Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i

Genetics
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Breker, M., Lieberman, K., Tulin, F., Cross, F. R. High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii. J. Vis. Exp. (118), e54831, doi:10.3791/54831 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Fenotypisk karakterisering av systematiska muterade samlingar av modellorganismer är en beprövad metod för att dissekera cellulär komplexitet. Den haploida encelliga grönalger Chlamydomonas reinhardtii har en anläggning liknande genuppsättning, men det skilde sig från landväxter innan flera genomdubbel i landet växt härstamning 2. I princip avsaknad av genduplikation och en huvudsakligen haploid livscykel underlättar i hög grad förlust av funktions genetiska metoder. Det är dock nästan omöjligt riktade störningar av gener av intresse på grund av bristen på effektiv homolog genomisk integration. Ett slumpmässigt inser avbrott bibliotek är under konstruktion, i kombination med identifiering av den avbrutna platsen hittills ger en klädd uppsättning av 1,935 mappade störningar representerar 1,562 gener 3. Emellertid är detta tillvägagångssätt (förväntas i allmänhet att producera null mutationer) inte tillämplig på essentiella gener. Temperaturkänsliga (ts) mutationer kan recovered i essentiella gener, och de senaste metoderna möjliggöra en effektiv identifiering av den muterade genen och orsakande skada. Fenotypisk analys vid hög temperatur ger sedan omedelbar information om funktionen av den muterade genen. Vi rapporterade om isolering och karakterisering av ts letala mutationer i ~ 70 essentiella gener i Chlamydomonas, med särskilt fokus på gener som är involverade i cellcykelprogression och kontrollerar 1,4.

Ts dödliga skärmar har varit en stöttepelare i genetisk analys i mikroorganismer i årtionden 5,6. I princip är en önskvärd egenskap att närma sig "mättnad", vilket innebär att alla gener kan mutera till TS dödlighet identifieras genom åtminstone en mutant, vilket gör att en fullständig analys. Men i praktiken, flera faktorer begränsar det tillvägagångssätt till mättnad. Först, medan nästan alla gener kan muteras till förlust av aktivitet vid hög temperatur, effektiviteten i utvinning av sådana mutanter varierar över åtminstoneen storleksordning 7,8. Därför börjar en slumpmässig skärm, för att plocka upp återkommande träffar i "frekventa" långt innan mättnad närmar sig. För det andra, medan ts mutationer resulterar vanligen i en minskning av funktion, kan de inte vara sanna nollor vid en restriktiv temperatur (och omvänt, är ofta inte fullt fungerande vid en tillåten temperatur). kan behandlas problemet med till viss del genom att jämföra flera alleler; om de alla har en gemensam fenotyp, är detta mer sannolikt att återspegla resultatet av enkel inaktivering av genen. Flera alleler är också till stor hjälp för definitiv molekylär identifiering av orsakande skada en. Men betyder "frequent flyer" problem att flera alleler i sällan drabbade gener kan vara svårt att återhämta sig.

Av dessa skäl har vi utvecklat en förbättrad rörledning för att isolera och fenotypiskt karakterisera ts mutanter. Vi har samlat över 3000 ts mutanter Hittills har jagncluding ca 200 nya kandidatcellcykel mutationer. Molekylär och fenotypisk analys av denna samling, som redan sannolikt innehåller mutationer i de flesta eller alla cell väsentliga vägar bör ge nya insikter och hypoteser i växt cellbiologi. Viktigt, kan denna rörledning tillämpas på alla mikroorganism som växer på agar för att effektivt konstruera ts muterade samlingar.

En notering om utrustning: två robotar är mycket viktiga för effektiviteten i detta förfarande (en koloni väljare och en kombination replik plater / skylift). Plockare har typiskt metallstift. Plockade kolonier hålls i luften på dessa stift för en period (sekunder till minuter, beroende på modell). Chlamydomonas dör i ungefär 20 sekunder på ett metallstift i luften. Detta begränsar modell val för organismen. Noggrannhet frågor. Vår koloni väljare är någorlunda korrekt; Det är dock något våldsamt i sin talan och har viss möjlighet till sprutbaserad korskontaminering. Den används inte vid höger än 384 densitet (4,5 mm centrum mittpunkt); vid denna densitet, är noggrannheten helt acceptabelt. Repliken beläggning / körsbär plockrobot (olika tillbehör som används för dessa applikationer) är mycket långsammare vid plockning, men är tillräckligt exakt för 1536 densitet (6144 är en utmaning, även för denna mycket noggrann robot, vi har utvärderat denna densitet men valt att inte att använda det på grund av dess olika svårigheter). Roboten kommer inte att fungera bra om plattorna lastas ojämnt, osv. Det är viktigt att spot-kontrollera att vara säker på att rätt saker händer; Naturligtvis kommer roboten köra obevakad och i allmänhet, allt kommer att gå bra, om de första plattorna var korrekta.

Protocol

1. UV-mutagenes

  1. Förbered en sats av 100 - 200 rektangulära agarplattor med Tris-acetat-fosfat (TAP) medel 9,10. Framställa dessa plattor några dagar framåt och hålla dem på bänken för att torka för att säkerställa snabb absorption av de suspenderade cellerna i nästa steg.
  2. Kultur Chlamydomonas-celler upp till 0,2 till 0,5 optisk densitet (OD 750; ~ 2 dagar) i 100 ml flytande TAP under lätt, vid 25 ° C och skakning vid 100 rpm.
    OBS: UV-mutagenes utförs självständigt i två genetiska bakgrunder: Mat- Hygro r (ger resistens mot hygromycin B) och Mat + Paro r (ger resistens mot Paromomycin). Antibiotikum val är godtyckligt, förutsatt att de båda parningstyper har kompletterande drogmotstånd.
  3. Ta ett prov av var och en av odlingarna under mikroskop för att se till att cellerna är livsdugliga, friska (simning och intakt), och utan kontaminering.
    OBS: bevuxna kulturer "krasch" ochförlorar livskraft, visas som "spöken" i faskontrastmikroskopi. Förvara inte shaker kulturer går när de når mättnad. "Spöket" fenomen är enkelt kan upptäckas i steg 1,3.
  4. Späd kulturen till 0,003 OD 750. Linda flaskan med aluminiumfolie för att säkerställa homogen densitet, som stammen är rörliga och simmar riktnings som svar på ljus.
    1. Justera densiteten av suspensionen baserat på den planerade UV-dos, så att redovisning av celldöd, 200 - kommer 600 överlevande kolonier bildas på plattorna (Figur 1). Se tabell 1 för information om UV exponeringstider.
  5. Fäst en liten tub kassett som passar en vätskedispenser och utföra en serie tvättar för sterilisering, enligt tillverkarens anvisningar för att förhindra kontaminering.
  6. Använda en 8 x 12 flytande dispenser, dosera 4 x 96 droppar 2 pl vardera på rektangulära plattor (Figur 1
  7. För att säkerställa mycket jämn enda cell spridning, använd torra plattor, såsom nämnts ovan, och snabbt täcka plattorna för att förhindra cellerna från att simma som svar på ljus. Håll den täckta plattor nivå och i mörker tills all vätska absorberats.
  • Placera plattorna i en bakteriedödande UV-lampa (30 watt bakteriedödande UV-rör) under tidsperioder bestäms empiriskt för att ge en optimal avkastning av TS- mutanter bland de överlevande. Här använder tider av 0,5 - 1,5 minuter vid ett avstånd av 40 - 50 cm för att resultera i 90 till 99,9% dödande. Överlevande innehåller 100 - 1000 UV-inducerad punktmutationer, varav ~ 10% förändring sekvenser.
    1. För att säkerställa maximal styrka av UV-strålning utan återgång till följd av ljusberoende DNA-reparation 11,12, arbete i mörker vid detta steg och omedelbart packaplattor i en mörk låda efter bestrålning.
  • Hålla plattorna i mörker under 8-24 timmar vid rumstemperatur.
  • Placera plattorna i en 21 ° C inkubator med belysning för att bilda kolonier. Kolonibildning tar ~ 10 dagar. Se till att linda plattorna med plastpåsar och lägga absorberande papper inne att utplåna upp vätska kondens. Förångning och kondensation cykler annars kan ge vätskefilm vägar för föroreningar att komma in plattorna.
  • Ladda plattorna i de relevanta staplar som källor för robot koloni plockning (Figur 2). Plocka kolonier för 384-arrayer på rektangulära plattor, och odla dem vid 21 ° C med belysning (~ 1 vecka).
  • Kondensera 384-arrayer i en 1536-arrayer (4: 1) med en replik-plating robot (Figur 3), och låt plattorna växa under ~ 3 dagar i 21 ° C inkubator.
  • Replikera 1536-arrayer till två plattor var och placera en i 21 ° C inkubator (tillåttemperatur) och den andra i en 33 ° C inkubator (restriktiv temperatur). Efter 24 timmar, replikera plattorna i 33 ° C till en ny uppsättning av förvärmda tallrikar och placera dem i 33 ° C inkubator.
    NOTERA: Anledningen till detta sekundära plätering är att ts dödliga mutanter kan i vissa fall ansamlas betydande biomassa, även om cellerna greps i den första cellcykeln efter plätering. Den sekundära replika eliminerar denna signal och kraftigt ökar känsligheten.
  • Fotografera plattorna med en digital kamera efter 3 dagar av tillväxt vid 33 ° C och 5 dagar av tillväxt vid 21 ° C. Håll plattorna i en fast ram. Använd en "grid-platta" märkta med nio inriktningsindikatorer som är fotograferade tillsammans med odlingsplattor (Figur 4). Fotograf odlingsplattor som alternerande parade 21 ° C och 33 ° C (21/33) bilder.
    OBS: Olika inkubationstider används för att utjämna tillväxt sedan vildtypen växer kraftigtsnabbare vid 33 ° C än vid 21 ° C.
  • 2. Identifiering av ts Mutant Kandidater: första skärmen

    1. Bearbeta de parade 21/33 platt bilder med en anpassad Matlab bildanalysmjukvara för att eliminera bakgrunden och segment bilderna i en 1536-array. Programmet kommer att bestämma den detekterade biomassa (totala pixelintensitet) i varje läge (fig 5).
      OBS: Programvaran (ges i SI tillsammans med instruktioner) kommer att använda gallerplattan bilden för att bestämma placeringen av celler (enskilda poster) i en 1536-array på förstoringen och plattan anpassning används och beräkna den totala pixelintensiteten i varje cell . Dessa värden för varje mutant jämförs sedan mot justerbara parametrar för att bestämma erforderlig tillväxt vid 21 ° C i förhållande till a + standard och graden av temperaturkänslighet ts, definierat som: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), där S är signalen (bildpunkt iSPÄNNING efter bakgrundssubtraktion), är Mut en individuell mutant, och "WT" är en slumpmässigt vald icke-temperaturkänslig koloni (muteras stam som hade ts + fenotyp). Tillväxt vid 21 ° C definieras som S (Mut 21) / S (WT 21). I denna första skärmen, tillämpa avslappnad urvalskriterier (tillåter relativt låg tillväxt vid 21 ° C och en relativt låg grad av temperaturkänslighet) för att hålla den falska negativa hastigheten låg.
    2. Ladda en lista över utvalda kolonier som genereras av programvaran som en instruktionsfilen för enkelkoloni plockar robotteknik (typiskt i en 384-array). Förbered käll- och måltavlorna enligt robot instruktioner och plocka kolonier till array (Figur 6).
      OBS: Konventionella plockare kräva en instruktionsfil i vissa format, t.ex. CSV, TXT eller .xls. Alla plockare kommer att ha kapacitet att vara fil driven; olika format kommer att kräva mindre redigering av MATLAB kod (källkod ingår). Placera målplattor i 21 ° C inkubator under ~ 5 dagar för att växa en moderplatta.

    3. Identifiera ts mutanter: Andra skärm

    1. Upprepa steg 2,1 till testa plockade kolonier. Typiskt 30-50% av kolonierna kommer testa som klara ts letaler, för ett utbyte av 2% - 5% ts letaler relativt initiala kolonier överlevande UV-mutagenes.
    2. Upprepa steg 2,2 för att plocka de två gånger skärmad ts letaler, men med en modifierad instruktionsfilen utformad för array kolonier i block om 100 kolonier på rektangulära plattor på en 384-densitet. Detta är för bekväm mikroskopisk undersökning i nästa steg. Instruktionen filformatet anges vid körning av MATLAB koden.
    3. Se till att omfatta flera WT kolonier som en kontroll och placera plattorna vid 21 ° C under ~ 5 dagar.

    4. Initial Fenotyp Fastställande

    1. Replikera 100-block plattor anordnade i steg 3,2 och placera dem i 21 ° C incubator för ~ 2 dagar för att få nytt växande kolonier.
    2. Replikera ny kopia av de 100-block plattor (4,1) till tre exemplar. Placera en kopia i 21 ° C inkubator och en i 33 ° C inkubator som kontroller.
    3. Placera den tredje kopian ( "screening plattor") i en robotinstallationen och upptäcka kolonierna med långa pinnar rörd med sterilt vatten.
      OBS: Chlamydomonas celler fästs på agar robot tenderar att landa först som en ganska tät plats av celler, med några enstaka celler som mikroskopisk undersökning. För att optimera de kolonier för mikroskopisk inspektion, upptäcka de initialt överförda cellerna med en droppe vatten (den volym vatten som överförs av robot långa stift är ~ 100 nl). Detta resulterar i dispersion av cellerna i en liten radie (~ 1 mm) kring den initiala nålning centrum, med många isolerade enstaka celler.
    4. Ta mikrofotografier av ett område av varje fläck av screening plattorna vid tiden 0 (men fortfarande singel, odelade celler) (Figur 7) och placera plattorna vid 33 ° C för inkubering. Bestäm bildens placering av den manuella steget kontroll av en modifierad tetrad dissekering mikroskop inställd för att ge stannar vid 4,5 mm centrum till centrumavstånd av en 384-densitet matris.
    5. Avlägsna silplattorna från 33 ° C inkubator och ta mikrofotografier, som i steg 4,4, vid varierande tidpunkter (10 h, 20 h, 48 h). Se till scenen, plåthållaren, och scenen styrenheten är exakt kalibrerad för att få bilder av samma celler i varje tidpunkt. Utför snabb mikrofotografi förvärv (~ 10 min).
    6. Använd den andra kopian i 33 ° C inkubator för att kontrollera ts fenotypen och se till att temperaturvariationer under bildtagning har någon större effekt på ts fenotypen.
      1. Analysera mikroskopiska bilder och välj för mutanter baserade på de önskade kriterier (Figur 8). Spot den sista valda uppsättningen i en 96-klädd agarplatta. Se till att varjeplatta innehåller mutanter av samma parning typ och läkemedelsresistens.
      2. För varje platta, införliva de två sista kolumnerna en positiv (query mutation) och en negativ (WT) kontroll för kompletteringsanalys.

    5. Komplettering och Linkage testning av nya mutanter till "frekventa"

    1. Överföra stora mängder av de grupperade kolonierna till kvävefria gamet-induktionsmedium 10 i 96-brunnars mikroplattor (densiteten hos varje koloni bör vara cirka 0,2 OD). Inkubera plattorna under lätt (13-20 W kvicksilverlampor) för ~ 5 timmar för att tillåta gametogenes.
      OBS: Detta steg kan utföras antingen med en replikerande robot installation eller manuellt med en enkel plätering enhet.
    2. Avbryta frågor med motsatta parningstyper hyser de alternativa motstånds kassetterna i rör med kvävefria gamet-induktionsmedium 10 för gametogenes.
    3. Blanda proverna i en målplatta i en hoppassande Mixture volym på 20 pl (Figur 9). Efter ~ 10 min under ljuset, plats 5 pl från varje brunn två gånger: en gång på en TAP platta för koppling testning och en gång på TAP + 5 iM Paro + 9 iM Hygro för komplemente testning.
    4. Inkubera länkplattorna i 21 ° C inkubator över natten, och sedan slå in dem i folie. Hålla dem i mörker i 5 dagar för att tillåta zygospore bildning.
    5. Inkubera komplemente testning plattor för ~ 10 dagar i ljus vid 21 ° C.
      OBS: Läkemedels belopp kalibreras för att tillåta överlevnad dubbelt heterozygota diploider, men de är ändå tillräckligt för att eliminera de samverkande haploider. Dessa belopp kalibrerad för standardmotstånd kassettintegrationer som används i detta specifika projekt; med nya integrationer, bör doser kalibreras. De flesta av biomassa har bekräftats vara diploider av flödescytometri (figur 9), även om en variabel nivå av haploider (troligen från meios och tillväxt av dubbelt resistentasegreganter) brukar observeras också.
    6. Replikera komplemente-testa plattor i två exemplar för ts fenotyp identifiering. Placera en kopia vid 21 ° C och en kopia vid 33 ° C under ~ 5 dagar.
    7. Test kolonier för ts fenotypen, som beskrivs i avsnitt 2.1 (Figur 5). Kolonier som inte kompletterar med frågan representerar sannolikt alleler av samma gen som de fråge (diploider hetero alleliska med avseende på mutationer i samma gen).
    8. För koppling testning, efter steg 5,4, flytta plattorna tillbaka till ljus för att möjliggöra meios och utväxt av haploida segreganter för ~ 7 dagar.
    9. Replikera länktestplattor till TAP + 10 pM Paro och 10 | iM Hygro för att selektera för dubbelresistenta avkommor (förutsagda att vara 25% av den haploida avkomma, eftersom kassetterna är olänkade) och inkubera vid 21 ° C i en vecka.
      OBS: Öka läkemedelsdosen för dubbelt resistenta haploider.
    10. Test kolonier för ts fenotypen, som jagn steg 2,1.
      OBS: En TS- fenotyp förväntas (och observerade) för mutanter i samma komplementegrupp som frågan. Dessutom har en ts fenotyp i länkanalys, för en mutant som kompletterar frågan, kan reflektera tät koppling mellan frågan och den nya mutationen. Mutanter som kompletterar de testade frågor är sannolikt nya gener som kommer in i pipelinen för bioinformatisk identifiering av orsakande skada, och i slutändan för ytterligare fenotypisk analys.

    Representative Results

    Vi visar en påskyndad rörledning för att isolera ts mutanter i Chlamydomonas. Celler dispenseras på agarplattor, och kort efter snabb validering under mikroskop för enkelcelldensitet, plattor är UV-bestrålades (Figur 1). Typiska bestrålade kolonier identifieras och plockade in en klädd format efter 10 dagars tillväxt vid en tillåten temperatur (Figur 2). De resulterande plattorna i 384-format slås samman till en 1536-array (Figur 3). Från dessa första steg för att samla in bestrålade kolonier, har vi klädd ~ 200.000 kolonier hittills. Densiteten av suspensionen justeras baserat på den planerade UV-dos så att, som står för död, 200 - kommer 600 överlevande kolonier bildas på plattorna. Tre UV exponeringstider (1,5 min, 1 min, och 0,5 min) och tre densiteter testades i enlighet med detta (tabell 1). Empiriskt, gav de flesta av de ts exponeringstiden 1,5 min- mutanter (~ 50%); emellertid överlägset, gav en min de flesta av de cellcykel kandidater. Därför var framtida UV mutagenes rundor gjort med bara en minut. En viktig fråga är stänk under första plockning och korskontaminering (särskilt i hög densitet format). Detta kan resultera i dubbelarbete och ytterligare fenotypning av samma mutant två gånger. För att minimera sannolikheten för ett sådant scenario, vara noga med att samla kolonier på den optimala storleken, och se till att angränsande kolonier inte plockas i den initiala analysen.

    Därefter tillsattes två sekventiella TS- fenotyp analyser (Figur 5) utförs, och omkring 3000 ts mutanter isolerades och fenotypiskt kännetecknas av tidsförlopp mikroskopi (Figur 8). På grund av den biologiska fokus studera cellcykeln av intresse för fenotyper som uppfyller vissa kriterier, vi är inte intresserade av att samla in mer än två alleler i varje mål gene. Därför genomförde vi komplettering och länktestning med redan karakteriserade gener med mer än två alleler (fråga) mot nyinsamlade kandidater för att ta bort mycket återkommande gener från nedströms rörledningen (figur 9).

    Figur 1
    Figur 1: Enhetlig Spridning av omutageniserad celler och UV-mutagenes. (a) 384 x 2 l droppar dispenseras på en agarplatta med användning av en reagensfördelaren. (b) Slumpmässiga plattorna testas under mikroskop för att kontrollera enkelcelldensitet och är UV-bestrålats med en 1-min exponering. Skalstreck = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2 Figur 2. UV-mutagenis kolonier för 384-arrayer. (a) UV-bestrålade enstaka celler odlas för ~ 10 dagar till synliga kolonier. Skalstreck = 2 cm. (b) bildanalysprogram erkänner avskiljbara kolonier enligt vissa parametrar och robot matriser dem i 384 plattor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3. Sammanslagning till 1536-array. Fyra 384-format plattor slås samman till en 1536-platta; en gång odlad de upprepar igen för att testa för TS- fenotypen. Klicka här för att se enstörre version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4. Imaging för kvantifiering. (a) Plattorna hålls i en ram under ett dokument fotografi monter så att alla plattor i en serie fotograferas på samma förstoring och positionering. (b) Den första bilden är en 1536-brunn mikrotiterplatta med röda prickar placerade vid hörn och mittpunkter. Denna "grid-plate" bild definierar positionen av arrayen. (c) Exempel på en 1536-array efter inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 5
    Figur 5. Identifiering av TS- fenotypen av Semi-automated bildanalys. Platt bilder analyseras sedvana MATLAB programvara (finns i SI). Bilden automatiskt segmenteras i cell arrayer (96, 384, eller 1536), och signalen i varje cell kvantifieras. Tillväxt vid 21 ° C markeras i blått, och tillväxt vid 33 ° C är markerat i gult. Kolonier uppvisar betydligt högre tillväxt vid 21 ° C jämfört med 33 ° C (standardiserat till ts +) väljs och markeras i svarta rutor med en grön prick. Dessa val kan redigeras manuellt. Slut val överförs till en fil som används av koloniplockrobot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 6
    Figur 6. Robotic Picking förstahands ts dödliga kandidater. Körsbär-picking robot följer instruktioner från en fil som genereras såsom beskrivs i steg 2,1 för att plocka kandidater till en ny array. Den övre panelen visar lastningen av en steriliserad pin. Den nedre panelen visar exakt plockning från en viss koloni i källplattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 7
    Figur 7. Time-lapse Screening för Initial Sortering av ts Dödliga fenotyper. Kloner som passerade två omgångar av screening-protokoll visas i fig 5 replikeras till plattor vid en celldensitet så att enskilda celler kan lösas mikroskopiskt. En modifierad tetrad dissekering mikroskop används för att identifiera positioner vid vilka mikrofotografier tas efter 0 timmar, 10 timmar och 20 timmar inkubationer en t 33 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 8
    Figur 8: Chlamydomonas cellcykeln Mutants identifierade av Time förlopp mikroskopi. (a) Illustration av Chlamydomonas unika cellcykeln beskriver den långa G1 fasen kännetecknas av celltillväxt, följt av klyvnings SM cykler, som hamnar med kläckning av nyfödda dotterceller. (b) Mikroskopiska bilder visar WT celler under cellcykeln och identifiering av typiska cellcykelns mutanter som inte slutföra mitos. Skalstreck = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 9
    Figur 9: Komplettering och Linkage Test. (a) Ett antibiotikum resistenta (t.ex. Hygro) query med en ofta upprepad muterad gen korsas i en 96-brunnsplatta med en uppsättning av mutanter av motsatt parningstyp som hyser en andra antibiotikaresistens kassett (t.ex., Paro). Komplementeringsplattor ge hög fraktion av diploider såsom visas av den nukleinsyra-färgning och analys i flödescytometri (nedre vänstra panelen i en). (b) passande blandning testas både för komplettering i diploider och för koppling i dubbel resistenta meiotiska avkomma. Den positiva kontrollen är frågan sig i motsatt parningstyp, och, som väntat, visar den ts fenotypen vid 33 ° C, medan den negativa kontrollen är WT och visar ts + fenotypen. De inringade kolonierna visar ingen komplettering med frågan och är därför nya TS- alleler för frågan genen. Dessa är i allmänhet undantagna från ytterligare karakterisering, eftersom endast "frekventa" är i komplemente test set. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    <td rowspan = "2"> 0.5 "
    Tid OD Kolonier plockade (#) ts fenotyp Cellcykel kandidater
    1,5 ' 0,012 6000 (Avg = ~ 200) 200 (3,3%) 7 (3,5%)
    1 ' 0,003 11000 131 (1,19%) 15 (11,4%)
    (Avg = ~ 360)
    6E-04 9000 40 (0,45%) 1 (2,5%)
    (Avg = ~ 300)

    Tabell 1: Kalibrering av bestrålning Times att maximera utbytet av cellcykeln Mutant kandidater. Tre strålnings gånger testades (30 plattor vardera) med motsvarande OD att säkerställa överlevande koloniantal (200 - 600).

    Discussion

    Rörledningen som beskrivs här för hög avkastning isolering av ts dödliga mutanter säkerställer att förmodligen alla cellulära väsentliga vägar i Chlamydomonas genomet är representerade. De två mest kritiska steg för effektiv insamling av potentiella cellcykelgener och för eliminering av repetitiva "frequent flyer" alleler är: 1) sammanhängande definition av häktnings fenotyp egenskaper för ofullständiga cellcykler och 2) parallellkompletteringsanalys mot redan identifierade fråga gener för att förstora den samling med nyisolerade sådana.

    När synkroniseras av ljus-mörker cykler, Chlamydomonas växer fotosyntetiskt under dagtid och ökningar i cellstorlek> 10x utan DNA-replikation eller celldelning 13. Ungefär sammanfaller med uppkomsten av natten, celler genomgår sedan flera cykler av omväxlande DNA-replikation, mitos och celldelning (Figur 8). Denna reglerings Scheme ger en naturlig skillnad mellan gener främst krävs för celltillväxt och integritet och gener som krävs specifikt för celldelningscykeln. Vi fann att 10-h och 20-h tidpunkter är mycket informativ för en första grov fenotypisk skära en. De breda klasser av ts dödliga mutanter som vi känner igen idag, baserat på dessa bilder (se SI i Tulin och Cross, 2014) 1, är: Notch, popcorn, runda, Small, Medium, tidig lys, och flera cykel (Figur 8 ).

    De tre mest relevanta kategorier vi fokuserar på är Notch, popcorn, och runda. De "Notch" och "Popcorn" fenotyper visades tidigare vara kännetecknande för de flesta cellcykelspecifika lesioner (t.ex. mitotiskt cyklin-beroende kinas, DNA-replikation maskiner, och topoisomeras II) 1. Utseendet på en (Notch) eller flera (Popcorn) uppenbara plan begynnande men misslyckades celldelning är en bekväm Morphological indikator på cellcykel inledande. Dessa mutanter uppvisar i allmänhet liten eller ingen tillväxtrubbningar, med ökningar i cellvolym liknar WT vid 10-hr märket. Notch och popcorn fenotyper är uppenbara på 10 timmar och är fullt utvecklade (ofta förknippade med cellys) med 20 timmar. "Round" celler växer på samma sätt som WT men med mycket minskad produktion av uppenbara begynnande division plan, vilket ger stora, runda gripits celler. Tidigare mutanter i denna kategori har fallit i delar av Anafasa befrämjande komplex 14 eller i gener som krävs för mikrotubuli funktion (tubulin-vikning cofaktorer, gamma-tubulin ring komplex) 1. Vid senare tillfällen, dessa celler uppvisar ofta uttalad cellys.

    "Small" och "Medium" celler växer antingen obetydligt (Small) eller betydligt mindre än WT (Medium). Många av dessa mutanter som hittills identifierats har lesioner i gener vars kommentarer tyder roller i grund ²cellula²r tillväxtprocesser (översättning eller membran biogenes). Den huvudsakliga mikroskopiska diskriminering mellan Medium och runda vilar på mängden tillväxt på 10 h (Round: som WT; Medium: reducerad). Eftersom små och medelstora kategorier är ganska stora och förmodligen återspeglar lesioner i ett stort utbud av cellulära vägar, är vi inte försöker att mätta dessa kategorier; Men vill vi molekylärt identifiera representanter för klassen att förstå fenotyper av förlust i olika vägar. Två unstudied kategorier är: 1) tidig lyse mutanter som förlorar integritet (förlust av grön färg, förlust av refractility) av 10-hr märket, med få tecken på tidigare celltillväxt och 2) de multipla cykler. Celler prolifererar på liknande sätt till WT vid 10 och 20 h, även om de uppvisar en fullständig oförmåga att utföra långsiktiga proliferationen.

    Vi är oftast kännetecknar "hack", "popcorn" och "rund" och undanta små och medelstora runda celler, samtsom läckande mutanter som kompletta några celldelningar. Detta är främst att se till att de grundläggande cellulära funktioner, såsom tillväxt och membranintegritet, är funktionella och berika sannolikheten för division relaterade gener. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara empiriskt effektiv; Emellertid kan det vara så att en cellcykel gen är pleiotropa och har ytterligare roller tidigare i G1, innan själva division. Sådana fall, som vi räknar med att vara sällsynta, missas. Mer allmänt, strävar vi efter homogen stillestånd, som i hög sannolikhet beror på en orsakande mutation som är en helt dysfunktionella protein. Emellertid av samma skäl som just beskrivits, kan det finnas flera gripande punkter och därför är viss flexibilitet tillrådligt att välja kandidater.

    För att berika samlingen med nyligen identifierade generna, är de utvalda kandidaterna analyserades för komplettering. Vi kräver TS- i den positiva kontrollen (fråga mot fråge mutation) och ts + i den negativa kontrollen (query mot WT). Nya mutanter i samma komplementegrupp som frågan är ts. Medlemskap i samma komplemente grupp nästan alltid avspeglar en molekylär skada i samma gen (detta har varit fallet för varje sådan gen vi har testat). Därför, för "frequent flyers" detta kriterium är utestängande för ytterligare karakterisering. Mutanter som inte var på samma komplemente grupper som de testade frågor är kandidater för nya gener och kännetecknas vidare av bioinformatik och experimentella verktyg. Mycket varierande återhämtning av TS- alleler i olika komplementegrupper är ett välkänt fenomen, det vill säga är markant större än Poisson buller variabilitet på grund av den stora inneboende variabilitet föränderlighet att TS- mellan olika gener. Orsaker kan omfatta inneboende thermolability skillnader; olika protein storlekar; närvaron av ett protein som en monomer kontra som en stor, stabiliserat komplex; och mutagena hot spots. Detta är nästan en ren nuisance. Men det är en följd positivt resultat att "frequent flyer" lista är inte lång (med endast ett fåtal mål som upptar större delen av listan), så den arbetsintensiva komplemente testning är inte en massiv företag tills de senare stadierna av projektet.

    Som ett komplement, genomförde vi en länkanalys. I denna analys är dubbelresistenta avkommor valt och testas för TS- fenotypen. En TS- fenotyp förväntas (och observerade) för mutanter i samma komplementegrupp som frågan eller för tätt kopplade mutationer. För var och en av de testade gener, är en WT avkomma väntas dyka upp (ts + fenotyp) i en viss sannolikhet beroende på den genetiska avstånd. Vi uppskattar att det finns omkring 100 zygospores för varje parning i dessa fläckar. Förutsatt 100% meiotiska effektivitet, kommer detta att resultera i cirka 100 dubbel-resistent avkomma från länkade läkemedelsresistenskassetter (25% av den meiotiska avkomma, fyra per meios, tack vare Mendelian arv). Detta skulle också vara fallet för TS- mutationer, där 25% av avkommorna blir dubbel mutant, och 25% kommer att vara WT Om frågan och test mutationer är okopplade. Därför ut ur den dubbelläkemedelsresistenta avkomman, kommer 25% att vara WT (cirka 25 celler). Detta är fallet för helt länkade mutationer; dock måttlig koppling (inom ~ 20 cm, ca 2 Mb, eller 2% av genomet 115) kommer att kraftigt reducera eller eliminera ts + signalen. I fallet med koppling av den testade mutationen mot antibiotikan kassett, ts + haploider som är dubbelläkemedelsresistenta är närvarande i mycket små mängder. Detta yttrar sig som uppenbara misslyckande att rekombinera med alla mutanter som testats, trots att komplettera alla mutanter testas, en avvikande resultat som lätt noteras; i sådana fall kommer återkorsning lösa problemet.

    Både från förkunskaper och från sekvensanalys, förväntar vi cellcykelgener i Chlamydomonas att vara cirka 500 gener 2, även om most, men troligen inte alla, är viktiga. Vi kommer att utvärdera behovet av ytterligare mutagenes rundor eftersom fler mutanter samlas in och graden av mättnads ​​stiger.

    Detta förfarande är unikt utformad för att studera grundläggande biologiska processer och gener och proteiner som utför dem. Andra metoder för att generera störningar i viktiga gener förekommer (t.ex. omvandling av slumpmässigt muterade alleler 16, villkorligt transkriberade alleler 17, eller hypomorphic alleler 18). Men de alla kräver homolog rekombination, som är starkt undertryckt i vegetativt Chlamydomonas. Den samlade regelbundet mellanrum kort palindrom upprepa (crispr) / Cas9-systemet har etablerats som ett kraftfullt verktyg för genmodifiering 19; Det är dock ännu att arbeta effektivt i Chlamydomonas 20. Kritiskt, alla dessa metoder kräver förkunskaper av målet. Detta är en allvarlig begränsningom man vill ha möjlighet att lära sig något nytt! Vår strategi kommer att ge mutationer som identifierar viktiga gener, oberoende av några förkunskaper. Därför på den nuvarande nivån på teknik, kan isolering av slumpvisa ts mutationer följt av genen identifiering genom djup sekvense vara den mest effektiva metoden för att få snabbt inträde i mikrobiell cellbiologi i anläggningen superkingdom.

    Identifiering av orsakande mutationer (bland ~ 100 kodande sekvens förändrande mutationer i varje klon) är utanför ramen för denna uppsats. Djup sekvensering av bulkade segregant pooler 1 är effektiv men arbetskrävande. En kombinatorisk pool strategi för bestämning av alla mutationer i ett stort antal stammar, efter sekvensering av ett litet antal pooler, är mycket kostnads- och arbetseffektiv. En ny strategi för kombinatorisk bulk segregant sekvense är under utveckling som gör det möjligt att identifiera orsaks mutationer i dussintals mutanter simultaneously i en enda sekvenseringskörning (under utarbetande). Dessa effektivitetsvinster är mycket viktigt att ge den kritiska genen identifierings steg för att hålla jämna steg med den mycket snabba ackumuleringen av mutanter som möjliggörs genom de förfaranden som beskrivs här.

    Disclosures

    Författarna förklarar inga väsentliga ekonomiska intressen.

    Acknowledgments

    Vi tackar Cross lab medlemmar för att få råd och nyttig diskussion. Detta arbete stöddes av PHS 5RO1-GM078153 och en Junior Fellow utmärkelse från Simons Foundation till Michal Breker.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment:
    Hudson RapidPick colony picker Hudson Robotics
    MultiDrop Combi Reagent Dispenser Thermo Scientific 5840300
    Small tube metal tip cassette Thermo Scientific 24073295
    Singer RotoR replica-plating robot Singer Instruments Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
    Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) Singer Instruments Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
    Name Company Catalog Number Comments
    Materials:
    SYTOX Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Tulin, F., Cross, F. R. A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom. Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).
    2. Cross, F. R., Umen, J. G. The Chlamydomonas cell cycle. Plant J. 82, 370-392 (2015).
    3. Li, X., et al. An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 28, 367-387 (2016).
    4. Tulin, F., Cross, F. R. Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas. Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).
    5. Simchen, G. Cell cycle mutants. Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).
    6. Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).
    7. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
    8. Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 30, 248-258 (2008).
    9. Harris, E. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Elsevier Academic Press. (2008).
    10. Dutcher, S. K. Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).
    11. Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations. Sci World J. 2015, 250158 (2015).
    12. Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).
    13. Francis, D. Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32. Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).
    14. Zachariae, W., Nasmyth, K. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).
    15. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318, 245-250 (2007).
    16. Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).
    17. Mnaimneh, S., et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
    18. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
    19. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
    20. Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics