Удаление биопленки с использованием диоксида углерода Аэрозоли без продувки азотом

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка поверхности для биопленки

  1. Вырезать 1 мм толщиной 304 пластины из нержавеющей стали в щепу (10 × 10 мм 2) с механическим резаком.
  2. Выполнение ультразвуковой очистки щепы в ацетоне, метаноле, и деионизированную (ДИ) воды последовательно в течение 10 минут каждый. Используйте растворитель резистентных контейнер, изготовленный из веществ, таких как стекло, для удаления органических загрязнений.
  3. Ополосните чипы с проточной DI воды в течение 3-5 сек.
  4. Сухие чипы с использованием N 2 поток газа в течение 3-5 сек.

2. Подготовка бактериальной культуры

  1. Возьмите P. putida KT2440 (любезно предоставленный проф Sung Kuk Ли, UNIST, Южная Корея) запаса , хранящегося в -80 ° C морозильнике.
  2. Разморозить при комнатной температуре, после 1 мин, а верхний слой замороженного исходного раствора превращается в слякоть. Погружают петлю в расплавленном слое исходного раствора.
  3. Используйте эту петлю, чтобы полоса бактерий на Лурия в-Bertani (LB) пластины, содержащей 1,5% агара.
  4. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 30 ° C, чтобы расти колонии бактерий.
  5. Выберите одну колонию из планшета с использованием свежей петли.
  6. Инокулируйте 10 мл LB бульона в конической трубе 50 мл с помощью петли, содержащей единственную бактериальную колонию.
  7. Инкубируйте бульон в качалке инкубаторе в течение 16 часов при температуре 30 ° C и 160 оборотов в минуту.

3. биопленки на поверхности

  1. Встреча каждого из готовых чипов с помощью пинцета и окунуть в 70% этаноле в 5 раз в течение 1-2 сек каждый, чтобы стерилизовать поверхность каждого чипа. Убедитесь в том, что чипы удерживаются с помощью пинцета во время погружения.
  2. Dip каждый чип в автоклавного DI воде и в LB бульоне последовательно, 5 раз в течение 1-2 сек каждый, чтобы удалить остатки этанола.
  3. Поместите эти фишки в 6-луночные культуральные планшеты с 2-х микросхемах и 5 мл LB бульона на лунку.
  4. не Развести бактериальной культуры до концентрации в бульоне LB достигает8 × 10 8 клеток / мл (оптическая плотность при 600 нм: ~ 0,8).
  5. Инокулируйте каждую лунку 50 мкл разведенного бактериальной культуры.
  6. Инкубируйте пластин при 30 ° С без встряхивания в течение 24 ч для образования биопленки.

Очистка 4. CO 2 Аэрозоль

  1. Dip биопленка сформированных чипов в 10 мМ буфере ацетата аммония (летучие) в 5 раз, чтобы удалить слабо связаны и планктонных бактерий.
  2. Сушат эти чипы в шкафу биологической безопасности, где воздух проходит мягко.
  3. Сразу после высыхания, поместите чип на место погрузки, который находится в 20 мм от CO 2 сопла вдоль оси струи. Наклон оси струи под углом 40 °.
  4. Установите Застой давление СО 2 и N 2 газа до 5,3 МПа и 0,7 МПа соответственно, с помощью регуляторов давления газа.
  5. Нанесите аэрозольную струю на центральную часть чипа. Белые аэрозоли , включая твердый CO 2 должнобыть видимым. Поворот "на" электромагнитный клапан для СО 2 в течение 5 секунд, а затем включите его "выключено" в течение 3 сек (цикл: 8 сек) периодически используя вручную управляемый выключатель. Если продувку азотом необходимо использовать, включите электромагнитный клапан для непрерывной подачи N 2.
  6. Лечить чипы с СО 2 аэрозолями для 16, 40 и 88 сек и без азота чисток. Сохранил чипы без лечения в качестве отрицательного контроля.

5. Анализ эффективности для удаления

  1. Приготовьте 1 мкМ зеленая флуоресценция нуклеиновой кислоты пятно (длина волны возбуждения / испускания: 480/500 нм) в деионизированной воде для окрашивания бактериальных клеток на контроле и аэрозольных обработанных чипов.
  2. Поместите фишки в красящим раствором.
  3. Инкубируйте чипы в инкубаторе без света при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
  4. После инкубации осторожно прополоскать стружку с проточной водой DI для удаления избытка флуоресцентного красителя.
  5. Сушат чипы Wiго N 2 потока газа.
  6. Возьмите флюоресценции микроскопические изображения 5 случайных полей зрения (321 × 240 мкм 2) для каждого чипа с помощью эпифлуоресцентной микроскопа, 40X объектив, и камера CCD.
  7. Получить интенсивности флуоресценции для каждого изображения, используя программное обеспечение для обработки изображений, такие как ImageJ. В ImageJ, используйте функцию "Вычитание фона" в меню "Process" и выберите "интегральной плотности" в окне "Установка измерений" в меню "Analyze". Выполните "измерения" в меню "Анализ", чтобы получить интенсивность флуоресценции.
  8. Рассчитать эффективность удаления биопленки в соответствии со следующей формулой: 100% × (I чипсов контрольных - I обработанных чипсов) / (I чипсов управления), где I является вычисленной интенсивности флуоресценции.
  9. Получить среднее эффективность удаления и стандартные отклонения. Использование вНаименее 4 фишки для каждого случая.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CO 2 аэрозолей были использованы для удаления P. putida биопленки из SUS304 поверхностей (рисунок 1). Большая часть поверхности были покрыты биопленки после 24 часов роста. Большая часть биопленки была удалена с помощью СО 2 аэрозолей (рисунок 2). Как и следовало ожидать, на рисунке 3 показано увеличение эффективности удаления биопленки как время обработки аэрозольный СО 2 увеличивается. За время лечения 88 сек, эффективность удаления была определена выше, 97,74% и 98,29%, с использованием и без продувки азотом, соответственно. Температура воздуха 23-24 ° С и относительная влажность была 26-50%, когда были проведены эксперименты по очистке.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема , показывающая удаление биопленки с использованием CO 2 аэрозолей. Аэрозоли генерируются при высоком давлении СО 2 газ адиабатически расширяется через сопло Вентури (0,4 мм) и температура газа резко падает. Эти высокоскоростные СО 2 Аэрозоли наносят на поверхность , покрытую биопленки. Когда продувочный азот используется, N 2 газ подается через 8 форсунок , окружающих центральный CO 2 сопла. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Флуоресцентные микроскопические изображения для 24-ч-выращенного P. putida биопленки на 304 фишек из нержавеющей стали. Чипы обрабатывали CO 2 для аэрозолей разное время лечения (0, 16, 40 и 88 сек) без азота чисток. Черно-белые изображения были окрашены в зеленый цвет, а белые полоски показывают масштаб 50 мкм.пс: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Эффективность удаления для P. putida биопленки из 304 поверхностей из нержавеющей стали с различными временами CO 2 обработки аэрозоля, с и без азота чисток. Эффективность удаления были рассчитаны на основе интенсивности флуоресценции биопленки. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats