كتلة الأنسجة لتحديد تنكس عصبي في

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يستخدم على نطاق واسع ذبابة الفاكهة كنظام نموذج لدراسة التنكس العصبي. يصف هذا البروتوكول الطريقة التي انحطاط، على النحو الذي يحدده تكوين فجوة في الدماغ، يمكن قياسها كميا. أنها تقلل أيضا الآثار الناجمة عن إجراء التجارب عن طريق تجهيز والسيطرة باجتزاء والذباب التجريبية كما عينة واحدة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أمراض الاعصاب التقدمية مثل مرض الزهايمر (م) أو مرض باركنسون (PD) هي تهديدا متزايدا لصحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أن نماذج الثدييات قدمت معلومات هامة في الآليات الكامنة وراء المرضية، ومدى تعقيد نظم الثدييات جنبا إلى جنب مع التكاليف الباهظة تحد استخدامها. لذلك، يوفر بسيطة ولكنها راسخة ذبابة الفاكهة نموذج نظام بديل عن التحقيق في المسارات الجزيئية التي تتأثر في هذه الأمراض. إلى جانب العجز السلوكية، وتتميز الأمراض العصبية التي كتبها الظواهر النسيجية مثل موت الخلايا العصبية وaxonopathy. لتحديد انحطاط الخلايا العصبية وتحديد كيف يتأثر بعوامل وراثية وبيئية، ونحن نستخدم منهج النسيجي التي تقوم على قياس الفجوات في العقول ذبابة الكبار. للحد من آثار خطأ منهجي ومقارنة مباشرة مقاطع من السيطرة وإكسبالذباب erimental في إعداد واحد، ونحن نستخدم طريقة "طوق" للأقسام البارافين. ثم يتم تقييم التنكس العصبي عن طريق قياس حجم و / أو عدد من الفجوات التي وضعت في الدماغ ذبابة. يمكن أن يتم ذلك إما من خلال التركيز على منطقة محددة من الفائدة أو من خلال تحليل الدماغ بأكمله من خلال الحصول على الأجزاء المتسلسلة التي تغطي الرأس الكامل. لذلك، هذا الأسلوب يسمح احد لقياس ليس فقط انحطاط شديد ولكن أيضا الظواهر خفيفة نسبيا ويمكن كشفها إلا في بعض الأقسام، كما يحدث أثناء الشيخوخة الطبيعية.

Introduction

مع زيادة في متوسط ​​العمر المتوقع، وأصبحت الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أو الشلل الرعاش تهديد الصحية المتزايدة للسكان عموما. ووفقا لمعاهد الصحة القومية، و 115 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وتوقع أن تتأثر الخرف في عام 2050. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في تحديد الجينات وعوامل المخاطر التي ينطوي عليها بعض على الأقل من هذه الأمراض، وبالنسبة للكثيرين منهم، والكامنة الآليات الجزيئية لا تزال غير معروفة أو غير مفهومة جيدا.

بسيطة الكائنات نموذج اللافقارية مثل انواع معينة ايليجانس وذبابة الفاكهة توفر مجموعة متنوعة من المزايا التجريبية لدراسة آليات الأمراض العصبية، بما في ذلك دورة حياة قصيرة، عدد كبير من ذرية، وتوافر وسائل الوراثية والجزيئية راسخة وفريدة من نوعها في بعض الأحيان 1 -12. وعلاوة على ذلك، هذه الكائنات قابلة للمنحازةشاشات التفاعل التي يمكن أن تحدد العوامل التي تسهم في هذه الأمراض آثار المشددة أو تخفيف على الظواهر العصبية.

تحليل هذه التفاعلات الوراثية وتقييم آثار الشيخوخة يتطلب بروتوكولات الكمي للكشف عن التنكس العصبي وقياس شدتها. ويمكن أن يتم هذا التقييم بسهولة نسبيا عند قياس الجوانب السلوكية في ذبابة الفاكهة، مثل التعلم حاسة الشم، انجذاب بالجاذبية السلبية، أو انجذاب ضوئي سريع، والتي توفر قيمة الأداء رقمية 13-21. ومن الممكن أيضا لتحديد الآثار المترتبة على بقاء الخلايا العصبية عن طريق عد الخلايا العصبية. ومع ذلك، وهذا ممكن فقط عندما تركز على مجموعة سكانية محددة يمكن تحديده بوضوح، مثل الخلايا العصبية الدوبامين التي تتأثر في PD، وحتى ذلك الحين، كانت النتائج مثيرة للجدل 22-24.

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم أسلوب طوق لأداء مسلسل أقسام البارافين، طريقةالتي وضعت أصلا من قبل هايزنبرغ وBöhl، الذي يستخدم لعزل المسوخ الدماغ التشريحية في ذبابة الفاكهة 25. وفيما بعد تم تكييفها استخدام طريقة طوق، بما في ذلك في cryosections، vibratome أقسام، والأقسام البلاستيك 26-28. هنا، يتم توظيف هذه الطريقة للحصول على أقسام المسلسل من رئيس الطيران بأكمله، والتي يمكن استخدامها لقياس الفجوات التي تنمي في الذباب مع الظواهر العصبية 16،21،29-32. هذه القياسات يمكن القيام به في مناطق محددة في الدماغ أو يمكن أن تغطي الدماغ بأكمله؛ هذا النهج الأخير يسمح احد لتحديد حتى ضعف الظواهر التنكسية، كما لوحظ أثناء الشيخوخة. وأخيرا، عند استخدام الياقات، وتصل إلى 20 الذباب يمكن معالجتها على النحو إعداد واحدة، وهي ليست فقط أقل، ولكنه يسمح أيضا لتحليل السيطرة والذباب التجريبية في إعداد نفسها، والتقليل من القطع الأثرية نظرا للتغيرات طفيفة في تستغرق وقتا طويلا الإعداد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد رئيس على الياقات وتضمينها في البارافين

ملاحظة: جميع الخطوات في عملية التثبيت وينبغي أن يتم في غطاء الدخان. Methylbenzoate، في حين لا يشكل خطرا صحيا، لها رائحة مميزة للغاية، والتي يمكن أن تكون ساحقة إذا لم يتم التعامل معها في غطاء الدخان.

  1. قبل التخدير الذباب، ويشكلون 50 مل من محلول Carnoy بإضافة 15 مل من الكلوروفورم و5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 30 مل من 99٪ من الإيثانول (لا تخلط الكلوروفورم وحمض الخليك). سكبه في وعاء زجاجي مع مسطحة القاع، مثل طبق crystalizing، للتأكد من أن الياقات يمكن وضع مسطح وتغطيها تماما من الحل.
  2. تخدير الذباب مع CO 2 أو الأثير.
  3. الذباب الموضوع (ما يصل الى 20 مع معظم الياقات) من أعناقهم في الياقات باستخدام ملقط. تذكر للتنسيق بين جميع رؤساء في نفس الاتجاه، كما رأينا في الشكل 1A، ويكون لطيف للتأكد من أن أي ضرر يحدث في الرأس أو العينين.
  4. تشمل الذباب شرط oculis (الأسهم، الشكل 1A) في مواقع عشوائية بحيث ترتيب الذباب يمكن التعرف عليها بسهولة في الفروع. وبالإضافة إلى ذلك، في حالة وجود الذباب التجريبية خفيفة أو أبيض لون العين، والخيط بعض الذباب حمراء العينين، مثل النوع البري، بينهما لضمان أن الصباغ يكفي وجود وصمة عار على الشرائح. تسجيل ترتيب الذباب على ورقة البروتوكول جنبا إلى جنب مع عدد طوق في حالة استخدام طوق أكثر من واحد.
  5. مرة واحدة وقد تم الانتهاء من ذوي الياقات البيضاء، وضعه في حل Carnoy استعدادا ل3،5-4 ساعة.
  6. تفريغ الحل Carnoy في علبة التخلص المناسبة والبدء يغسل الايثانول. تأكد من أن تصب ببطء حتى لا تعكر صفو موضع الياقات في الحاوية.
  7. غسل الياقات لمدة 30 دقيقة في 99٪ من الإيثانول مرتين.
  8. غسل الياقات في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة. تأكد من تغيير يغسل في الوقت المناسب لمنع overdehydration.
  9. وضع الياقات في methylbenzoateO / N في RT. ختم الحاويات مع بارافيلم لمنع تبخر methylbenzoate.
  10. صب methylbenozate في وعاء القابل للتصرف السليم في غطاء الدخان. إضافة خليط معدة مسبقا من 1: 1 نقطة انصهار منخفضة (56-57 درجة مئوية) شمع البارافين وmethylbenzoate. من هذه النقطة، تحتاج الياقات إلى أن يوضع في حاضنة عند 65 درجة مئوية للتأكد من أن البارافين لا تتصلب.
  11. من اجل الخروج من methylbenozate وخليط البارافين في وعاء القابل للتصرف السليم، وتصب المنصهر النقي شمع البارافين، وأبقى عند 65 درجة مئوية، على الياقات.
  12. تغيير البارافين بعد 30 دقيقة، وكرر هذا 5 مرات على الأقل. يجب أن يتم تنفيذ 8 يغسل - 6 على الأقل.
  13. وبمجرد أن يغسل كاملة، ووضع أطواق إلى علبة مكعبات الثلج المطاط مع فتحات تقريبا حجم الياقات. صب البارافين المنصهر عليها حتى تغطيها تماما والسماح لها تتصلب O / N (في محاولة لتجنب فقاعات الهواء).
  14. إزالة كتل البارافين contaiنينغ الياقات من علبة مكعبات الثلج. فصل كتلة البارافين من ذوي الياقات البيضاء باستخدام شفرة حلاقة، وكسر بلطف من ذوي الياقات البيضاء. فإن رؤساء يكون في كتلة البارافين فيما تكون هيئات ستبقى في طوق. يمكن أن تظل لبنات في درجة حرارة الغرفة.
  15. لتنظيف الياقات، نقع عليها في وكيل deparafinization عند 65 درجة مئوية لإزالة البارافين، نظيفة مع الغسل الخفيف، ويغسل في الإيثانول قبل إعادة.

2. باجتزاء وتركيب

  1. تدفئة لوحة التدفئة إلى 50 درجة مئوية. وضع أصحاب كائن (أو كتل متزايدة المعادن) وشفرات الحلاقة على لوحة والسماح لهم الاحماء.
  2. اعتمادا على الاتجاه المطلوب لباجتزاء، ونعلق كتلة البارافين إما مع رؤساء نحو الجانب (لأقسام أفقية) أو متجهة لأعلى (لأقسام الأمامية) إلى كتلة متزايدة ساخنة (ذوبان لفترة وجيزة كتلة في الجانب اتصال). إزالة كتلة من لوحة التدفئة والسماح لتبرد لا يقل عن 10 ميلن لضمان البارافين هو صلابة كافية لختم الصحيح على كتلة متزايدة. الحفاظ على صف من رؤساء الانحياز بالتوازي مع سطح كتلة قدر الإمكان لمنع أقسام متفاوتة.
  3. تأخذ شفرة حلاقة وتقليم البارافين الزائدة بعيدا عن رؤساء الطيران بحيث لا يبقى سوى صف واحد صغير مع رؤساء جزءا لا يتجزأ من (شفرة حلاقة يمكن استعد لتسهيل تقليم). تأكد من عدم خفض أكثر من اللازم بحيث لا كسر البارافين خلال باجتزاء (المزيد تقليم يمكن القيام به خلال باجتزاء).
  4. وضع كتلة متزايدة في حامل كائن من مشراح وضمان المواءمة بين صف من رؤساء موازية قدر الإمكان إلى حافة شفرة.
  5. إعداد الشرائح المجهر من قبل تغطيتها بطبقة رقيقة من بولي-L-ليسين (PLL) حل والسماح لهم الجافة لمدة 5 دقائق. غطاء لهم مع الماء قبل وقت قصير من استخدامها.
  6. قطع 7 ميكرون أقسام ونقل الشريط من المقاطع إلى الشريحة تطفو على الماء. <ر /> ملاحظة: للحصول على الدماغ بأكمله لأقسام أفقية، نقوم بجمع الشريط من عند بدء لقطع في العين حتى تم قطع رأسه تماما (قطع من خرطوم في الدماغ). قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من شريحة واحدة لجميع الرأس.
  7. وضع الشريحة على طبق من الحرارة عند 37 درجة مئوية، والسماح للالشريط لتوسيع لمدة 1 دقيقة.
  8. إزالة المياه الزائدة (بصب تشغيله أو استعمال المنديل) وتجفيف الشرائح O / N.
  9. إزالة شمع البارافين من الشريحة من خلال وضع الشرائح في طويل القامة، الرأسي جرة الشريحة تلطيخ مليئة كيل deparafinization (تغطي تماما الأقسام). أداء 3 يغسل من 30 دقيقة - 60 دقيقة لكل منهما.
  10. إزالة الشريحة من غسل النهائي. وضعت 2 قطرات من وسائل الإعلام تضمين على الشريحة، وتغطي مع ساترة كبيرة.

3. تصوير وتحليل الأقسام

  1. السماح للشرائح مستعدة لتجف لمدة 1-2 د. ثم، دراستها على microsc مضانمكتب مستشار رئيس الوزراء تحت الضوء الأزرق.
  2. استخدام التكبير السفلي لتحديد اتجاه الذباب وللعثور على المنطقة من اهتمام إذا التركيز على منطقة معينة.
    ملاحظة: للحصول على الذباب SWS (انظر الشكل 2)، نجد أن المقطع الذي يحتوي على الصوار الكبير والتقاط صورة (عادة في 40X التكبير). عند تحليل دماغ كامل (كما في الشكل 3)، ونحن تمرير خلال كافة الأقسام من الرأس وإما تصوير المقطع مع النمط الظاهري أشد أو جميع المقاطع التي تظهر فجوات.
  3. للاطلاع على تحليل مزدوجة التعمية، واتخاذ وصور عدد من دون معرفة التركيب الوراثي وتسجيل عدد ذوي الياقات البيضاء ووضع الرأس في صف واحد لتتعرف عليها لاحقا.
  4. بعد أخذ الصور وتحليلها باستخدام برامج التصوير.
  5. حساب عدد من الفجوات في القسم أو في الرأس. لقياس حجم فجوة، افتح الصور في البرنامج وتحديد الفجوات مع مجموعة مختارة جدال. تحديد مقدار بكسل في فجوات المحدد.
  6. لتحويلها إلى ميكرون والتقاط صورة لشريحة معايرة مرحلة ميكرومتر في التكبير المستخدمة للحصول على الصور. تحديد مقدار بكسل في 100 ميكرون 2 لحساب عامل التحويل.
  7. تحويل مجموع عدد بكسل إلى ميكرومتر 2 بقسمة عدد البكسلات التي كتبها عامل التحويل المحسوبة في الخطوة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام نتائج الطريقة الموضحة في مسلسل أقسام الملون من العين الصباغ 33 التي تشمل رأس ذبابة بأكمله. ويرد جزءا من هذا في الشكل 1B، حيث يتم عرض المقاطع من رئيس الفردية من أعلى إلى أسفل. وينظر تركت مقاطع من الذباب مختلفة إلى اليمين في هذا المثال. لتسهيل التوجه والتعرف على الذباب، هو عبارة عن ذبابة بلا عيون (oculis جيب) كعلامة على موقف 3 (السهم، الشكل 1B).

