Mass Histologi å kvantifisere Nevrodegenerasjon i

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Drosophila er mye brukt som modellsystem for å studere neurodegeneration. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte ved hvilken degenerasjon, bestemt ved vakuole dannelse i hjernen, kan kvantifiseres. Det minimerer også effekter på grunn av den eksperimentelle prosedyren ved behandling og seksjonering kontroll og eksperimentelle fluer som en prøve.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Progressive nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD) eller Parkinsons sykdom (PD) er en økende trussel mot menneskers helse over hele verden. Selv pattedyr modeller har gitt viktig innsikt i de underliggende mekanismene for patogenitet, er kompleksiteten i pattedyrsystemer sammen med sine høye kostnader begrenser deres bruk. Derfor gir den enkle, men godt etablert Drosophila modell-system et alternativ for å undersøke molekylære stier som er berørt i disse sykdommene. Dessadferdsmessige mangler, er nevrodegenerative sykdommer kjennetegnet ved histologiske fenotyper som neuronal død og axonopathy. For å kvantifisere neuronal degenerasjon og for å bestemme hvordan den påvirkes av genetiske og miljømessige faktorer, bruker vi en histologisk tilnærming som er basert på måling av vakuoler i voksen flue hjerner. For å minimere effekten av systematisk feil og direkte sammenligne seksjoner fra kontroll og experimental fluer i en forberedelse, bruker vi "krage" -metoden for parafinsnitt. Neurodegenerasjon blir så vurdert ved å måle størrelsen og / eller antallet av vakuoler som har utviklet seg i fly hjernen. Dette kan enten gjøres ved å fokusere på et bestemt område av interesse eller ved å analysere hele hjernen ved å skaffe seriesnitt som strekker seg over hele hodet. Derfor gir denne metoden en til å måle ikke bare alvorlig degenerasjon, men også relativt milde fenotyper som kun er synlig i noen deler, som oppstår under normal aldring.

Introduction

Med økningen i levealder, har nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers eller Parkinsons blitt et økende helsetrussel for befolkningen generelt. Ifølge National Institutes of Health, 115 millioner mennesker over hele verden er spådd til å bli rammet av demens i 2050. Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort for å identifisere gener og risikofaktorer som er involvert i det minste noen av disse sykdommene, for mange av dem, den underliggende molekylære mekanismer er fortsatt ukjent eller ikke godt forstått.

Enkle virvelløse modellorganismer som Caenorhabditis elegans og Drosophila melanogaster tilbyr en rekke eksperimentelle fordeler for å studere mekanismene for nevrodegenerative sykdommer, inkludert en kort livssyklus, stort antall avkom, og tilgjengeligheten av godt etablerte og noen ganger unike genetiske og molekylære metoder 1 -12. Videre disse organismene er mottagelig for objektivinteraksjons skjermer som kan identifisere faktorer som bidrar til disse sykdommene ved sine skjerpende eller lindring effekter på nevrodegenerative fenotyper.

Analysere slike genetiske interaksjoner og vurdere aldringseffekter krever kvantitative protokoller for å oppdage nevrodegenerasjon og å måle alvorlighetsgrad. Denne vurderingen kan gjøres relativt enkelt når man måler atferdsmessige aspekter i Drosophila, for eksempel olfactory læring, negative geotaxis, eller rask phototaxis, som gir en numerisk ytelse verdi 13-21. Det er også mulig å bestemme effektene på neuronal overlevelse ved å telle neuroner. Men dette er bare mulig når du fokuserer på en bestemt befolkning som er klart identifiserbar, som dopaminerge nevroner som er berørt i PD, og selv da, har resultatene vært kontroversiell 22-24.

Protokollen er beskrevet her anvender kraven metode for å utføre parafinseriesnitt, en fremgangsmåtesom opprinnelig ble utviklet av Heisenberg og Böhl, som brukte den til å isolere anatomiske hjerne mutanter i Drosophila 25. Bruken av kraven Metoden har senere blitt tilpasset, inkludert i frysesnitt, vibratome seksjoner, og plastseksjoner 26-28. Her er denne metode som anvendes for å oppnå seriesnitt av hele fly hode, som deretter kan brukes til å måle vakuoler som utvikler seg i fluer med nevrodegenerative fenotyper 16,21,29-32. Disse målingene kan gjøres i spesifikke hjerneområder, eller kan dekke hele hjernen; sistnevnte tilnærmingen gjør det mulig å identifisere selv svake degenerative fenotyper, som observert under aldring. Til slutt, ved bruk av kragene, opp til 20 fluer kan behandles som en forberedelse, som ikke bare er mindre tidkrevende, men også gir mulighet for analyse av kontroll og eksperimentelle flyr i det samme preparat, noe som minsker artefakter som følge av små endringer i fremstillingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fikse hodet på krage og bygge inn i Parafin

Merk: Alle trinnene i fiksering prosessen bør gjøres i en avtrekkshette. Metylbenzoat, mens ikke utgjør en helserisiko, har en svært distinkt lukt, som kan være overveldende hvis ikke håndteres på en avtrekkshette.

  1. Før bedøvelse fluene, utgjør 50 ml Carnoy oppløsning ved tilsetning av 15 ml kloroform og 5 ml iseddik til 30 ml av 99% etanol (ikke blande kloroform og eddiksyre). Helle det i en glassbeholder med en flat bunn, slik som en crystalizing tallerken, for å sikre at kragene kan ligge flatt og er fullstendig dekket av oppløsningen.
  2. Anesthetize fluer med CO 2 eller eter.
  3. Tråd fluer (opp til 20 med de fleste krager) av nakken i kragene bruker pinsett. Husk å justere alle hodene i samme retning, som vist i figur 1A, og være forsiktig for å sikre at det ikke oppstår skade i hodet eller øynene.
  4. Inkluder sinus oculis fluer (piler, figur 1A) på tilfeldige posisjoner slik at rekkefølgen av fluene lett kan identifiseres i seksjonene. I tillegg, hvis de eksperimentelle fluer har en lys eller hvit øyenfarge, træ noen rød-eyed fluer, for eksempel villtype, mellom dem for å sikre at tilstrekkelig pigment er til stede for å flekke lysbildet. Spill rekkefølgen av fluene på en protokoll ark sammen med halsbåndet nummer hvis du bruker mer enn en krage.
  5. Når en krage er ferdig, legg den i den utarbeidede Carnoy løsning for 3,5 til 4 t.
  6. Dumpe ut Carnoy løsningen inn i riktig avhending beholderen og begynne etanol vasker. Sørg for å helle sakte for ikke å forstyrre plasseringen av krager i beholderen.
  7. Vask kragene i 30 minutter i 99% etanol to ganger.
  8. Vask kragene i 100% etanol i 1 time. Sørg for å endre de vasker i tide for å unngå overdehydration.
  9. Sett kragene i metylbenzoatO / N ved RT. Forsegle beholderen med parafilm for å hindre fordamping av metylbenzoat.
  10. Hell methylbenozate i riktig engangsbeholder i avtrekksskap. Legg til en tidligere fremstilt blanding av 1: 1 med lavt smeltepunkt (56-57 ° C) parafinvoks og metylbenzoat. Fra dette punkt, kragene må holdes i en inkubator ved 65 ° C for å sikre at parafinen ikke herde.
  11. Hell ut methylbenozate og parafinblandingen inn i riktig engangsbeholder, og helle smeltet ren parafinvoks, holdt ved 65 ° C, på kragene.
  12. Endre parafin etter 30 minutter og gjenta dette minst 5 ganger. Minst 6 - 8 vasker skal utføres.
  13. Når vasker er fullført, plasserer krage inn i en gummiisbitboksen med sporene omtrent på størrelse med kragene. Hell smeltet parafin over dem til det er helt dekket og la det stivne O / N (prøve å unngå luftbobler).
  14. Fjern parafinblokker containing kragene fra isbitboksen. Skill parafin blokk fra halsbåndet ved hjelp av et barberblad, forsiktig bryte av kragen. Hodene vil være i parafin blokken mens likene vil bo i kragen. Blokkene kan oppbevares i romtemperatur.
  15. Slik rengjør du krager, suge dem i en deparafinization middel ved 65 ° C for å fjerne parafin, rent med lys skrubbing, og vask i etanol før gjenbruk.

2. Seksjonering og Montering

  1. Varm en varmeplate til 50 ° C. Plasser objekteierne (eller metall montering blokker) og barberblader på tallerkenen og la dem varme opp.
  2. Avhengig av den ønskede orientering til snitting, feste parafin blokken, enten med hodet mot den side (for horisontale seksjoner) eller vendt oppover (for frontale seksjoner) til en oppvarmet monteringsblokk (kortvarig smelting av blokken på kontaktsiden). Fjern blokken fra varmeplaten og la den avkjøles i minst 10 min for å sikre at parafinen er herdet tilstrekkelig for en skikkelig tetning mot monteringsblokken. Hold raden av hoder innrettet parallelt med overflaten av blokken så mye som mulig for å hindre ujevne seksjoner.
  3. Ta et barberblad og trim overflødig parafin bort fra fly hoder, slik at bare en liten rad med den innebygde hoder forblir (barberblad kan bli varmet opp for enklere trimming). Pass på å ikke klippe for mye slik at parafinen ikke bryter under snitting (mer trimming kan gjøres under snitting).
  4. Plasser monteringsblokken inn i objektet innehaveren av mikrotomen, og sørge for at innretting av raden av hoder er mest mulig parallell til kanten av bladet.
  5. Forbered objektglass ved å dekke dem med et tynt lag av poly-L-lysin (PLL) løsning og la dem tørke i 5 min. Dekk dem med vann like før bruk.
  6. Skjær 7 mikrometer seksjoner og overføre bånd av seksjonene til lysbildet som flyter på vannet. <br /> MERK: For å få hele hjernen for horisontale seksjoner, samler vi båndet fra når du begynner å skjære i øyet inntil hodet er helt kuttet (kutte fra snabel inn i hjernen). Mer enn ett lysbilde kan være nødvendig for hele hodet.
  7. Plasser lysbildet på en varmeplate ved 37 ° C og tillate båndet å ekspandere i ca. 1 min.
  8. Fjern overflødig vann (ved å helle den av eller ved hjelp av en vev) og tørk lysbilder O / N.
  9. Fjern parafinvoks fra raset ved å plassere lysbilder i en høy, loddrett slide-farging krukke fylt med en deparafinization middel (helt dekker seksjonene). Utfør 3 vasker av 30 min - 60 min hver.
  10. Fjern lysbildet fra siste vask. Legg 2 dråper innebygging media på lysbildet og dekke den med en stor dekkglass.

3. Fotografering og Analysere Seksjoner

  1. La de preparerte lysbilder tørke i 1-2 d. Deretter undersøke dem på en fluorescens mikroskopope etter blått lys.
  2. Bruk en lavere forstørrelse for å bestemme retningen på fluene og for å finne den regionen av interesse hvis fokusere på en bestemt region.
    MERK: For SWS fluer (se figur 2), finner vi den delen som inneholder den store commissure og ta et bilde (vanligvis på 40X forstørrelse). Ved å analysere hele hjernen (som i figur 3), blar vi gjennom alle seksjoner fra et hode og enten fotografere delen med mest alvorlig fenotype eller alle deler som viser vakuoler.
  3. For en dobbelt-blind analyse, ta og tallbilder uten å vite det genotype og registrere kraven antall og posisjon av hodet i raden for å identifisere dem senere.
  4. Når bildene er tatt, analysere dem ved hjelp av et bildebehandlingsprogrammer.
  5. Tell antall vakuoler per seksjon eller per hode. For å måle vakuole størrelse, åpne bildene i et program og velg vakuoler med et utvalg forl. Bestemme mengden av piksler i de utvalgte vakuoler.
  6. For konvertering til mikrometer 2, ta et bilde av en scene mikrometer kalibrering sklie på forstørrelse som brukes for å skaffe bilder. Bestemme mengden av piksler i 100 mikrometer 2 for å beregne en omregningsfaktor.
  7. Omdanne det totale antall piksler i mikrometer 2 ved å dividere antall piksler ved omregningsfaktor beregnet i det foregående trinn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av de beskrevne metode resulterer i seriesnitt farget med det blotte øye pigment 33 som omfatter hele fluehodet. En del av dette er vist i figur 1 B, hvor seksjonene fra en individuell leder er vist fra topp til bunn. Seksjonene fra forskjellige fluer er sett fra venstre til høyre i dette eksempelet. For å lette orientering og identifisering av fluer, er en eyeless fly (sinus oculis) satt inn som en markør i posisjon 3 (pil, figur 1B).

For å kvantifisere nevrodegenerasjon, måler vi dannelsen av vakuoler som kan oppdages i disse avsnittene. Vakuoler er definert som rund, mørke flekker som er innenfor det grønne fluorescente neuropil (pilhoder i figur 2 og 3) eller cortex og som er synlig i minst 2 påfølgende seksjoner av fly hjernen. Kvantifisering neurodegeneration avmåle vakuoler kan enten gjøres ved å fokusere på en spesifikk region hjerne eller ved å analysere hele hjernen. Begrense analysen til et bestemt område av hjernen er nyttig i tilfeller der en mutasjon påvirker bare en bestemt region, som olfactory lapper i futsch 'olk mutant 34, men det kan også brukes når det er alvorlig degenerasjon i alle eller mange regioner av hjernen. Et eksempel på det siste er sveitserost (SWS) mutant (figur 2), hvor måle alle vakuoler ville være for tidkrevende. Derfor tok bare ett bilde, og for å sikre at målingene ble alltid utført på samme nivå, tok vi alle bildene på nivået av den store commissure (gc, figur 2A), som bare inneholdt i en eller to deler. Mens vi ikke oppdage vacuole formasjonen i en-dag-gamle SWS '1 fluer (data ikke vist), et tap-av-funksjon allel 35, noen vakuoler kunne påvises in 7 dager gamle SWS '1 fluer (pilspisser, figur 2A). Aldring fluene til 14 d (figur 2B) og 21 d (figur 2C) ytterligere økt denne fenotype, viser sin progressive natur. Å telle antallet av vakuoler i deutocerebral neuropil (dn) ved anvendelse av den beskrevne metode bekreftet en betydelig økning i antall vakuoler med alderen. Også den kombinerte areal som omgis av vakuoler ble betydelig øket med aldring (figur 2D).

Men ikke alle mutanter viser en så alvorlig fenotype som SWS, og i de tilfeller det er forskjeller i degenerasjon er vanskelig å fastslå når fokusere på et lite område. Tilsvarende degenerasjon som oppstår under aldring er ganske mild (figur 3A - C), og derfor, analyserte vi hele hjernen når kvantifisere denne fenotype. Bestemme summen av alle vakuoler i hjernen avslørten signifikant økning med alderen, og dette var også tilfelle når man måler det kombinerte arealet av disse vakuoler (figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Parafin seriesnitt. A) Ved å bruke fremgangsmåten kragen, kan eksperimentelle og kontroll fluer bli behandlet som en prøve ved å tre dem på en krage. Eyeless sinus oculis fluer er satt inn for orientering (piler). B) Skjematisk viser retningen på flue hoder i kragen. C) I dette bildet, seksjoner fra forskjellige flue hoder er orientert venstre til høyre på lysbildet. Fra topp til bunn på lysbildet, kan seriesnitt fra samme flua hodet bli sett. I dette tilfelle ble en sinus oculis flue innsatt i posisjon tre (pil). Seksjonene er farget av det fluorescerende øyet pigment som skyller over seksjoner etter skjæring. Scale bar i A = 5 mm og i C = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Progressive Nevrodegenerasjon i Swiss-ost Mutant. Parafin hodeseksjon fra 7-day (A), 14-day (B) og 21-day (C) gamle SWS '1 fluer. Pilene peker på vakuoler som har utviklet med aldring. Aldersrelatert degenerasjon er kvantifisert ved å telle antall vakuoler og måling av deres kombinerte område (D). SEM og antallet analyserte fluer er indikert. Målestokk = 25 mikrometer. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Nevrodegenerasjon oppstår med alderen. Parafin hoveddelen fra 10-day (A), 30-day (B) og 60-day (C) gamle vill type fluer. Pilene peker vakuoler som har utviklet i alderen fluer. Aldersrelatert degenerasjon er kvantifisert ved å telle antall vakuoler og måling av deres kombinerte område (D). SEM og antallet analyserte fluer er indikert. Målestokk = 25 mikrometer. *** P <0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåten tilveiebringer et middel for å kvantifisere neurodegenerasjon i hjernen hos Drosophila. Mens andre metoder, som teller et bestemt celletype, kan benyttes til å identifisere nevrodegenerasjon, er fordelen med denne metoden er at den kan anvendes mer generelt. Telle celler krever at disse cellene kan bli pålitelig identifiseres ved hjelp av enten et spesifikt antistoff eller ekspresjonen av en celle-spesifikk markør, noe som ikke alltid er tilgjengelig. Videre har det blitt vist at dramatisk forskjellige resultater kan oppnås med den metode 24, antagelig på grunn av de betingelser som anvendes for merking og for deteksjon. En annen metode for å detektere degenererende celler er bruken av celledød markører, slik som anti-aktivert kaspase 3, men dette er bare identifiserer cellene som gjennomgår aktivt celledød og når cellene er døde, er de ikke lenger kunne påvises. En annen fordel ved fremgangsmåten foreslått her, er at ingen farging er nødvendig på grunn av den autofluorescence forårsaket av øyet pigment, noe som sparer tid og reduserer artifakter forårsaket av endringer i fargebetingelsene. Det er viktig å merke seg at når du bruker denne metoden, fluer øyne har nok pigment for å farge lysbildet. Hvis øyet fargen er for lys, legge noen villtype flyr til halsbåndet ville være tilrådelig å sikre tilstrekkelig og selv flekker over raset. En ytterligere fordel ved denne metoden er at flere områder kan bli undersøkt, selv i det samme hode. Selv om vi ikke viser dataene, har vi brukt disse delene for å undersøke nevrodegenerasjon i netthinnen og glial celle tap i lamina cortex 30,36. Som beskrevet her, gir denne metoden horisontale seksjoner, men ved å dreie parafinblokk ved 90 ° når det smelter på objektholderen, kan man også oppnå frontale seksjoner. Således er denne fremgangsmåte en allsidig fremgangsmåte som gjør det mulig for rettidig og effektiv måling av neurodegenerasjon i hjernen fly. På grunn av at dannelsen av vacuoles har blitt observert i mange flue modeller av menneskelige nevrodegenerative sykdommer, inkludert modeller for AD, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og sykdommer forårsaket av polyglutamine-gjentakelser 16,37-40, denne metoden kan brukes til å kvantifisere nevrodegenerative fenotyper i en rekke sykdomsmodeller.

Totalt sett er denne protokollen enkel og lett avsluttet når det første oppsettet av utstyret utføres. Noen notater for å huske på er å nøye tid etanol vasker for å unngå over-dehydrering av hodene, nøye trimme parafinblokker for ikke å miste deler eller hoder, og å ikke overexpand båndet på vannet når dekselet er på den varme blokken. Hvis båndet er lov til å utvide for langt, rive av fluehoder kan føre og rekkefølgen på lederne i båndet kan gå tapt. I tillegg blir blind for genotype mens de gjør analysene er avgjørende for å unngå skjevhet. Dette oppnås best ved å ha en person forbereder SLIdes og holde poster mens en annen person tar bilder og gjør målingene. En av begrensningene ved denne metode er at degenerering av bare noen få celler vil være svært vanskelig å detektere. I så fall ville en spesifikk flekk av de berørte cellepopulasjon være mer informativ. I tillegg vil denne metoden ikke tillater en å skille mellom forskjellige typer celledød, noe som krever mer spesifikke metoder, for eksempel en TUNEL-farging for å bestemme apoptotisk celledød. Til slutt kan denne metoden ikke skille mellom celledød og aksonal degenerasjon, noe som ville også være påvisbar som vakuoler i neuropil.

Som vist i våre resultater, kan denne metoden brukes til å adressere degenerasjon i bestemte hjerneområder eller i hele hjernen. I vår erfaring, er det nyttig å analysere bare et bestemt område når fenotype er ganske sterk, selv når alle områder av hjernen som er berørt. Dette reduserer arbeidsbelastning og påvirker ikkeutfall. Vi opprinnelig analysert flere områder i SWS mutant og observert svært lignende resultater i utviklingen av fenotype når man sammenligner bare ett område og når analysere alle områder (data ikke vist). Imidlertid bør det bemerkes at en klart identifiserbar region bør velges for å unngå artifakter på grunn av analyse av ulike områder eller områder på ulike nivåer.

I motsetning til dette, i tilfeller hvor fenotypen er relativt milde, er det bedre å analysere hele hjernen, fordi sannsynligheten for å finne vakuoler i en spesifikk region er lav. For eksempel er dette tilfelle ved bestemmelse aldersrelatert nevrodegenerasjon, som vist i figur 3, noe som resulterer i kun 4. - 5. vakuoler i hele hjernen i 60-dager gamle fluer. Når telle vakuoler i hele hjernen, må man ta hensyn til at små vakuoler vil bare dukke opp i den ene delen, mens større de vil strekke seg over flere seksjoner. Når det gjelder sistnevnte, nærhet av adjAcent seksjoner ved bruk av denne fremgangsmåten (figur 1) gir en annen fordel, fordi det er forholdsvis lett å bestemme hvorvidt den samme vakuolen er til stede i flere seksjoner.

Som konklusjon, kan denne protokollen være nyttig for å studere mange Drosophila modeller av ulike nevrodegenerative sykdommer. Identifisering samspill proteiner som lindre eller forverre degenerative fenotype kan gi viktige innsikter om de underliggende mekanismene som forårsaker eller endre sykdommer som Alzheimers og Parkinsons. I denne publikasjonen bruker vi denne metoden for å oppdage degenerasjon som er progressiv, der dyrene utvikler seg normalt, men viser økende degenerasjon under aldring. I tillegg kan denne fremgangsmåten også tilpasses for å fastslå degenerasjon som er forårsaket av utviklingsdefekter, som bør allerede være tilstede i nylig eclosed fluer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics