Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in

Neuroscience

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Summary

Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.

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Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

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Abstract

malattie neurodegenerative progressive come la malattia di Alzheimer (AD) o malattia di Parkinson (PD) è una crescente minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Sebbene i modelli di mammiferi hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi alla base della patogenicità, la complessità dei sistemi di mammiferi insieme con i loro alti costi stanno limitando il loro utilizzo. Pertanto, il semplice ma ben consolidata modello di sistema Drosophila fornisce un'alternativa per lo studio dei meccanismi molecolari che sono colpite in queste malattie. Oltre a deficit comportamentali, malattie neurodegenerative sono caratterizzate da fenotipi istologici come la morte neuronale e assonopatia. Per quantificare la degenerazione neuronale e per determinare come esso è influenzato da fattori genetici e ambientali, usiamo un approccio istologico che si basa sulla misurazione dei vacuoli nel cervello mosca adulta. Per ridurre al minimo gli effetti di errore sistematico e di confrontare direttamente le sezioni di controllo e expmosche erimental in una preparazione, si usa il metodo 'collare' per le sezioni di paraffina. Neurodegeneration viene valutata misurando la dimensione e / o il numero di vacuoli che si sono sviluppate nel cervello mosca. Questo può essere fatto sia concentrandosi su una specifica regione di interesse o analizzando l'intero cervello ottenendo sezioni seriali che attraversano la testa completa. Pertanto, questo metodo permette di misurare non solo la degenerazione grave, ma anche fenotipi relativamente lievi che sono rilevabili solo in alcune sezioni, come avviene durante il normale invecchiamento.

Introduction

Con l'aumento dell'aspettativa di vita, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer o di Parkinson sono diventati una minaccia per la salute crescente per la popolazione generale. Secondo il National Institutes of Health, 115 milioni di persone nel mondo sono previsti per essere colpiti da demenza nel 2050. Anche se sono stati compiuti progressi significativi per identificare geni e fattori di rischio coinvolti in almeno alcune di queste malattie, per molti di loro, il sottostante meccanismi molecolari sono ancora sconosciuti o non ben compreso.

Semplici invertebrati organismi modello come Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster offrono una varietà di vantaggi sperimentali per studiare i meccanismi di malattie neurodegenerative, tra cui un breve ciclo di vita, gran numero di discendenti, e la disponibilità di metodi ben consolidati e, a volte unici genetici e molecolari 1 -12. Inoltre, questi organismi sono suscettibili di imparzialeschermi di interazione in grado di identificare i fattori che contribuiscono a queste malattie per i loro effetti aggravanti o Ameliorating sui fenotipi neurodegenerative.

Analizzando tali interazioni genetiche e valutare gli effetti dell'invecchiamento richiede protocolli quantitativi per rilevare neurodegenerazione e misurare la sua gravità. Questa valutazione può essere fatta in modo relativamente facile quando si misura aspetti comportamentali di Drosophila, quali l'apprendimento olfattivo, geotassi negativi, o fototassi veloce, che forniscono un valore numerico delle prestazioni 13-21. È anche possibile determinare gli effetti sulla sopravvivenza neuronale contando neuroni. Tuttavia, questo è possibile solo quando concentrandosi su una specifica popolazione che è chiaramente identificabile, come i neuroni dopaminergici che sono interessati nel PD, e anche allora, i risultati sono stati controversi 22-24.

Il protocollo qui descritto utilizza il metodo collare per eseguire sezioni seriali paraffina, un metodoche è stato originariamente sviluppato da Heisenberg e Böhl, che lo utilizzò per isolare i mutanti cerebrali anatomiche in Drosophila 25. L'utilizzo del metodo collare è stato successivamente adattato, anche in criosezioni, vibratome sezioni e profilati in plastica 26-28. Ecco, questo metodo viene utilizzato per ottenere sezioni seriali di tutta la testa mosca, che può quindi essere utilizzato per misurare i vacuoli che si sviluppano in mosche con fenotipi neurodegenerative 16,21,29-32. Queste misurazioni possono essere eseguite in specifiche aree cerebrali o in grado di coprire l'intero cervello; il secondo approccio permette di identificare anche fenotipi degenerative deboli, come osservato durante l'invecchiamento. Infine, quando si utilizzano i collari, fino a 20 in linea può essere elaborato come una preparazione, che è non solo meno tempo, ma consente anche per l'analisi di controllo e mosche sperimentali nella stessa preparazione, minimizzando artefatti da lievi variazioni la preparazione.

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Protocol

1. fissare la testina sui collari e inclusione in paraffina

Nota: Tutte le fasi del processo di fissazione dovrebbe essere fatto in una cappa aspirante. Benzoato di metile, anche se non presentano un rischio per la salute, ha un odore molto distinta, che può essere schiacciante, se non gestita in una cappa aspirante.

  1. Prima anestetizzare le mosche, portare 50 mL di soluzione di Carnoy aggiungendo 15 ml di cloroformio e 5 ml di acido acetico glaciale a 30 ml di 99% di etanolo (non mescolare cloroformio e acido acetico). Versare in un contenitore di vetro con un fondo piatto, come un piatto di cristallizzazione, il garantire che i collari possono distesi e sono completamente coperti dalla soluzione.
  2. Anestetizzare le mosche con CO 2 o etere.
  3. mosche filo (fino a 20) con la maggior parte collari per il collo nelle collari che utilizzano pinze. Ricordare per allineare tutte le teste con lo stesso orientamento, come mostrato in figura 1A, ed essere gentile per garantire che nessun danno si verifica alla testa o occhi.
  4. Includere mosche sine Oculis (frecce, Figura 1A) in posizioni casuali in modo che l'ordine delle mosche può essere facilmente identificato in sezioni. Inoltre, se le mosche sperimentali hanno un colore degli occhi chiaro o bianco, filo alcune mosche dagli occhi rossi, come il tipo selvaggio, tra di loro per garantire che il pigmento è considerata sufficiente a macchiare la diapositiva. Registrare l'ordine delle mosche su un foglio protocollo nonché il numero collare se si utilizza più di un collare.
  5. Una volta che un collare è stato finito, posizionarlo nella soluzione Carnoy preparato per 3,5-4 ore.
  6. Dump la soluzione Carnoy nel contenitore di smaltimento appropriato e iniziare i lavaggi etanolo. Assicurarsi di versare lentamente in modo da non disturbare il posizionamento dei collari nel contenitore.
  7. Lavare i collari per 30 minuti in 99% etanolo due volte.
  8. Lavare i collari in 100% di etanolo per 1 h. Assicurarsi di modificare i lavaggi in tempo per evitare overdehydration.
  9. Mettere i collari di benzoato di metileO / N a temperatura ambiente. Sigillare il contenitore con parafilm per impedire l'evaporazione del benzoato di metile.
  10. Versare il methylbenozate nel corretto contenitore monouso nella cappa. Aggiungere una miscela precedentemente preparata di 1: 1 a basso punto di fusione (56-57 ° C) cera di paraffina e benzoato di metile. Da questo punto in poi, i collari devono essere tenuti in un incubatore a 65 ° C per assicurarsi che la paraffina non si indurisce.
  11. Versare il methylbenozate e la miscela di paraffina nel giusto contenitore monouso, e versare fuso paraffina pura, mantenuta a 65 ° C, sui collari.
  12. Modificare la paraffina dopo 30 minuti e ripetere questo almeno 5 volte. Almeno 6 - 8 lavaggi devono essere eseguiti.
  13. Una volta che i lavaggi sono completi, inserire i collari in una vaschetta per il ghiaccio in gomma con scanalature circa le dimensioni dei collari. Versare paraffina fusa su di loro fino a quando completamente ricoperta e lasciarlo indurire O / N (cercare di evitare bolle d'aria).
  14. Rimuovere i blocchi di paraffina containing i collari dal vassoio del cubo di ghiaccio. Separare il blocco di paraffina dal collare con una lama di rasoio, rompendo delicatamente il collare. Le teste saranno nel blocco di paraffina mentre i corpi rimarranno nel collare. I blocchi possono essere conservati a temperatura ambiente.
  15. Per pulire i collari, ammollo in un agente deparafinization a 65 ° C per rimuovere la paraffina, pulito, con lavaggio luce, e lavare in etanolo prima di riutilizzarlo.

2. Sezioni e montaggio

  1. Riscaldare una piastra riscaldante a 50 ° C. Posizionare i titolari oggetto (o blocchi di montaggio in metallo) e lame di rasoio sul piatto e lasciarli riscaldare.
  2. A seconda dell'orientamento desiderato per il sezionamento, collegare il blocco di paraffina o con le teste verso il lato (per sezioni orizzontali) o verso l'alto (per le sezioni frontali) a un blocco di montaggio riscaldata (fusione brevemente il blocco sul lato di contatto). Rimuovere il blocco dalla piastra di riscaldamento e lasciarlo raffreddare per almeno 10 min garantire che la paraffina è indurito sufficiente per una buona tenuta sul blocco di montaggio. Mantenere la fila di teste allineate parallelamente alla superficie del blocco il più possibile per evitare sezioni irregolari.
  3. Prendere una lametta e tagliare l'eccesso di paraffina dalle teste volo in modo che solo una piccola fila con le teste incorporate rimane (la lama può essere riscaldato per facilitare il taglio). Assicurarsi di non tagliare troppo in modo che la paraffina non si rompa durante il sezionamento (più il taglio può essere fatto durante il sezionamento).
  4. Posizionare il blocco di montaggio nel supporto oggetto del microtomo e garantire che l'allineamento della fila di teste è più possibile parallelo al bordo della lama.
  5. Preparare vetrini da microscopio coprendole con un sottile strato di soluzione di poli-L-lisina (PLL) e lasciate asciugare per 5 min. Coprire con acqua poco prima di utilizzare.
  6. Tagliare 7 sezioni micron e trasferire il nastro delle sezioni alla slitta galleggiante sull'acqua. <br /> Nota: Per ottenere l'intero cervello per le sezioni orizzontali, raccogliamo il nastro da quando si inizia a tagliare in un occhio fino a quando la testa è stata completamente tagliato (il taglio dal proboscide nel cervello). Più di una diapositiva può essere necessaria per l'intera testa.
  7. Posizionare il vetrino su una piastra di calore a 37 ° C e permettere al nastro di espandersi per circa 1 min.
  8. Rimuovere l'acqua in eccesso (versando fuori o utilizzando un tessuto) e asciugare il diapositive O / N.
  9. Rimuovere la cera di paraffina dal vetrino posizionando i vetrini in un uomo alto, vaso slide-colorazione verticale riempito con un agente deparafinization (che copre completamente le sezioni). Effettuare 3 lavaggi di 30 min - 60 min ciascuno.
  10. Rimuovere il vetrino dal lavaggio finale. Mettere 2 gocce di media incorporamento sul vetrino e coprirlo con un largo coprioggetti.

3. Fotografare e l'analisi dei Sezioni

  1. Lasciare i vetrini preparati ad asciugare per 1 - 2 d. Poi, li esaminerà in una microsc a fluorescenzaope sotto la luce blu.
  2. Utilizzare un ingrandimento minore per determinare l'orientamento delle mosche e per individuare la zona di interesse se concentrandosi su una regione specifica.
    NOTA: Per le mosche SWS (vedi figura 2), troviamo la sezione che contiene il grande commessura e scattare una foto (di solito a 40X di ingrandimento). Analizzando l'intero cervello (come in figura 3), si scorrere tutte le sezioni da una testa e sia fotografare la sezione con il fenotipo più grave o tutte le sezioni che mostrano vacuoli.
  3. Per un'analisi doppio cieco, prendere e immagini numero senza conoscere il genotipo e registrare il numero di collare e la posizione della testa della fila di identificarli in seguito.
  4. Una volta che sono state prese le immagini, analizzarli utilizzando un software di imaging.
  5. Contare il numero di vacuoli per sezione o per capo. Per misurare la dimensione vacuolo, aprire le immagini in un programma software e selezionare i vacuoli con una selezione troppol. Determinare la quantità di pixel nei vacuoli selezionati.
  6. Per la conversione di micron 2, scattare una foto di uno scivolo di calibrazione micrometrico al ingrandimento utilizzato per l'acquisizione di foto. Determinare la quantità di pixel in 100 micron 2 per calcolare il fattore di conversione.
  7. Convertire il numero totale di pixel in micron 2 dividendo il numero di pixel per il fattore di conversione calcolata nel passaggio precedente.

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Representative Results

Utilizzando i risultati metodo descritto in sezioni seriali colorati con l'occhio del pigmento 33 che comprendono l'intera testa mosca. Una parte di questo è mostrato in Figura 1B, dove le sezioni da una testa individuo sono mostrati dall'alto verso il basso. Le sezioni di diverse mosche sono visti da sinistra a destra in questo esempio. Per facilitare l'orientamento e l'identificazione delle mosche, una mosca senza occhi (Oculis sinusoidali) è inserito come un marcatore in posizione 3 (freccia, Figura 1B).

Per quantificare neurodegenerazione, si misura la formazione di vacuoli che possono essere rilevati in queste sezioni. Vacuoli sono definiti come rotonda, macchie scure che rientrano neuropil fluorescente verde (frecce in figura 2 e 3) o corteccia e che sono visibili in almeno 2 sezioni consecutive del cervello mosca. Quantificare neurodegenerazione byvacuoli di misura può essere fatto sia concentrandosi su una regione del cervello specifica o analizzando l'intero cervello. Limitando l'analisi a una regione specifica del cervello è utile nei casi in cui una mutazione riguarda solo una regione specifica, come i lobi olfattivi nel futsch 'olk mutante 34, ma può essere utilizzato anche quando vi è grave degenerazione in tutto o molti regioni del cervello. Un esempio di quest'ultimo è il formaggio svizzero (SWS) mutante (Figura 2), in cui la misurazione di tutti vacuoli sarebbe troppo tempo. Abbiamo quindi preso una sola immagine e, per assicurare che le misurazioni sono state effettuate sempre allo stesso livello, abbiamo preso tutte le immagini a livello della grande commissura (gc, Figura 2A), che è contenuto solo in una o due sezioni. Mentre Non abbiamo rilevato la formazione di vacuoli in 1 mosche 1-giorno-vecchi SWS '(dati non riportati), un allele 35 perdita-di-funzione, alcuni vacuoli erano i rilevabile1 mosche n 7 giorni di età SWS "(punte di freccia, figura 2a). Invecchiamento le mosche a 14 d (Figura 2B) e 21 quinquies (Figura 2C) ulteriormente aumentato questo fenotipo, che mostra la sua natura progressiva. Contando il numero di vacuoli nel neuropil deutocerebral (dn) con il metodo descritto confermato un aumento significativo nel numero di vacuoli con l'età. Inoltre, la superficie complessiva abbracciato da vacuoli è risultato significativamente aumentato con l'invecchiamento (Figura 2D).

Tuttavia, non tutti i mutanti mostrano una grave fenotipo come SWS, e in tali casi, le differenze di degenerazione sono difficili da determinare quando concentrandosi su una piccola area. Analogamente, la degenerazione che si verifica durante l'invecchiamento è abbastanza mite (Figura 3A - C) e quindi, abbiamo analizzato l'intero cervello quando quantificare questo fenotipo. Determinare la somma di tutti vacuoli nel cervello rivelatoun aumento significativo con l'età, e questo è stato anche il caso in cui la misurazione della superficie complessiva di questi vacuoli (Figura 3D).

Figura 1
Figura 1. paraffina sezioni seriali. A) Usando il metodo collare, mosche sperimentali e di controllo possono essere trattati come un campione da loro filettatura su un collare. Eyeless mosche Oculis sinusoidale vengono inseriti per orientamento (frecce). B) Schema che mostra l'orientamento delle teste mosca nel collare. C) In questa immagine, sezioni di diverse teste di mosca sono orientate da sinistra a destra sulla diapositiva. Dall'alto verso il basso sul vetrino, sezioni seriali della stessa testa volo può essere visto. In questo caso, una mosca Oculis sinusoidale è stato inserito nella posizione tre (freccia). Le sezioni sono macchiate dal pigmento dell'occhio fluorescente che lava sopra la sezioni dopo il taglio. Barra di scala in A = 5 mm e in C = 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. progressiva neurodegenerazione nel mutante svizzero-formaggio. Capo sezione paraffina dal 7-giorno- (A), 14-giorno- (B) e 21-giorno- (C) vecchi SWS '1 mosche. Le frecce indicano vacuoli che si sono sviluppate con l'invecchiamento. La degenerazione correlata all'età è quantificata contando il numero di vacuoli e misurare la loro area combinata (D). Il SEM e il numero di mosche analizzati è indicato. La barra della scala = 25 micron. *** P <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Neurodegeneration si verifica con l'età. Capo sezione paraffina da 10-giorno- (A), 30-giorno- (B) e 60-giorno-wild-type mosche (C) vecchi. Le frecce indicano vacuoli che si sono sviluppate in mosche di età. La degenerazione correlata all'età è quantificata contando il numero di vacuoli e misurare la loro area combinata (D). Il SEM e il numero di mosche analizzati è indicato. La barra della scala = 25 micron. *** P <0.001. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ A>

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Discussion

Il metodo descritto fornisce un mezzo per quantificare neurodegenerazione nel cervello di Drosophila. Mentre altri metodi, come conteggio di un tipo di cellula specifico, possono essere utilizzati per identificare neurodegenerazione, il vantaggio di questo metodo è che può essere applicata più in generale. Contare le cellule richiede che queste cellule possono essere identificate in modo affidabile utilizzando un anticorpo specifico o l'espressione di un marcatore specifico per cellule, che non è sempre disponibile. Inoltre, è stato dimostrato che drammaticamente diversi risultati possono essere ottenuti con tale metodo 24, presumibilmente a causa delle condizioni utilizzate per l'etichettatura e per il rilevamento. Un altro metodo per rilevare le cellule degenerano è l'uso di marcatori di morte cellulare, come anti-caspasi 3. Tuttavia, identifica soltanto cellule in fase attiva la morte cellulare e una volta che le cellule sono morti, essi non sono più rilevabili. Un altro vantaggio del metodo qui proposto è che nessuna colorazione è richiesto a causa della autofluorescence causata dal pigmento dell'occhio, che consente di risparmiare tempo e riduce al minimo gli artefatti causati dalle variazioni delle condizioni di colorazione. È importante notare che, quando si usa questo metodo, gli occhi le mosche 'hanno abbastanza pigmento macchiare la diapositiva. Se il colore degli occhi è troppo chiaro, aggiungendo un po 'wild-type vola al collare sarebbe consigliabile garantire una sufficiente e anche la colorazione tutta la diapositiva. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è che le zone multiple possono essere esaminati, anche nella stessa testa. Anche se non mostriamo i dati, abbiamo usato queste sezioni per esaminare neurodegenerazione nella perdita di cellule della retina e gliali nella lamina corticale 30,36. Come descritto qui, questo metodo fornisce sezioni orizzontali, ma ruotando il blocco di paraffina di 90 ° quando la fusione sul porta oggetto, si può anche ottenere sezioni frontali. Pertanto, questo metodo è una procedura versatile che consente la misura puntuale ed efficiente neurodegenerazione nel cervello mosca. Poiché la formazione di vacuoles è stata osservata in molti modelli mosca di malattie neurodegenerative umane, compresi i modelli per l'AD, PD, Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), e le malattie causate da polyglutamine-ripete 16,37-40, questo metodo può essere utilizzato per quantificare fenotipi neurodegenerative in una varietà di modelli di malattia.

Nel complesso, questo protocollo è semplice e facilmente completato una volta che la configurazione iniziale del dispositivo viene effettuata. Alcune note da tenere a mente sono in volta con attenzione i lavaggi etanolo per evitare un eccesso di disidratazione delle teste, per tagliare con attenzione i blocchi di paraffina in modo da non perdere le sezioni o teste, e di non overexpand il nastro in acqua quando la slitta è sul blocco termico. Se il nastro viene lasciato espandere troppo, strappo delle teste mosca può comportare e l'ordine delle teste del nastro può essere perso. Inoltre, essere ciechi per il genotipo, mentre facendo le analisi è fondamentale per evitare distorsioni. Ciò si ottiene da avere una persona la preparazione del slides e tenuta dei registri, mentre un'altra persona sta prendendo le immagini e fare le misurazioni. Uno dei limiti di questo metodo è che la degenerazione di poche cellule sarà molto difficile da rilevare. In tal caso, un colorante specifico della popolazione di cellule colpite sarebbe più informativo. Inoltre, questo metodo non consente di distinguere tra i diversi tipi di morte cellulare, che richiede metodi più specifici, come ad esempio una colorazione TUNEL per determinare la morte cellulare per apoptosi. Infine, questo metodo non può distinguere tra morte cellulare e degenerazione assonale, che sarebbe anche rilevabile come vacuoli nella neuropil.

Come mostrato nei risultati, questo metodo può essere utilizzato per affrontare degenerazione in specifiche aree cerebrali o in tutto il cervello. Nella nostra esperienza, è utile analizzare solo un'area specifica quando il fenotipo è abbastanza forte, anche quando tutte le regioni del cervello sono colpite. Questo riduce notevolmente il carico di lavoro e non incide sullarisultato. Originariamente abbiamo analizzato diverse aree nel mutante SWS e osservato risultati molto simili nella progressione del fenotipo quando si confrontano una sola area e nell'analisi tutte le aree (dati non mostrati). Tuttavia, va notato che una regione chiaramente identificabile dovrebbe essere scelta per evitare artefatti dovuti all'analisi delle diverse zone o aree a diversi livelli.

Al contrario, nei casi in cui il fenotipo è relativamente lieve, è meglio analizzare l'intero cervello, perché la probabilità di trovare vacuoli in una regione specifica è bassa. Per esempio, questo è il caso per determinare neurodegenerazione correlata all'età, come mostrato in figura 3, che si traduce in soli 4 - 5 vacuoli in tutto il cervello in 60 giorni di età mosche. Quando il conteggio vacuoli in tutto il cervello, si deve tener conto che i piccoli vacuoli verranno visualizzati solo in una sezione, mentre quelli più grandi si estenderanno su più sezioni. Per quanto riguarda quest'ultimo, la vicinanza di aggsezioni acent quando si utilizza questo metodo (Figura 1) fornisce un altro vantaggio, perché è relativamente facile determinare se stesso vacuolo è presente in diverse sezioni.

In conclusione, questo protocollo può rivelarsi utile per lo studio di molti modelli di Drosophila di diverse malattie neurodegenerative. Identificare le proteine ​​che interagiscono che migliorare o aggravare il fenotipo degenerativo può fornire spunti importanti sui meccanismi di base che causano o modificano le malattie come l'Alzheimer e il Parkinson. In questa pubblicazione, usiamo questo metodo per rilevare la degenerazione che è progressiva, in cui gli animali si sviluppano normalmente, ma mostrano crescente degenerazione durante l'invecchiamento. Inoltre, questo metodo può anche essere adattato per determinare la degenerazione che è causato da difetti di sviluppo, che dovrebbero già essere presenti nella mosche di nuova eclosed.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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