Strukturell Informasjon fra Single-molekyl FRET Eksperimenter Bruke Fast Nano-posisjonering System

* These authors contributed equally
Biochemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bestemmelse av strukturen til et biomolekyl er en viktig forutsetning for å forstå dens funksjon. To godt etablerte metoder for strukturbestemmelse er kryo-elektronmikroskopi og røntgen-krystallografi 1, 2. I dag, begge metodene gir høy oppløsning strukturell informasjon med en oppløsning ned til Angstrom nivå. Disse to metoder er blitt brukt i stor utstrekning for å klargjøre konstruksjonen av store biomolekyler slik som proteinkomplekser. Selv om eksisterende metoder har stadig blitt forbedret gjennom de siste tiårene, kompleksiteten i biologiske strukturer utgjør fortsatt en stor utfordring for strukturbiologi, spesielt når store, dynamiske og forbigående komplekser er undersøkt tre.

For å studere dynamikken i makromolekylære komplekser og struktur-funksjon relasjonen spesielt enkelt-molekyl metoder har provided nyttig informasjon fire. Flere nye strategier ble utviklet som gir en rettvinklet tilnærming på å anskaffe strukturell og dynamisk informasjon. Eksempler er høy hastighet AFM 5, mekanisk manipulasjon 6, fluorescens lokalisering mikros 7, samt enkelt-molekyl Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) 8, 9. Siden ganske tidlig FRET er blitt betegnet som en molekylær linjal, på grunn av avstanden avhengighet av lengden omfanget av biomacromolecules 10.

En spesielt interessant anvendelse av smFRET er å bruke avstandsinformasjon oppnådd fra smFRET målinger for å utlede strukturinformasjon 11, 12, 13, 14, 15 >, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. På grunn av den høye tidsoppløsning på smFRET, kan posisjonen av mobile deler av en proteinstruktur bli lokalisert. Imidlertid, for å trekke ut kvantitativ informasjon fra smFRET data viktige korreksjonsparametre om fargestoffmolekylene må bestemmes under målingen 24. Med disse korreksjonsfaktorer kan gnage effektivitet E FRET beregnes ved hjelp av formelen

ligning 1 ,


der jeg A og jeg D figur 2). Den β-faktor står for krysstale, lekkasje av donor utslipp til akseptor-kanal og er beregnet ved å

ligning 2

hvor jeg A og jeg vil er fluorescensstyrkene til donor og akseptor molekylet etter bilde bleking av akseptor molekylet.

Den γ-faktor korrigerer forskjellen i de relative deteksjonseffektivitet i de to kanaler, så vel som forskjeller i fluorescens kvanteutbytte av donor og akseptor fargestoff. Det beregnes ut fra hver enkelt gang spor etter

Legg merke til at denne beskrivelsen forsømmer direkte eksitering av akseptor-molekyl, som noen ganger blir viktig, og vil måtte korrigeres for i tillegg. For bestemmelse av disse korreksjonsfaktorer er det nyttig å eksitere både donor og akseptor i et vekslende ordning 25 for å skille mellom foto fysiske endringer og strukturelle dynamikk.

For å ikke bare få kvantitative smFRET effektivitet, men også kvantitative strukturell informasjon, ble Nano-Positioning System (NPS) ble introdusert i 2008 26. Navnet ble valgt på bakgrunn av sine likheter med satellitt-baserte Global Positioning System (GPS). NPS er en hybrid teknikk som kombinerer smFRET og Røntgenkrystallografi-data for lokalisering av ukjente farve stillinger i biomacromolecular komplekser. den ckrystall-struktur fungerer som en referanserammen og smFRET resultatene brukes til å innhente informasjon om avstand mellom en ukjent fluorofor stilling (antenne) og en stilling som er kjent fra krystallstrukturen (satellitt). I etterfølgende eksperimenter avstandene mellom antennen og flere satellitter måles, og posisjonen av antennen bestemmes ved hjelp av en statistisk grundig analyse ordning basert på Bayesian parameterestimering. Som et resultat, er ikke bare den mest sannsynlige posisjon av antennen beregnet, men dens fullstendige 3D usikkerhets fordeling, den såkalte posterior, visualisert ved troverdige volumer. Videre NPS ble utvidet for å tillate analyse av komplette smFRET nettverk 27.

NPS har vært brukt til å løse en rekke viktige spørsmål i eukaryote transkripsjons, nemlig i løpet av oppstrøms DNA, ikke-templat-DNA, og den begynnende mRNA i RNA Polymerase II forlengelse complex 12, 28, som også viser virkningen av transkripsjonsinitiering faktorer 26 og den dynamiske arkitekturen til en åpen-promotor kompleks 29. Videre ble NPS brukt til å belyse strukturen av archaeal RNA Polymerase åpen kompleks 30 og spesielt posisjonen av transkripsjonsinitiering faktor TFE, som bindes kompetitivt til det samme området som transkripsjons elongeringsfaktor Spt4 / 5 31.

Siden den gang har en rekke smFRET basert strukturelle tilnærminger blitt publisert 15, 18, 21, 23. Når man sammenligner ulike smFRET baserte strukturelle metoder, blir det klart at den tilsynelatende presisjonen av fremgangsmåten er svært avhengig av det spesielle valg av fargestoff-modeller. Man bør merke seg atfargestoffer kan utvise forskjellig romlig og orienteringsatferd avhengig av sitt nærmiljø.

For å oppnå dette, ble Fast-NPS innført 32. Fast-NPS bruker en avansert prøvetaking algoritme redusere beregnings ganger drastisk. Videre gir Fast-NPS en for å utføre en strukturell analyse og for hver fargestoffmolekylet at brukeren kan velge mellom et sett av fem forskjellige modeller fargestoff som vil bli beskrevet etterpå. Den mest konservative modellen, kalt klassisk, forutsetter at fargestoffet opptar bare en, men ukjent, posisjon. På denne stilling kan fluoroforen rotere fritt innenfor en kjegle, hvis størrelse bestemmes ut fra sin respektive (tidsavhengig) fluorescens anisotropi. Orienteringen av kjeglen er ikke kjent, noe som fører til store usikkerheter ved konvertering, målt smFRET effektiviteten til avstander. I dette henseende, er modellen konservativ, da det vil føre til den minste presisjon i forhold til den andre modusen fargestoffls. Bare for svært korte avstander bør forutsetningene gjort av den klassiske modellen føre til et merkbart feil posisjonsbestemmelse. For typiske smFRET verdier, er riktig posisjon alltid vedlagt i den forholdsvis store troverdig volum.

Imidlertid, siden en høyere nøyaktighet er ønskelig, er det viktig å utvikle og teste alternative fargestoff modeller, som kan bidra til å forbedre presisjonen. Hvis fargestoffet roterer mye raskere enn dens iboende fluorescens levetid, kan den såkalte iso-modellen benyttes. Her, orienteringen faktor κ 2 (som er nødvendig for å beregne den karakteristiske isotropisk Förster radius ligning 1 ) Er satt til 2/3. Som et resultat av de beregnede troverdige volumene er nesten to størrelsesordener mindre, sammenlignet med de i den klassiske modell 32. I det tilfellet at fluoroforen er funnet i et miljø som muliggjør ikke bare en rask reorientering, men i tillegg rask bevegelse hele sin tilgjengelige volum, bør meanpos-iso-modellen brukes. I denne modellen fargestoffet opptar effektivt bare en midlere posisjon, hvor den romlige gjennomsnitts føres etter et polynom avstand konvertering 15. Denne modellen gjelder hvis for eksempel den (vanligvis hydrofobe) fargestoff er festet til en hydrofil region, for eksempel, DNA. Anvendelse av meanpos-iso-modell fører til en ytterligere reduksjon i størrelsen av de troverdige volum med en faktor på omtrent to. Imidlertid kan et fargestoff bundet til et protein som bindes reversibelt til flere hydrofobe flekker i sin sterisk tilgjengelige volum (AV). En fluorophore som øyeblikkelig bytter mellom disse regionene, men innenfor en region gjennomgår fri rotasjon og rask lokalisert bevegelse er best beskrevet av VAR-meanpos-iso modell. For en lignende situasjon der fargestoffet er ikke gratis å rotere VAR-meanpos modell gjelder. mer d etails om disse modellene finner du i vår siste utgivelse 32.

Disse modellene gir et omfattende repertoar å spesifikt redegjøre for de ulike miljøene et fargestoff kan støte på og bruke dem klokt optimaliserer sin lokalisering presisjon. I Fast-NPS hver fargestoff molekyl festet til en bestemt stilling kan tilordnes en enkelt modell, slik at FRET-partnere har lov til å ha forskjellige modeller. Dette muliggjør ubegrenset og nær-til-naturen modellering. Det er imidlertid viktig at man gjennomfører krevende statistiske tester for å sikre at det resultat som oppnås ved den endelige modell kombinasjonen er fortsatt i samsvar med de eksperimentelle data. Disse testene er inkludert i Fast-NPS programvare.

For å bruke Fast-NPS til eksperimentelle data er nødvendig for måling av (bare) tre input parametere. Først fargestoff-paret bestemt isotropisk Förster radier (/54782/54782eq5.jpg "/>) Er ikke bestemt. Derfor kvanteutbyttet (QY) av donor fargestoff, giver fluorescens-emisjonsspektra og akseptor-absorpsjonsspektra trenger å bli målt. Disse målingene kan utføres i bulk, ved hjelp av en standard spektrometer og en standard fluorescens-spektrometer. for hvert par, er R 0 deretter beregnet ved anvendelse av freeware PhotochemCAD og kan brukes i NPS-analyse. Dessuten er (tids-oppløst) fluorescens anisotropier av fargestoffmolekylene trenger som skal oppnås ved hjelp av en polarisering (og tid) følsom fluorescens spektrometer. Men de viktigste innsatsparametre for Fast-NPS er smFRET effektivitet målt på en enkelt-molekyl fluorescens mikroskopi oppsett, for eksempel en total intern refleksjon fluorescens mikroskop (TIRFM) .

Her presenterer vi en steg-for-steg-protokollen for å skaffe smFRET data og bruke Fast-NPS (figur 1).

Protocol

1. Forutsetninger og Lab Utstyr

NB: Sammenstillingen av målekammeret er vist i figur 3. Sandwich-konstruksjon av målekammeret består av tre hovedkomponenter: en kvarts glass (smeltet silika) sklie, en forsegling film og en dekk som tetter flyten kammeret. Målekammeret er montert på en tilpasset prøveholder. Dimensjonene av prøvekammeret og metallholderen er rettet slik at de passer til en standard mikroskvartsglass (76 mm x 26 mm).

  1. Snitt kvartsglass ved hjelp av et diamantbor (0,75 mm) ved posisjoner som er angitt på figur 4. Utformingen av kvartsglass er asymmetrisk for å skille mellom de to sider av hvert lysbilde.
    MERK: kvartsglass kan brukes om igjen etter målingen til overflaten blir oppskrapet.
  2. For å montere kamrene, bruke tilpassede metall prøveholdere som vist i figur 5 </ Strong>. Prøveholdere inneholde to tråder (M4) for å koble til en innløp og utløp rør for flyten kammeret. Videre bruker tråder (M3) for å montere i prøvekammeret mot metall holder samt tråder (M3) for å feste holderen på prismet til den nedre halvdel av metallholderen.
  3. Utfør smFRET målingene på en prismer total indre refleksjon fluorescens mikroskop (TIRFM) (figur 6).
    MERK: TIRFM har tre lasere: Et grønt (532 nm, Nd: YAG-laser) og en rød laser (643 nm, diode laser) for eksitering av donor og akseptor fargestoffmolekylene så vel som en blå laser (491 nm , diode-pumpet solid-state laser) for bleking av bakgrunns fluorescerende forurensninger på prøvekammeret før den smFRET målingen. De tre laserstråler er romlig kombinert og kan velges via en akustooptiske tunable filter (AOTF). Fluorescens-lys samles opp ved en høy åpning objektiv, delt inn i en donor og en godtaeller kanal ved hjelp av en dichroic speil og projisert på to EM-CCD-kameraer. Prøvekammeret er festet til en mikrometer trinn som tillater bevegelse i x- og y-retningen med to stegmotorer. En tredje piezo motor benyttes sammen med en IR-laser og en posisjonssensitiv detektor for å bygge en autofokussystem for å sikre optimal fokus gjennom hele eksperimentet.
    1. Bruk vekslende laser eksitasjon (ALEX) når dynamikk i gnage tids baner er observert 25. Slike dynamikk kan forårsakes av enten konformasjonelle endringer i molekylene eller ved svingninger i akseptor lysstyrke og akseptor blinking.
      MERK: ALEX åpner for diskriminering mellom disse to mulige årsaker og hindrer feiltolkning av dynamiske FRET baner. Men for enkelthets skyld er den protokoll delen begrenses til analyse av filmer som er tatt uten ALEX.
      Forsiktig: Klasse 3B lasere brukes i single-molekyl fluorescens oppsett. Sikre at tilstrekkelig laser sikkerhetsregler, ifølge lokale statlige reguleringer, har blitt tatt før systemet tas i bruk.
  4. Utfør absorpsjonsmåling som brukes for bestemmelse av kvanteutbytte på en UV-VIS-spektrometer (se Materialer og Metoder).
  5. Utføre målingen av donor fluorescens-emisjonsspektrum, akseptor absorpsjonsspektrum og fluorescensen anisotropi på en fluorescens-spektrometer (se Materialer og Metoder).
  6. Forbered prøvekamre ifølge publiserte prosedyrer 33. Alternativt kan fremgangsmåten beskrevet i [34] kan benyttes.
  7. Etiketten de undersøkte prøvene med en donor-akseptor fargestoffmolekylet par egnet for smFRET og sikre at det er en biotinrest for immobilisering på overflaten av prøvekammeret.
    MERK: For å lokalisere en ukjent antenne fargestoff stilling med Fast-NPS programvare forskjellige prøve konstruksjoner blir nødvendig. Hver konstruere needs å ha en etikett på det ukjente antenne fargestoff posisjon og en etikett på en satellittposisjon kjent fra krystallstrukturen. Minst tre forskjellige konstruksjoner med fargestoffer som er koblet til antenneposisjonen og tre forskjellige satellittposisjoner er nødvendig for nøyaktige resultater. Målinger mellom antennene samt mellom satellitter er også nyttig for å forbedre nøyaktigheten, krever imidlertid denne utvekslingen av fargestoffer som trenger å bli riktig angitt i analysen.

2. Montering av Flow Chambers i en egendefinert Holder

  1. Trekk silikonslanger (0,8 mm ID, 2,4 mm OD) i hule kategorien skruer (M4) og kutte røret i begge ender rett etterlot et overheng på 1 cm på begge sider ved hjelp av en skarp barberhøvel blad. Juster overheng av slangen til ca. 2 mm på den ene side av fliken skruen.
  2. Monter strømningskammeret inn i prøveholderen på en slik måte at hullene i kvartsglasset glide passer til gjengene i prøveholderen. Strammeinnløp og utløp skruer forsiktig for å sikre at innløpet og utløpet av prøvekammeret fremdeles er gjennomtrengelig. Stram de fire skruene på akrylglass holder å fikse posisjonen til strømningskammeret.
  3. Cut silikonslanger (0,58 mm ID, 0,96 mm OD) til 20 cm lange biter. Sette inn en av bitene til innløpet og utløpet av skruen målekammeret. Lukker innløps- og utløpsslangen ved hjelp av en klemme.
    MERK: De monterte prøvekamre kan oppbevares i romtemperatur i opptil to uker.

3. smFRET Måling på TIRF mikroskop

  1. Bruke en sprøyte for å vaske prøvekammeret med 500 ul PBS. Hindre at luftbobler fra å komme inn i prøvekammeret til enhver tid ved å lage en dråpe på enden av innløpsrøret før bytte til et annet bufferoppløsning.
  2. Spyl prøvekammeret med 100 pl neutravidin (0,5 mg / ml i PBS) løsning og inkuberes 15 minutter ved romtemperatur.
  3. vaskut neutravidin løsning med 500 mL PBS.
  4. Skru metall holder for prismet på prøvekammeret.
  5. Monter prøvekammeret til den mikrometer stadium av TIRF-mikroskop. Sørg for å montere prøvekammeret horisontalt så rett som mulig foran målet å unngå defokusering under skanning prosessen.
  6. Start programmet styre de EM-CCD-kameraer og programvare for styring av piezo-motorene i scenen.
  7. Juster fokus av mikroskopet målet ved å se på refleksjoner av IR laser.
  8. Plasser prisme (PS991, n = 1,52) på toppen av metallprismeholderen. Juster sideleie av prismet for å sørge for at laserstrålene treffer prismet deretter bruke et lim og inkuberes med UV-lys i 5 min.
    MERK: Montert prisme kan gjenbrukes ved rengjøring.
  9. I kamerakontroll programvare klikk "Setup Acquisition" og angir følgende oppkjøp parametere: 100 ms integration tid, 401 bilder / film (grønn kamera), 400 rammer / film (rød kamera), elektron multiplier få 225, pre-forsterkereffekten 5x og avlesning sats 3 MHz på 14 bit.
  10. Lag en mappe på den lokale harddisken for målingen. Velg et ønsket navn for måle filer, for eksempel År-måned-dag. I programvaren innstillingene går du til "Auto-Save" rider, aktiver "Auto lagre" og velge filformat * .sif for film oppkjøpet. Velg mappen på harddisken. Bruk mappenavnet som filestem.
  11. Aktiver "AutoIncrement" -funksjonen (sett startverdien til 1). Aktiver festing av en operatør til filnavnet. Bruk «DON" og "ACC" for donor og akseptor kanal, henholdsvis. Velg "_" som separator.
  12. I kamerakontroll programvare klikk på "Video" for å starte levende bilde av kameraet og blekemiddel bakgrunn fluorescens ved å skanne prøvekammeret ved hjelp av maksimalt laser intensitet av alle tre lasere (comnert ≈3,000 W / cm 2 for 10 s per synsfelt).
  13. Slå av blå laser. Redusere intensiteten av den grønne laser til omkring 200 W / cm 2, og til omkring 40 mW / cm2 for den røde laser hvis alternerende laser eksitasjon (ALEX) brukes.
  14. Fortynn biotinylert fluorescerende prøven til en konsentrasjon på 50-100 pM. Belastning 100 ul av løsningen. Prøven blir immobilisert på overflaten kammeret ved binding.
    MERK: Pass på å ikke overbelaste kammeret. Nabomolekyler må skilles fra hverandre.
  15. Om nødvendig setter en ekstra 100 mL av en 2x mer konsentrert prøven til kammeret.
  16. Forsegl innløps- og utløpsslangen til målekammeret ved hjelp av klemmene etter lasting er fullført.
  17. Slå av alle lasere og bruke piezo-motorer for å flytte flyten kammeret to synsfelt videre.
  18. I kamerakontroll programvare klikk på "Ta signal" for å starte filmopptak og bryterpå laser samtidig. Sørge for at mer enn 80% av molekylene er bleket ved slutten av filmen ved å justere lasereffekt.
  19. Gjenta trinn 3,17 og 3,18 for hele prebleached prøvekammer regionen.

4. Erverv av Transformation Map ( "beadmap")

  1. Forbered en flyt kammer som beskrevet i avsnitt 1.1, 1.2 og 2.
  2. Bruk avidinbelagte fluorescerende multispektrale kuler som viser fluorescensemisjonen i donor og akseptor-kanalen. Vortex aksjen i 1 min, deretter fortynne 50 mL av lager i 50 mL DDH 2 O. Vortex igjen i 1 min, sonicate 1-2 min, deretter vortex ytterligere 10 s.
  3. Utfør trinnene for smFRET målinger (§ 03.05 til 03.10).
  4. Last 100 ul (1 kammeret volum) av 1: 2 fortynnet fluoriserende perler inn i strømningskammeret. Vent i 10 min for de fluorescerende kuler til å binde seg til overflaten.
  5. Bruk oppkjøpet parametrene i 3.9 men change film lengde til 26 (grønn kamera) og 25 (rødt kamera) og elektron multiplikator gevinsten til 10.
  6. Angi intensiteten av grønn laser til en verdi på 20 W / cm 2.
  7. Ta en film på et synsfelt med ca 50-100 perler.

5. Bearbeiding og analyse av smFRET data

  1. Bruk tilpasset skriftlig programvare SM FRET for analyse av beadmap (se Materialer og metoder) og de oppkjøpte filmer. Start programmet viewPlot1.m.
  2. Klikk på analyse | Batch Analysis, endre alternativet "ALEX" hvis den ikke har vært brukt. For best ytelse velge terskelen for topp funn "høy". Trykk "OK".
  3. Velg "Nei" når du blir spurt om et beadmap allerede er analysert. Bla til mappen som inneholder den oppkjøpte beadmap og velg * .sif fil (ved å dobbeltklikke på det). I det neste dialogvinduet trykker "OK".
    MERK: Hvis en beadmap allerede har analysert i et tidligere målment, velg "YES" her og velg den lagrede beadmap ved å bla til riktig mappe og dobbeltklikke på beadmap * .map fil. Fortsett med trinn 5.8.
  4. Velg to enkle perler plassert i motsatte hjørner av synsfeltet. Piksel intensiteter er fargekodet fra mørkeblå (lav intensitet) til mørk rød (høy intensitet).
  5. Klikk på midten av første perlen. Hvis senteret av molekylet kan være plassert tydelig av fargekoding, velg "JA" eller annet klikk "NEI" og velge et annet molekyl par.
  6. Plasser trådkorset på pixel viser maksimal intensitet og trykk "KEEP". Gjenta fremgangsmåten med den andre kanalen.
  7. Klikk på molekylet i motsatt hjørne og gjenta trinn 5,5 og 5,6.
    MERK: Den relative pixel forskyvning av de to kanalene vises i kommandovinduet og karttransformasjonen blir automatisk lagret som * .map filen i mappen som inneholder beadmap * .sif fil <./ Li>
  8. For å laste donor og akseptor filmer (* .sif) for "batch-analyse", bla til mappen, velge alle filmer som skal analyseres, og klikk på "OK". I det neste dialogvinduet, trykk "OK".
    MERK: batch analyse er ferdig når den siste kjørefelt vises i kommandovinduet begynner med "ferdig med å analysere ...". De påviste molekyler vises i et nytt vindu, noe som også indikerer den relative forskyvning av donor og akseptor kanal bestemmes ut fra kartet transformasjon.
  9. For å laste satsfilmfiler klikk på Fil | Load. Fjern merkingen for "ALEX" hvis den ikke har vært brukt. Sett smoothwidth til 10 og klikk "OK". Velg mappen som inneholder * .ttr filer, og klikk på "select all" og "OK" i neste kontekstmenyen.
  10. Hvis den viste spor har de karakteristiske smFRET faser (figur 2) Trykk på veksleknappen "Ikke valgt" og førstevelge tidspunktet for begynnelsen av FRET hendelsen ved å flytte linjen med musepekeren og klikke på venstre museknapp. Neste velge tidspunktet for bleking av akseptor-molekyl og endelig tidspunktet for bleking av donor-molekylet.
  11. I det neste vinduet gnage effektivitet er plottet i blått. For å velge spor ved å trykke på "Ja" -knappen ellers velg "Nei". Å re-tilgang til en tid sporing klikker du på "Forrige" -knappen.
  12. Gjenta prosedyren til siste molekyl av filmen.
  13. Etter å ha analysert den siste molekyl i en film redde de valgte spor ved å klikke på "File | Save". Lagre de valgte sporene i den samme mappen som * .sif filer.
  14. Gjenta trinn 05.10 til 05.13 for alle oppkjøpte filmer.
  15. Kjør programmet combine_fret_results.m. Velg mappen som inneholder * Res filer og alle * .FRETonly_trace filer. Redd molekyl-messig gnage og ramme-messig FRET filer som MW.dat ogFRW.dat hhv.
    MERK: * dat filer lagres som ASCII-filer. Den FRW.dat filen inneholder seks kolonner og en rad for hver FRET-ramme. Den sjette kolonnen inneholder den korrigerte ramme-messig FRET effektivitet. Den MW.dat filen inneholder 21 kolonner og en rad per valgt FRET molekyl. Den tredje kolonnen inneholder molekylet-messig FRET effektivitet.

6. Viser smFRET data i Histograms

MERK: For å trekke gjennomsnittet smFRET effektiviteten av alle registrerte smFRET data ramme-messig data eller molekyl-messig data er plottet i histogrammet og analysert ved hjelp Gaussian passer til (flere) topper. I det følgende bruker protokollen en kommersiell dataanalyseprogramvare (se Materialer List). Imidlertid kan en hvilken som helst annen tilgjengelig programvare brukes i stedet.

  1. Åpne en dataanalyse programvare (se Materials List). Klikk på Fil | Importer | multippel ASCII. Velg mappen som inneholder den FRW.dat filen. Velg filen og trykk "OK & #34 ;. Godta input alternativet med "OK" uten en endring.
  2. Velg det tredje kolonne C (Y) som inneholder de korrigerte FRET effektivitet, høyreklikker du på kolonnen og velg Plot | Statistikk | Histogram. I histogrammet vinduet dobbeltklikker på kolonnene og fjerner markeringen for «automatisk binning" og velg en ønsket bin-størrelse, for eksempel 0,05. Også velge start- og sluttverdiene, f.eks -0,025 og 1,025.
  3. Velg kolonnene i histogrammet ved å venstreklikke på dem. Høyreklikk og velg "gå til Bin regneark". Velg "teller" -kolonnen ved å venstreklikke på den og deretter høyreklikk og velg Plot | Column / Bar / Pie | Column.
  4. I kolonne bar tomten farten til analyse | Montering | Ikke-lineær kurve | Åpen dialog. Velg "Gaussian" under Funksjon deretter gå til "Parameter" rytter. Opphev valget auto parameter initialisering. Fest forskyvningsverdi (y0) på 0. Klikk på "Tilpass".
    MERK: fit funksjon samt montering dehaler blir nå vist i kolonne tomten. Den "xc" verdi gir midten av passform funksjon, dvs. middelverdien FRET effektivitet som fungerer som inngangsparameter for NPS programvare.

7. Måling av Quantum Yield

  1. Utføre kvanteutbytte bestemmelse med den relative fremgangsmåte tilsvarende fremgangsmåten beskrevet av Würth et al. 35, ved hjelp av rhodamin 101 oppløst i etanol (QY = 91,5%) som en standard.
  2. Record absorpsjonsspektra ved en UV-VIS-spektrometer ved bruk av en 80 ul volum i en kuvette absorpsjon av 1 cm veilengde. Absorbansen ved den bølgelengde som vil bli brukt for fluorescenseksitasjon må være ≤ 0,05.
  3. Record emisjonsspekter på en lampe-kalibrert spektrometer operert i foton-telling modus. Utføre målinger med Glan-Thompson polarisatorer i eksitasjon (0 °) og utslipps (54,7 °) bane (magic angle forhold) ved hjelp av en spectr al båndbredde på ca. 5 nm og 2,5 nm for eksitasjon og emisjon monokromator, respektivt. Mål prøver etter å overføre dem til en fluorescens kyvette med 3 mm veilengden ta vare at tellehastighet ikke overstiger 10 6 s -1.
    1. Beregn kvanteutbyttet ifølge

ligning 6

hvor n og n Std er brytningsindeksene av løsningsmidlet for prøven og standard hhv. f (λ) og f_Std (λ) er fluorescensstyrkene til prøven og standard ved bølgelengden λ. A (λ ex) og A stdex) er absorbansen til prøven og referansen ved eksitasjonsbølgelengden og Φ std er kvanteutbyttet av standarden.

le "> 8. Beregning av Isotrop Förster Radius

  1. Beregn radius isotrop Förster ( ligning 5 ) Fra emisjonsspekteret av donor-molekylet, absorpsjonsspekteret av akseptor-molekyl, kvanteutbyttet av donor og brytningsindeksen for mediumet. Bruk freeware PhotochemCAD for beregning av ligning 1 . Men noen annen tilgjengelig programvare kan brukes i stedet 36.

9. Måling av anisotropier

  1. Bestem steady-state fluorescens anisotropier fra innspillinger av Fluorescensspektrene med ulike eksitasjon / utslipp polarisatoren innstillinger (V / V, V / H, H / V, H / H) 36.
  2. Beregn G-faktor, som korrigerer for polariserings gjenstander av instrumentet, for hver bølgelengde fraforhold

ligning 9

og bruke den til å beregne anisotropien verdi for hver bølgelengde:

ligning 10

hvor jeg xy indikerer intensiteten for eksitasjon polarisering x og utslipp polarisering y.

  1. Gjennomsnittlig verdiene over utslipp spektralområdet å beregne steady-state fluorescens anisotropi.

10. Installasjon av Fast-NPS programvare

  1. Last ned UCSF Chimera fra http://www.cgl.ucsf.edu/chimera og følg installasjonsveiledningen.
  2. Gå til nettsiden til "Institutt for biofysikk"ved Ulm University: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Last ned den nyeste versjonen av Fast-NPS og pakke ut til en mappe av valget. Åpne undermappen "Redistributable" og installerer Visual C ++ Redistributable som er hensiktsmessig for systemet.

11. Sentre PDB fil

  1. Åpne PDB filen (e) av interesse i Chimera. Velg alle atomer av det makromolekylære kompleks og beregne koordinatene for tyngdepunktet (Verktøy | Struktur Analyse | Akser / Planes / centroids | Definer Tyngdepunktet ... | Ok).
  2. Åpne Svar Log (Favoritter | Svar Log) og Transformation Tool (Verktøy | Movement | Transform Koordinater). Skriv inn koordinatene til tyngdepunktet vist på svar Logg inn tekstboksen "Shift" av Transform Koordinater vinduet og endre tegn på hver koordinat. Trykk på "Apply" og lagre filen med "Lagre PDB» (Fil | Lagre PDB).

12. Innstillingstillingen Priors

MERK: Alle verdier er vurdert i Angstrom.

  1. Start teknisk databehandling språk og endre gjeldende mappe til den lokale Fast-NPS-mappen. Skriv inn i kommandovinduet: FastNPS.
  2. Opprett en ny jobfile i Prosjektleder (Project | Ny).
  3. Sett opp stillingen før (Verktøy | Model fargestoff før).
  4. I panelet "før basics" definere romlig oppløsning av posisjonen før ved å skrive inn verdien (2 anbefales).
  5. Ekskluder det indre av makromolekyl ved å aktivere alternativet og klikke på "last PDB" -knappen. Velg og laste sentrert PDB fil som beskrevet i § 11.
  6. Spesifiser omtrentlig diameter (13 Å anbefales, se omtale) av fargestoff ved å angi verdien.
  7. Skriv inn et skjelettisering avstand, dvs. avstanden fargestoffet molekylet kan trenge inn i makromolekyl (2 Å anbefales).
  8. påpanel "maksimal før size" angir de minimale og maksimale koordinatene til posisjonen før (anbefalt: x i [-150 150], y i [-150 150] og z i [-150 150]).
  9. Når du definerer en satellitt, aktivere boksen "vedlegg via fleksibel linker" i panelet "tidligere basics" og skriv i panelet "linker" koordinatene til atom (i sentrert PDB fil) hvor fargestoffet molekylet er festet. Videre, angir lengden og diameteren av linkeren ved å angi deres verdier (13 Å og 4,5 Å er anbefalt, se diskusjon). I tilfelle av en antenne hoppe over dette punktet.
  10. Trykk på knappen "beregn tilgjengelig volum".
  11. Lagre posisjon før og eventuelt eksportere den for visualisering ved hjelp av programvare som Chimera.

13. Definere Network Geometry

  1. Åpne Definer Måling Window (Mode | Rediger geometri).
  2. Opprett en ny farge molekyl ved å trykke på bakenpå "Ny" i panelet "Fargestoffer".
  3. Sett sin fluorescens anisotropi (§ 9) ved å angi en verdi, og velg en farge modell i rullegardinmenyen "Dye modellen".
  4. Trykk på knappen "Load", velg den tilsvarende posisjon før og sjekk aktivere boksen av fargestoff. Gjenta denne fremgangsmåten for alle fargestoffer, dvs. for alle antenner, så vel som for alle satellitter.
  5. Når du har opprettet alle fargestoffer, definerer målingene. Opprett en ny måling ved å klikke på "Ny" i panelet "Målinger".
  6. Velg dets FRET partnere i rullegardinmenyene "Dye1" og "Dye2" nedenfor.
  7. Skriv inn smFRET effektivitet med feil og isotrop Förster radius av denne fargestoff paret.
  8. Til slutt, sjekk Aktiver boksen av målingen. Gjenta denne prosedyren for alle målinger.
    MERK: Ofte nettverket blir stadig mer komplekse, slik at brukeren kan bli forvirret. For å foret feil, sjekk nettverket visuelt ved å trykke på "Check Network" -knappen. Figuren viser de aktiverte fargestoffer og viser målinger via linjene sammenhengende gnage fargestoffer.

14. Beregning

  1. Åpne Beregning Window (Mode | Beregning).
  2. Hvis hver fargestoff i nettverket har en bestemt modell tildelt, velg "Brukerdefinert" og starte beregningen ved å trykke "Beregning". Å ha alle fargestoffer i samme modell, velger du en av de fem modellene (klassisk, iso, meanpos-iso, VAR-meanpos-iso og VAR-meanpos) og fortsette.
    MERK: Kommandoen vinduet vil vise fremdriften i beregningen. Fast-NPS vil gjøre det med en pop-up melding, når beregningen er fullført.

15. Visualisering av resultater

  1. For å eksportere troverdig volumer av fargestoffer, åpne Se resultat Window (Modell | Vis resultater).
  2. Eksporter dye tettheter:
    1. Eksportfargestoffer enkeltvis eller alle samtidig. For å eksportere en enkelt fargestoff velg det i panelet "Viste Farger" og trykk "Export intensitet". Skriv en oppløsning (2 anbefales), og velg en filtype for eksport. På høyre tettheten blir forhånds og noen av dens matematiske egenskaper er vist.
    2. For å eksportere alle fargestoffer samtidig presse "Batch Export".
  3. Åpne tetthet filene som resulterer i Chimera.

16. konsistenssjekk av Chosen Model Kombinasjon

  1. Åpne Vis resultater Window (Modell | Vis resultater). Hvis i panelet "Beregning Info" tekstboksen "Konsistens" viser en verdi lavere enn 90% av dagens modell ikke representerer de målte smFRET effektivitet tilstrekkelig og er således inkonsekvent.
  2. Ved motstrid trykk på knappen "Detaljert Konsistens". Søk etter målingene som har en verdi under 90%. Dersom en eller flere fargestoffs er hovedsakelig involvert i disse målingene sine modeller vil trolig føre til inkonsekvens. Vurdere ulike fargemodeller for disse fargestoffer og kjør Fast-NPS beregning.

Representative Results

Transkripsjon er det første trinnet i genuttrykk i alle organismer. I Archaea, blir transkripsjon utføres av en enkelt RNA-polymerase (rnap). Sammenlignet med eukaryoter, bærer archaeal rnap en slående strukturell likhet med sine eukaryote kolleger og samtidig ha en enklere transkripsjonen maskiner. Således kan Archaea brukes som et modellsystem for å studere eukaryot transkripsjonsinitiering etter RNA-polymerase II (Pol II). Nylig har komplett arkitekturen i archaeal RNA polymerase åpen komplekse blitt bestemt fra enkelt-molekyl gnage og NPS. Dataene fra NPS-analyse ble brukt for å bygge en modell av hele archaeal åpen promotor-komplekset, noe som gir nyttig innsikt i mekanismen av transkripsjonsinitiering.

For å belyse denne strukturen, ble smFRET effektivitet målt mellom ukjente antennefargestoffer som ligger innenfor den åpne promotor comPlex og flere kjente satellitt fargestoffer som ble innlemmet i fem referanse steder i rnap, hvis posisjoner er kjent fra krystallografiske strukturer (pdb-ID: 2WAQ) 37. Antennefargestoffer som var festet til det ene av forskjellige posisjoner på den ikke-templat-DNA, TFB, TBP eller TFE. Den fullstendige nettverk brukt i denne studien bestod av mer enn 60 målte avstander.

Figur 7 viser modell av hele archaeal åpen promotor kompleks bygget fra NPS analyse. Den omfatter den dobbeltkjedet DNA-promoteren (lyse og mørke blå), RNA Polymerase (grå) og transkripsjons-initierings-faktorer TBP (purpur), TFB (grønn) og TFE (gul). Modellen er overlagret med resultatene fra NPS analyse, troverdige volumer, som ble beregnet ved hjelp av den klassiske modellen (A), iso-modellen (B), den meanpos-iso-modell (C), VAR-meanpos-iso-modellen (D) og VAR-meanpos modell (E).

Figur 1
Figur 1: Arbeidsflyt for innsamling og prosessering av parametrene som trengs for Fast-NPS beregning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Eksemplarisk fluorescens intensitet tid spor av en smFRET hendelse. Fluorescensstyrkene til giver (grønn) og akseptor-molekyl (rød) som viser tre karakteristiske faser, nemlig I: smFRET, II: donor fluorescens etter akseptor fotobleking, III: bakgrunnsfluorescens etter donor fotobleking.g2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Skjematisk illustrasjon av strømningskammeret for smFRET eksperimenter. Strømningskammeret er montert på en tilpasset metallholder med akrylglassholdere. Sandwich-konstruksjon av den strømningskammeret omfatter en kvartsglass (smeltet kisel) skyver med to hull for å feste innløps- og utløpsslangen, en tettende film og et dekkglass som lukker strømnings-kammeret. Prismet for TIRF belysning er montert på den nedre halvdel av strømningskammeret. Hul tab skruer gi innløp og utløp for strømningskammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

alt = "Figur 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" />
Figur 4: Fremstilling av kvartsglass og forseglingsfilmen. Mekanisk tegning av kvartsglass som angir posisjonene for hullene (gitt i millimeter). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Mekanisk tegning av strømningskammeret. Tiltakene for aluminiums prisme holderen, akrylglassholdere og aluminium monteringsrammen er gitt i millimeter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/>
Figur 6: Skjematisk illustrasjon av prismetypen TIRF oppsett brukes for smFRET eksperimenter. Forkortelser for optiske komponenter: A, blenderåpninger; DM, dichroic speil; F, utslipp filter; L, linse; M, speil; O, objektiv; P, prisme; PSD, posisjon sensitiv foto-diode; S, sample; PS, posisjonering scenen; T, teleskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: Simulering resultatene av de forskjellige modellforutsetninger. Alle bildene viser archaeal RNA polymerase (pdb-ID: 2WAQ, sett ovenfra) sammen med modellen for arrangøren DNA (tDNA og ntDNA i blått og cyan, henholdsvis), TBP (lilla), TFB (grønn) og TFE (gul)i archaeal åpne komplekse 30. De troverdige volumer lagres for NPS simulering resultater av (A) den klassiske modellen, (B) iso-modellen, (C) meanpos-iso-modell, (D) VAR-meanpos-iso-modellen og (E) VaR -meanpos modell. Alle volumer er vist på 68% troverdighet. Den klassiske og VAR-meanpos nettverk er konsistente med smFRET data. I kontrast, nettverk der for alle fargestoffer iso, meanpos-iso eller VAR-meanpos-iso-modellen er valgt er i strid med de målte data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi presenterer oppsettet og eksperimentell prosedyre for å fastslå nøyaktig FRET effektivitet mellom fargestoffer festet via fleksible forbindelsesledd til biomacromolecules, dvs. nukleinsyrer og / eller proteiner.

For å sikre nøyaktige målinger smFRET (avsnitt 3), er det viktig å utelukke luft fra strømningskammeret til enhver tid under målingen. Videre sørge for å ikke overbelaste strømmen kammer med fluorophores. Fluoroforene må være klart atskilt for å sikre korrekt analyse. Som smFRET par, som ikke viser bleking av donor må være ekskludert fra analysen, sørg for at> 80% av molekylene i synsfeltet er bleket på slutten av filmen. Å ta hensyn til inhomogeniteter i utvalget av β-faktor og γ-faktor, korrigere cross-talk og relative deteksjonseffektivitet av donor og akseptor kanal, henholdsvis beregnes for hver FRET pare individuelt.

For målingene på fluorescens spektrometer (§§ 7 til 9) et godt kompromiss mellom signalintensitet og spektral oppløsning av de registrerte data må bli funnet. For dette formål er slissene i den eksitasjon og emisjon passasje i fluorescens spektrometer må tilpasses avhengig av det instrument som brukes og prøven konsentrasjon.

Videre presenterer vi Fast-NPS analysemetode for å oppnå strukturell informasjon fra forbigående eller dynamisk MACROMolecular komplekser. NPS har blitt anvendt for å vise banen for den ikke-templat DNA-tråd, og posisjonen av transkripsjonsinitieringsseter faktorer i archaeal RNA-polymerase åpen kompleks. Bruke nettverk av mer enn 60 forskjellige avstandsmålinger, vi viste at Fast-NPS, utstyrt med en nylig gjennomført prøvetaking motor (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. under forberedelse), reduserer den tiden som er nødvendig for analysen av dette komplekset smFRET nettverk av ≈2 størrelsesordener, sammenlignet med den opprinnelige globale NPS metode 27. Algoritmen robusthet er forankret i en Metropolis-i-Gibbs sampler kombinert med en parallell tempe ordningen. Fast-NPS viser eksakt reproduserbarhet av nettverk resultater og er konsistent med resultatene publisert tidligere 30.

Flere ulike metoder har blitt publisert som mål å antyde strukturell informasjon fra smFRET målinger 11 opp>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alle disse fremgangsmåter gir bare en spesifikk modell fargestoff. Dermed fargestoffer, som ikke oppfyller forutsetningene gjort av den aktuelle modellen, kan ikke brukes eller føre til falsk strukturell informasjon. Rask-NPS tvert, innrømmer å hver velge fargestoff molekylet forskjellige modellen. Dette bidrar til å gjøre rede for ulike konformasjonelle oppførsel av begge deler, fargestoffmolekylet selv, samt linkeren anvendt for innfestingen. De lokale molekylære omgivelser i fargestoffmolekylet, så vel som dens fysiske egenskaper vil bestemme hvilken modell som er mest hensiktsmessig.

For den analyserte smFRET nettverk av archaeal initieringskomplekset, en isotrop antakelse for alle fargestoffer som fører til en drastisk reduksjon in størrelsen av troverdige volum i forhold til den klassiske modell. I kombinasjon med en dynamisk posisjon gjennomsnitt for alle fargestoffmolekyler medianverdien av alle troverdige volumstørrelser (ved 95%) reduseres til mindre enn 0,5 nm 3. Men disse fargestoff molekylet posteriors er ikke lenger i samsvar med deres smFRET målinger, noe som indikerer at de forutsetninger som fører til falsk strukturell informasjon. I kontrast til posteriors fastsatt i den klassiske modellen er konsistent med de fast smFRET effektivitet.

Som forutsetning av isotrop og / eller dynamisk stilling i snitt for alle fargestoffer føre til uoverensstemmelser, Fast-NPS gjør dye molekyl priors der hver farge kan tilordnes en av de fem modellene. Hver modell bruker samme tilgjengelig volum. Algoritmen for beregning av fargestoffet AVS gjør flere forutsetninger. Til å begynne med blir fluoroforen romlige form tilnærmes av en sfære. Således, en diameter tar hensyn til fluoroforen er width, høyde og tykkelse bør brukes (avsnitt 12). Videre er linkeren form tilnærmes ved hjelp av en fleksibel stang. Verdiene som presenteres i kapittel 12 ble beregnet for fargestoffet Alexa 647 festet via en 12-C linker. Til dags dato er det ikke mulig å nøyaktig bestemme a priori modell som er mest egnet, gitt en eksperimentell geometri, og således alle modeller bør testes. Generelt vil man velge den modell som gir den minst mulige størrelse bakre, mens den fortsatt er i samsvar med dataene. For å teste om et utvalg av modeller er i samsvar med smFRET data, beregner vi både bakre og sannsynligheten. Konsistens betyr at mer enn 90% av prøvene som er samlet fra den bakre er innenfor 95% konfidensintervall for sannsynligheten.

Mens det er sant at den nedre anisotropien, jo mindre er avstanden usikkerheten i et smFRET nettverk geometriske arrangementer av fargestoffmolekylene må også tas i betraktning. Således, mens representing fargestoffer med lav fluorescens anisotropi med en iso-modellen er en typisk førstevalget, gir konsistens test en mer direkte måte for å velge riktig farge modell. Det optimale valget av fargestoff-modeller kan føre til en drastisk økning i lokalisering nøyaktighet og samtidig beholde nettverkets konsistens med sine FRET-data.

For å oppsummere, gjør Fast-NPS å få strukturelle og dynamisk informasjon av store makromolekylære komplekser. I motsetning til vanlige konstruksjonsmetoder som røntgen krystallografi eller kryo elektronmikroskopi av dette gir mulighet for å overvåke meget fleksible eller forbigående komplekser, og dermed i stor grad utvider vår mekanistisk forståelse av komplekse biologiske prosesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flowchamber preparation
Customized metall sample holder self-built n/a
quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm Technical Glass Products 26007
coverslips, 60 mm x 24 mm Marienfeld 101242
detergent, Hellmanex II Hellma 320.001
ultra-pure water from Synergy UV Millipore 2512600
Zepto plasma cleaner Diener n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. Sigma-Aldrich A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa Laysan Bio Inc. MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa Laysan Bio Inc. BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate Sigma-Aldrich S5761 Sigma 
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S2127 Sigma-Aldrich 
sealing film (Nescofilm) Fisher Scientific 12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD Saint-Gobain Performance Plastics 720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) Fisher Scientific 12665497
Neutravidin Life Technologies A2666
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm Newport Spectra-Physics EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso Cobolt 904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart Toptica iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC Chroma F33-540
dichroic mirror, 476 RDC Chroma F33-476z
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm Thorlabs LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm Thorlabs
prism, PS 991 Thorlabs PS991
focusing lens, f = 75 mm Thorlabs LA1608-B
syringe pump, PHD 2000 Harvard Apparatus 70-2002
2 stepper motors, Z812B Thorlabs Z812B
piezoelectric actuator, PE4 Thorlabs PE4
IR diode laser Edmund Optics CPS808 part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR Chroma 775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A Thorlabs PDP90A part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 Nikon MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR Chroma 645 DCXR part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510 Omega Optical 3RD550-510 green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760 Omega Optical 3RD660-760 red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV Andor AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV Andor AND-20-000141
Miscellaneous
Varian 50 Cary UV-VIS spectrometer
Fluorolog2 SPEX fluorescence spectrometer
Solis (V4.15) Andor control software for the EM-CCD camera
Apt user utility  (V1.022) Thorlabs control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68 Thorlabs adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red Kisker Biotech avidin-coated fluorescent multispec beads 
Matlab Mathworks technical computing language for custon written software
Origin (V9.0) Originlab scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40 Hellma 105-202-15-40 absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40 Hellma 105-251-15-40 fluorescence cuvette with 3 mm path length

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
  2. Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343, (6175), 1102-1108 (2014).
  3. Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
  4. Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
  5. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
  6. Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
  7. Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, (5628), 2061-2065 (2003).
  8. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77, (1), 51-76 (2008).
  9. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43, (4), 1156-1171 (2014).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58, (2), 719-726 (1967).
  11. Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336, (2), 395-408 (2004).
  12. Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (1), 135-140 (2008).
  13. Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158, (3), 150-157 (2004).
  14. Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (26), 15516-15521 (2003).
  15. Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9, (12), 1218-1227 (2012).
  16. Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23, (August 2015), 110-115 (2015).
  17. Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107, (9), 2037-2048 (2014).
  18. Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
  19. Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88, (4), 2939-2953 (2005).
  20. McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99, (3), 961-970 (2010).
  21. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
  22. Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer. J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).
  23. Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17, (3), 318-324 (2010).
  24. Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26, (2), 161-193 (1979).
  25. Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38, (7), 523-533 (2005).
  26. Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5, (11), 965-971 (2008).
  27. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115, (41), 11927-11937 (2011).
  28. Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37, (17), 5803-5809 (2009).
  29. Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46, (2), 136-146 (2012).
  30. Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
  31. Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43, (2), 263-274 (2011).
  32. Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
  33. Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8, (7), 606-610 (2001).
  34. Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
  35. Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8, (8), 1535-1550 (2013).
  36. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer US. Boston, MA. (2006).
  37. Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7, (5), (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics