Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence

Neuroscience

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Summary

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

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Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

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Abstract

maladies progressives neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer (AD) ou la maladie de Parkinson (PD) sont une menace croissante pour la santé humaine dans le monde entier. Bien que les modèles de mammifères ont fourni des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité, la complexité des systèmes de mammifères ainsi que leurs coûts élevés limitent leur utilisation. Par conséquent, le modèle système Drosophila simple mais bien établie offre une alternative pour étudier les voies moléculaires qui sont affectés dans ces maladies. Outre les déficits comportementaux, les maladies neurodégénératives sont caractérisées par des phénotypes histologiques tels que la mort neuronale et axonopathy. Pour quantifier la dégénérescence neuronale et de déterminer comment elle est affectée par des facteurs génétiques et environnementaux, nous utilisons une approche histologique qui est basé sur la mesure des vacuoles dans le cerveau des mouches adultes. Pour minimiser les effets de l'erreur systématique et de comparer directement les sections de contrôle et expmouches erimental dans une préparation, nous utilisons la méthode du «col» pour des coupes en paraffine. La neurodégénérescence est ensuite évaluée par la mesure de la taille et / ou le nombre de vacuoles qui se sont développées dans le cerveau de mouche. Cela peut être fait en se concentrant sur une région d'intérêt spécifique ou en analysant l'ensemble du cerveau en obtenant des coupes en série qui couvrent la tête complète. Par conséquent, cette méthode permet de mesurer non seulement la dégénérescence sévère, mais aussi des phénotypes relativement douces qui ne sont détectables que dans quelques sections, comme cela se produit au cours du vieillissement normal.

Introduction

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson sont devenus une menace pour la santé de plus en plus pour la population générale. Selon les instituts nationaux de la santé, 115 millions de personnes dans le monde sont prévus d'être affectées par la démence en 2050. Bien que des progrès significatifs ont été réalisés dans l'identification des gènes et des facteurs de risque impliqués dans au moins certaines de ces maladies, pour beaucoup d'entre eux, le sous-jacent mécanismes moléculaires sont encore inconnus ou mal compris.

Organismes modèles invertébrés simples comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster offrent une variété d'avantages expérimentaux pour étudier les mécanismes des maladies neurodégénératives, y compris un cycle court de la vie, un grand nombre de descendants, et la disponibilité des méthodes génétiques et moléculaires bien établies et parfois uniques 1 -12. En outre, ces organismes se prêtent à impartialeécrans d'interaction qui permettent d'identifier les facteurs qui contribuent à ces maladies par leurs effets aggravants ou améliorer sur phénotypes neurodégénératives.

L'analyse de ces interactions génétiques et évaluer les effets du vieillissement nécessite des protocoles quantitatifs pour détecter la neurodégénérescence et de mesurer sa gravité. Cette évaluation peut se faire relativement facilement lorsque l'on mesure les aspects comportementaux chez la drosophile, tels que l' apprentissage olfactif, géotaxie négative, ou phototaxie rapide, qui fournissent une valeur de performance numérique 13-21. Il est également possible de déterminer les effets sur la survie neuronale en comptant les neurones. Cependant, ceci est seulement possible lorsqu'on se concentre sur une population spécifique qui est clairement identifiable, comme les neurones dopaminergiques qui sont affectés dans la MP, et même alors, les résultats ont été controversés 22-24.

Le protocole décrit ici utilise la méthode du collier pour effectuer des coupes en série de paraffine, un procédéqui a été à l' origine développé par Heisenberg et Böhl, qui sert à isoler des mutants du cerveau anatomiques chez la drosophile 25. L'utilisation de la méthode du collier a été ensuite adapté, y compris dans cryocoupes, vibratome sections, et les sections en plastique 26-28. Ici, cette méthode est utilisée pour obtenir des coupes en série de la tête de la mouche entière, qui peut ensuite être utilisé pour mesurer les vacuoles qui se développent dans les mouches avec des phénotypes neurodégénératives 16,21,29-32. Ces mesures peuvent être effectuées dans des zones spécifiques du cerveau ou peuvent couvrir l'ensemble du cerveau; cette dernière approche permet d'identifier même faibles phénotypes dégénératives, comme observé au cours du vieillissement. Enfin, lors de l'utilisation des colliers, jusqu'à 20 mouches peuvent être traités comme une préparation, ce qui est non seulement moins de temps, mais permet également à l'analyse de contrôle et les mouches expérimentales dans la même préparation, en minimisant les artefacts dus à de légers changements dans la préparation.

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Protocol

1. Fixation de la tête sur les colliers et incorporation dans la paraffine

Note: Toutes les étapes du processus de fixation doit être fait dans une hotte. Méthylbenzoate, tout en ne posant un risque pour la santé, a une odeur très distincte, ce qui peut être écrasante en cas de manipulation dans une hotte.

  1. Avant anesthésier les mouches, forment 50 ml de solution Carnoy en ajoutant 15 ml de chloroforme et 5 ml d'acide acétique glacial à 30 ml d'éthanol à 99% (ne pas mélanger le chloroforme et l'acide acétique). Verser dans un récipient en verre à fond plat, comme un plat cristallisant, veiller à ce que les colliers peuvent poser à plat et sont complètement couvertes par la solution.
  2. Anesthetize les mouches avec du CO 2 ou de l' éther.
  3. les mouches de la discussion (jusqu'à 20 avec la plupart des colliers) par leur cou dans les colliers à l'aide de pinces. Rappelez - vous d'aligner toutes les têtes dans la même orientation, comme on le voit sur la figure 1A, et être doux pour assurer qu'aucun dommage se produit à la tête ou les yeux.
  4. Inclure les mouches sinus de oculis (flèches, Figure 1A) à des positions aléatoires de sorte que l'ordre des mouches peut être facilement identifié dans les sections. En outre, si les mouches expérimentales ont une couleur des yeux clair ou blanc, enfiler des mouches aux yeux rouges, comme le type sauvage, entre eux pour veiller à ce que le pigment est présent suffisamment pour colorer la diapositive. Notez l'ordre des mouches sur une feuille de protocole ainsi que le nombre de collier si vous utilisez plus d'un collier.
  5. Une fois un collier a été terminé, placez-le dans la solution préparée Carnoy pendant 3,5 - 4 h.
  6. Déverser la solution Carnoy dans la disposition cartouche appropriée et commencer les lavages à l'éthanol. Assurez-vous de verser lentement afin de ne pas perturber le placement des colliers dans le conteneur.
  7. Laver les colliers pendant 30 minutes dans 99% d'éthanol deux fois.
  8. Laver les colliers dans 100% d'éthanol pendant 1 h. Assurez-vous de changer les lavages à temps pour éviter overdehydration.
  9. Mettez les colliers en méthylbenzoateO / N à la température ambiante. Fermer le récipient avec du parafilm pour empêcher l'évaporation du benzoate de méthyle.
  10. Verser le methylbenozate dans le récipient jetable approprié dans la hotte. Ajouter un mélange préalablement préparé de 1: 1 à faible point de fusion (56-57 ° C) de la paraffine de cire et méthylbenzoate. A partir de ce moment-là, les colliers doivent être conservés dans un incubateur à 65 ° C pour faire en sorte que la paraffine ne durcit pas.
  11. Verser le methylbenozate et le mélange de paraffine dans le récipient jetable approprié et verser la cire de paraffine fondue pure, maintenue à 65 ° C sur les collerettes.
  12. Modifier la paraffine après 30 minutes et répéter ce au moins 5 fois. Au moins 6 - 8 lavages doivent être effectués.
  13. Une fois que les lavages sont complets, placez les colliers dans un bac à glaçons en caoutchouc avec des fentes d'environ la taille des colliers. Versez la paraffine fondue sur eux jusqu'à ce que complètement couvert et laisser durcir O / N (essayez d'éviter les bulles d'air).
  14. Retirez les blocs de paraffine containing les colliers à partir du bac à glaçons. Séparer le bloc de paraffine du collier à l'aide d'une lame de rasoir, brisant doucement le col. Les têtes seront dans le bloc de paraffine tandis que les corps restent dans le col. Les blocs peuvent être maintenus à la température ambiante.
  15. Pour nettoyer les colliers, les faire tremper dans un agent de deparafinization à 65 ° C pour éliminer la paraffine, propre avec lavage léger, et laver dans de l'éthanol avant de le réutiliser.

2. Sectionnement et montage

  1. Chauffer une plaque chauffante à 50 ° C. Placez les porte-objets (ou des blocs métalliques de montage) et des lames de rasoir sur la plaque et laissez-les réchauffer.
  2. En fonction de l'orientation souhaitée pour sectionner, fixer le bloc de paraffine, soit avec les têtes vers le côté (pour les sections horizontales) ou vers le haut (pour les sections frontales) à un bloc de montage chauffé (fondre brièvement le bloc du côté de contact). Retirez le bloc de la plaque chauffante et laisser refroidir pendant au moins 10 min pour veiller à ce que la paraffine est durcie suffisamment pour une bonne étanchéité sur le bloc de montage. Gardez la rangée de têtes alignées parallèlement à la surface du bloc, autant que possible pour éviter les sections inégales.
  3. Prenez une lame de rasoir et couper l'excédent de paraffine à l'écart des têtes de mouches de sorte que seule une petite rangée avec les têtes intégrés reste (la lame de rasoir peut être réchauffé pour faciliter la garniture). Assurez-vous de ne pas couper trop de sorte que la paraffine ne se casse pas pendant la coupe (plus parage peut être fait pendant la coupe).
  4. Placez le bloc de montage dans le porte-objet de la microtome et veiller à ce que l'alignement de la rangée de têtes est aussi parallèle que possible du bord de la lame.
  5. Préparer des lames de microscope en les recouvrant d'une fine couche de poly-L-lysine (PLL) solution et les laisser sécher pendant 5 min. Couvrez-les avec de l'eau peu avant d'utiliser.
  6. Couper 7 um sections et transférer le ruban de sections à la diapositive flottant sur l'eau. <br /> NOTE: Pour obtenir l'ensemble du cerveau pour les sections horizontales, nous recueillons le ruban à partir de quand commencer à couper dans l'oeil jusqu'à ce que la tête a été complètement coupé (coupe de la trompe dans le cerveau). Plus d'une diapositive peut être nécessaire pour l'ensemble de la tête.
  7. Placer la lame sur une plaque chauffante à 37 ° C et laisser le ruban d'étendre pendant environ 1 min.
  8. Retirer l'excès d'eau (en le versant hors ou à l'aide d'un tissu) et sécher les diapositives O / N.
  9. Retirez la cire de paraffine de la diapositive en plaçant les lames dans un, vertical jar grand slide-coloration rempli d'un agent de deparafinization (recouvrant complètement les sections). Effectuer 3 lavages de 30 min - 60 min chacun.
  10. Retirer la lame du lavage final. Placez 2 gouttes de médias d'enrobage sur la lame et le couvrir avec une grande lamelle.

3. Photographier et analyse les sections

  1. Laisser les lames préparées à sécher pendant 1 - 2 d. Ensuite, examinez-les sur une Microsc de fluorescenceope sous une lumière bleue.
  2. Utilisez un faible grossissement pour déterminer l'orientation des mouches et de trouver la région d'intérêt se concentrant sur une région spécifique.
    NOTE: Pour les mouches de sws (voir la figure 2), on trouve la section qui contient la grande commissure et de prendre une image (généralement à un grossissement de 40X). Lors de l' analyse de la totalité du cerveau (comme dans la figure 3), nous faisons défiler à travers toutes les sections de la tête et soit photographier la section avec le phénotype le plus sévère ou toutes les sections qui montrent vacuoles.
  3. Pour une analyse en double aveugle, prendre et images numériques sans connaître le génotype et enregistrer le nombre de cols et de la position de la tête dans la ligne pour les identifier plus tard.
  4. Une fois que les images ont été prises, de les analyser en utilisant un logiciel d'imagerie.
  5. Comptez le nombre de vacuoles par section ou par tête. Pour mesurer la taille de la vacuole, ouvrez les images dans un logiciel et sélectionnez les vacuoles avec une sélection tropl. Déterminer la quantité de pixels dans les vacuoles sélectionnés.
  6. Pour la conversion en um 2, prendre une photo d'un étalonnage micromètre d'étape au grossissement utilisé pour acquérir des photos. Déterminer la quantité de pixels à 100 um 2 pour calculer un facteur de conversion.
  7. Convertir le nombre total de pixels en um 2 en divisant le nombre de pixels par le facteur de conversion calculé à l'étape précédente.

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Representative Results

En utilisant les résultats de la méthode décrite dans les sections en série colorées par le pigment de l' œil 33 qui englobent la tête de la mouche entière. Une partie de ceci est montré à la figure 1B, où les sections à partir d' une tête individuelle sont présentés de haut en bas. Les sections de différentes mouches sont vu de gauche à droite dans cet exemple. Pour faciliter l' orientation et l' identification des mouches, une mouche eyeless (oculis de sinus) est inséré comme un marqueur à la position 3 (flèche, figure 1B).

Pour quantifier la neurodégénérescence, on mesure la formation de vacuoles qui peuvent être détectés dans ces sections. Les vacuoles sont définis comme ronde, des taches sombres qui sont dans le neuropile fluorescente verte (pointes de flèches dans la figure 2 et 3) ou du cortex et qui sont visibles dans au moins 2 sections consécutives du cerveau de la mouche. Quantifier neurodégénérescence parvacuoles de mesure peut être fait soit en se concentrant sur une région spécifique du cerveau ou en analysant l'ensemble du cerveau. Limitation de l'analyse à une région spécifique du cerveau est utile dans les cas où une mutation affecte seulement une région spécifique, comme les lobes olfactifs dans le Futsch 'olk mutant 34, mais il peut aussi être utilisé quand il y a une dégénérescence grave dans tout ou beaucoup des régions du cerveau. Un exemple pour ce dernier est le fromage suisse (sws) mutant (Figure 2), où la mesure de tous les vacuoles serait trop de temps. Nous avons donc pris une seule image, et veiller à ce que les mesures ont été toujours fait au même niveau, nous avons pris toutes les images au niveau de la grande commissure (gc, figure 2A), qui est seulement contenue dans une ou deux sections. Alors que nous ne détectons formation vacuole dans 1 vol de 1 jour vieux sws (données non présentées), un allèle de perte de fonction 35, certains vacuoles étaient i détectable1 vol de n 7 jours d'âge sws (pointes de flèches, Figure 2A). Le vieillissement des mouches à 14 d (figure 2B) et 21 d (figure 2C) encore accru ce phénotype, montrant sa nature progressive. Compter le nombre de vacuoles dans le neuropile deutocerebral (dn) en utilisant le procédé décrit a confirmé une augmentation significative du nombre de vacuoles avec l'âge. En outre, la superficie totale couverte par les vacuoles a significativement augmenté au vieillissement (figure 2D).

Cependant, tous les mutants montrent un tel phénotype sévère que sws, et dans ces cas, les différences dans la dégénérescence sont difficiles à déterminer lors de la focalisation sur une petite surface. De même, la dégénérescence qui se produit au cours du vieillissement est assez doux (figure 3A - C) et , par conséquent, nous avons analysé l'ensemble du cerveau lors de la quantification ce phénotype. La détermination de la somme de tous les vacuoles dans le cerveau a révéléune augmentation significative avec l' âge, et ce fut également le cas lorsque la mesure de la superficie combinée de ces vacuoles (Figure 3D).

Figure 1
Figure 1. Coupes en paraffine série. A) En utilisant la méthode de collier, les mouches expérimentaux et de contrôle peuvent être traitées comme un échantillon en les enfilant sur une collerette. Eyeless sinus vol d'oculis sont insérés pour orientation (flèches). B) Schéma montrant l'orientation des têtes de mouches dans le col. C) Dans cette image, les sections de différentes têtes de mouches sont orientés de gauche à droite sur la diapositive. De haut en bas sur la diapositive, des sections en série à partir de la même tête de mouche peut être vu. Dans ce cas, une mouche oculis sine a été inséré à la position trois (flèche). Les sections sont colorées par le pigment de l'œil fluorescent qui lave sur sections après la coupe. Barre d'échelle en A = 5 mm et C = 0,5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Progressive neurodégénérescence dans le Mutant fromage suisse. Section de tête de paraffine de 7-jour- (A), 14-jour- (B) et 21-jour- 1 mouches »(C) vieux sws. Les flèches pointent vers vacuoles qui se sont développées avec le vieillissement. La dégénérescence liée à l' âge est quantifiée en comptant le nombre de vacuoles et en mesurant leur surface combinée (D). La SEM et le nombre de mouches analysés est indiqué. La barre d'échelle = 25 pm. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. neurodégénérescence se produit avec l' âge. Section de tête de paraffine de 10-jour- (A), 30-jour- (B) et 60-jour- (C) vieux mouches de type sauvage. Les flèches pointent vers vacuoles qui se sont développées dans les mouches âgées. La dégénérescence liée à l' âge est quantifiée en comptant le nombre de vacuoles et en mesurant leur surface combinée (D). La SEM et le nombre de mouches analysés est indiqué. La barre d'échelle = 25 pm. *** P <0,001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ A>

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Discussion

Le procédé décrit fournit un moyen pour quantifier la neurodégénérescence dans le cerveau de la drosophile. Alors que d'autres méthodes, telles que le comptage d'un type de cellule spécifique, peuvent être utilisées pour identifier la neurodégénérescence, l'avantage de cette méthode est qu'elle peut être appliquée de façon plus générale. Le comptage des cellules exige que ces cellules puissent être identifiées de façon fiable en utilisant soit un anticorps spécifique ou l'expression d'un marqueur spécifique de la cellule, qui ne sont pas toujours disponibles. En outre, il a été montré que des résultats très différents peuvent être obtenus avec ce procédé 24, vraisemblablement en raison des conditions utilisées pour le marquage et pour la détection. Une autre méthode pour détecter les cellules dégénérant est l'utilisation de marqueurs de mort cellulaire, comme anti-caspase activée 3. Toutefois, cela n'identifie les cellules subissant activement la mort cellulaire et une fois que les cellules sont mortes, ils ne sont plus détectables. Un autre avantage de la méthode proposée ici est qu'aucune coloration est nécessaire en raison de la autofluorescence causé par le pigment de l'œil, ce qui fait gagner du temps et réduit les artefacts causés par des changements dans les conditions de coloration. Il est important de noter que, lors de l'utilisation de cette méthode, les yeux des mouches ont assez de pigment pour colorer la diapositive. Si la couleur des yeux est trop léger, ajoutant un peu de type sauvage vole au collier serait souhaitable d'assurer suffisamment et même coloration dans la diapositive. Un avantage supplémentaire de ce procédé est que de multiples zones peuvent être examinées, même dans la même tête. Bien que nous ne montrons pas les données, nous avons utilisé ces sections pour examiner la neurodégénérescence dans la rétine et gliale perte de cellules dans le cortex lamina 30,36. Comme cela est décrit ici, cette méthode fournit des sections horizontales, mais en faisant tourner le bloc de paraffine à 90 ° lorsque le fondant sur le porte-objet, on peut également obtenir des coupes frontales. Ainsi, ce procédé est un procédé polyvalent qui permet la mesure rapide et efficace de la neurodégénérescence dans le cerveau de mouche. Étant donné que la formation de vacuoles a été observée dans de nombreux modèles de mouches des maladies neurodégénératives humaines, y compris les modèles pour AD, PD, la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les maladies causées par polyglutamine-répétitions 16,37-40, cette méthode peut être utilisée pour quantifier les phénotypes neurodégénératives une variété de modèles de maladies.

Dans l'ensemble, ce protocole est simple et facilement complété une fois la configuration initiale de l'appareil est effectué. Quelques notes à garder à l'esprit sont en temps soigneusement les lavages à l'éthanol pour éviter la déshydratation des têtes, pour couper avec précaution les blocs de paraffine afin de ne pas perdre de sections ou de têtes, et de ne pas overexpand le ruban sur l'eau lorsque le tiroir est sur le bloc thermique. Si le ruban est autorisé à étendre trop loin, arrachant des têtes de mouches peut entraîner et l'ordre des têtes dans le ruban peut être perdu. En outre, être aveugle au génotype tout en faisant les analyses est indispensable pour éviter les biais. Ceci est mieux réalisé en ayant une personne qui prépare le slides et la tenue des dossiers alors qu'une autre personne prend les photos et de faire des mesures. L'une des limites de cette méthode est que la dégénérescence de seulement quelques cellules sera très difficile à détecter. Dans ce cas, une tache spécifique de la population de cellules affectées serait plus instructif. En outre, cette méthode ne permet pas de distinguer entre les différents types de mort cellulaire, ce qui nécessite des procédés plus spécifiques, tels qu'une coloration TUNEL pour déterminer la mort cellulaire apoptotique. Enfin, cette méthode ne peut pas différencier entre la mort cellulaire et la dégénérescence axonale, qui serait également détectable comme vacuoles dans le neuropile.

Comme on le voit dans les résultats, cette méthode peut être utilisée pour traiter la dégénérescence des zones spécifiques du cerveau ou dans la totalité du cerveau. Dans notre expérience, il est utile d'analyser seulement une zone spécifique lorsque le phénotype est très forte, même lorsque toutes les régions du cerveau sont affectées. Cela réduit considérablement la charge de travail et ne modifie pas larésultat. Nous avons analysé l' origine de plusieurs zones dans le mutant sws et observé des résultats très similaires dans la progression du phénotype lorsque l'on compare une seule région et lors de l' analyse tous les domaines (données non présentées). Toutefois, il convient de noter qu'une région clairement identifiable doit être choisie afin d'éviter des artefacts dus à l'analyse des différents domaines ou zones à différents niveaux.

En revanche, dans le cas où le phénotype est relativement doux, il est préférable d'analyser la totalité du cerveau, car la probabilité de trouver des vacuoles dans une région spécifique est faible. Par exemple, ceci est le cas lors de la détermination de la neurodégénérescence liée à l'âge, comme le montre la figure 3, ce qui résulte en seulement 4-5 vacuoles dans la totalité du cerveau, en 60 jours d'âge des mouches. Lors du comptage vacuoles dans l'ensemble du cerveau, il faut prendre en compte que les petites vacuoles ne seront visibles que dans une section, alors que les plus grands se prolonger sur plusieurs sections. En ce qui concerne ce dernier, la proximité adjles sections acent lors de l' utilisation de cette méthode (figure 1) fournit un autre avantage, car il est relativement facile de déterminer si la même vacuole est présent dans plusieurs sections.

En conclusion, ce protocole peut se révéler utile pour l' étude de nombreux modèles de Drosophila de différentes maladies neurodégénératives. Identifier les protéines interagissant qui améliorent ou aggravent le phénotype dégénérative peut fournir des informations cruciales sur les mécanismes sous-jacents qui causent ou modifient des maladies telles que la maladie d'Alzheimer et de Parkinson. Dans cette publication, nous utilisons cette méthode pour détecter la dégénérescence qui est progressive, où les animaux se développent normalement mais montrent de plus en plus la dégénérescence au cours du vieillissement. En outre, cette méthode peut également être adapté pour déterminer la dégénérescence qui est causée par des anomalies du développement, qui devraient déjà être présents dans les mouches nouvellement éclos.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

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References

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