Mass Histologi at kvantificere neurodegeneration i

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Drosophila er almindeligt anvendt som et modelsystem til at studere neurodegeneration. Denne protokol beskriver en metode, hvorved degenerering, som bestemt ved vacuole dannelse i hjernen, kan kvantificeres. Det minimerer også effekter som følge af den eksperimentelle procedure ved behandling og sektionering kontrol og eksperimentelle fluer som en prøve.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Progressive neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom (AD) eller Parkinsons sygdom (PD) er en voksende trussel mod menneskers sundhed i hele verden. Selv pattedyr modeller har givet vigtig indsigt i de underliggende mekanismer af patogenicitet, er kompleksiteten af ​​pattedyr systemer sammen med deres høje omkostninger begrænser deres anvendelse. Derfor er den enkle, men veletablerede Drosophila model-system giver et alternativ til at undersøge de molekylære veje, der er berørt i disse sygdomme. Udover adfærdsmæssige afvigelser, er neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved histologiske fænotyper såsom neuronal død og axonopathy. For at kvantificere neuronal degeneration og at bestemme, hvordan det påvirkes af genetiske og miljømæssige faktorer, bruger vi en histologisk tilgang, der er baseret på måling af vakuoler i voksne flyve hjerner. For at minimere virkningerne af systematisk fejl og til direkte at sammenligne sektioner fra kontrol- og experimental fluer i en forberedelse, bruger vi "krave" metode til paraffinsnit. Neurodegeneration vurderes derefter ved at måle størrelsen og / eller antallet af vakuoler, der har udviklet i gylp hjernen. Dette kan enten ske ved at fokusere på en bestemt region af interesse eller ved at analysere hele hjernen ved at opnå serielle snit, der spænder over fuldstændige hoved. Derfor er denne metode tillader en at måle ikke blot alvorlig degeneration, men også relativt milde fænotyper, der kun kan påvises i et par afsnit, som forekommer under normal aldring.

Introduction

Med stigningen i den forventede levetid, har neurodegenerative sygdomme som Alzheimers eller Parkinsons blevet et stigende sundhedstrussel for den almene befolkning. Ifølge National Institutes of Health, 115 millioner mennesker verden over forventes at blive påvirket af demens i 2050. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med at identificere gener og risikofaktorer der er involveret i det mindste nogle af disse sygdomme, for mange af dem, den underliggende molekylære mekanismer er stadig ukendt eller ikke godt forstået.

Simple hvirvelløse modelorganismer som Caenorhabditis elegans og Drosophila melanogaster tilbyder en bred vifte af eksperimentelle fordele at studere mekanismerne i neurodegenerative sygdomme, herunder en kort livscyklus, stort antal afkom, og tilgængeligheden af veletablerede og til tider unikke genetiske og molekylære metoder 1 -12. Desuden er disse organismer er modtagelige for fordomsfriinteraktion skærme, der kan identificere faktorer, der bidrager til disse sygdomme ved deres skærpende eller lindring af virkninger på neurodegenerative fænotyper.

Analyse sådanne genetiske interaktioner og vurdere aldrende effekter kræver kvantitative protokoller til at opdage neurodegeneration og måle dens sværhedsgrad. Denne vurdering kan gøres relativt let ved måling adfærdsmæssige aspekter i Drosophila, såsom olfaktoriske læring, negative geotaxis, eller hurtig phototaxis, som giver en numerisk ydeevne værdi 13-21. Det er også muligt at bestemme virkningerne på neuronal overlevelse ved at tælle neuroner. Men dette er kun muligt, når der fokuseres på en bestemt befolkning, der er klart identificerbare, ligesom de dopaminerge neuroner, der er berørt i PD, og selv da, har resultaterne været kontroversielle 22-24.

Protokollen beskrevet her anvender kraven metode til at udføre paraffin serielle snit, en fremgangsmådeder oprindeligt blev udviklet af Heisenberg og Böhl, der brugte det til at isolere anatomiske hjernen mutanter i Drosophila 25. Brugen af kraven metode er efterfølgende blevet tilpasset, herunder kryosektioner, Vibratome sektioner, og plastprofiler 26-28. Her er denne metode anvendes til opnåelse serielle sektioner af hele flue hoved, som derefter kan anvendes til at måle vakuolerne der udvikler sig i fluer med neurodegenerative fænotyper 16,21,29-32. Disse målinger kan udføres på specifikke områder i hjernen eller kan dække hele hjernen; sidstnævnte tilgang tillader en at identificere selv svage degenerative fænotyper, som observeret under aldring. Endelig, når anvendelse af kraverne, op til 20 fluer kan behandles som én præparat, som ikke blot er mindre tidskrævende, men også giver mulighed for analyse af kontrol- og eksperimentelle fluer i det samme præparat, hvilket minimerer artefakter som følge af små ændringer i præparatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fastsættelse chefen på Kraver og Indlejring i Paraffin

Bemærk: Alle trinene i fiksering processen bør ske i et stinkskab. Methylbenzoat, mens ikke udgør en sundhedsrisiko, har en højt udtalt lugt, som kan være overvældende, hvis ikke håndteres i et stinkskab.

  1. Før bedøve fluerne, udgør 50 ml Carnoy ved tilsætning 15 ml chloroform og 5 ml iseddike til 30 ml 99% ethanol (ikke blande chloroform og eddikesyre). Hæld det i en glasbeholder med en flad bund, såsom en crystalizing skålen, for at sikre, at kraverne kan ligge fladt og er helt dækket af opløsningen.
  2. Bedøver fluerne med CO 2 eller ether.
  3. Tråd fluer (op til 20 med de fleste kraver) ved deres hals ind i kraver bruger pincet. Husk at tilpasse alle de hovedet i samme retning, som det ses i figur 1A, og være blid til at sikre, at der ikke sker skade på hovedet eller øjnene.
  4. Medtag sinus oculis fluer (pile, figur 1A) på tilfældige positioner, således at rækkefølgen af fluerne kan let identificeres i afsnittene. Desuden, hvis de eksperimentelle fluer har en lys eller hvid øjenfarve, tråd nogle røde øjne fluer, såsom vildtype, mellem dem for at sikre, at der er tilstrækkelig pigment er til stede til at plette dias. Optag rækkefølgen af ​​fluer på en protokolblad sammen med kraven nummer hvis du bruger mere end en krave.
  5. Når en krave er afsluttet, placere den i den forberedte Carnoy løsning til 3,5-4 time.
  6. Dump ud Carnoy opløsningen i passende bortskaffelse beholder og begynde den ethanol vaske. Sørg for at hælde langsomt for ikke at forstyrre placeringen af ​​kraverne i beholderen.
  7. Vask kraverne i 30 minutter i 99% ethanol to gange.
  8. Vask kraverne i 100% ethanol i 1 time. Vær sikker på at ændre vaskene til tiden for at forhindre overdehydration.
  9. Sæt kraver i methylbenzoatO / N ved stuetemperatur. Forsegl beholderen med parafilm at forhindre fordampning af methylbenzoat.
  10. Hæld methylbenozate i den rigtige engangsbeholderen i stinkskab. Tilføj en tidligere fremstillet blanding af 1: 1 lavt smeltepunkt (56 - 57 ° C) paraffinvoks og methylbenzoat. Fra dette punkt, skal holdes i en inkubator ved 65 ° C kraverne for at sikre, at paraffinen ikke hærde.
  11. Hæld methylbenozate og paraffin blanding i den korrekte engangsbeholderen, og hæld smeltet ren paraffin, holdt ved 65 ° C, på kraverne.
  12. Ændre paraffin efter 30 minutter og gentage dette mindst 5 gange. bør udføres 8 gange vask - Mindst 6.
  13. Når vaskene er færdige, placere kraver i en gummi isterning bakke med slots omtrent på størrelse med de kraver. Hæld smeltet paraffin over dem indtil den er helt dækket og lad det hærde O / N (forsøge at undgå luftbobler).
  14. Fjern paraffinblokke beholdere underning kraverne fra isterning bakken. Adskil paraffinblokken fra kraven under anvendelse af et barberblad, forsigtigt brækker kraven. Lederne vil være i paraffin blok, mens de organer vil blive i kraven. Blokkene kan opbevares ved stuetemperatur.
  15. For at rengøre kraver, suge dem i en deparafinization agent ved 65 ° C for at fjerne paraffin, ren med lys skrubbe, og vask i ethanol før genbrug.

2. Skæring og montering

  1. Varm en varmeplade til 50 ° C. Placer objekt indehavere (eller metal montering blokke) og barberblade på pladen og lad dem varme op.
  2. Afhængigt af den ønskede orientering for sektionering, vedhæfte paraffinblokken enten med lederne mod siden (for vandrette sektioner) eller opad (for frontale sektioner) til en opvarmet monteringsblok (kortvarigt smeltning af blokken på kontaktsiden). Tag blok fra varmepladen og lad det køle af i mindst 10 min at sikre, at paraffinen er hærdet nok til en korrekt forsegling på monteringsblokken. Hold rækken af ​​hoveder på linie parallelt med overfladen af ​​blokken så meget som muligt at forhindre ujævn sektioner.
  3. Tag et barberblad og trim overskydende paraffin væk fra flyve hoveder, så kun en lille række med de indlejrede hoveder er stadig (det barberblad kan varmes op for lettere trimning). Sørg for ikke at trimme for meget, så paraffinen ikke knækker under sektionering (mere trimning kan gøres under sektionering).
  4. Anbring monteringsblokken i holderen formål med mikrotomen og sikre, at opretningen af ​​rækken af ​​hoveder er så vidt muligt parallelt med kanten af ​​bladet.
  5. Forbered mikroskopobjektglas ved at dække dem med et tyndt lag af poly-L-lysin (PLL) opløsning og lad dem tørre i 5 minutter. Dæk dem med vand kort før brug.
  6. Skær 7 um snit og overføre båndet af sektioner til objektglasset flyder på vandet. <br /> BEMÆRK: For at opnå hele hjernen for vandrette sektioner, vi indsamler båndet fra når du begynder at skære i øjet indtil hovedet er blevet fuldstændig skåret (skæring fra snabel ind i hjernen). kan være behov for mere end én slide for hele hovedet.
  7. Placer glider på en varme plade ved 37 ° C, og tillade båndet at ekspandere i ca. 1 min.
  8. Fjern overskydende vand (ved at hælde det ud eller ved hjælp af et væv) og tør dias O / N.
  9. Fjern paraffinvoks fra slide ved at placere objektglassene i en høj, lodret slide-farvning krukke fyldt med en deparafinization middel (helt dækker afsnittene). Udfør 3 vaske med 30 min - 60 min hver.
  10. Fjern dias fra den sidste vask. Placer 2 dråber indlejring medier på dias og dække det med et stort dækglas.

3. Fotografering og analysere de Sektioner

  1. Lad forberedte dias tørre i 1 - 2 ud d. Derefter undersøge dem på en fluorescens Microscope under blå lys.
  2. Brug en lavere forstørrelse til at bestemme orienteringen af ​​fluer og at finde området af interesse, hvis fokusere på en bestemt region.
    BEMÆRK: SWS fluer (se figur 2), finder vi det afsnit, der indeholder den store commissure og tage et billede (som regel ved 40X forstørrelse). Ved analyse af hele hjernen (som i figur 3), rulle vi gennem alle sektioner fra et hoved og enten fotografere afsnittet med den mest alvorlige fænotype eller alle sektioner, der viser vakuoler.
  3. For en dobbeltblind analyse, tage og antal billeder uden at kende genotypen og registrere kraven antal og placering af hovedet i rækken til at identificere dem senere.
  4. Når billederne er taget, analysere dem ved hjælp af en imaging software.
  5. Tæl antallet af vakuoler pr sektion eller pr hoved. For at måle vakuolen størrelse, åbne billederne i et program, og vælg de celleblærer med et udvalg forl. Bestem mængden af ​​pixels i de udvalgte vakuoler.
  6. For konvertering til um 2, tage et billede af en scene mikrometer kalibrering slide på forstørrelsen anvendt til at erhverve fotos. Bestem mængden af pixels i 100 um 2 til at beregne en omregningsfaktor.
  7. Konvertere det samlede antal pixel i pm2 ved at dividere antallet af pixels med omregningsfaktoren beregnet i ovenstående trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde resulterer i serielle snit farvet af øjet pigment 33, der omfatter hele flue hoved. En del af dette er vist i figur 1B, hvor sektionerne fra en individuel hoved er vist fra top til bund. Sektionerne fra forskellige fluer ses venstre til højre i dette eksempel. For at lette orienteringen og identifikation af fluerne, er en eyeless flue (sinus oculis) indsættes som en markør ved position 3 (pil, figur 1B).

For at kvantificere neurodegeneration, vi måler dannelsen af ​​vakuoler, der kan påvises i disse afsnit. Vakuoler defineres som runde, mørke pletter, der er inden for det grønne fluorescerende neuropil (pilespidser i figur 2 og 3) eller cortex, og som er synlige i mindst 2 på hinanden følgende sektioner af flue hjernen. Kvantificering neurodegeneration vedmåling vakuoler kan enten gøres ved at fokusere på en bestemt område af hjernen eller ved analyse af hele hjernen. Begrænse analysen til en specifik region af hjernen er nyttig i tilfælde, hvor en mutation påvirker kun en specifik region, ligesom de olfaktoriske lapper i Futsch 'Olk mutant 34, men den kan også bruges, når der forekommer alvorlig degenerering i alle eller mange regioner i hjernen. Et eksempel på sidstnævnte er den schweizerost (SWS) mutanten (figur 2), hvor måling af alle vakuoler ville være for tidskrævende. Vi tog derfor kun et billede, og at sikre, at målingerne altid blev gjort på samme niveau, tog vi alle billeder på samme niveau som den store commissure (gc, figur 2A), som kun indeholdt i et eller to sektioner. Hvor vi ikke afsløre vakuolen dannelse i en dag gamle SWS '1 fluer (data ikke vist), et tab af funktion allel 35, nogle vakuoler var påviselige in 7 dage gamle SWS '1 fluer (pilespidser, figur 2A). Aging fluerne til 14 d (figur 2B) og 21 d (Figur 2C) yderligere forøget denne fænotype, viser sin progressive karakter. Tælle antallet af vakuoler i deutocerebral neuropil (dn) under anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde bekræftede en væsentlig stigning i antallet af vakuoler med alderen. Desuden blev det kombinerede område omfattet af vakuoler signifikant øget med aldring (figur 2D).

Men ikke alle mutanter viser sådan en alvorlig fænotype som SWS, og i de tilfælde, forskelle i degeneration er vanskeligt at afgøre, når der fokuseres på et lille område. Tilsvarende degeneration, der opstår under ældning er ganske mild (figur 3A - C) og derfor analyserede vi hele hjernen, når kvantificere denne fænotype. Bestemmelse af summen af ​​alle vakuoler i hjernen afsløreten betydelig stigning med alderen, og dette var også tilfældet ved måling af samlede areal af disse vakuoler (figur 3D).

figur 1
Figur 1. Paraffin serielle snit. A) Ved hjælp af kraven metode, kan eksperimentelle og kontrol fluer behandles som en prøve ved at skrue dem på en krave. Eyeless sinus oculis fluer indsættes til orientering (pile). B) Skematisk viser orienteringen af fluen hoveder i kraven. C) I dette billede, sektioner fra forskellige flyve hoveder er orienteret fra venstre mod højre på diaset. Fra top til bund på dias, kan serielle sektioner fra den samme flue hoved ses. I dette tilfælde blev en absolut oculis flue indsat ved position tre (pil). Sektionerne farves ved det fluorescerende øje pigment, der skyller over sektioner efter opskæring. Scale bar i A = 5 mm, og i C = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Progressiv neurodegeneration i schweizisk ost Mutant. Paraffin hoved sektion fra 7-dag- (A), 14-dag-(B) og 21-dag-(C) gamle SWS '1 fluer. De pilespidser peger på vakuoler, der har udviklet med aldring. Den aldersrelateret degeneration kvantificeres ved at tælle antallet af vakuoler og måle deres samlede område (D). SEM og antallet af analyserede fluer er angivet. Skalaen bar = 25 um. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Neurodegeneration opstår med alderen. Paraffin hovedsektionen fra 10-dag-(A), 30-dag-(B) og 60-dag-(C) gamle vildtype-fluer. De pilespidser peger på vakuoler, der har udviklet i alderen fluer. Den aldersrelateret degeneration kvantificeres ved at tælle antallet af vakuoler og måle deres samlede område (D). SEM og antallet af analyserede fluer er angivet. Skalaen bar = 25 um. *** P <0,001. Klik her for at se en større version af dette tal. </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer et middel til at kvantificere neurodegeneration i hjernen hos Drosophila. Mens andre metoder, såsom at tælle en specifik celletype, kan anvendes til at identificere neurodegeneration, fordelen ved denne fremgangsmåde er, at den kan anvendes mere generelt. Tælle celler kræver, at disse celler kan identificeres pålideligt ved anvendelse af enten et specifikt antistof eller ekspressionen af ​​en cellespecifik markør, som ikke altid er til rådighed. Endvidere er det blevet vist, at dramatisk forskellige resultater kan opnås med denne fremgangsmåde 24, formentlig på grund af de betingelser, der anvendes til mærkning og til detektion. En anden metode til påvisning af degenererende celler er anvendelsen af ​​celledød markører, ligesom anti-aktiveret caspase 3. dog kun identificerer celler aktivt undergår celledød og når cellerne er døde, er de ikke længere påviselig. En anden fordel ved den her foreslåede fremgangsmåde er, at ingen farvning er påkrævet på grund af autofluorescence forårsaget af øjet pigment, hvilket sparer tid og minimerer artefakter forårsaget af ændringer i farvningsbetingelser. Det er vigtigt at bemærke, at når du bruger denne metode, de fluer øjne har nok pigment til at farve dias. Hvis øjenfarve er for lys, tilføje nogle vildtype flyver til kraven vil være tilrådeligt at sikre en tilstrækkelig og endda farvning tværs af dias. En yderligere fordel ved denne fremgangsmåde er, at flere områder kan undersøges, selv i samme hoved. Selvom vi ikke viser dataene, har vi anvendt disse afsnit for at undersøge neurodegeneration i nethinden og gliacelle tab i lamina cortex 30,36. Som beskrevet her, tilvejebringer denne fremgangsmåde vandrette sektioner, men ved at dreje paraffinblokken ved 90 °, når smeltning det på holderen objektet, kan man også opnå frontale sektioner. Således er denne fremgangsmåde er en alsidig fremgangsmåde, der giver mulighed for en hurtig og effektiv måling af neurodegeneration i gylp hjernen. Fordi dannelsen af ​​vacuoles er blevet observeret i mange flyve modeller for humane neurodegenerative sygdomme, herunder modeller for AD, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og sygdomme forårsaget af polyglutaminkanaler-gentagelser 16,37-40, denne metode kan anvendes til at kvantificere neurodegenerative fænotyper i en række forskellige sygdomsmodeller.

Samlet set er denne protokol er enkel og uden besvær, når den indledende opsætning af udstyret udføres. Nogle noter at huske på er at omhyggeligt tid ethanol vasker for at undgå overdreven dehydrering af lederne, at omhyggeligt trimme paraffinblokke for ikke at miste sektioner eller hoveder, og ikke overexpand båndet på vandet, når diaset er på varmeblokken. Hvis farvebåndet tillades at ekspandere for langt, tåreflåd af fluen hoveder kan resultere og kan gå tabt rækkefølgen af ​​hoveder i båndet. Hertil kommer, at være blind for genotypen samtidig gør analyserne er vigtigt at undgå bias. Det opnås bedst ved at have én person forbereder SLIdes og holde posterne, mens en anden person tager billederne og gør målingerne. En af begrænsningerne ved denne metode er, at degeneration af kun få celler vil være meget vanskelig at opdage. I så fald ville en specifik farvning af de berørte cellepopulation være mere informativ. Hertil kommer, at denne metode ikke tillader en at skelne mellem forskellige former for celledød, som kræver mere specifikke metoder, såsom en TUNEL-farvning til bestemmelse apoptotisk celledød. Endelig kan denne metode ikke skelne mellem celledød og axonal degeneration, hvilket også ville kunne påvises som vakuoler i neuropil.

Som vist i vores resultater, kan denne fremgangsmåde anvendes til at behandle degeneration i bestemte områder i hjernen eller i hele hjernen. Det er vores erfaring, er det nyttigt kun at analysere et bestemt, da fænotypen er ganske stærk, selv når alle hjerneområder er berørt. Dette reducerer arbejdsbelastningen betydeligt og påvirker ikkeresultat. Vi oprindeligt analyseret flere områder i SWS mutant og observerede meget lignende resultater i udviklingen af den fænotype, når man sammenligner kun ét område, og når man analyserer alle områder (data ikke vist). Det skal dog bemærkes, at der skal vælges en klart identificerbar region for at undgå artefakter på grund af analyse af forskellige områder eller områder på forskellige niveauer.

I modsætning hertil i tilfælde, hvor fænotypen er relativt milde, er det bedre at analysere hele hjernen, fordi sandsynligheden for at finde vakuoler i en bestemt region er lav. For eksempel er dette tilfældet, når det bestemmes aldersrelateret neurodegeneration, som vist i figur 3, som resulterer i kun 4. - 5. vakuoler i hele hjernen i 60 dage gamle fluer. Når tælle vakuoler i hele hjernen, man må tage hensyn til, at de små vakuoler kun vil dukke op i et afsnit, mens større virksomheder vil strække sig over flere afsnit. Med hensyn til sidstnævnte, den tætte nærhed af adjacent sektioner ved brug af denne metode (figur 1) giver en anden fordel, fordi det er relativt nemt at afgøre, om den samme vacuole er til stede i flere sektioner.

Som konklusion kan denne protokol vise sig nyttigt til undersøgelse mange Drosophila modeller af forskellige neurodegenerative sygdomme. Identifikation interagerende proteiner, bedre eller forværre degenerative fænotype kan give afgørende indsigt de underliggende mekanismer, der forårsager eller ændre sygdomme som Alzheimers og Parkinsons. I denne publikation, bruger vi denne metode til at påvise degeneration, der er progressiv, hvor dyrene udvikle sig normalt, men viser stigende degeneration under ældning. Derudover kan denne fremgangsmåde også indrettet til at bestemme degeneration, der er forårsaget af udviklingsmæssige defekter, der allerede skulle være til stede i nyligt eclosed fluer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics