A Laser rápida Sondagem Método facilita a determinação não invasiva e sem contato das propriedades térmicas da folha

Biochemistry

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Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Wehner, M. A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties. J. Vis. Exp. (119), e54835, doi:10.3791/54835 (2017).

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Abstract

As plantas podem produzir substâncias valiosas tais como metabolitos secundários e proteínas recombinantes. A purificação deste último a partir da biomassa da planta pode ser racionalizada por tratamento térmico (branqueamento). Um aparelho de branqueamento pode ser concebido de forma mais precisa se as propriedades térmicas das folhas são conhecidos em detalhe, isto é, a capacidade de calor específico e condutividade térmica. A medição destas propriedades é demorado e trabalhoso, e geralmente requer métodos invasivos que em contacto com a amostra directamente. Isto pode reduzir o rendimento do produto e podem ser incompatíveis com as exigências de contenção, por exemplo, no contexto de boas práticas de fabrico. Para resolver estas questões, um método não-invasivo, sem contato foi desenvolvido que determina a capacidade de calor específico e condutividade térmica de uma folha da planta intacta em cerca de um minuto. O método envolve a aplicação de um curto impulso de laser de comprimento e intensidade definida a uma pequena área doamostra de folha, fazendo com que um aumento de temperatura que é medido usando um sensor de infravermelho próximo. O aumento da temperatura é combinada com as propriedades conhecidas da folha (espessura e densidade) para determinar a capacidade de calor específico. A condutibilidade térmica é então calculada com base no perfil da queda de temperatura subsequente, tomando radiação térmica e a transferência de calor por convecção em conta. Os cálculos associados e aspectos críticos da manipulação da amostra são discutidos.

Introduction

O processamento em larga escala de materiais biológicos, muitas vezes requer passos de tratamento térmico, tais como a pasteurização. O equipamento de tais processos pode ser concebido de forma mais precisa se as propriedades térmicas dos materiais biológicos estão bem caracterizadas, incluindo a capacidade de calor específico (c p, s) e da condutibilidade térmica (λ). Estes parâmetros podem ser determinados facilmente para líquidos, suspensões e homogeneizados por calorimetria 1. No entanto, medição tais parâmetros em amostras sólidas pode ser trabalhoso, e muitas vezes requer o contato direto com a amostra ou até mesmo sua destruição 2. Por exemplo, as técnicas fototérmicos requerem contato direto entre a amostra eo detector 3. Tais limitações são aceitáveis durante o processamento de alimentos, mas são incompatíveis com os processos altamente regulados, tais como a produção de proteínas biofarmacêuticas em plantas no contexto das boas práticas de fabricação 4. Eun tal contexto, repetido (por exemplo, semanalmente) monitoramento das propriedades térmicas podem ser necessárias durante um período de crescimento de sete semanas para as plantas individuais como uma ferramenta de controle de qualidade. Se uma tal monitorização exigiria e consumir uma folha para cada medição, não haveria esquerda para a processar, no momento da colheita da biomassa.

Além disso, utilizando apenas partes de folha em vez iria causar ferimentos para a planta e aumentar o risco de necrose ou infecção patogénica, novamente diminuindo o rendimento do processo. O risco de infecção patogénica pode também aumentar se com um método de contacto directo com a amostra seria usado, induzir o risco de que um lote inteiro de plantas podem ser infectados através de contacto com um sensor de dispositivo contaminado. Aspectos semelhantes têm que ser consideradas para o monitoramento da planta salienta como a seca, por exemplo, em um contexto ecofisiológico. Por exemplo, a perda de água é frequentemente acompanhada por uma alteração na biomassa fresca, o que requer uma Tre invasivaatment das plantas sob investigação 5, por exemplo, dissecando uma folha. Em vez disso, a determinação da capacidade de calor específico, que depende do teor de água de uma amostra, de um modo não-invasivo, como descrito aqui, pode ser utilizada como um parâmetro alternativo para o estado de hidratação das plantas. Em ambos os casos (produção farmacêutica e ecofisiologia), tensões artificiais induzidas por técnicas de medição destrutivas ou invasivos seria prejudicial uma vez que pode distorcer os dados experimentais. Métodos de flash Portanto, relatados anteriormente 6 ou a colocação de amostras entre as placas de prata 7 são inadequados para tais processos e experiências porque quer requerem contato direto com a amostra ou são destrutivos. Os parâmetros c p, s e λ deve ser determinada, a fim de projetar os equipamentos de processo para um passo de branqueamento que podem simplificar a purificação do produto e, assim, reduzir os custos de fabricação 8-10. ambos cp, s e λ agora pode ser rapidamente determinada por infravermelho próximo não destrutivo (NIR) de laser sem contacto de sondagem de um modo consistente e reprodutível 11 e este novo método irá ser explicado em detalhe a seguir. Os resultados obtidos com este método foram usadas com sucesso para simular a transferência de calor em folhas de tabaco 12, permitindo que o design do equipamento de processamento apropriado e a selecção dos parâmetros correspondentes, tais como a temperatura de branqueamento.

O método é fácil de configurar (Figura 1) e tem duas fases, medição e análise, cada um dos quais compreende duas etapas principais. Na fase de medição, uma amostra de folhas é em primeiro lugar aquecida localmente por um impulso laser curto e a temperatura máxima da amostra é registado. O perfil de temperatura da amostra é então registada para a duração de 50 s. Na fase de análise, as propriedades da folha, como a densidade (facilmente e com precisão determinada pelo measurem picnométricoENT) são combinados com a temperatura máxima da amostra para calcular c p, s. No segundo passo, o perfil de temperatura da folha é usada como entrada para uma equação do balanço de energia, tendo condução, convecção e radiação em consideração, para calcular λ.

As instruções detalhadas passo-a-passo são fornecidos na secção de protocolo, a expansão do conteúdo do vídeo de acompanhamento. medições típicas são mostrados na seção de resultados. Finalmente, os benefícios e as limitações do método são destacadas na seção de discussão, juntamente com potenciais melhorias e outras aplicações.

figura 1
Figura 1: Os aparelhos utilizados para determinar as propriedades térmicas da folha. Uma. Fotografia do aparelho de medição utilizadas para determinar a capacidade de calor específico e condutividade térmica do leAves. Os dispositivos periféricos (computadores, osciloscópio) não são mostrados. B. Representação esquemática do aparelho de medição. O laser e os equipamentos conectados são destacadas em vermelho, o detector NIR para medição de temperatura é mostrado em roxo, a amostra da folha é verde e o sensor de potência fotodiodo é azul. C. Desenho dos elementos da configuração de medição, com o mesmo código de cores como em B. A barra indica o tamanho de 0,1 m. D. Screenshot ilustrando os elementos típicos do software de controle de laser. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. cultivo de plantas e Preparação de Amostras

  1. Lavar cada bloco de lã mineral com 2/1 L de água desionizada e, subsequentemente, com 1 L de 0,1% [m / v] solução de fertilizante. Coloque uma tabaco (Nicotiana tabacum ou N. benthamiana) semente em cada bloco e suavemente nivelado com 0,25 L de solução de fertilizante sem lavar a descendência.
  2. Cultivar as plantas para 7 semanas em uma estufa ou phytotron com 70% de umidade relativa, um fotoperíodo de 16 h (180 mol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) e uma / temperatura escuro 25/22 ° C luz regime.
  3. Mover as plantas para o aparelho de medição. Se as plantas são imóveis, folhas individuais de colheita para a medição das propriedades térmicas.

2. Determinar Folha espessura e densidade

  1. Determinar a espessura da folha
    1. Prepara-se uma [m / v] solução de agarose a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) eautoclave ele. Deixar a solução arrefecer para 40 ° C e incorporar uma amostra de folhas colocado numa placa de Petri. Solidificar a agarose, colocando a placa de Petri num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
    2. Cortar o bloco de agarose em fatias de 200 um utilizando um vibratome com um ângulo de corte de lâminas de barbear de 15 °. Utilize uma velocidade de corte de 1,0 mm s-1 e uma amplitude de 0,5 mm.
    3. Mount cinco seções folha transversal sobre uma lâmina de vidro usando cianoacrilato como um fixador. Determinar a espessura da folha sob um microscópio com uma objectiva de 20 × e uma ocular com 10 x de ampliação, utilizando as ferramentas de medição incorporadas ao microscópio software de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Determinar a espessura da folha em áreas de amostra, sem veias.
    5. Alternativamente, determinar a espessura da folha com um seletor de calibre em uma área livre de veia do limbo foliar. Verifique se o calibre de marcação é realizada perpendicular ao plano da lâmina foliar.
      CAUTION: cianoacrilato é um irritante da pele e também pode colar dedos juntos se não for tratada com cuidado.
  2. Determinar a densidade de folhas
    1. Determinar a massa em vazio (m 0) de um picnómetro, em seguida, preenchê-lo com água e determinar a massa novamente (m 1). Seque o picnómetro completamente, coloque uma folha dentro e determinar a massa (m 2) mais uma vez. Com a folha de dentro, com cuidado preencher o picnómetro com água e determinar a massa (m 3).
    2. Calcular a densidade foliar (Ps) usando a Equação 1.
      Equação 1: Equação

3. Determinar a emissão espectral e Reflexão das folhas

  1. Coloque uma folha na câmara de amostra de um espectrofotômetro UV / VIS, fixando-o entre as braçadeiras de retenção de amostra. Para as medições de transmissão, colocar a folha em frente da Det ector. Para medições de reflexão colocar a folha na parte de trás da câmara de detecção.
  2. Inicie o software de controle de espectrofotômetro. Seleccionar um espectro de 900 nm a 1600 nm. Iniciar uma nova digitalização e gravar os valores para a transmissão T) e reflexão R) exibido pelo / software UV VIS, com base na curva espectral.
  3. Executar todas as medidas com pelo menos três repetições biológicas. Aumentar o número de réplicas biológicas para cinco ou mais, se uma amostra heterogénea qualidade pode ser esperada, isto é, a variação na morfologia da superfície da folha e espessura.
  4. Calcule a potência de transmissão (P T) e reflexão (P R), multiplicando os valores de R u medida μ T ou pela Laser laser de potência P medido de acordo com as equações 2 e 3.
    Equação 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
    Equação 3: Equação
    NOTA: A transmissão pode também ser determinada com um sensor de fotodiodo durante a medição (ver 6.3).

4. Configure o aparelho de medição

  1. Montar uma única barra de NIR-diodo laser acoplada a fibra (comprimento de onda = 1,550 nm) para um cone de diâmetro de 25,4 mm sobre um suporte de aço inoxidável. Ligue um controlador para ajustar a potência de saída (P Laser) do laser NIR para 4-6 W.
  2. Colocar uma lente bi-convexa com uma distância focal de 25,4 mm na extremidade do cone para ajustar a largura do feixe de 13 mm.
  3. Coloque um sensor de potência fotodíodo 354 mm abaixo da parte inferior da lente. Em seguida, atenuam o fotodiodo por colocação de um filtro de densidade neutra com uma densidade óptica de 1,0 e uma camada de cerâmica de 22 mm acima do sensor.
  4. Ligue o sensor de potência fotodiodo para um osciloscópio usando um cabo coaxial.
  5. Conectaruma estrutura 10 × 10 cm, que tem uma área de exposição de 6 × 6 centímetros da amostra com o andaime da configuração de medição a uma altura de 308 mm abaixo da lente (Figura 1). Fixar a posição da folha no espaço por montá-lo no quadro cm 10 × 10.
  6. Ligue um detector NIR a um computador pessoal usando um cabo Universal Serial Bus (USB) e instalar o software de interface para o detector.
  7. Colocar o detector a um ângulo de 45 ° em relação ao feixe de laser de 135 mm acima da camada de cerâmica. Alinhar a área de medição do detector para o ponto de laser na amostra através da variação da posição do sensor de ângulo e até se observar o sinal de temperatura máxima.
  8. Usar o software interface de controlo do laser para ajustar a potência de laser de saída para 5 W e a duração do impulso de laser de 0,5 s. Selecione o comando "Controle de corrente" na janela de opções de controle abaixo da representação gráfica da potência do laser e ajustar a potência do laser, digitando "5" para o & #34; Potência [W] ". Campo Ajuste a duração do pulso de laser, digitando" 0,5 "para o" Time "campo [s].
  9. Para determinar a potência do laser absoluta para cada conjunto de experiências, substituir o sensor de potência fotodíodo com um sensor poder absorvente de superfície térmico no final de cada conjunto de experiências e medir a potência de saída do laser para 20 s na ausência de amostra.

5. Prepare as amostras de folhas

  1. Use folhas intactas e sem danos para as medições.
  2. Se relevante para a investigação, imitar tipos de dano folha típicos pela perfuração da folha com um bisturi, esfregando a folha entre luvas de látex, expondo a folha a uma chama ou um feixe de laser para 2-3 s, ou usar outras técnicas para simular outra tipos de danos.
  3. Cuidadosamente mas rapidamente montar a amostra de folhas entre as braçadeiras de retenção de amostra.

6. Tome as medições de temperatura

  1. Evitar o contacto directo entre a folha e a cerâmicaatenuador colocado acima do sensor fotodiodo para evitar a transferência de calor artificial que interfere com o cálculo do c p, s e λ (ver secção 9).
  2. Usar o software de medição de temperatura para recolher o perfil de temperatura da amostra de folhas para um total de 60 s através do detector NIR. Em primeiro lugar, gravar a linha de base de temperatura durante 10 s, em seguida, ativar o laser durante 0,5 s e continuar a coleta de dados para 49,5 s.
    1. Iniciar uma medição, clicando em "Medição" e depois "nova medição". Depois clique na seta verde acima da representação gráfica do perfil térmico. Salve o perfil de temperatura, clicando no ícone "Save" (um disco estilizado) acima a representação gráfica do perfil.
  3. Confirmam a potência do laser transmitidas por meio do sensor de potência fotodíodo através do cálculo da diferença de sinal para as medições com e sem uma amostra de folha usando um osciloscópio ligadopara o sensor poder fotodíodo através de um cabo coaxial (Figura 2).
    1. Determinar a altura dos dois flancos (F 1, F 2 e S, S) no perfil de tensão adquirida com o osciloscópio.
    2. Repita a medição sem uma amostra da folha como uma referência (f 1,0 e f 2,0). Calcular transmissão μ T como a relação destas medições de acordo com a Equação 4 (ver também a Figura 2).
      Equação 4: Equação

Figura 2
Figura 2: Medição de transmissão da folha usando um sensor de potência fotodiodo. Uma. perfil de tensão típica de uma experiência de referência sem uma amostra de folhas visualizada usando um osciloscópio. B. perfil de tensãocom uma amostra de folha montada no aparelho. Em ambos os casos, a potência do laser transmitida é proporcional a cada um dos dois flancos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Calcule a capacidade de calor específica da amostra Folha

  1. Calcula-se a diferença de temperatura máxima AT [K] durante o impulso de laser subtraindo a temperatura ambiente T 0 [K] a partir do máximo da temperatura da folha de ma t X [K] (equação 5).
    Equação 5: Equação
  2. Calcula-se a energia absorvida por uma folha (E S [j]) com base na potência do laser e o laser duração do impulso eficaz (Equação 6), em que P R [W] é a potência e de laser reflectido P T [W] é o laser transmitida poder.
    Equação 6: Equação
  3. Calcula-se a massa da área foliar aquecida (m S [kg]) utilizando a Equação 7, em que d S [M] é a espessura da folha de acordo com 2.1), R Laser [M] é o raio do ponto de laser, V S [ m 3] é o volume da folha aquecida, e ρ S [kg m-3] é a densidade da folha de acordo com 2.2).
    Equação 7: Equação
  4. Calcular C P, S [J K -1 kg -1] de acordo com a equação 8 dividindo a energia absorvida E S pelo produto da área aquecida da folha de massa m S e máxima diferença de temperatura AT.
    Equação 8: Equação

8. Preparar os dados de temperatura perfil para ThermCálculos al Condutividade

  1. Use o comando "Export" do software de controle de sensor NIR para exportar os dados brutos de tempo e temperatura como um arquivo * .dat e abra o arquivo em um processador de planilha.
  2. Aplicar 1: 100 de redução de dados, por exemplo, usando um "IF (MOD (valor; 100) = 0;" x "," 0 ")" de comando, o que resulta numa densidade de dados de um ponto de dados por 0,1 s.
  3. Calcula-se a média de temperatura de linha de base T B [° C] para cada perfil de temperatura ao longo dos primeiros 10 s de uma medição, durante o qual o laser ainda estava fora. Em seguida, calcular a diferença entre a temperatura ambiente real T 0 [° C] B e T.
  4. Use essa diferença para normalizar individualmente cada perfil, deslocando-a para T 0 (y-normalização), por exemplo, se T B - T 0 = 2,0 K, em seguida, subtrair 2,0 K de cada valor de temperatura na temperatura proFile (Figura 3A).
  5. Normalizar o tempo de coordenadas de cada perfil de temperatura (X-a normalização), excluindo todos os pontos de dados antes que a temperatura máxima de amostra (T max) e atribuir novos valores de tempo a partir de T = 0 para t max (Figura 3B).
  6. Tela de cada perfil para mudanças bruscas de temperatura, ou seja, diferenças de temperatura que são mais de três vezes o nível de ruído da linha de base, que é tipicamente 3 × 0,31 K ≈ 1,0 K. Remover estas regiões a partir do conjunto de dados, porque eles correspondem a medição artefatos (Figura 3C ).
  7. Montar uma função de decaimento exponencial (Equação 9) para os dados utilizando um processador de folha de cálculo, onde T T [K] é a temperatura da amostra de folha equipada no tempo t [s], t 0 é a temperatura ambiente, A [K] é a amplitude e t 1 [s] a constante de decaimento (Figura3D).
    Equação 9: Equação
  8. Utilizar a função equipado para calcular a queda de temperatura na amostra de folha 0-80 s depois do pulso de laser.
  9. Transformar os dados de temperatura medidos em [° C] para a escala de [K], através da adição de um valor de 273,15 para cada ponto de dados de temperatura (Figura 3E).

Figura 3
Figura 3: esquema de processamento de dados para o cálculo de λ. Uma. Após a redução de dados, os perfis de temperatura são normalizados para a temperatura ambiente. B. Em seguida, todos os pontos de dados antes que a máxima temperatura da amostra (Tmax) são removidos. C. artefatos de medição (mostrado no "inconsistente" conjunto de dados) são identificados com base na temperatura desloca maior do thvezes ree o ruído da linha de base e removidos do conjunto de dados antes do ajuste para uma função exponencial. D. A escala de temperatura Celsius é convertido em escala Kelvin. E. Para cada intervalo de tempo, λ é calculado com base no perfil de temperatura. F. Uma janela de 20 s é definido em que uma mudança de temperatura relevante pode ser observada. G. Com base na janela de tempo selecionado, a média eo desvio padrão são calculados para λ. H. Os resultados representativos para duas amostras de folhas de N. tabacum diferentes. flechas e as linhas de laranja indicam o efeito do passo de processamento correspondente dos dados apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. O cálculo da condutividade térmica da amostra de folhas

  1. Calcule o differe temperaturaNCE entre a amostra de folhas e o meio ambiente para cada 0,1-s intervalo de acordo com a Equação 10, em que AT X [K] é a diferença de temperatura, T T [° C] é a temperatura da amostra de folha equipada e T 0 [° C] a temperatura ambiente (Figura 3E).
    Equação 10: Equação
  2. Assume-se que a diminuição da temperatura é devida ao efeito combinado de transferência de calor por convecção, radiação térmica e condução térmica. Usa o balanço de energia correspondente (Equação 11), como base para o cálculo de λ, onde AE Temp [j] é a diferença na energia térmica da amostra em dois pontos de tempo consecutivos, AE Rad [j] é a diferença de energia devido a radiação térmica, AE conv [J] é a diferença de energia devido à transferência de calor por convecção, e Δ; E cond [J] é a diferença de energia devido à condução térmica.
    Equação 11: Equação
  3. Substituir os termos gerais no balanço energético com as propriedades físicas reais produzindo Equação 12, onde AT t [K] é a diferença entre a temperatura da amostra de folha equipada, ε a emissividade sem unidade, σ [kg s -3 K -4] a Stefan -Boltzmann constante, um rad [m2] da área de radiação térmica, h [J s -1 m -2 K -1] o coeficiente de transferência de calor por convecção, um conv [m2] da área de transferência de calor por convecção, uma cond [m 2] da área de condução térmica e l [m] o comprimento característico.
    Equação 12:
    Equação
  4. Calcule o charal comprimento cteristic com base na correlação: l = V / A.
  5. Utilizar a amostra aquecida de volume V S e a área da secção transversal da amostra para calcular uma folha [m 2]. A área da folha em corte transversal corresponde a um cond acordo com a Equação 13, em que A cond é a área onde ocorre a condução, laser r é o raio do ponto de laser e s d é a espessura da folha.
    Equação 13: Equação
  6. Calcular um rad e um conv de acordo com a Equação 14, em que um laser, é a área do ponto laser.
    Equação 14: Equação
  7. Equações substitutos 9, 12 e 13 na Equação 11 e resolver o último para λ, produzindo Equação 15 onde t Laser é tele pulso de laser duração [s].
    Equação 15:
    Equação
  8. Assumir um valor de 0,94 para calcular λ ε e para cada intervalo de tempo de 0,1 s-ao longo dos primeiros 20 s de o perfil de temperatura. Calcular a média dos valores para 200 λ obtido desta maneira e calcular o desvio padrão (Figura 3F - H).

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Representative Results

Medição das propriedades da folha

Usando o método acima microscópica, uma espessura de folha 0,22-0,29 × 10-3 m foi determinada para ambos N. tabacum (0,25 ± 0,04 × 10-3 m, n = 33) e N. benthamiana (0,26 ± 0,02 x 10 - 3 m, n = 24), o que está bem dentro da 0,20-0,33 × 10 - intervalo de razões m 3 previamente relatado para as folhas de diversas espécies de plantas 3. Determinar a espessura com um calibre de marcação resultou em valores de ~ 0,28 × 10-3 M (n = 10), que foi dentro de um desvio padrão dos resultados da medição microscópica. Assim, a medida de calibre de marcação pode ser preferido em relação ao método microscópico para determinação de espessura em aplicações de rotina, uma vez que era mais fácil de aplicar eos resultados para C p, s e ʎ desviado menos do que 10% a partir da técnica mais trabalho intensivo. A densidade de N. tabacum e folhas benthamiana N. era de 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), que corresponde a 631-918 kg m - 3 Faixa previamente relatado para as folhas em outras espécies 3.

Cálculo da capacidade térmica específica

Os perfis de temperatura recolhidos para as espécies de Nicotiana mostrou um aumento rápido ao longo do tempo do pulso de laser até que a temperatura máxima (Tmax) foi alcançado em menos de 1 s. Após o pulso, a temperatura diminuiu exponencialmente até atingir a temperatura ambiente (T 0) (Figura 3A - E). A capacidade de calor específico (c P, S kg-1 K-1 para N. tabacum e 2.252 ± 285 J kg-1 K-1 para N. benthamiana. Duas configurações de cultivo e durações foram usados ​​para cada espécies (ver secção 1.2), mas isto não afecta C P, S (Figura 4). No entanto, os valores de C p, s diminuiu linearmente a partir da idade (em baixo) a (parte superior) folhas jovens (r 2 = 0,85) no caso de N. tabacum (Figura 4A), que se correlacionava com o teor em água [GG -1 biomassa] que tinha sido determinada como a diferença de biomassa húmida no momento da colheita e a massa após 72 h de incubação a 60 ° C 11. Essa correlação entre o teor de água e capacidade de calor específica estava de acordo com observações anteriores por outros autores 13. Uma correlação inversa foi observada para N. benthamiaNa (R 2 = 0,79), em que a diferença entre os calores específicos de folhas de diferentes graus de maturidade (inferior = velhos; = topo jovem) eram apenas 13% em comparação com 21% para N. tabacum. Esta diferença pode ter origem no facto de o teor de água nas folhas de N. benthamiana é quase constante ao longo dos diferentes graus de maturação da folha 11. Uma análise de sensibilidade revelou que as diferenças de C p, s foram proporcionais às flutuações dos parâmetros de medição na Equação 8. O efeito do refletida e transmitida potência do laser foi sub-proporcional, porque estes parâmetros não foram factores individuais na Equação 7. Por conseguinte, o efeito de erros nesses dois parâmetros foi menor do que aqueles causados ​​por flutuações na potência do laser ou a temperatura ambiente. Em geral, a medição foi considerado ser robusta, porque todos os parâmetros envolvidos no cálculo de C p, s tinha um coeficientevariação de menos do que 10% (Figura 4C e D).

Figura 4
Figura 4: capacidade de calor específico e condutividade térmica valores determinados para N. tabacum e N. benthamiana. Uma. Capacidade específica de calor e condutividade térmica de N. tabacum deixa de acordo com a posição da folha na planta (fundo = folhas velhas; média = folhas maduras; top = folhas jovens). As estrelas e triângulos indicam as plantas que eram 49 e 56 dias de idade, respectivamente. B. Capacidade de calor específico e condutividade térmica de N. benthamiana folhas de acordo com a posição da folha na planta. Estrelas e triângulos indicam plantas que foram cultivadas em um phytotron ou estufa, respectivamente. C. Sensibilidade de valores de capacidade de calor específico para alterações nos parâmetros de entrada. Triangles mostrar valores de capacidade de calor específicas resultantes de um aumento de 10% (vermelho, para cima) ou diminuição (azul, para baixo) nos parâmetros de um modelo único. D. Sensibilidade de valores de condutividade térmica para mudanças nos parâmetros de entrada. Triângulos marcar valores de sapato de condutividade térmica resultantes de um aumento de 10% (vermelho, para cima) ou diminuir (azul, para baixo) nos parâmetros de um modelo único. As barras de erro em A e B indicam o desvio padrão (n≥3), enquanto em C e D, que representam a gama completa de valores obtidos durante a análise de sensibilidade variação de 10%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cálculo da condutividade térmica

A condutividade térmica (ʎ) foi calculada a partir dos perfis de temperatura por exponencialencaixe (Figura 3), combinado com as equações para a transferência de calor condutivo e convectivo bem como radiação térmica. Equação 15 apresentaram valores médios de 0,49 ± 0,13 m J - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) para N. tabacum e 0,41 ± 0.20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) para N. benthamiana. Não houve correlação entre ʎ e idade da planta ou o ajuste de cultivo, embora uma correlação entre a idade da folha e ʎ foi observado para N. benthamiana (Figura 4B), concordando com as diferenças dependentes da idade previamente relatados em outras espécies de plantas 14. Como discutido acima, o teor de água era uma razão provável para esta diferença uma vez que se verificou ser homogéneo entre folhas de diferentes graus de maturidade para N. benthamiana. Em vez disso, especula-se que as mudanças no lEAF tecido, por exemplo, a composição da parede celular, são responsáveis por esta observação, alterando as propriedades de transferência de calor das folhas e, portanto, afectando o valor de ʎ. A determinação de ʎ era sensível a mudanças na temperatura ambiente. Uma análise de sensibilidade revelou que as flutuações de ± 2,3 K alterado o valor de ʎ por 64-125%. De acordo com a Equação 15, a temperatura ambiente tem um efeito pelo poder de quatro na radiação térmica e, portanto, afeta diretamente o valor de ʎ.

Avaliação do aparelho de medio

Foi possível configurar o conjunto de medição dentro de 3 h. Uma vez que esta foi concluída, o tempo de arranque do sistema foi de aproximadamente 15 minutos por série de medições. medições individuais levou menos de 3 min, incluindo a preparação da amostra e de todo o ciclo de medição. Análise do tempo de exposição ao laser revelaram que umatempo de aquecimento de 0,5 s resultou num aumento de temperatura de 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) foi o melhor compromisso entre a elevada AT (conseguido por pulsos de laser de comprimento) necessária para uma boa relação sinal-para-ruído (SNR) e a partir AT (conseguido por pulsos de laser de curta duração) necessária para evitar danos nos tecidos. durações de pulso mais longo do que 0,5 s, resultou na perda de massa da amostra, provavelmente reflectindo a evaporação de água e / ou danos ao tecido de folha como a temperatura da amostra atingiu-se a 70 ° C, enquanto que apenas 42,9 ± 4,2 ° C (n foram observadas = 55) durante 0,5 s pulsos de laser. Para períodos de menos do que 0,5 s, o ruído de temperatura de ± 0,31 K (desvio padrão, n = 25) foram responsáveis por mais de 5% de AT e foi, assim, uma parte significativa da AT. Em contraste, a 0,5 s do ruído era de apenas 2,5% do sinal e, assim, foi considerada insignificante. Além disso, as amostras não aquecer até mais de ~ 45 ° C, que éuma temperatura que plantas de tabaco também podem ser expostos no trópico natural habitat sub-trópicos e que só é prejudicial para espécies de plantas encontradas em habitats de tundra 15. A densidade de potência do laser foi de 170 kW m-2, enquanto que a radiação solar natural é tipicamente na gama de 1,0-1,4 kW 16,17 m -2. No entanto, devido ao curto espaço de tempo do pulso, esta dose de energia mais elevado que provavelmente não danificar o tecido da folha, tal como indicado por uma análise microscópica recentemente publicado em 11. Os dados de temperatura usados ​​para calcular ʎ foram restringidos aos primeiros 20 s, após o impulso de laser, porque só durante este período fez o ruído (± 0,31 K) representam menos de 5% do sinal de temperatura da amostra e foi, portanto, considerada insignificante. Quando foram utilizados dados de temperatura de além-20 s prazo, os valores calculados para ʎ diminuiu (Figura 3F). Uma explicação possível era que alguns dos pressupostosfeita para o cálculo do ʎ não se aplica para valores baixos de AT. Especialmente, o termo que descreve a radiação térmica na Equação 15, pode ter sido afectado dado que é afectada pela temperatura de alimentação por diante. Além disso, a área foliar em torno do local da amostra exposta ao laser pode ter aquecido ligeiramente e, portanto, pode não ter sido o dissipador de calor ideal assumida no modelo de redução do x AT eficaz e, finalmente, o ʎ calculado.

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Discussion

A, método de medição não destrutivo sem contacto descrito acima pode ser utilizado para determinar c p, s e ʎ de uma forma simultânea e reprodutível. O cálculo de ʎ em particular depende de vários parâmetros que são sensíveis a erros. No entanto, o impacto dos erros era linear ou sub-proporcional, e o coeficiente de variação para todos os parâmetros se verificou ser inferior a 10%. Embora o método pode, assim, ser considerada como robusta, algumas melhorias técnicas podem ser feitas para reduzir as restantes fontes de erro.

Montagem da amostra para a montagem era tecnicamente desafiador, porque uma superfície lisa da folha é preferível para medição, mas a amostra, naturalmente, tem uma superfície ondulante. Este problema poderia ser superado através da concepção de um suporte de amostras dedicado com geometrias precisamente ajustados à amostra de folha, por exemplo, espessura e largura da folha, fixação da amostra na preferênciaorientação capaz. Esta abordagem permitiria fazer as medições mais reprodutível, mas comprometeria a natureza sem contacto da medição porque firme contato entre a amostra e titular seria necessária para puxar o plano da superfície da folha. As vantagens da utilização deste tipo de suporte, portanto, dependerá do contexto da medição, isto é, se a natureza precisão ou sem contacto da medição é mais importante. Em contraste, estas considerações podem não ser necessários em todos para folhas com uma superfície plana inerentemente, por exemplo, arroz e espécies relacionadas.

Transferência de calor por convecção devido à circulação de ar no ambiente da amostra deve ser mantido a um mínimo durante as medições porque isto afecta fortemente o cálculo do Índice de C p, s e ʎ 18. O aparelho deve estar localizado longe de correntes de ar geradas por sistemas de ar condicionado, aquecedores ou outros equipamentos, como computador comventoinhas de arrefecimento integral. Isso também é importante porque as mudanças no conteúdo relativo de água das folhas 19 que podem ocorrer antes ou durante a medição devido à evaporação, que pode ser aumentada por movimentos de ar 20, não foram contabilizados no modelo. Assim, as medições, especialmente com folhas destacadas, deve ser efectuado rapidamente, tal como descrito na secção de protocolo para evitar erros durante a aquisição de dados. No futuro, os efeitos da evaporação sobre a medição pode ser reduzida ou evitada, se a medição é realizada numa câmara de medição, pelo menos, parcialmente fechado com um controlo de humidade implementado.

A precisão de C p, s e valores ʎ pode ser aumentada através da medição dos parâmetros utilizados nas equações correspondentes mais precisamente. No caso de C p, s estes parâmetros são a potência do laser, o volume máximo e a temperatura ambiente e de amostra, ou seja, o produto de Laser área do ponto e da espessura e densidade da amostra (Equação 8). Os dois últimos parâmetros devem ser determinados em experiências de acompanhamento a medição real e a sua fiabilidade pode ser melhorada se várias réplicas biológicas representativas são testados. No entanto, mesmo quando uma medição de calibre ligação simples foi usada, a diferença na espessura da folha em comparação com uma análise microscópica foi de apenas 11%, o que afectou os valores calculados para C p, s e ʎ no mesmo grau. Em contraste, as temperaturas e a potência do laser pode ser monitorizada ao longo da medição. A precisão de C p, s pode ser melhorada se estes dados online são usados em vez de valores fixados para potência do laser e da temperatura ambiente, e os dados são recolhidos usando sensores bem calibrado. Estas considerações também se aplicam a ʎ, mas o ambiente e temperaturas de amostra são os parâmetros mais importantes, pois ambos afetam o valor calculado pelo poder de quatro.

O cálculo atual de ʎ foi baseada em várias suposições relativas à transferência de calor por convecção e radiação térmica. Por exemplo, a emissividade (ε) e o coeficiente de transferência de calor por convecção (h) não foram medidos ou calculados explicitamente no método acima descrito, mas foram derivadas a partir das publicações anteriores 18,21. A precisão de ʎ podia, portanto, ser melhorada por meio da determinação destes dois parâmetros sob as condições de medição reais. No entanto, utilizando os dados da literatura para os cálculos, no entanto, resultou em valores de ʎ que estavam dentro da gama determinada experimentalmente para outras espécies de plantas para as quais propriedades semelhantes podem ser esperados, devido à sua filogenia de espécies de Nicotiana e sua fisiologia, ou seja, plantas herbáceas 3. Mesmo se os valores para ε e H foram variadas ao longo de toda a gama anteriormente relatados para estes valores em plantas, por exemplo, para ε 0,93-0,98 21, o seu efeito sobre o valor final de ʎ era <10% e, portanto, dentro da variação natural aqui observado.

O método apresentado acima não só foi capaz de determinar as propriedades térmicas de folhas ileso intactas e folhas destacadas, mas também identificou corretamente diferentes tipos de danos mais graves introduzidas intencionalmente antes da medição. Por conseguinte, diferentes tipos de amostras de folhas pode ser prontamente distinguido, proporcionando uma ferramenta para remover, antes da análise, as amostras pobres que produzem dados de baixa qualidade. Este recurso pode ser usado para controle de qualidade durante o monitoramento materiais biológicos, por exemplo, as amostras não cumprir as especificações em termos de c p, s e ʎ poderia ser excluído do processamento posterior. Esta seria uma mais-valia no contexto de um processo altamente regulamentados, como agricultura molecular 4.

As vantagens deste novo método de comparação com outrosa literatura incluem a manipulação rápida da amostra, o mínimo de preparação, medição simultânea e não destrutivo sem contacto de C p, s e ʎ, e a utilização de equipamento comum que pode ser encontrado em muitos laboratórios ópticos. Isto irá facilitar a aplicações mais amplas do método em comparação com aqueles que requerem dispositivos especializados e onerosos tais como calorímetro de varrimento diferencial. Além disso, a calorimetria requer o contacto directo com a amostra 22, de modo que há um risco de danos, e o método é geralmente limitado à medição da capacidade de calor específica de 22. Em contraste, enquanto que as imagens térmicas pode detectar necrose ou mudanças físicas em folhas ou plantas inteiras de uma maneira sem contacto 23, também requer análise de imagem complexa e dispositivos especializados dedicados 24, que pode ser superada no futuro por câmeras de infravermelho mais baratos e mais poderosos e que acompanham os dispositivos periféricos. A análise espectral é outro contato-frEE método para a análise do teor de água e os níveis de clorofila 25, mas que ainda não tenha sido usado para determinar a capacidade de calor específico e / ou a condutividade térmica.

O método de medição aqui relatado é um método robusto para determinar as propriedades térmicas das folhas das plantas com baixos custos de investimento e tempos de medição curtos. Foi utilizado com sucesso para determinar c P, S e N. tabacum ʎ em N. benthamiana e, duas espécies que são relevantes no domínio da agricultura molecular 4. Os valores calculados para ambos os parâmetros com base nos perfis de temperatura da folha estavam em boa concordância com aqueles previamente relatados para outras espécies de plantas 3. O método é não-destrutivo, sem contacto, e não necessita de preparação de amostras complexas, proporcionando vantagens sobre todos os métodos alternativos atuais para a análise das propriedades térmicas. O design simples também podem facilitar o desenvolvimento de mão-heldispositivos d para aumentar a flexibilidade.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" tube Thorlabs SM1L10E Tube for fiber holder
Agarose Sigma Aldrich A0701 Agarose
Bi-Convex lense f=25.4 Thorlabs LB1761 Lense
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console Thorlabs PM100D Console for thermal surface absorber sensor
Digital Phosphor Oscilloscope  Tektronix DPO7104 Oscilloscope
DMR light microscope Leica n.a. Light microscope
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-2 Pycnometer
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Fiber holder Thorlabs Fiber holder
Forma -86 °C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Infrared Detector Optris CT Optris OPTCTLT15 Infrared detector
Infrared Detector Software Compact Connect Optris n.a. Control software for infrared detector
Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer PerkinElmer L1050 UV/VIS Spectrophotometer
Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module DILAS M1F-SS2.1 Laser
Laser cover Amtron LM200 Laser Cover
Laser Driver  Amtron CS 408 Laser Driver
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Photodiode sensor  Thorlabs PDA20H-EC Power sensor for transmission measurements
Precision weight Ohaus Analytical Plus Ohaus 80251552 Precision weight
Sample frame Fraunhofer ILT n.a. Fixation of the leaf sample
Software Pyro Control Amtron n.a. Laser Power Control Software
Stainless-steel-holder n.a. n.a. Holder for measurement set-up
Teflon plates 2 cm Fraunhofer ILT n.a. Teflon attenuation
Thermal surface absorber Power sensor Thorlabs S314C Sensor for laser power measurements
Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome
Zoc/Pro 6.51  EmTec Innovative Software n.a. Laser Control Software 

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References

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