De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en

Genetics
 

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Breker, M., Lieberman, K., Tulin, F., Cross, F. R. High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii. J. Vis. Exp. (118), e54831, doi:10.3791/54831 (2016).

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Abstract

Introduction

Caracterización fenotípica de las colecciones de mutantes sistemáticas de los organismos modelo es un enfoque probado para diseccionar la complejidad celular. El unicelular Chlamydomonas reinhardtii algas verde haploide tiene un conjunto de genes de plantas similares, pero se separaron de las plantas terrestres antes de múltiples duplicaciones del genoma en el linaje planta de la tierra 2. En principio, la falta de la duplicación de genes y un ciclo de vida principalmente haploide facilita en gran medida enfoques genéticos de pérdida de función. Sin embargo, la interrupción dirigida de los genes de interés es casi imposible debido a la falta de integración genómica homóloga eficiente. Una biblioteca interrupción inserción aleatoria está en construcción, junto con la identificación del sitio perturbado, lo que va produciendo una serie ordenada de centros 1.935 interrupciones asignadas que representan 1.562 genes 3. Sin embargo, este enfoque (que se espera en general para producir mutaciones nulas) no es aplicable a genes esenciales. Sensible a la temperatura (ts) las mutaciones se pueden recovered en genes esenciales, y los métodos recientes permiten la identificación eficaz del gen mutado y la lesión causante. El análisis fenotípico a alta temperatura y luego proporciona información inmediata acerca de la función del gen mutado. Hemos informado sobre el aislamiento y caracterización de mutaciones letales en ts ~ 70 genes esenciales en Chlamydomonas, centrándose especialmente en los genes implicados en la progresión del ciclo celular y controlamos 1,4.

Ts pantallas letales han sido un pilar de análisis genético de los microorganismos durante décadas 5,6. En principio, una característica deseable es acercarse a la "saturación", lo que significa que todos los genes capaces de mutar al TS letalidad se identifican por lo menos un mutante, lo que permite un análisis completo. Sin embargo, en la práctica, varios factores limitan la aproximación a la saturación. En primer lugar, mientras que casi todos los genes pueden mutarse a la pérdida de actividad a alta temperatura, la eficiencia de la recuperación de tales mutantes varía sobre al menosun orden de magnitud 7,8. Por lo tanto, una pantalla al azar comienza a recoger los accesos recurrentes en "viajeros frecuentes" mucho antes de que se aborda la saturación. En segundo lugar, mientras que mutaciones ts suelen dar lugar a la reducción de la función, que pueden no ser verdaderos valores nulos a una temperatura restrictiva (y por el contrario, con frecuencia no son completamente funcional a una temperatura permisiva). Este problema puede ser tratado en cierta medida mediante la comparación de múltiples alelos; si todos comparten un fenotipo común, esto es más probable que refleje el resultado de sencilla la inactivación del gen. Múltiples alelos son también muy útiles para la identificación molecular definitivo de la lesión causante 1. Sin embargo, el problema del "viajero frecuente" significa que múltiples alelos en los genes afectados rara vez pueden ser difíciles de recuperar.

Por estas razones, hemos desarrollado una tubería mejorado para aislar y caracterizar fenotípicamente mutantes ts. Hemos recogido más de 3.000 mutantes ts hasta ahora, including aproximadamente 200 nuevas mutaciones del ciclo celular candidato. El análisis molecular y fenotípica de esta colección, que ya incluye probablemente en la mayoría de las mutaciones o todas las vías de células esencial, debería proporcionar nuevos conocimientos e hipótesis en la biología celular vegetal. Es importante destacar que esta tubería se puede aplicar a cualquier microorganismo que crece en agar para construir eficientemente ts colecciones mutantes.

Una nota en el equipo: dos robots son muy importantes para la eficacia de este procedimiento (una colonia recogedor y una combinación réplica selector de chapista / cereza). Los recolectores suelen tener los pernos de metal. Las colonias escogidas se llevan a cabo en el aire en estos pines para un período (de segundos a minutos, dependiendo del modelo). Chlamydomonas muere en aproximadamente 20 segundos sobre un pasador metálico en el aire. Esto restringe la elección del modelo para el organismo. asuntos precisión. Nuestra colonia recogedor es razonablemente exacta; Sin embargo, es un poco violenta en su acción y tiene alguna posibilidad de contaminación cruzada basada en aerosol. No se utiliza en altoer que la densidad de 384 (4,5 mm de distancia de centro-centro); a esta densidad, la precisión es completamente aceptable. El robot de recogida cultivo en placas replicadas / cerezo (diferentes accesorios utilizados para estas aplicaciones) es mucho más lento en el picking, pero es lo suficientemente preciso para la densidad de 1.536 (6.144 es un reto, incluso para este robot muy preciso; hemos evaluado esta densidad, pero no elegidos para usarlo debido a sus diversas dificultades). El robot no funcionará bien si las placas se cargan de forma desigual, etc. Es importante detectar a verificar para asegurarse de que las cosas correctas están sucediendo; por supuesto, el robot se ejecutará desatendida y, en general, todo va a ir bien si las primeras placas eran correctas.

Protocol

1. Mutagénesis UV

  1. Preparar un lote de 100 - 200 placas de agar rectangulares con Tris-acetato-fosfato (TAP) 9,10 medianas. Preparar estos platos unos días antes y mantenerlos en el banco que se seque para garantizar la rápida absorción de las células suspendidas en los próximos pasos.
  2. Cultura Chlamydomonas células hasta 0,2 - 0,5 de densidad óptica (OD 750; ~ 2 días) en 100 ml de líquido bajo la luz TAP, a 25 ° C y agitación a 100 rpm.
    NOTA: mutagénesis UV se lleva a cabo de forma independiente en dos fondos genéticos: Mat- Higro r (confiere resistencia a la higromicina B) y Mat + Paro r (confiere resistencia a la paromomicina). la elección del antibiótico es arbitraria, siempre que los dos tipos de apareamiento tienen resistencias a fármacos complementarios.
  3. Disponibilidad de una muestra de cada uno de los cultivos con un microscopio para asegurar que las células son viables, sano (natación e intacto), y sin contaminación.
    NOTA: Los cultivos cubierta de hierbas "accidente" yperder viabilidad, apareciendo como "fantasmas" en la microscopía de contraste de fase. No mantenga culturas shaker va una vez que alcanzan la saturación. El fenómeno de "fantasma" es fácilmente detectable en el paso 1.3.
  4. Se diluye la cultura a 0.003 OD 750. Envolver el frasco con hoja de aluminio para asegurar la densidad homogénea, como la cepa es móvil y nada direccionalmente en respuesta a la luz.
    1. Ajuste la densidad de la suspensión basándose en la dosis UV previsto, por lo que la contabilidad de la muerte celular, a 200 - 600 colonias sobrevivientes se formarán en las placas (Figura 1). Véase la Tabla 1 para obtener información sobre los tiempos de exposición UV.
  5. Adjuntar un casete de tubo pequeño que se ajuste a un dispensador de líquido y llevar a cabo una serie de lavados para la esterilización, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para evitar la contaminación.
  6. El uso de un dispensador de líquido de 8 x 12, prescindir 4 x 96 gotas de 2 l cada una en placas rectangulares (Figura 1
  7. Para asegurar la dispersión celular muy sencillo, incluso, utilizar placas secas, como se mencionó anteriormente, de forma rápida y cubrir las placas para evitar que las células de la natación en respuesta a la luz. Mantener el nivel de las placas de cubierta y en la oscuridad hasta que se absorba todo el líquido.
  • Colocar las placas bajo una lámpara UV germicida (30 vatios tubo germicida UV) durante períodos de tiempo determinados empíricamente para dar un rendimiento óptimo de los mutantes TS entre los supervivientes. Aquí, usar tiempos de 0,5 a 1,5 min a una distancia de 40 - 50 cm para dar lugar a 90 a 99,9% de destrucción. Los supervivientes contienen 100 - 1.000 mutaciones puntuales inducidos por UV, de los cuales ~ secuencias de codificación 10% de cambio.
    1. Con el fin de garantizar la máxima potencia de irradiación UV sin reversión debido a ADN dependiente de la luz reparar 11,12, el trabajo en la oscuridad a este paso e inmediatamente el paqueteplacas en una caja oscura después de la irradiación.
  • Mantener las placas en la oscuridad durante 8 a 24 horas a temperatura ambiente.
  • Colocar las placas en una incubadora a 21 ° con la iluminación para formar colonias. La formación de colonias tarda unos 10 días. Asegúrese de envolver las placas con bolsas de plástico y añadir papel absorbente en el interior de borrar hasta la condensación de líquido. ciclos de evaporación y condensación de lo contrario pueden proporcionar rutas de película líquida para los contaminantes entren en las placas.
  • Cargar las placas en las pilas relevantes como fuentes para la recolección de la colonia robótico (Figura 2). Recoger colonias para 384-arrays en las placas rectangulares, y crecer a 21 ° C con iluminación (~ 1 semana).
  • Condensar el 384-arrays en un 1.536-arrays (4: 1) usando un robot réplica-plating (Figura 3), y permitir que las placas de crecer durante ~ 3 días en el 21 ° C incubadora.
  • Replicar los 1.536-arrays de dos placas de cada uno y colocar uno en la incubadora a 21 ° C (permisivatemperatura) y el otro en un 33 ° C incubadora (temperatura restrictiva). Después de 24 horas, replicar las placas de 33 ° C a una nueva serie de placas pre-calentado, y colocarlos en la incubadora a 33 °.
    NOTA: La razón de esto es que chapado secundaria mutantes ts letales puede en algunos casos se acumulan biomasa sustancial, incluso si las células son detenidos en el primer ciclo celular después de la siembra. La réplica secundaria elimina esta señal y aumenta en gran medida la sensibilidad.
  • Fotografiar las placas con una cámara digital después de 3 días de crecimiento a 33 ° C y 5 días de crecimiento a 21 ° C. Mantener las placas en un marco fijo. Use una "rejilla-placa" marcado con nueve indicadores de alineación que se fotografía junto con las placas de cultivo (Figura 4). placas de cultivo de fotografía como alterna emparejados 21 ° 33 ° C (21/33) y C imágenes.
    NOTA: Los diferentes tiempos de incubación se utilizan para igualar el crecimiento ya que el tipo silvestre crece significativamentemás rápido a 33 ° C que a 21 ° C.
  • 2. Identificación de candidatos mutantes ts: Primera pantalla

    1. Procesar las imágenes de planchas 21/33 emparejados con una costumbre Matlab software de análisis de imágenes para eliminar el fondo y para segmentar las imágenes en un 1.536-matriz. El programa determinará la biomasa detectado (intensidad total de píxeles) en cada posición (Figura 5).
      NOTA: El software (proporcionado en el SI junto con instrucciones) utilizarán la imagen Red-placa para determinar la ubicación de las células (entradas individuales) en un 1.536-array en la alineación de ampliación y la placa de utilizar y calcular la intensidad total de píxeles en cada celda . Estos valores para cada mutante se comparan entonces en contra de parámetros ajustables para determinar el crecimiento requerida a 21 ° C con respecto a un ts + estándar y el grado de sensibilidad a la temperatura, definida como: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), donde S es la señal (en píxelesintensidad después de la sustracción del fondo), Mut es un mutante individual, y "WT" es una colonia no sensible a la temperatura elegida al azar (cepa mutagenizada que tenía ts + fenotipo). El crecimiento a 21 ° C se define como S (Mut 21) / S (WT 21). En esta primera pantalla, aplicar criterios de selección relajado (que permiten un crecimiento relativamente bajo a 21 ° C y un grado relativamente bajo de sensibilidad a la temperatura) para mantener la falsa baja tasa negativa.
    2. Cargar la lista de colonias seleccionadas generadas por el software como un archivo de instrucciones para la única colonia de recoger la robótica (típicamente en una gama de 384). Preparar las placas de origen y de destino de acuerdo con las instrucciones de la robótica y recoger colonias a matriz (Figura 6).
      NOTA: los recolectores convencionales requieren un archivo de instrucciones de alguna forma, como de .csv, .txt, .xls o. Todos los recolectores tendrán la capacidad de ser archivo de guiado; diferentes formatos deberán ser menores de edición del código de MATLAB (código fuente proporcionado). Colocar las placas de puntería en la incubadora a 21 ° C durante ~ 5 días para crecer un plato stock.

    3. La identificación de mutantes ts: segunda pantalla

    1. Repita el paso 2.1 para volver a probar colonias escogidas. Típicamente 30 - 50% de las colonias se vuelva a probar ts como claras letales, para un rendimiento de 2% - 5% de TS letales relativa a las colonias supervivientes iniciales mutagénesis UV.
    2. Repita el paso 2.2 para recoger los ts letales seleccionados dos veces, pero con un archivo de instrucciones modificado diseñado para colonias de matriz en bloques de 100 colonias en placas rectangulares en un 384 densidad. Esto es para el examen microscópico conveniente en el siguiente paso. El formato de archivo de instrucciones se especifica en tiempo de ejecución por el código de MATLAB.
    3. Asegúrese de incluir varias colonias WT como un control y colocar las placas a 21 ° C durante ~ 5 días.

    4. Determinación del fenotipo inicial

    1. Replicar las placas 100-bloques dispuestos en el paso 3.2 y colocarlos en el C 21 ° incuBator para ~ 2 días para obtener colonias recién crecientes.
    2. Replicar la nueva copia de las placas 100-bloque (4.1) a tres copias. Coloque una copia en la incubadora a 21 ° y una en el 33 ° C incubadora como controles.
    3. Coloque la tercera copia ( "screening placas") en una configuración de robótica, y encuentra las colonias con los pernos largos tocados con agua esterilizada.
      NOTA: Las células de Chlamydomonas clavado en agar robóticamente tienden a la tierra inicialmente como un lugar bastante densa de células, con pocas células individuales disponibles para la inspección microscópica. Para optimizar las colonias para la inspección microscópica, detectar las células transferidas inicialmente con una gota de agua (el volumen de agua trasvasada por los pasadores largos robóticos es ~ 100 nl). Esto da como resultado la dispersión de las células en un radio pequeño (~ 1 mm) sobre el centro pinning inicial, con muchas células individuales aisladas.
    4. Tomar microfotografías de una región de cada punto de las placas de detección a tiempo 0 (sin dejar sola, células indivisas) (La Figura 7) y colocar las placas a 33 ° C para la incubación. Determine la ubicación de la imagen por el control manual de la etapa de un microscopio de disección modificada tétrada fijada de manera que se detiene en el 4.5-mm de distancia de centro a centro de una matriz de 384 densidad.
    5. Retire las placas de detección de la incubadora a 33 ° y tomar microfotografías, como en el paso 4.4, a diferentes puntos de tiempo (10 h, 20 h, 48 h). Asegúrese de que la etapa, el soporte de la placa, y el controlador de fase son calibrados con precisión para obtener imágenes de las mismas células en cada punto de tiempo. Realizar adquisición fotomicrografía rápida (~ 10 min).
    6. Utilice la segunda copia en el 33 ° C incubadora para verificar el fenotipo ts y para asegurarse de que las fluctuaciones de temperatura durante la adquisición de imágenes no tienen ningún efecto importante sobre fenotipo ts.
      1. Analizar imágenes microscópicas y seleccionar para mutantes en base a los criterios deseados (Figura 8). Detectar el conjunto seleccionado final en una placa de agar-96 dispuestos. Asegúrese de que cadaplaca contiene mutantes del mismo tipo de apareamiento y la resistencia a los medicamentos.
      2. Para cada plato, incorporar las dos últimas columnas positivo (mutación consulta) y un control negativo (WT) para el ensayo de complementación.

    5. Complementación y varillaje de la prueba de nuevos mutantes para "viajeros frecuentes"

    1. Transferir grandes cantidades de las colonias arrays al medio de gametos-inducción libre de nitrógeno 10 en microplacas de 96 pocillos (densidad de cada colonia debe estar alrededor de 0,2 OD). Se incuban las placas con luz (13 - lámparas de mercurio de 20 W) durante ~ 5 horas para permitir la gametogénesis.
      NOTA: Este paso puede llevarse a cabo ya sea con una configuración de robótica replicar o manualmente con un dispositivo de recubrimiento simple.
    2. Suspender las consultas con los tipos de apareamiento opuestos que albergan los casetes de resistencia alternativos en tubos con medio de gametos de inducción libre de nitrógeno 10 para la gametogénesis.
    3. Mezclar las muestras en una placa diana en una mixt apareamientovolumen ure de 20 l (Figura 9). Después de ~ 10 minutos bajo la luz, punto 5 l de cada pocillo dos veces: una vez en una placa TAP para las pruebas de vinculación y una vez con TAP + 5 M + Paro 9 M Higro para las pruebas de complementación.
    4. Se incuban las placas de articulación en la incubadora a 21 ° durante la noche, y luego envolverlos en papel de aluminio. Mantenerlos en la oscuridad durante 5 días para permitir la formación zygospore.
    5. Incubar las placas para análisis de complementación para ~ 10 días a la luz a 21 ° C.
      NOTA: Las cantidades de la droga están calibrados para permitir la supervivencia de los diploides doblemente heterocigóticos, pero aún son suficientes para eliminar los haploides de apareamiento. Estas cantidades fueron calibrados para las integraciones de casete de resistencia estándar que se utilizan en este proyecto específico; con nuevas integraciones, las dosis deben ser recalibrados. La mayor parte de la biomasa se verifica a ser diploides por citometría de flujo (Figura 9), aunque un nivel variable de haploides (probablemente de la meiosis y el crecimiento de doblemente resistentessegregantes) por lo general se observa también.
    6. Replicar las placas de complementación-prueba en dos ejemplares para la identificación fenotipo TS. Coloque una copia a 21 ° C y una copia en 33 ° C durante ~ 5 días.
    7. Colonias de prueba para el fenotipo TS, tal como se describe en la sección 2.1 (Figura 5). Las colonias que no se complementan con la consulta probablemente representan alelos del mismo gen como los de consulta (diploides hetero-alélicas de mutaciones en el mismo gen).
    8. Para las pruebas de vinculación, después del paso 5.4, cambiar las placas de nuevo a la luz para permitir la meiosis y el crecimiento de los segregantes haploides de ~ 7 días.
    9. Replicar las placas de ensayo de ligamiento a TAP + 10 mM y 10 mM Paro Higro para seleccionar progenie de doble resistente (se prevé que el 25% de la progenie haploide, ya que las cintas estén disociados) y se incuba a 21 ° C durante una semana.
      NOTA: Aumentar la dosis del fármaco para haploides doblemente resistentes.
    10. colonias de prueba para el fenotipo TS, como yon paso 2.1.
      NOTA: Se espera que un fenotipo TS (y observado) para los mutantes en el mismo grupo de complementación como la consulta. Además, un fenotipo TS en el ensayo de unión, por un mutante que complementa la consulta, puede reflejar apretado vinculación entre la consulta y la nueva mutación. Los mutantes que complementan las consultas probados son probables nuevos genes que entrarán en la tubería para la identificación bioinformático de la lesión causante, y en última instancia, para su posterior análisis fenotípico.

    Representative Results

    Mostramos una tubería acelerada para aislar mutantes ts en Chlamydomonas. Las células se dispensaron en placas de agar, y poco después de la validación rápida bajo el microscopio para la densidad de una sola célula, las placas son UV irradiada (Figura 1). Colonias irradiados típicos se identifican y se recogieron en un formato dispuestos después de 10 días de crecimiento a una temperatura permisiva (Figura 2). Las placas resultantes en el formato 384 se fusionan a un 1536-array (Figura 3). A partir de estas primeras etapas de recoger colonias irradiados, hemos dispuestos ~ 200.000 colonias hasta el momento. La densidad de la suspensión se ajusta basándose en la dosis UV previsto de modo que, lo que representa la muerte, a 200 - 600 colonias sobrevivientes se formarán en las placas. Tres veces UV de exposición (1,5 min, 1 min, y 0,5 min) y tres densidades fueron probados en consecuencia (Tabla 1). Empíricamente, el tiempo de exposición 1,5 min produjo la mayoría de los ts- mutantes (~ 50%); sin embargo, por el momento, 1 min produjo la mayoría de los candidatos del ciclo celular. Por lo tanto, las futuras rondas de mutagénesis UV se realizaron con sólo 1 min. Una preocupación importante es la salpicaduras durante la recolección inicial y la contaminación cruzada (especialmente en los formatos de alta densidad). Esto puede resultar en la duplicación y más fenotipificación de la misma mutante dos veces. Para reducir al mínimo la probabilidad de que tal escenario, tenga cuidado para recoger colonias en el tamaño óptimo, y asegúrese de que las colonias adyacentes no son recogidos en el ensayo inicial.

    A continuación, se llevaron a cabo dos ensayos secuenciales fenotipo TS (Figura 5), y se aislaron aproximadamente 3.000 TS mutantes y fenotípicamente caracterizan por microscopía de lapso de tiempo (Figura 8). Debido al enfoque biológico en el estudio del ciclo celular de interés en fenotipos que cumplen con ciertos criterios, no estamos interesados ​​en la recogida de más de dos alelos en cada gen dianami. Por lo tanto, hemos realizado pruebas de complementación y articulación con genes ya caracterizados con más de dos alelos (consulta) contra candidatos recién recogidos para eliminar genes altamente recurrentes de la tubería aguas abajo (Figura 9).

    Figura 1
    Figura 1: Uniforme propagación de las células no mutagenizado y mutagénesis UV. (a) 384 x 2 gotas mu l se dispensan en una placa de agar usando un dispensador de reactivos. (b) placas de azar son probados bajo el microscopio para verificar la densidad de una sola célula y son irradiadas con UV una exposición de 1-min. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2 Figura 2. Las colonias mutagenizadas UV-elegido para el 384-arrays. (a) las células individuales irradiados con UV se cultivan durante unos 10 días en colonias visibles. Barra de escala = 2 cm. (b) El programa de análisis de imágenes reconoce colonias separables de acuerdo con ciertos parámetros y robóticamente ellas la viste en 384 placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    Figura 3. La fusión al 1.536-matriz. Cuatro placas 384-formato se fusionan con una placa-1536; una vez crecido, que se replican de nuevo para poner a prueba para el fenotipo TS. Haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4. Imagen de cuantificación. (a) Las placas se llevan a cabo en un marco en virtud de un soporte de documentos fotografía de modo que todas las placas en una serie se fotografían a un aumento idéntico y posicionamiento. (b) La primera imagen es la de una placa de microtitulación de 1536 bien con puntos rojos colocados en las esquinas y puntos medios. Esta "red-placa" imagen define la posición de la matriz. (c) Ejemplo de una matriz de 1536-después de la incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5. Identificación del fenotipo TS por puntoAnálisis de Imágenes -automated. imágenes de placas se analizaron por la costumbre de software MATLAB (proporcionado en el SI). La imagen se divide en segmentos de forma automática en matrices celulares (96, 384, o 1.536), y la señal en cada célula se cuantifica. El crecimiento a 21 ° C está marcado en azul, y el crecimiento a 33 ° C está marcado en amarillo. Las colonias que presentan un crecimiento significativamente mayor a 21 ° C en comparación con 33 ° C (estandarizados para ts +) son seleccionados y marcados en cuadrados de color negro con un punto verde. Estas opciones se pueden editar manualmente. selecciones finales se transfirieron a un archivo utilizado por el robot de colonias de picking. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 6
    Figura 6. Los candidatos de selección robótica de Lethal ts primera ronda. La cereza-Picking robot sigue las instrucciones de un archivo generado como se describe en el paso 2.1 para recoger los candidatos para una nueva matriz. El panel superior muestra la carga de un pin esterilizado. El panel inferior muestra el picking precisa de una cierta colonia en la placa de fuente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 7
    Figura 7. Proyección de lapso de tiempo para la clasificación inicial de los fenotipos ts letal. Clones que pasaron dos rondas del protocolo de cribado se ilustra en la Figura 5 se replican en placas a una densidad celular tal que las células individuales se pueden resolver microscópicamente. Un microscopio de disección tétrada modificado se utiliza para identificar posiciones en las que se toman fotomicrografías después de 0 h, 10 h, y 20 hr incubaciones una t 33 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 8
    Figura 8: Los Mutantes Chlamydomonas del Ciclo Celular identificados por microscopía de lapso de tiempo. (a) Ilustración del ciclo celular único Chlamydomonas describe la fase G1 a largo caracterizado por un crecimiento celular, seguido de ciclos de SM de fisión, que terminan con la incubación de las células hijas recién nacidos. (b) Imágenes microscópicas demuestran células WT durante el ciclo celular y la identificación de mutantes típicas del ciclo celular que no para completar la mitosis. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 9
    Figura 9: Prueba de Complementación y Vinculación. (a) Una consulta resistentes a los antibióticos (por ejemplo, Higro) con un gen mutado se repite con frecuencia es atravesado en una placa de 96 pocillos con una serie de mutantes del tipo de apareamiento opuesto que albergan un segundo casete de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, de Paro). placas de Complementación alto rendimiento de fracción de diploides como se muestra por la tinción de ácidos nucleicos y análisis de citometría de flujo (panel inferior izquierdo en a). (b) La mezcla de acoplamiento se prueba tanto para la complementación en diploides y de vinculación en la progenie de doble resistente meiótica. El control positivo es la propia consulta en el tipo de apareamiento opuesto, y, como se esperaba, se muestra el fenotipo TS a 33 ° C, mientras que el control negativo es WT y muestra la ts + fenotipo. Las colonias en círculo no muestran ninguna complementación con la consulta y por lo tanto nTS-ew alelos para el gen de la consulta. Estos son generalmente excluidos de la caracterización adicional, ya que sólo los "viajeros frecuentes" están en el equipo de prueba de complementación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    <td rowspan = "2"> 0.5 '
    Hora sobredosis Las colonias escogidas (#) fenotipo TS- Candidatos del ciclo celular
    1.5 ' 0,012 6000 (Promedio = ~ 200) 200 (3,3%) 7 (3,5%)
    1 ' 0,003 11.000 131 (1.19%) 15 (11,4%)
    (Med = ~ 360)
    6E-04 9000 40 (0,45%) 1 (2.5%)
    (Med = ~ 300)

    Tabla 1: Calibración de irradiación Times para maximizar el rendimiento de Ciclo Celular candidatos mutantes. Se probaron tres tiempos de irradiación (30 placas cada una) con diámetros exteriores correspondientes para asegurar que sobreviven número de colonias (200 - 600).

    Discussion

    La tubería se describe aquí para el aislamiento de alto rendimiento de mutantes letales ts asegura que presumiblemente todas las vías celulares esenciales del genoma Chlamydomonas están representados. Los dos pasos más críticos para la recolección eficiente de los posibles genes del ciclo celular y para la eliminación de alelos repetitivas "viajero frecuente" son: 1) la definición coherente de características fenotípicas de detención para los ciclos celulares incompletas y 2) el ensayo de complementación paralelo contra ya identificados, consultar los genes para ampliar la colección con los recién aisladas.

    Si existe sincronización de los ciclos de luz-oscuridad, Chlamydomonas crece fotosintética durante el día y el aumento de tamaño de celda> 10 veces sin ningún tipo de replicación del ADN celular o la división 13. Aproximadamente coincidente con el inicio de la noche, las células entonces someterse a múltiples ciclos de alternancia replicación del ADN, la mitosis y la división celular (Figura 8). Este schem reglamentarioE proporciona una distinción natural entre los genes necesarios principalmente para el crecimiento celular y la integridad y los genes requeridos específicamente para el ciclo de división celular. Se encontró que los puntos de tiempo de 10 hr y 20 hr-son muy informativos para una fenotípico inicial aproximada cortó 1. Las amplias clases de mutantes letales ts que reconocemos actualmente, basados en estas imágenes (ver la IS en Tulin y Cross, 2014) 1, son: Notch, palomitas de maíz, redondo, pequeño, medio, la lisis temprana, y el ciclo múltiple (Figura 8 ).

    Las tres categorías más relevantes que nos centramos son Notch, palomitas de maíz, y Ronda. Los fenotipos y "Notch", "palomitas de maíz" fueron previamente demostrado ser característica de la mayoría de las lesiones del ciclo celular específicos (por ejemplo, mitótico quinasa dependiente de ciclina, maquinaria de replicación del ADN y la topoisomerasa II) 1. La aparición de un (Notch) o múltiple (palomitas) planos aparentes de la división celular incipiente pero sin éxito es un Morphol convenienteindicador ogical de inicio del ciclo celular. Estos mutantes exhiben generalmente poco o nada de defectos de crecimiento, con aumentos en el volumen celular similar a WT en la marca de 10-hr. Los fenotipos Notch y palomitas de maíz son evidentes a las 10 h, y se han desarrollado completamente (con frecuencia asociada a la lisis celular) por 20 horas. células "redondas" crecen de manera similar a WT, pero con una producción muy reducida de planos de división incipientes aparentes, produciendo de este modo células grandes, redondos detenidos. Mutantes anteriores de esta categoría han caído en los componentes del complejo 14 o en los genes anafase de la promoción necesarios para la función de los microtúbulos (tubulina cofactores de plegado, complejo de anillo gamma tubulina) 1. En tiempos posteriores, estas células exhiben frecuentemente lisis celular pronunciada.

    células "medio" y "pequeñas" y crecen ya sea insignificante (Pequeño) o significativamente menos de WT (Medio). Muchos de estos mutantes identificados hasta la fecha tienen lesiones en genes cuyas anotaciones sugieren papeles en cellula básicalos procesos de crecimiento r (traducción o de la biogénesis de la membrana). La principal discriminación microscópica entre medio y Ronda se basa en la cantidad de crecimiento a las 10 horas (Ronda: como WT; Medio: reducido). Debido a las pequeñas y medianas categorías son bastante grandes y probablemente reflejan lesiones en una gran variedad de rutas celulares, no estamos tratando de saturar estas categorías; Sin embargo, sí queremos identificar molecularmente representantes de la clase de entender fenotipos de pérdida de diversas vías. Dos categorías no estudiados son: 1) el-principios de lisis de mutantes que pierden la integridad (pérdida del color verde, la pérdida de refringencia) por la marca de 10-hr, con poca evidencia de crecimiento celular antes y 2) los múltiples ciclos. Las células proliferan de manera similar al WT a las 10 y 20 horas, a pesar de que exhiben una completa incapacidad para llevar a cabo la proliferación de más largo plazo.

    Estamos caracterizando su mayor parte "de primera clase", "palomitas de maíz", y "redondo" y excluir las células redondas pequeñas y medianas empresas, asícomo mutantes con fugas que pocas divisiones celulares completos. Esto se debe principalmente a asegurar que las características celulares básicos, tales como el crecimiento y la integridad de la membrana, son funcionales y enriquecer la probabilidad de que los genes relacionados con la división. Este enfoque se encuentra para ser empíricamente eficiente; sin embargo, puede ser que un gen del ciclo celular es pleiotrópica y tiene roles adicionales anteriormente en G1, antes de la división real. Tales casos, lo que esperamos ser poco frecuente, se pierden. De manera más general, nuestro objetivo para la detención homogénea, que a su alta probabilidad se debe a una mutación causante de que es una proteína completamente disfuncional. Sin embargo, para la misma razón que se acaba de describir, puede haber varios puntos de detención y por lo tanto, una cierta flexibilidad es aconsejable en la elección de candidatos.

    Con el fin de enriquecer la colección con genes recientemente identificados, los candidatos seleccionados se analizan para determinar la complementación. Requerimos TS en el control positivo (consulta en consulta mutación) y TS + en el control negativo (query contra la WT). Nuevos mutantes en el mismo grupo de complementación como la consulta son TS. La pertenencia a un mismo grupo de complementación refleja casi invariablemente una lesión molecular en el mismo gen (este ha sido el caso de cada uno de estos genes que hemos probado). Por lo tanto, para los "viajeros frecuentes", este criterio es excluyente para una caracterización adicional. Los mutantes que no estaban en los mismos grupos de complementación como las consultas probados son candidatos para nuevos genes y se caracterizan además por la bioinformática y herramientas experimentales. recuperación muy variables de TS-alelos en diferentes grupos de complementación es un fenómeno bien conocido que es, la variabilidad es marcadamente mayor que el ruido de Poisson, debido a la gran variabilidad intrínseca de la mutabilidad de TS entre diferentes genes. Las causas pueden incluir las diferencias intrínsecas termolábil; diferentes tamaños de la proteína; la presencia de una proteína como un monómero de frente como una grande, estabiliza complejo; y los puntos calientes mutagénicos. Esto es casi una pura nuisana vez. Sin embargo, un resultado favorable resultante es que la lista de "viajero frecuente" no es largo (con sólo unos pocos objetivos que ocupan la mayor parte de la lista), por lo que la prueba de complementación mucha mano de obra no es una empresa de gran envergadura hasta las etapas posteriores del proyecto.

    Como un enfoque complementario, se realizó un ensayo de ligamiento. En este ensayo, progenie de doble resistentes se seleccionan y se prueban para el fenotipo TS. Se espera que un fenotipo TS (y observado) para los mutantes en el mismo grupo de complementación como la consulta o de mutaciones estrechamente vinculados. Para cada uno de los genes probados, se espera que una progenie WT a aparecer (ts + fenotipo) en una cierta probabilidad en función de la distancia genética. Estimamos que hay alrededor de 100 zigosporas para cada apareamiento en estos puntos. Asumiendo 100% de eficiencia meiótica, esto dará lugar a progenie alrededor de 100 doble resistente a los medicamentos a partir de los casetes de resistencia a fármacos no ligados (25% de la progenie meiótica, cuatro por meiosis, debido a Mherencia endelian). Esto también sería el caso de mutaciones TS, donde el 25% de las progenies será doble mutante, y el 25% será WT si las mutaciones de consulta y de prueba estén disociados. Por lo tanto, fuera de la progenie resistente al doble de drogas, el 25% será WT (alrededor de 25 células). Este es el caso para las mutaciones completamente disociados; Sin embargo, la vinculación moderada (a menos de ~ 20 cm, aproximadamente 2 Mb, o 2% del genoma 115) será fuertemente reducir o eliminar la señal de TS +. En el caso de la vinculación de la mutación probado para el casete de antibiótico, ts + haploides que son resistentes doble de fármaco están presentes en cantidades muy bajas. Esto se manifiesta como falta evidente para recombinarse con todos los mutantes analizados, a pesar de que complementa a prueba todos los mutantes, un resultado aberrante que fácilmente se nota; en tales casos, el retrocruzamiento va a resolver el problema.

    Tanto desde el conocimiento previo y del análisis de la secuencia, esperamos que los genes del ciclo celular en la Chlamydomonas estar alrededor de 500 genes 2, aunque most, pero probablemente no todos, son esenciales. Vamos a evaluar la necesidad de rondas de mutagénesis adicionales que se recogen más mutantes y eleva el nivel de saturación.

    Este procedimiento está especialmente diseñado para el estudio de los procesos biológicos esenciales y los genes y proteínas que las llevan a cabo. Otras metodologías para generar existen perturbaciones en los genes esenciales (por ejemplo, la transformación de los alelos mutados al azar a 16, alelos condicionalmente transcritos 17, o alelos hypomorphic 18). Sin embargo, todos ellos requieren la recombinación homóloga, que está fuertemente suprimida en vegetativo Chlamydomonas. El agrupado, interspaced regularmente repetición corta capicúa (CRISPR) / sistema de Cas9 se ha establecido como una herramienta poderosa para la modificación del gen 19; Sin embargo, todavía es trabajar de manera eficiente en Chlamydomonas 20. Fundamentalmente, todos estos métodos requieren un conocimiento previo de la diana. Esta es una restricción severaSi se desea tener la posibilidad de aprender algo nuevo! Nuestro enfoque producirá mutaciones que identifican genes esenciales, independiente de cualquier conocimiento previo. Por lo tanto, en el nivel actual de la tecnología, el aislamiento de mutaciones ts aleatoria seguida de la identificación de genes mediante secuenciación profunda puede ser el método más eficiente de obtener una rápida entrada en biología celular microbiana en el superreino planta.

    La identificación de mutaciones causales (de entre ~ 100 de codificación de la secuencia de cambio de mutaciones en cada clon) está más allá del alcance de este documento. Secuenciación profunda de piscinas segregantes voluminosos 1 es eficaz, pero mucha mano de obra. Una estrategia piscina combinatoria para la determinación de todas las mutaciones en un gran número de cepas, después de la secuenciación de un pequeño número de piscinas, es muy costos y mano de obra eficaz. Una nueva estrategia para la secuenciación combinatoria segregante granel está en desarrollo que permitirá la identificación de mutaciones causantes de decenas de mutantes SIMultaneously en una única prueba de secuenciación (en preparación). Estas eficiencias son muy importantes para permitir el paso crítico identificación de genes para mantener el ritmo con la rápida acumulación de mutantes que se hace posible gracias a los procedimientos descritos aquí.

    Disclosures

    Los autores declaran no tener ningún interés económico significativo.

    Acknowledgments

    Agradecemos a los miembros del laboratorio de la Cruz de asesoramiento y discusión útil. Este trabajo fue apoyado por PHS-5RO1 GM078153 y por un premio junior Fellow de la Fundación Simons a Michal Breker.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment:
    Hudson RapidPick colony picker Hudson Robotics
    MultiDrop Combi Reagent Dispenser Thermo Scientific 5840300
    Small tube metal tip cassette Thermo Scientific 24073295
    Singer RotoR replica-plating robot Singer Instruments Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
    Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) Singer Instruments Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
    Name Company Catalog Number Comments
    Materials:
    SYTOX Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020

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    References

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