Biyofilm Kaldırma azotla temizleme karbon dioksiti aerosollerle

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Biyofilm Oluşumunun için Yüzeyin hazırlanması 1.

  1. Mekanik kesici ile çipleri içine 304 1 mm kalınlığında paslanmaz çelik levhalar (10 × 10 mm 2) kesin.
  2. 10 dakika her biri için aseton, metanol ve deiyonize (Dİ) su ardışık olarak cips ultrasonik temizleme gerçekleştirin. Organik kirlenmeyi kaldırmak için, cam gibi maddelerden yapılmış bir çözücü dayanıklı kap kullanın.
  3. 3-5 saniye DI akan su ile cips durulayın.
  4. 3-5 saniye N2 gaz akışını kullanarak cips kurutun.

Bakteriyel kültür 2. Hazırlık

  1. Bir P al -80 ° C derin dondurucuda saklanan stokunun (nazikçe Prof. Sung Kuk Lee, unist, Güney Kore tarafından sağlanan) putida KT2440.
  2. 1 dakika sonra oda sıcaklığında erimeye ve dondurulmuş stok çözeltisi üst tabaka çamur döner. stok solüsyonu erimiş tabaka haline bir döngü daldırın.
  3. Bir Luria üzerine çizgi bakteri bu döngü kullanmak% 1.5 agar içeren -Bertani (LB) plaka.
  4. Bakteri kolonileri büyümesi 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
  5. taze döngüsünü kullanarak plaka tek bir koloni seçin.
  6. tek bir bakteriyel koloniden ihtiva eden halka ile 50 ml konik bir tüp içinde LB suyu 10 ml inoküle.
  7. 30 ° C'de 16 saat ve 160 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesi içinde suyu inkübe edin.

Yüzey 3. Biyofilm Oluşumu

  1. Her çip yüzeyi sterilize etmek için, 1-2 saniye her 5 kez cımbız ile hazırlanan cips her Pick up ve% 70 etanol bunları batırın. cips daldırma sırasında cımbız ile yapılan emin olun.
  2. Geri kalan etanolü çıkarmak için otoklavlanmış DI su ve LB suyu sırayla her bir çip, 1-2 sn her biri için 5 kez, batırın.
  3. 2 yongaları ve oyuk başına 5 mi LB suyu ile 6 oyuklu kültür plakaları, bu fiş yerleştirin.
  4. LB suyu ulaştığı konsantrasyon kadar bakteri kültürü sulandırınız8 x 10 8 hücre / ml (600 nm dalga boyunda optik yoğunluk: ~ 0.8).
  5. Seyreltilmiş bir bakteri kültürü 50 ul her bir inoküle.
  6. biyofilmlerin oluşturulması için 24 saat boyunca çalkalamadan 30 ° C'de inkübe edin.

4. CO 2 Aerosol Temizleme

  1. 10 mM amonyum asetat tamponunda biyofilm oluşan fiş Dip (uçucu) 5 kat gevşek bağlı planktonik bakterilerin çıkması için.
  2. Hava hafif akan bir biyo-güvenlik kabini, bu yongaları kurutun.
  3. Hemen kurutulduktan sonra, jet ekseni boyunca CO 2 memeden 20 mm yükleme yerinde, bir çip koyun. 40 ° açı jet ekseni yatırın.
  4. Gaz basınç regülatörleri kullanılarak, sırasıyla 5.3 MPa ve 0,7 MPa, CO 2 ve N 2 gazı durgunluk basınçları ayarlayın.
  5. çip orta kesiminde üzerine aerosol jet uygulayın. 2 olmalıdır katı CO dahil beyaz aerosollergörülebilir. 5 saniye CO 2 için solenoid valf "konulu" çevirin ve ardından 3 saniye "kapalı" açın: periyodik elle kontrol anahtarı kullanarak (döngü 8 sn). Azot temizleme kullanılması gerekiyorsa, N2 sürekli bir kaynağı için selenoid vana açın.
  6. 16, 40 CO 2 aerosoller cips davranın ve ile ve azot tasfiyeler olmadan 88 saniye. Negatif kontrol olarak tedavi olmadan fiş saklayın.

Kaldırma Verimliliği için 5. Analiz

  1. Kontrol ve aerosol tedavi edilen yongaları üzerinde bakteri hücreleri boyamak için DI su: 1 iM yeşil floresan nükleik asit leke (480/500 nm uyarma / emisyon dalga boyu) hazırlayın.
  2. boyama çözeltisi içinde cips yerleştirin.
  3. 30 dakika boyunca 37 ° C'de ışıksız bir kuluçka makinesi içinde fiş inkübe edin.
  4. inkübasyonu takiben, hafifçe aşırı floresan boya kaldırmak için distile su akan fiş ile durulayın.
  5. cips wi kurutuninci N2 gaz akışı.
  6. Bir Epifloresans mikroskop, 40X objektif lens ve CCD kamera kullanarak her çip için görüş 5 rastgele alanlara (321 × 240 mikron 2) mikroskopik görüntüleri floresan atın.
  7. Böyle ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak her resim için floresan yoğunluğu elde edin. ImageJ, "Süreç" menüsünden "Çıkart Arkaplan" işlevini kullanın ve "Analiz" menüsünden "Set Ölçümleri" penceresinde "Entegre yoğunluğu" seçeneğini seçin. floresan yoğunluğu elde etmek için "Analiz" menüsünden "Ölçüm" yapın.
  8. Aşağıdaki formüle göre biyofilm çıkarma verimliliğini hesaplama:% 100 x (kontrol fişleri I - muamele edilmiş fiş I) / I hesaplanan floresan yoğunluğu (kontrol fişleri I).
  9. giderim verimleri ve standart sapmalar ortalama edinin. kullanmakHer iki durum için en az 4 cips.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CO2 aerosoller P çıkarmak için kullanıldı putida SUS304 yüzeyler (Şekil 1) den Biyofilmlererde. yüzeylerin çoğu büyüme 24 saat sonra biyofilm ile kaplanmıştır. Biyofilm çoğu CO 2 aerosoller (Şekil 2) kullanılarak çıkarıldı. Beklendiği gibi, Şekil 3 artmış CO2 aerosol tedavi süresi olarak biyofilm giderme veriminde bir artış gösterir. 88 saniye tedavi süresi için, çıkarma verimi 97.74 ve% ile, sırasıyla, bir nitrojen akışı olmayan 98.29% kadar yüksek olduğu belirlenmiştir. hava sıcaklığı 23-24 ° C idi ve temizleme deneyi yapılmıştır nispi nem,% 26-50 idi.

Şekil 1
CO 2 aerosoller kullanarak bir biyofilm kaldırılmasını gösteren Şekil 1. şematik. Aerosoller oluştuğunda yüksek basınçlı CO2 gazı adyabatik bir venturi meme (0.4 mm) ile genişletildi ve gaz sıcaklığı hızla düştüğünde. Bu yüksek hızlı CO2 aerosoller bir biyofilm ile kaplanmış bir yüzeye uygulanır. Azot temizleme kullanıldığında, N2 gaz merkezi CO2 meme çevreleyen 8 memeleri yoluyla sağlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
24-hr-yetiştirilen P. Şekil 2. Floresan mikroskobik görüntüleri 304 paslanmaz çelik çipleri putida biyofilm. fiş temizlenmiş azot olmadan CO2 farklı tedavi kez aerosoller (0, 16, 40 ve 88 sn) ile muamele edildi. Tek renkli görüntüler yeşil renkli edildi ve beyaz ölçek çubuklar 50 mikron göstermektedir.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
P. Şekil 3. giderim verimleri ve azot tasfiyeler olmadan farklı CO 2 aerosol tedavi süreleri, 304 paslanmaz çelik yüzeyler putida biyofilm. giderme verimleri biyofilm floresan yoğunlukları temel alınarak hesaplanmıştır. Hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats