去除生物膜使用二氧化碳气溶胶没有氮气吹扫

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
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Environment

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Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

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Abstract

Protocol

1.表面的制备生物膜形成

  1. 切断用机械切刀1毫米厚的304不锈钢板成芯片(10×10毫米2)。
  2. 每10分钟进行的丙酮,水依次甲醇和去离子(DI)芯片的超声波清洗。使用的耐溶剂容器,制成的物质如玻璃,以除去有机污染物。
  3. 有3-5秒的流动DI水冲洗芯片。
  4. 使用3-5秒 N 2气流干燥该芯片。

2.细菌培养的制备

  1. 以一个P.恶臭假单胞菌 KT2440储存在-80℃深冷冻股票(由宋谷李教授,UNIST,韩国友情提供)。
  2. 解冻在室温下1分钟后,与冷冻储液的顶层变为融雪。浸入一个循环到原液的熔化层。
  3. 使用此循环连胜细菌到卢里亚含有1.5%琼脂-Bertani(LB)板上。
  4. 过夜孵育所述板在30℃下生长的细菌菌落。
  5. 使用一个新的循环板挑取单个菌落。
  6. 接种10毫升LB肉汤中在与含有单菌落环路50ml锥形管中。
  7. 孵育在振荡培养箱的肉汤在30℃下16小时和160的转速。

3.表面生物膜的形成

  1. 拿起所制备的各芯片用镊子和在70%的乙醇蘸5次,每次1-2秒,以消毒每个芯片的表面上。确保芯片保持与浸渍期间镊子。
  2. 浸在蒸压DI水和肉汤LB依次每一个芯片,5次,每次1-2秒,以去除残留的乙醇。
  3. 放置在6孔培养板,这些芯片具有2芯片和每孔5ml的LB肉汤。
  4. 稀释细菌培养,直到在LB肉汤达到的浓度8×10 8个细胞/ ml(在600nm波长的光密度:〜0.8)。
  5. 用50μl稀释的细菌培养物接种每个孔中。
  6. 孵育在30℃下将板不摇动用于形成生物膜的24小时。

4. 二氧化碳汽清洗

  1. 浸生物膜形成芯片在10mM乙酸铵缓冲液(挥发性的)5次,以去除松散附着和浮游细菌。
  2. 在生物安全柜,那里的空气流动婉转干这些芯片。
  3. 立即干燥后,放置在装载位置,这是由沿射流轴线的CO 2的喷嘴20mm的芯片。倾斜射流轴线以40°角。
  4. 设置CO 2和N 2气体的停滞压力分别5.3兆帕和0.7兆帕,利用气体压力调节器。
  5. 应用该气溶胶喷射到芯片的中心部分。白色的气溶胶包括固体二氧化碳应是可见的。转“的”为二氧化碳 5秒电磁阀,然后将其“关闭”3秒(周期:8秒)定期使用手动控制开关。如果氮气吹扫需要使用,打开该电磁阀的N 2的连续供给。
  6. 用CO处理芯片2气溶胶16,40,和88秒的使用和不使用氮气清洗。芯片保留不经处理作为阴性对照。

5.分析去除效率

  1. 制备1μM的绿色荧光核酸染料(激发/发射波长:500分之480纳米)在DI水中进行染色上的控制和气溶胶处理的芯片的细菌细胞。
  2. 放置芯片在染色溶液。
  3. 孵育在培养箱芯片没有光在37℃下30分钟。
  4. 孵育后,轻轻地用流动的去离子水去除过量的荧光染料冲洗芯片。
  5. 擦干芯片无线第N 2气的流动。
  6. 取荧光用落射荧光显微镜,40X物镜,和CCD照相机对每个芯片的视图5随机视野(321×240微米2)的显微图像。
  7. 获得如ImageJ的每个图像使用图像处理软件的荧光强度。在ImageJ的,使用“扣除背景”功能,在“进程”菜单,在“分析”菜单中的“设置测量”窗口中选择“集成密度”。执行“测量”中的“分析”菜单获得的荧光强度。
  8. 根据下列公式计算生物膜去除效率:100%×(的控制芯片 - 处理芯片)/(Ⅰ的控制芯片),其中I是计算的荧光强度。
  9. 获得平均去除率和标准偏差。在使用至少4芯片每种情况。

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Representative Results

二氧化碳气溶胶被用来去除P.恶臭从SUS304表面( 图1)生物膜。大部分表面被后生长24小时覆盖有生物膜。大多数生物膜的是使用二氧化碳气溶胶( 图2)除去。正如预期的那样, 图3示出生物膜去除效率为二氧化碳气溶胶处理时间增加的增加。为88秒的处理时间,除去效率被确定为高达97.74%和有和没有氮气吹扫,分别98.29%。空气的温度为23-24℃,相对湿度为26-50%时在清洁实验。

图1
图1.示意图,显示除去使用 CO 2气溶胶生物膜,产生气溶胶当高压 CO 2气体绝热通过文丘里喷嘴英寸(0.4毫米)膨胀和气体温度迅速下降。这些高速二氧化碳气溶胶被施加到覆盖有生物膜的表面。当使用氮气吹扫,N 2气体通过围绕中央CO 2的喷嘴8喷嘴提供。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
24小时生长P.图2.荧光显微图像304不锈钢片恶臭假单胞菌生物膜。该芯片用无氮吹扫 CO 2气溶胶不同处理时间(0,16,40,和88秒)处理。单色图像彩色绿色和白色的刻度条表示50微米。PS://www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. P.去除率来自具有不同 CO 2气雾剂治疗时间,有和没有氮气吹扫的304不锈钢表面恶臭假单胞菌生物膜。基于所述生物膜的荧光强度计算的去除效率。误差条表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

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References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

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