مع الكفاءات smFRET تحديدها.

كما تولي منصب الخواص و / أو متحركا في المتوسط ​​لجميع الأصباغ يؤدي إلى التضارب، سريعة NPS تمكن مقدمو الاديره صبغ جزيء فيها كل صبغة يمكن تعيين واحد من النماذج الخمسة. يستخدم كل نموذج نفس الحجم للوصول. خوارزمية لحساب الأسهم السعودية صبغ يجعل العديد من الافتراضات. في البداية، وتقريب الشكل المكاني للfluorophore من خلال المجال. وهكذا، فإن قطر مع الأخذ بعين الاعتبار دور المرأة في التنمية وfluorophore لوينبغي أن تستخدم عشر والطول والسمك (المادة 12). وعلاوة على ذلك، تم تقريب شكل رابط من قبل قضيب مرن. تم حساب القيم المعروضة في القسم (12) لصبغ اليكسا 647 المرفقة عن طريق رابط 12-C. حتى الآن، فإنه ليس من الممكن تحديد بدقة مسبقا النموذج الذي هو الأكثر ملاءمة، نظرا لهندسة التجريبية، وبالتالي يجب أن يتم اختبار جميع النماذج. بصفة عامة، فإن للمرء أن يختار النموذج الذي يعطي أصغر حجم ممكن الخلفي، في حين لا تزال متسقة مع البيانات. لاختبار ما إذا كان اختيار النماذج يتسق مع البيانات smFRET، نحسب كل من الخلفي واحتمال. الاتساق يعني أن أكثر من 90٪ من العينات التي تم جمعها من الخلفية تقع ضمن فاصل الثقة 95٪ من احتمال.

ولئن كان صحيحا أن لديهم أقل تباين، وأصغر من عدم اليقين بعد، في شبكة smFRET الترتيبات الهندسية للجزيئات الصبغة أيضا أن تؤخذ بعين الاعتبار. وهكذا، في حين صepresenting جزيئات الصبغة مع انخفاض تباين مضان مع نموذج ايزو هو الخيار الأول نموذجي، يوفر اختبار الاتساق وسيلة أكثر مباشرة لاختيار نموذج صبغ الصحيح. الخيار الأمثل للنماذج الصبغة يمكن أن يؤدي إلى زيادة كبيرة في توطين الدقة، وفي الوقت نفسه تحتفظ الاتساق الشبكة مع البيانات الخاصة به الحنق.

لتلخيص، وسرعة وNPS يسمح للحصول على المعلومات الهيكلية والدينامية للمجمعات الجزيئات الكبيرة. وعلى النقيض من الطرق الهيكلية المشتركة مثل البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني البرد وهذا يسمح لرصد المجمعات عالية مرنة أو عابرة، مما وسع كثيرا فهمنا الآلية معقدة من العمليات البيولوجية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flowchamber preparation
Customized metall sample holder self-built n/a
quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm Technical Glass Products 26007
coverslips, 60 mm x 24 mm Marienfeld 101242
detergent, Hellmanex II Hellma 320.001
ultra-pure water from Synergy UV Millipore 2512600
Zepto plasma cleaner Diener n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. Sigma-Aldrich A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa Laysan Bio Inc. MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa Laysan Bio Inc. BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate Sigma-Aldrich S5761 Sigma 
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S2127 Sigma-Aldrich 
sealing film (Nescofilm) Fisher Scientific 12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD Saint-Gobain Performance Plastics 720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) Fisher Scientific 12665497
Neutravidin Life Technologies A2666
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm Newport Spectra-Physics EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso Cobolt 904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart Toptica iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC Chroma F33-540
dichroic mirror, 476 RDC Chroma F33-476z
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm Thorlabs LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm Thorlabs
prism, PS 991 Thorlabs PS991
focusing lens, f = 75 mm Thorlabs LA1608-B
syringe pump, PHD 2000 Harvard Apparatus 70-2002
2 stepper motors, Z812B Thorlabs Z812B
piezoelectric actuator, PE4 Thorlabs PE4
IR diode laser Edmund Optics CPS808 part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR Chroma 775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A Thorlabs PDP90A part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 Nikon MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR Chroma 645 DCXR part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510 Omega Optical 3RD550-510 green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760 Omega Optical 3RD660-760 red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV Andor AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV Andor AND-20-000141
Miscellaneous
Varian 50 Cary UV-VIS spectrometer
Fluorolog2 SPEX fluorescence spectrometer
Solis (V4.15) Andor control software for the EM-CCD camera
Apt user utility  (V1.022) Thorlabs control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68 Thorlabs adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red Kisker Biotech avidin-coated fluorescent multispec beads 
Matlab Mathworks technical computing language for custon written software
Origin (V9.0) Originlab scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40 Hellma 105-202-15-40 absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40 Hellma 105-251-15-40 fluorescence cuvette with 3 mm path length

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
  2. Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343, (6175), 1102-1108 (2014).
  3. Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
  4. Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
  5. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
  6. Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
  7. Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, (5628), 2061-2065 (2003).
  8. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77, (1), 51-76 (2008).
  9. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43, (4), 1156-1171 (2014).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58, (2), 719-726 (1967).
  11. Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336, (2), 395-408 (2004).
  12. Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (1), 135-140 (2008).
  13. Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158, (3), 150-157 (2004).
  14. Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (26), 15516-15521 (2003).
  15. Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9, (12), 1218-1227 (2012).
  16. Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23, (August 2015), 110-115 (2015).
  17. Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107, (9), 2037-2048 (2014).
  18. Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
  19. Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88, (4), 2939-2953 (2005).
  20. McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99, (3), 961-970 (2010).
  21. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
  22. Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer. J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).
  23. Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17, (3), 318-324 (2010).
  24. Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26, (2), 161-193 (1979).
  25. Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38, (7), 523-533 (2005).
  26. Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5, (11), 965-971 (2008).
  27. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115, (41), 11927-11937 (2011).
  28. Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37, (17), 5803-5809 (2009).
  29. Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46, (2), 136-146 (2012).
  30. Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
  31. Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43, (2), 263-274 (2011).
  32. Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
  33. Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8, (7), 606-610 (2001).
  34. Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
  35. Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8, (8), 1535-1550 (2013).
  36. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer US. Boston, MA. (2006).
  37. Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7, (5), (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics