Fjernelse Biofilm Brug kuldioxid Aerosoler uden Nitrogen Purge

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Forberedelse af overflade til biofilmdannelse

  1. Skær rustfrit stål plader 1-mm-tykke 304 i chips (10 × 10 mm 2) med en mekanisk cutter.
  2. Udfør ultralyds rengøring af chips i acetone, methanol og deioniseret (DI) vand sekventielt i 10 min hver. Brug et opløsningsmiddel-resistent beholder, fremstillet af stoffer, såsom glas, for at fjerne organisk forurening.
  3. Skyl chips med strømmende DI vand i 3-5 sek.
  4. Tør chips ved hjælp N2-gas flow for 3-5 sek.

2. Fremstilling af bakteriekultur

  1. Tag en P. putida KT2440 (venligst stillet til rådighed af prof Sung Kuk Lee, UNIST, Sydkorea) bestand er lagret i en -80 ° C dyb-fryser.
  2. Tø op ved stuetemperatur efter 1 min, og det øverste lag af den frosne stamopløsning bliver til sjap. Fordyb en løkke i den smeltede lag af stamopløsningen.
  3. Brug denne løkke til streak bakterierne på en Luria-Bertani (LB) plade indeholdende 1,5% agar.
  4. Inkubér pladen natten over ved 30 ° C til dyrkning af de bakteriekolonier.
  5. Vælg en enkelt koloni fra pladen ved hjælp af en ny løkke.
  6. Inokulere 10 ml LB-bouillon i et 50 ml konisk rør med løkken indeholder den enkelte bakteriekoloni.
  7. Inkubér bouillonen i en rysteinkubator i 16 timer ved 30 ° C og 160 rpm.

3. biofilmdannelse på Surface

  1. Saml hver af de fremstillede chips med pincet og dyppes dem i 70% ethanol 5 gange i 1-2 sek hver, at sterilisere overfladen af ​​hver chip. Sørg for, at chips er holdt med en pincet under dypning.
  2. Dyp hver chip i autoklaveret deioniseret vand og i LB-bouillon successivt, 5 gange i 1-2 sek hver, for at fjerne resterende ethanol.
  3. Placer disse chips i 6-brønds dyrkningsplader med 2 chips og 5 ml LB-bouillon per brønd.
  4. Fortynd bakteriekulturen indtil koncentrationen i LB bouillon når op8 × 10 8 celler / ml (optisk densitet ved 600 nm bølgelængde: ~ 0.8).
  5. Inokulere hver brønd med 50 pi af den fortyndede bakteriekultur.
  6. Pladerne inkuberes ved 30 ° C uden omrystning i 24 timer til dannelse af biofilm.

4. CO 2 Aerosol Rengøring

  1. Dyp biofilm-formet chips i 10 mM ammoniumacetatbuffer (flygtige) 5 gange for at fjerne løst tilknyttet og planktoniske bakterier.
  2. Tør disse chips i et biosikkerhed skab, hvor luften strømmer mildt.
  3. Umiddelbart efter tørring, placere en chip på lastning sted, som er 20 mm fra CO 2 dyse langs strålens akse. Vip jet-aksen til en 40 ° vinkel.
  4. Indstil stagnation pres fra CO 2 og N 2 gas til 5,3 MPa og 0,7 MPa, henholdsvis ved hjælp af gas-trykregulatorer.
  5. Påfør aerosol strålen på den centrale del af chippen. Hvide aerosoler herunder det faste CO 2 børvære synlige. Slå "på" magnetventilen for CO 2 i 5 sek, og derefter tænde den "off" i 3 sekunder (cyklus: 8 sek) periodisk ved hjælp af en manuelt styret afbryder. Hvis en nitrogenrensning skal bruges, tænde magnetventilen en stadig tilførsel af N2.
  6. Behandl chips med CO 2 aerosoler for 16, 40, og 88 sek med og uden kvælstof udrensninger. Behold chips uden behandling som negative kontroller.

5. Analyse for fjernelse Effektivitet

  1. Forberede 1 uM grøn fluorescens nucleinsyrefarve (excitation / emission bølgelængde: 480/500 nm) i DI vand at farve bakterieceller om kontrol og aerosol-behandlede chips.
  2. Placer chips i farvningsopløsning.
  3. Inkubér chips i en inkubator uden lys ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Efter inkuberingen forsigtigt skylle chips med strømmende DI vand for at fjerne overskydende fluorescerende farvestof.
  5. Tør chips with N2-gas flow.
  6. Tag fluorescens mikroskopiske billeder af 5 tilfældige synsfelter (321 × 240 um 2) for hver chip under anvendelse af et epifluorescensmikroskop, et 40X objektiv linse, og et CCD-kamera.
  7. Anskaf fluorescensintensitet for hvert billede ved hjælp af et billedbehandling software som ImageJ. I ImageJ, bruge "Træk baggrund" funktionen i menuen "processen", og vælg "Integreret tæthed" i "Set Målinger" vinduet i "Analyser" menuen. Gør "måling" i "Analyser" menuen for at opnå fluorescensintensiteten.
  8. Beregn biofilmfjernelse effektivitet efter følgende formel: 100% × (I i kontrolchips - I i behandlede chips) / (I kontrolchips), hvor I er den beregnede fluorescensintensitet.
  9. Hent den gennemsnitlige fjernelseseffektiviteter og standardafvigelser. Brug påmindst 4 chips til det enkelte tilfælde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CO 2 aerosoler blev anvendt til at fjerne P. putida Biofilm fra SUS304 overflader (figur 1). De fleste af overfladerne var dækket med biofilmen efter 24 timer af vækst. De fleste af biofilmen blev fjernet under anvendelse af CO 2 aerosoler (figur 2). Som forventet, Figur 3 viser en stigning i biofilm udskilningsgrad som CO 2 aerosol behandlingstid forøget. Til behandling på cirka 88 sekunder, blev fjernet effektivitet bestemt til at være så høj som 97,74% og 98,29% med og uden nitrogenskylning, hhv. Lufttemperaturen var 23-24 ° C og den relative fugtighed var 26-50%, når blev udført eksperimenter rengøring.

figur 1
Figur 1. Skematisk viser fjernelsen af en biofilm ved hjælp af CO 2 aerosoler. De aerosoler når højtryk CO2 gas adiabatisk udvidet gennem en venturidyse (0,4 mm) og gastemperaturen falder hurtigt. Disse højhastighedstog CO 2 aerosoler påføres en overflade dækket med en biofilm. Når der anvendes nitrogenskylning, er N2 gas leveret gennem 8 dyser omgiver den centrale CO 2 dyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Fluorescens mikroskopiske billeder til 24-timers-dyrkede P. putida biofilm på 304 rustfrit stål chips. De chips blev behandlet med CO 2 aerosoler til forskellige behandlingstider (0, 16, 40, og 88 sek) uden nitrogenrensninger. Monokrome billeder blev farvet grøn, og de hvide skala søjler indikerer 50 um.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. fjernelseseffektiviteter for P. putida biofilm fra 304 rustfrit ståloverflader med forskellige CO 2 aerosol behandlingstider, med og uden kvælstof udrensninger. De fjernelsesgrader blev beregnet baseret på fluorescens intensiteter af biofilm. Fejlbjælkerne viser standardafvigelserne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats