バイオフィルム除去窒素パージすることなく、二酸化炭素エアロゾルを使用します

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
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Environment

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Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

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Abstract

Protocol

バイオフィルム形成のための表面の調製

  1. 機械式カッターでチップ(10×10ミリメートル2)に1 mm厚の304ステンレス鋼板をカットします。
  2. 10分ごとに、アセトン、メタノール、および脱イオン(DI)水を順次内のチップの超音波洗浄を行ってください。有機汚染を除去するために、ガラスのような物質で作られた耐溶剤性容器を、使用してください。
  3. 3-5秒間DI水を流しながらチップを洗浄します。
  4. 3~5秒間N 2ガス流を用いてチップを乾燥させます。

細菌培養物の調製

  1. P.を取りますプチダ KT2440(親切教授宋東国李、UNIST、韓国によって提供される)-80°Cディープフリーザーに保存されている株式。
  2. 1分後に室温で解凍し、凍結した原液の最上層はスラッシュになります。原液の溶融層にループを浸し。
  3. ルリア上にストリークに細菌をこのループを使用します1.5%寒天を含む-Bertani(LB)プレート。
  4. 細菌コロニーを成長させるために30℃で一晩プレートをインキュベートします。
  5. 新鮮なループを使用してプレートから単一コロニーを採取。
  6. 単一の細菌コロニーを含むループで50ミリリットルコニカルチューブにLBブロスの10ミリリットルを接種します。
  7. 30℃で16時間および160 rpmで振とう培養器で培養液をインキュベートします。

表面上3.バイオフィルム形成

  1. 各チップの表面を殺菌するために、1-2秒ごとに5回をピンセットで準備された各チップをピックアップし、70%エタノールでそれらを浸し。チップは浸漬中にピンセットで開催されていることを確認してください。
  2. 、オートクレーブ滅菌DI水にし、LBブロス順次に各チップを浸し1-2秒ごとに、5回、残りのエタノールを除去します。
  3. 2チップを搭載した6ウェル培養プレート中でこれらのチップを置き、ウェルあたり5ミリリットルのLBブロス。
  4. LBブロスが到達中の濃度まで、細菌培養物を希釈8×10 8細胞/ ml(600 nmの波長での光学密度:〜0.8)。
  5. 希釈した細菌培養物の50μlの各ウェルに接種します。
  6. バイオフィルムの形成のために24時間振盪せずに30℃で培養します。

4. CO 2エアロゾルクリーニング

  1. ゆるく取り付けられ浮遊細菌を除去するために、10mM酢酸アンモニウム緩衝液中のバイオフィルム形成のチップ(揮発性に)5回浸します。
  2. 空気は穏やかに流れて安全キャビネットでこれらのチップを乾燥させます。
  3. 乾燥直後に、ジェットの軸に沿ってCO 2ノズルから20ミリメートルである積載場所、上のチップを配置します。 40°の角度にジェット軸を傾けます。
  4. ガス圧力調整器を使用して、それぞれ5.3 MPaで0.7 MPaのにCO 2とN 2ガスの停滞圧力を設定します。
  5. チップの中央部にエアロゾルジェットを適用します。固体CO 2を含むホワイトエアロゾルはすべき見えるように。 5秒間のCO 2用の電磁弁を「オン」にしてから、3秒間「オフ」に回し:定期的に手動で制御されるスイッチを使用して(サイクル8秒)。窒素パージを使用する必要がある場合、N 2の連続的な供給のための電磁弁をオン。
  6. 窒素パージでとすることなく、CO 2 16のためのエアロゾル、40、および88秒でチップを扱います。陰性対照として処理せずにチップを保持します。

除去効率5.分析

  1. 制御およびエアロゾル処理されたチップ上の細菌の細胞を染色するためにDI水中:1μM緑色蛍光核酸染色(500分の480 nmの励起/発光波長)を準備します。
  2. 染色液にチップを置きます。
  3. 37℃で30分間光せずにインキュベータ内のチップをインキュベートします。
  4. インキュベーション後、穏やかに過剰な蛍光色素を除去するために流れるDI水でチップを洗浄します。
  5. チップのwiを乾燥目のN 2ガス流量。
  6. 落射蛍光顕微鏡、40X対物レンズ、CCDカメラを使用して、各チップのためのビューの5ランダムフィールドの蛍光顕微鏡像(321×240μmの2)を取ります。
  7. 例えば、ImageJのような画像処理ソフトウェアを使用して各画像の蛍光強度を得ました。 ImageJのでは、「プロセス」メニューの「減算背景」機能を使用し、「分析」メニューの「測定値の設定」ウィンドウ内の「統合密度」を選択します。蛍光強度を得るために、「分析」メニューの「測定」を行います。
  8. 以下の式に従ってバイオフィルム除去の効率を計算する:100%×(制御チップのIを -処理されたチップのIを )/ Iが計算された蛍光強度である(制御チップのI)。
  9. 平均除去効率と標準偏差を取得します。で使用してください各ケースの少なくとも4チップ。

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Representative Results

CO 2エアロゾルは、Pを除去するために使用されましたSUS304の表面( 図1)からプチダバイオフィルム。表面の大部分は、成長の24時間後にバイオフィルムで覆った。バイオフィルムの大部分はCO 2エアロゾル( 図2)を用いて除去しました。予想されるように、 図3は、増加したCO 2エアロゾル処理時間などのバイオフィルム除去効率の増加を示します。 88秒の処理時間のために、除去効率は97.74%であり、とはそれぞれ、窒素パージなしで98.29%と高いことが決定されました。空気温度は23〜24℃であったクリーニング実験を行った時の相対湿度は26-50%でした。

図1
CO 2エアロゾルを用いてバイオフィルムの除去を示す、図1の回路図は、エアロゾルが生成されます高圧CO 2ガスが断熱ベンチュリノズル(0.4ミリメートル)を介して展開され、ガス温度が急激に低下した場合。これらの高速CO 2エアロゾルは、バイオフィルムで覆われた表面に適用されます。窒素パージを使用する場合は、N 2ガスは、中央CO 2ノズルを囲む8ノズルを介して供給されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
24時間成長させたP.図2.蛍光顕微鏡像304ステンレス鋼チップのプチダバイオフィルム。チップは、窒素パージすることなくCO 2の異なる処理時間のためのエアロゾル(0、16、40、88秒)で処理しました。モノクロ画像は緑色、白色のスケールバーは50μmでを示しました。PS://www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
P.図3.除去効率窒素パージを有するとすることなく、異なるCO 2エアロゾル処理時間を有する304ステンレス鋼の表面からプチダバイオフィルムは、除去効率は、バイオフィルムの蛍光強度に基づいて計算しました。エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

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References

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