لتحديد التنكس العصبي، نقيس تشكيل الفجوات التي يمكن الكشف عنها في هذه المقاطع. وتحدد الفجوات كما جولة والبقع الداكنة التي تقع ضمن neuropil الفلورية الخضراء (النصال في الشكل 2 و 3) أو القشرة والتي هي واضحة في ما لا يقل عن 2 أقسام متتالية من الدماغ ذبابة. قياس تنكس عصبي من قبليمكن أن يتم ذلك إما فجوات قياس من خلال التركيز على منطقة محددة في الدماغ أو عن طريق تحليل الدماغ بأكمله. الحد من التحليل لمنطقة محددة من الدماغ هو مفيد في الحالات التي يؤثر طفرة فقط في منطقة معينة، مثل الفص الشم في futsch "OLK متحولة 34، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم عندما يكون هناك انحطاط شديد في كل أو كثير مناطق الدماغ. مثال لهذا الأخير هو الجبن السويسري (SWS) متحولة (الشكل 2)، حيث قياس كل الفجوات سيكون تستغرق وقتا طويلا. لذا أخذنا صورة واحدة فقط، والتأكد من أن القياسات تم القيام به دائما في نفس المستوى، اتخذنا جميع الصور على مستوى الصوار الكبير (القيادة العامة، الشكل 2A)، الذي يرد فقط في واحد أو قسمين. في حين أننا لم يكشف عن تشكيل فجوة في 1 الذباب SWS القديمة 1 يوما "(لا تظهر البيانات)، وفقدان وظيفة، أليل 35، وكانت بعض الفجوات ط كشفهان SWS القديمة لمدة 7 أيام '1 الذباب (النصال، الشكل 2A). الشيخوخة الذباب إلى 14 د (الشكل 2B) و 21 د (الشكل 2C) زاد من هذا النمط الظاهري، والتي تبين طبيعته التقدمية. عد عدد من الفجوات في neuropil deutocerebral (DN) باستخدام الطريقة الموصوفة أكد زيادة كبيرة في عدد من الفجوات مع التقدم في السن. كما زاد مجموع مساحة التي يشملها الفجوات بشكل كبير مع الشيخوخة (الشكل 2D).

ومع ذلك، ليس كل المسوخ تظهر مثل هذا النمط الظاهري بالحدة SWS، وفي تلك الحالات، والاختلافات في انحطاط من الصعب تحديد متى التركيز على منطقة صغيرة. وبالمثل، فإن انحطاط الذي يحدث أثناء الشيخوخة معتدل جدا (الشكل 3A - C)، وبالتالي، قمنا بتحليل المخ بأكمله عند قياس هذا النمط الظاهري. تحديد مجموع كل الفجوات في الدماغ كشفوكانت زيادة كبيرة مع التقدم في السن، وهذا هو الحال أيضا عند قياس مجموع مساحة هذه الفجوات (الشكل 3D).

شكل 1
الشكل 1. البارافين أقسام المسلسل. أ) باستخدام طريقة طوق، الذباب التجريبية والضابطة يمكن معالجتها كما عينة واحدة من خيوط لهم على طوق واحد. يتم إدراج بلا عيون الذباب oculis شرط للتوجيه (السهام). ب) رسم تخطيطي يظهر توجه رؤساء الطيران في طوق. C) في هذه الصورة، موجهة يقم مقاطع من رؤساء الطيران مختلفة إلى اليمين على الشريحة. من أعلى إلى أسفل على الشريحة، مسلسل أقسام من رأس ذبابة نفسه يمكن أن ينظر إليه. في هذه الحالة، تم إدراجها ذبابة oculis شرط في موقف الثلاث (السهم). هي ملطخة المقاطع من قبل الصباغ العين الفلورسنت أن يغسل على أقسام بعد القطع. شريط النطاق في A = 5 ملم وفي C = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تنكس عصبي التقدمي في المسخ السويسري الجبن. البارافين رئيس قسم من 7 اليوم-(A)، 14-اليوم-(ب) و 21-اليوم-SWS (C) القديمة "1 الذباب. وتشير النصال على الفجوات التي وضعت مع الشيخوخة. وكميا انحطاط المرتبطة بالعمر عن طريق حساب عدد من الفجوات وقياس مساحة إجمالية من (D). يشار إلى SEM وعدد من الذباب تحليلها. شريط مقياس = 25 ميكرون. *** ع <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تنكس عصبي يحدث مع تقدم العمر. البارافين رئيس قسم من 10 اليوم-(A)، لمدة 30 يوم-(ب) و 60 اليوم-(C) البالغة من النوع البري الذباب. وتشير النصال على الفجوات التي وضعت في الذباب البالغ من العمر. وكميا انحطاط المرتبطة بالعمر عن طريق حساب عدد من الفجوات وقياس مساحة إجمالية من (D). يشار إلى SEM وعدد من الذباب تحليلها. شريط مقياس = 25 ميكرون. *** ع <0.001. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر طريقة وصفها وسيلة لقياس تنكس عصبي في الدماغ من ذبابة الفاكهة. في حين أساليب أخرى، مثل عد نوع خلية معينة، ويمكن استخدامها لتحديد التنكس العصبي، والاستفادة من هذه الطريقة هو أنه يمكن تطبيقها بشكل عام. عد الخلايا يتطلب أن هذه الخلايا يمكن التعرف بشكل موثوق سواء باستخدام الأجسام المضادة المحددة أو التعبير عن علامة خلية محددة، وهي ليست متوفرة دائما. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن نتائج مختلفة بشكل كبير ويمكن الحصول مع هذا الأسلوب 24، ويفترض نظرا للظروف تستخدم لوضع العلامات وللكشف. طريقة أخرى للكشف عن خلايا التردي هو استخدام علامات موت الخلايا، مثل معاداة تفعيل كاسباس 3. ومع ذلك، وهذا يحدد فقط الخلايا التي تمر بنشاط موت الخلايا ومرة ​​واحدة لقوا حتفهم الخلايا، وأنها لم تعد للكشف. ميزة أخرى للطريقة المقترحة هنا هي أن هناك حاجة إلى تلطيخ بسبب autofluorescence الناجمة عن الصباغ العين، مما يوفر الوقت ويقلل من القطع الأثرية التي تسببها التغيرات في الظروف تلطيخ. ومن المهم أن نلاحظ أنه عند استخدام هذه الطريقة، وعيون الذباب "لديها ما يكفي من الصباغ وصمة عار على الشرائح. إذا كان لون العين خفيفة جدا، مضيفا ان بعض من النوع البري يطير إلى طوق سيكون من المستحسن لضمان كافية، وحتى تلطيخ عبر الشريحة. ميزة إضافية لهذه الطريقة هي أن مجالات متعددة يمكن فحصه، حتى في نفس الرأس. على الرغم من أننا لا يمكن أن تظهر البيانات، وقد استخدمنا هذه الأقسام لدراسة التنكس العصبي في فقدان الخلية الشبكية والدبقية في القشرة الصفيحة 30،36. كما هو موضح هنا، وهذه الطريقة توفر أقسام أفقية، ولكن من خلال تحويل كتلة البارافين بنسبة 90 درجة عند ذوبان وضعها على حامل كائن، يمكن للمرء أيضا الحصول على المقاطع الأمامية. وهكذا، وهذا الأسلوب هو إجراء متعدد الاستعمالات التي تسمح لقياس سرعة وكفاءة من التنكس العصبي في الدماغ ذبابة. لأن تشكيل بطالةوقد لوحظ uoles في العديد من النماذج الطيران من أمراض الاعصاب الإنسان، بما في ذلك نماذج لميلادي، PD، التصلب الجانبي الضموري (ALS)، والأمراض التي تسببها polyglutamine-يكرر 16،37-40، وهذه الطريقة يمكن استخدامها لقياس الظواهر العصبية في مجموعة متنوعة من نماذج المرض.

وعموما، هذا البروتوكول هو بسيط والانتهاء بسهولة مرة واحدة ويتم الإعداد الأولي للمعدات خارج. بعض الملاحظات أن نأخذ في الاعتبار هي لآخر بعناية يغسل الايثانول لتجنب الإفراط في جفاف رؤساء لتقليم بعناية كتل البارافين حتى لا تفقد أقسام أو رؤساء، وعدم overexpand الشريط على الماء عند الشريحة على كتلة الحرارة. إذا سمح الشريط لتوسيع بعيدا جدا، وتمزيق لرؤساء الطيران يمكن أن يؤدي وترتيب رؤوس في الشريط يمكن أن تضيع. وبالإضافة إلى ذلك، التعامي عن التركيب الوراثي أثناء القيام بتحليلات لا بد من تجنب التحيز. وأفضل طريقة لتحقيق ذلك من خلال وجود شخص واحد إعداد سليقصر وحفظ السجلات بينما شخص آخر يأخذ الصور والقيام القياسات. واحد من أوجه القصور في هذه الطريقة هو أن انحطاط سوى عدد قليل من الخلايا سيكون من الصعب جدا اكتشاف. في هذه الحالة، سيكون وصمة عار محددة من السكان خلية تتأثر يكون أكثر إفادة. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يسمح أحد للتمييز بين أنواع مختلفة من موت الخلايا، الأمر الذي يتطلب أساليب أكثر تحديدا، مثل تلطيخ النفق لتحديد أفكارك موت الخلية. وأخيرا، وهذه الطريقة لا يمكن التفريق بين موت الخلايا وانحطاط محور عصبي، والتي ستكون أيضا كشفها كما فجوات في neuropil.

كما هو مبين في نتائجنا، وهذه الطريقة يمكن استخدامها لمعالجة ضمور في مناطق محددة في الدماغ أو في الدماغ بأكمله. في تجربتنا، فمن المفيد تحليل فقط منطقة معينة عندما النمط الظاهري هو قوي جدا، حتى عندما تتأثر جميع مناطق الدماغ. وهذا يقلل إلى حد كبير من عبء العمل ولا يؤثر علىالنتيجة. قمنا بتحليل أصلا عدة مناطق في متحولة SWS ولاحظ النتائج متشابهة جدا في تطور النمط الظاهري عند المقارنة بين منطقة واحدة فقط وعند تحليل جميع المجالات (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المنطقة بشكل واضح للتعريف ينبغي اختيار لتجنب القطع الأثرية ويرجع ذلك إلى تحليل مختلف المجالات أو المناطق على مختلف المستويات.

في المقابل، في الحالات التي يكون فيها النمط الظاهري معتدل نسبيا، فمن الأفضل لتحليل الدماغ بأكمله، لأن احتمال العثور على فجوات في منطقة محددة منخفضة. على سبيل المثال، وهذا هو الحال عند تحديد التنكس العصبي المرتبط بالعمر، كما هو مبين في الشكل (3)، والذي ينتج فقط 4 - 5 فجوات في الدماغ بأكمله في الذباب القديمة لمدة 60 يوما. عندما عد فجوات في الدماغ بأكمله، على المرء أن يأخذ في الاعتبار أن فجوات صغيرة سوف تظهر فقط في قسم واحد، في حين أن أكبر منها سوف تمتد إلى عدة أقسام. فيما يخص الشرق الأوسط، وعلى مقربة من صفةأقسام acent عند استخدام هذه الطريقة (الشكل 1) توفر ميزة أخرى، لأنه من السهل نسبيا لتحديد ما إذا كان نفس فجوة موجودة في عدة أقسام.

في الختام، يمكن هذا البروتوكول يكون مفيدا لدراسة العديد من النماذج ذبابة الفاكهة من الأمراض العصبية المختلفة. تحديد البروتينات التفاعل أن تحسين أو تفاقم النمط الظاهري التنكسية يمكن تقديم رؤى حاسمة حول الآليات الكامنة التي تسبب أو تعديل أمراض مثل الزهايمر والشلل الرعاش. في هذا المنشور، ونحن نستخدم هذه الطريقة للكشف عن انحطاط يكون تقدميا، حيث تتطور الحيوانات عادة ولكن تبين زيادة انحطاط أثناء الشيخوخة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لتحديد انحطاط التي يسببها العيوب التنموية، التي ينبغي أن تكون موجودة بالفعل في الذباب eclosed حديثا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics