Un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de Propiedades Térmicas

Biochemistry

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Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Wehner, M. A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties. J. Vis. Exp. (119), e54835, doi:10.3791/54835 (2017).

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Abstract

Las plantas pueden producir sustancias valiosas tales como metabolitos secundarios y proteínas recombinantes. La purificación de este último a partir de biomasa de la planta puede ser simplificado mediante el tratamiento de calor (escaldado). Un aparato de escaldado se puede diseñar con más precisión si las propiedades térmicas de las hojas se conocen en detalle, es decir, la capacidad de calor específico y conductividad térmica. La medición de estas propiedades es mucho tiempo y mucha mano de obra, y por lo general requiere métodos invasivos que entran en contacto la muestra directamente. Esto puede reducir el rendimiento del producto y puede ser incompatible con los requisitos de contención, por ejemplo, en el contexto de buenas prácticas de fabricación. Para abordar estos problemas, un método no invasivo, sin contacto fue desarrollado que determina la capacidad de calor específico y la conductividad térmica de una hoja de la planta intacta en aproximadamente un minuto. El método implica la aplicación de un pulso de láser corto de la longitud y la intensidad se define a una pequeña área de lamuestra de hoja, causando un aumento de la temperatura que se mide usando un sensor de infrarrojo cercano. El aumento de temperatura se combina con conocidas propiedades de la hoja (espesor y densidad) para determinar la capacidad de calor específico. La conductividad térmica se calcula entonces basándose en el perfil de la disminución de la temperatura posterior, teniendo la radiación térmica y la transferencia de calor por convección en cuenta. Se discuten los cálculos asociados y aspectos críticos de la manipulación de las muestras.

Introduction

El procesamiento a gran escala de materiales biológicos a menudo requiere pasos de tratamiento térmico tales como la pasteurización. El equipo para tales procesos se puede diseñar con más precisión si las propiedades térmicas de los materiales biológicos están bien caracterizadas, incluyendo la capacidad específica de calor (c p, s) y la conductividad térmica (λ). Estos parámetros se pueden determinar fácilmente para líquidos, suspensiones y homogeneizados mediante calorimetría 1. Sin embargo, la medición de estos parámetros en muestras sólidas pueden ser de mano de obra, y a menudo requiere el contacto directo con la muestra o incluso su destrucción 2. Por ejemplo, las técnicas de fototérmicos requieren contacto directo entre la muestra y el detector 3. Estas limitaciones son aceptables durante el procesamiento de alimentos, pero son incompatibles con los procesos altamente regulados, tales como la producción de proteínas biofarmacéuticas en plantas en el contexto de las buenas prácticas de fabricación 4. yon este contexto, puede ser necesario repetir (por ejemplo, semanal) el seguimiento de las propiedades térmicas durante un período de siete semanas de crecimiento para las plantas individuales como una herramienta de control de calidad. Si una supervisión de este tipo requeriría y consumir una hoja para cada medición, no habría biomasa izquierda a procesar en el momento de la cosecha.

Además, utilizando únicamente piezas de hoja en lugar podría causar heridas a la planta y aumentar el riesgo de necrosis o infección por patógenos, de nuevo disminuyendo el rendimiento del proceso. La probabilidad de que la infección por patógenos también puede aumentar si se utiliza un método de contacto directo con la muestra, que induce el riesgo de que un lote entero de las plantas puede estar infectada por el contacto con un dispositivo sensor contaminada. Aspectos similares tienen que ser considerados para la supervisión de la planta destaca como la sequía, por ejemplo, en un contexto ecofisiológica. Por ejemplo, la pérdida de agua es a menudo controlado por un cambio en la biomasa fresca, lo que requiere un tre invasivaatment de las plantas que se investigan 5, por ejemplo, una hoja de disección. En lugar de ello, la determinación de la capacidad de calor específico, que depende del contenido de agua de una muestra, de una manera no invasiva como se ha descrito aquí, se puede utilizar como un parámetro sustituto para el estado de hidratación de las plantas. En ambos escenarios (producción farmacéutica y ecofisiología), tensiones artificiales inducidos por técnicas de medición destructivas o invasivos serían perjudiciales ya que pueden distorsionar los datos experimentales. Métodos de flash, por lo tanto, se informó anteriormente 6 o la colocación de muestras entre las placas de plata 7 no son adecuados para este tipo de procesos y experimentos, ya sea porque requieren contacto directo con la muestra o son destructivos. Los parámetros c p, s y λ deben determinarse con el fin de diseñar el equipo de proceso de una etapa de blanqueo que puede simplificar la purificación del producto y reducir así los costes de fabricación 8-10. tanto cp, s y λ ahora pueden determinarse rápidamente por láser sin contacto infrarrojo cercano no destructivo (NIR) de sondeo de una manera consistente y reproducible 11 y este nuevo método se explicarán en detalle a continuación. Los resultados obtenidos con este método se utilizaron con éxito para simular la transferencia de calor en las hojas de tabaco 12, lo que permite el diseño de equipos de procesamiento apropiada y la selección de los parámetros correspondientes tal como la temperatura de escaldado.

El método es fácil de configurar (Figura 1) y tiene dos fases, la medición y el análisis, cada una de las cuales comprende dos etapas principales. En la fase de medición, una muestra de hoja se calienta primero a nivel local por un pulso de láser corto y se registra la temperatura máxima de la muestra. El perfil de temperatura de la muestra se registra a continuación, para una duración de 50 s. En la fase de análisis, las propiedades de la hoja tales como la densidad (con facilidad y precisión determinados por measurem picnométricoent) se combinan con la temperatura máxima de la muestra para calcular c p, s. En el segundo paso, el perfil de temperatura de la hoja se utiliza como entrada para una ecuación de balance de energía, teniendo la conducción, convección y radiación en cuenta, para calcular λ.

Detalladas instrucciones paso a paso se proporcionan en la sección de protocolo, ampliando el contenido del video que lo acompaña. mediciones típicos se muestran a continuación en la sección de resultados. Por último, los beneficios y limitaciones del método se resaltan en la sección de discusión, junto con las posibles mejoras y nuevas aplicaciones.

Figura 1
Figura 1: Aparato utilizado para determinar las propiedades térmicas de las hojas. A. Fotografía del aparato de medición utilizado para determinar la capacidad de calor específico y la conductividad térmica de leAves. Los dispositivos periféricos (ordenadores, osciloscopio) no se muestran. B. Representación esquemática del aparato de medición. El láser y el equipo conectado están resaltados en rojo, el detector NIR para la medición de la temperatura se muestra en la púrpura, la muestra de la hoja es verde y el sensor de potencia fotodiodo es de color azul. C. Dibujo de los elementos de la configuración de la medición con el mismo código de color como en B. La barra indica el tamaño de 0,1 m. D. Captura de pantalla que ilustra los elementos típicos del software de control de láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. El cultivo de plantas y la preparación de muestras

  1. Enjuague cada bloque de lana mineral con 1-2 litros de agua desionizada y después con 1 l de 0,1% [m / v] solución de fertilizante. Coloque un tabaco (Nicotiana tabacum o N. benthamiana) semilla en cada bloque y suavemente a ras de 0,25 l de solución de fertilizante sin lavarse la descendencia.
  2. Cultivar las plantas durante 7 semanas en un invernadero o fitotron con un 70% de humedad relativa, un joven de 16 h de fotoperiodo (180 mol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) y un 25/22 ° C luz / oscuridad de temperatura régimen.
  3. Mover las plantas para el aparato de medición. Si las plantas son inmóviles hojas individuales, la cosecha de la medición de las propiedades térmicas.

2. Determinar la hoja de espesor y densidad

  1. Determine el espesor de la hoja
    1. Preparar una [v m /] solución 2% de agarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) yautoclave ella. Deje que la solución se enfríe a 40 ° C e incrustar una muestra de hoja se coloca en una placa de Petri. Solidificar la agarosa mediante la colocación de la placa de Petri en un refrigerador a 4 ° C durante 30 min.
    2. Cortar el bloque de agarosa en rodajas de 200 micras usando un vibratome con un ángulo de corte de cuchillas de afeitar de 15 °. Utilice una velocidad de corte de 1,0 mm s -1 y una amplitud de 0,5 mm.
    3. Monte cinco secciones de hoja transversal sobre un portaobjetos de vidrio utilizando cianoacrilato como fijador. Determine el espesor de la hoja con un microscopio con un objetivo de 20 aumentos y un ocular con aumento de 10x, usando las herramientas de medición incorporados en el software microscopio de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Determinar los espesores de las hojas en las áreas de muestra sin venas.
    5. Por otra parte, determinar el grosor de la hoja con una línea de vía en una zona libre de la vena de la lámina de la hoja. Asegúrese de que la línea de calibre se mantiene perpendicular al plano de la lámina de la hoja.
      CAUTION: cianoacrilato es un irritante de la piel y también puede pegar los dedos juntos si no se maneja con cuidado.
  2. Determinar la densidad de hojas
    1. Determinar la masa en vacío (m 0) de un picnómetro, luego llenarlo con agua y determinar la masa de nuevo (m 1). Secar por completo el picnómetro, colocar una hoja dentro y determinar la masa (m 2) una vez más. Con la hoja interior, llenar cuidadosamente el picnómetro con agua y determinar la masa (m 3).
    2. Calcular la densidad de hojas (Sal) utilizando la Ecuación 1.
      Ecuación 1: Ecuación

3. Determinar la transmisión espectral y Reflexión de las hojas

  1. Coloque una hoja en la cámara de muestras de un espectrofotómetro UV / VIS fijándolo entre las abrazaderas de sujeción de muestra. Para las mediciones de transmisión, colocar la hoja delante de la det ector. Para la reflexión mediciones colocan la hoja en la parte trasera de la cámara de detección.
  2. Poner en marcha el software de control espectrofotómetro. Seleccionar un espectro de 900 nm a 1600 nm. Iniciar una nueva exploración y registre los valores para la transmisión (T) y μ reflexión R) aparece en el software UV / VIS, en base a la curva espectral.
  3. Llevar a cabo todas las mediciones con al menos tres repeticiones biológica. Aumentar el número de repeticiones biológica a cinco o más si se puede esperar una calidad muestra heterogénea, es decir, la variación en la morfología de la superficie de la hoja y grosor.
  4. Calcular la potencia de transmisión (P T) y reflexión (P R) multiplicando los valores de R mu μ T medido o por el láser láser de potencia P medida de acuerdo con las Ecuaciones 2 y 3.
    Ecuación 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
    Ecuación 3: Ecuación
    NOTA: La transmisión puede ser también determinada con un sensor de fotodiodo durante la medición (véase 6.3).

4. La instalación del equipo de medición

  1. Montar una sola barra NIR diodo láser de fibra acoplada (longitud de onda = 1550 nm) en un cono de diámetro 25,4 mm sobre un soporte de acero inoxidable. Conectar un controlador para ajustar la potencia de salida (P láser) del láser NIR a 4-6 W.
  2. Colocar una lente biconvexa con una distancia focal de 25,4 mm en el extremo del cono para ajustar la anchura del haz de 13 mm.
  3. Colocar un sensor de potencia fotodiodo 354 mm por debajo de la parte inferior de la lente. Entonces atenuar el fotodiodo mediante la colocación de un filtro de densidad neutra con una densidad óptica de 1,0 y una capa de cerámica 22 mm por encima del sensor.
  4. Conectar el sensor de potencia fotodiodo a un osciloscopio con un cable coaxial.
  5. Conectarun marco de 10 x 10 cm que tiene un área de 6 cm de la muestra × 6 exposición con el andamio de la configuración de la medición a una altura de 308 mm por debajo de la lente (Figura 1). Fijar la posición de la hoja en el espacio montándolo en el marco de 10 x 10 cm.
  6. Conectar un detector NIR a un ordenador personal a través de un cable de bus serie universal (USB) e instalar el software de interfaz para el detector.
  7. Colocar el detector en un ángulo de 45 ° con respecto al haz de láser 135 mm por encima de la capa de cerámica. Alinear la zona de medición del detector al punto de láser en la muestra mediante la variación de la posición del sensor y el ángulo hasta que se observa la señal de la temperatura máxima.
  8. Utilice el software de interfaz de control de láser para ajustar la potencia del láser de salida a 5 W y la duración del pulso láser a 0,5 s. Seleccionar el comando "Control de corriente" en la ventana de opciones de control por debajo de la representación gráfica de la potencia del láser y ajustar la potencia del láser escribiendo "5" en el & #34; Potencia [W] ". Campo Ajuste la duración del pulso láser escribiendo" 0,5 "en el campo" Tiempo [s] ".
  9. Para determinar la potencia del láser absoluta para cada conjunto de experimentos, sustituir el sensor de potencia fotodiodo con un sensor de potencia de absorción de superficie térmica al final de cada conjunto de experimentos y medir la potencia de salida del láser durante 20 s sin una muestra.

5. Preparar las muestras de hojas

  1. Utilice hojas intactas y sin daños para las mediciones.
  2. Si es relevante para la investigación, imitar las formas de daño hoja típicos perforando la hoja con un bisturí, frotando la hoja entre los guantes de látex, la exposición de la hoja a una llama abierta o un rayo láser durante 2-3 s, o utilizar otras técnicas para simular otra tipos de daños.
  3. Colocar con cuidado pero rápidamente la muestra de hojas de muestra entre las abrazaderas de sujeción.

6. Tomar las mediciones de temperatura

  1. Evitar el contacto directo entre la hoja y la cerámicaatenuador colocado por encima del sensor de fotodiodo para evitar la transferencia de calor artificial que interfiera con el cálculo de c p, s y λ (véase la sección 9).
  2. Utilice el software de medición de la temperatura para recoger el perfil de temperatura de la muestra de la hoja para un total de 60 s a través del detector de NIR. En primer lugar, registrar la línea de base temperatura durante 10 s, a continuación, activar el láser durante 0,5 s y continuar la recogida de datos para el 49,5 s.
    1. Iniciar una medición haciendo clic en "medición" y luego "Nuevo medición". Luego haga clic en la flecha verde sobre la representación gráfica del perfil térmico. Guarde el perfil de temperatura haciendo clic en el icono "Guardar" (un disco estilizada) por encima de la representación gráfica del perfil.
  3. Confirmar la potencia del láser transmitida usando el sensor de potencia de fotodiodos mediante el cálculo de la diferencia de señal para mediciones con y sin una muestra de hoja usando un osciloscopio conectadoal sensor de potencia fotodiodo a través de un cable coaxial (Figura 2).
    1. Determinar la altura de los dos flancos (f 1, S y f 2, S) en el perfil de la tensión adquirida con el osciloscopio.
    2. Repita la medición sin una muestra de hoja como referencia (f 1,0 y f 2,0). Calcular transmisión μ T como la relación de estas medidas según la ecuación 4 (véase también la Figura 2).
      Ecuación 4: Ecuación

Figura 2
Figura 2: Medición de transmisión de la hoja utilizando un sensor de potencia fotodiodo. A. perfil de tensión típica para un experimento de referencia sin una muestra de hoja visualizado utilizando un osciloscopio. B. perfil de voltajecon una muestra de hoja montado en el aparato. En ambos casos, la potencia del láser transmitida es proporcional a cada uno de los dos flancos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Calcular la capacidad calorífica específica de la muestra de la hoja

  1. Calcular la máxima diferencia de temperatura? T [K] durante el pulso láser restando la temperatura ambiente T 0 [K] de la máxima temperatura de la hoja T ma x [K] (Ecuación 5).
    Ecuación 5: Ecuación
  2. Calcular la energía absorbida por una hoja (E S [J]) en base a la potencia del láser y el láser de duración de pulso efectiva (Ecuación 6), donde P R [W] es la potencia del láser reflejada y P T [W] es el láser transmitida poder.
    Equala 6: Ecuación
  3. Calcular la masa de la zona de la hoja calentada (m S [kg]) utilizando la Ecuación 7, donde d S [m] es el grosor de la hoja de acuerdo con 2.1), r Laser [m] es el radio del punto de láser, V S [ m 3] es el volumen de la hoja se calienta, y ρ S [kg m-3] es la densidad de hojas de acuerdo a 2.2).
    Ecuación 7: Ecuación
  4. Calcular c p, s [J kg -1 K -1] según la ecuación 8 dividiendo la energía absorbida E S por el producto de la climatizada área de la hoja de masa m S y la máxima diferencia de temperatura? T.
    Ecuación 8: Ecuación

8. Preparar los datos de temperatura del perfil de ThermCálculos al Conductividad

  1. Utilice el comando "Exportar" del software de control del sensor NIR para exportar los datos de tiempo y temperatura primas como un archivo * .dat y abra el archivo en un procesador de hoja de cálculo.
  2. Aplicar 1: reducción 100 de datos, por ejemplo, usando un "IF (MOD (Valor; 100) = 0;" x "," 0 ")" de comandos, que resulta en una densidad de datos de un punto de datos por 0,1 s.
  3. Calcular el promedio de línea de base temperatura T B [° C] para cada perfil de temperatura durante los 10 s iniciales de una medición, durante el cual el láser estaba todavía fuera. A continuación, calcular la diferencia entre T B y la temperatura ambiente real T 0 [° C].
  4. Utilizar esta diferencia para normalizar de forma individual cada perfil desplazando hacia T0 (y-normalización), por ejemplo, si T B - T 0 = 2.0 K, luego restar 2.0 K de cada valor de temperatura en la temperatura prRETR A TO (Figura 3A).
  5. Normalizar la coordenada de tiempo de cada perfil de temperatura (x-normalización) mediante la supresión de todos los puntos de datos antes de la temperatura máxima de la muestra (T max) y asignar nuevos valores de tiempo empezando con T = 0 para T max (Figura 3B).
  6. Pantalla de cada perfil para los cambios bruscos de temperatura, es decir, las diferencias de temperatura que son más de tres veces el nivel de ruido de línea de base, que suele ser de 3 x 0,31 K ≈ 1,0 K. Eliminar estas regiones del conjunto de datos, ya que corresponden a la medición artefactos (Figura 3C ).
  7. Montar una función de decaimiento exponencial (Ecuación 9) a los datos utilizando un procesador de hoja de cálculo, donde T t [K] es la temperatura ajustada muestra de hojas en el tiempo t [s], T0 es la temperatura ambiente, A [K] es la amplitud y t 1 [s] la constante de desintegración (Figura3D).
    Ecuación 9: Ecuación
  8. Utilice la función equipada para calcular la disminución de temperatura en la muestra de hoja de 0-80 s después del pulso láser.
  9. Transformar los datos de temperatura medidos en [° C] a la escala [K] mediante la adición de un valor de 273,15 a cada punto de datos de temperatura (Figura 3E).

figura 3
Figura 3: esquema de procesamiento de datos para el cálculo de λ. A. Después de la reducción de datos, los perfiles de temperatura se normalizan a la temperatura ambiente. B. A continuación, todos los puntos de datos antes de la máxima temperatura de la muestra (Tmax) se quitan. C. artefactos de medición (se muestra en el conjunto de datos "incompatibles") están identificados en función de la temperatura cambia más grande que THree veces el ruido de línea de base y se retira del conjunto de datos antes de su colocación a una función exponencial. D. La escala de temperatura Celsius se convierte en la escala Kelvin. E. Para cada intervalo de tiempo, λ se calcula basándose en el perfil de temperatura. F. Una ventana de 20 s se define en el que un cambio de temperatura correspondiente se puede observar. G. Sobre la base de la ventana de tiempo seleccionada, la media y la desviación estándar se calculan para λ. H. Los resultados representativos para dos muestras de hojas de N. tabacum diferente. flechas y líneas de color naranja indican el efecto de la etapa de procesamiento correspondiente en los datos presentados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Cálculo de la conductividad térmica de la muestra de hojas

  1. Calcular la temperatura differena vez que entre la muestra de la hoja y el medio ambiente, por cada 0,1-s intervalo de acuerdo con la Ecuación 10, donde? T x [K] es la diferencia de temperatura, T t [° C] es la temperatura de la muestra de la hoja equipada y T 0 [° C] del temperatura ambiente (Figura 3E).
    Ecuación 10: Ecuación
  2. Supongamos que la disminución de la temperatura se debe al efecto combinado de la transferencia de calor por convección, radiación térmica y conducción térmica. Utilice el equilibrio de energía correspondiente (Ecuación 11) como base para el cálculo de λ, donde Temp de? E [J] es la diferencia en la energía térmica de la muestra en dos puntos de tiempo consecutivos,? E rad [J] es la diferencia de energía debido a la radiación térmica, conv? e [J] es la diferencia de energía debido a la transferencia de calor por convección, y Δ; E cond [J] es la diferencia de energía debido a la conducción térmica.
    Ecuación 11: Ecuación
  3. Sustituir los términos generales en el balance energético con las propiedades físicas reales que producen la Ecuación 12, donde t? T [K] es la diferencia en la temperatura de la muestra de la hoja equipada, ε la emisividad sin unidades, σ [kg s -3 -4 K] la ley de Stefan -Boltzmann constante, A rad [m 2] el área de radiación térmica, h [J s -1 m -2 K -1] el coeficiente de transferencia de calor por convección, una conv [m 2] el ámbito de la transferencia de calor por convección, un cond [m 2] el ámbito de la conducción térmica y l [m] la longitud característica.
    Ecuación 12:
    Ecuación
  4. Calcular la characteristic longitud l basado en la correlación: l = V / A.
  5. Utilice el volumen de la muestra se calienta V S y el área de sección transversal de la muestra de la hoja para calcular A [m 2]. El área de la hoja de la sección transversal corresponde a un cond acuerdo con la Ecuación 13, en la que A cond es el área donde se produce la conducción, r láser es el radio del punto de láser y d s es el espesor de la hoja.
    Ecuación 13: Ecuación
  6. Calcular un rad y A conv acuerdo con la Ecuación 14, donde un láser es el área del punto de láser.
    Ecuación 14: Ecuación
  7. Ecuaciones de sustitución 9, 12 y 13 en la Ecuación 11 y resolver el último, de λ, obteniéndose la ecuación 15 en la que t es t Laserque la duración del pulso láser [s].
    Ecuación 15:
    Ecuación
  8. Supongamos que un valor de 0,94 para ε y calcular λ para cada intervalo de 0,1-s de tiempo durante los primeros 20 s del perfil de temperatura. La media de los 200 valores de λ obtenido de esta manera y el cálculo de la desviación estándar (Figura 3F - H).

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Representative Results

Medición de las propiedades de la hoja

Utilizando el método microscópico anteriormente, un espesor de hoja de 0,22 hasta 0,29 × 10-3 m se determinó tanto para N. tabacum (0,25 ± 0,04 × 10-3 m, n = 33) y N. benthamiana (0,26 ± 0,02 × 10 - 3 m, n = 24), que está bien dentro de la 0,20-,33 × 10 - m rango 3 se informó anteriormente para las hojas de varias especies de plantas 3. 3 m (n = 10), que fue dentro de una desviación estándar de los resultados de la medición microscópica - Determinar el espesor con una línea de calibre valores de ~ 0,28 × 10 produjo. Por lo tanto, la medición de línea de calibre puede ser preferido sobre el método para la determinación microscópica espesor en aplicaciones de rutina, ya que era más fácil de aplicar ylos resultados para c p, s y ʎ desviaron menos de 10% a partir de la técnica de más mano de obra. La densidad de N. tabacum y N. benthamiana hojas fue de 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), que coincide con el 631 a 918 kg m - 3 rango ya se ha informado de hojas en otras especies 3.

Cálculo de la capacidad de calor específico

Los perfiles de temperatura recogidos para las especies de Nicotiana mostraron un rápido incremento en el tiempo del impulso de láser hasta que la temperatura máxima (T max) se alcanzó en menos de 1 s. Después del pulso, la temperatura disminuyó exponencialmente hasta que alcanzó la temperatura ambiente (T 0) (Figura 3A - E). La capacidad de calor específico (c P, S kg-1 K-1 de N. tabacum y 2.252 ± 285 J kg-1 K-1 de N. benthamiana. Dos configuraciones de cultivo y duraciones se utilizaron para cada especies (ver sección 1.2), pero esto no afectó c p, s (Figura 4). Sin embargo, los valores de la c p, s disminuyeron linealmente desde la edad (inferior) a (arriba) las hojas jóvenes (R 2 = 0,85) en el caso de N. tabacum (Figura 4A), lo que se correlaciona con el contenido de agua [gg -1 biomasa] que había sido determinada como la diferencia de biomasa húmeda en el momento de la cosecha y la masa después de 72 h de incubación a 60 ° C 11. Esta correlación entre el contenido de agua y la capacidad de calor específico estaba de acuerdo con observaciones anteriores por otros autores 13. Se observó una correlación inversa para N. benthamiana (R2 = 0,79), donde la diferencia entre las capacidades caloríficas específicas de hojas de diferentes grados de madurez (= parte inferior de edad; top = joven) eran sólo el 13% comparado con el 21% de N. tabacum. Esta diferencia puede originar en el hecho de que el contenido de agua en hojas de N. benthamiana es casi constante en los diferentes grados de maduración de la hoja 11. Un análisis de sensibilidad reveló que las diferencias en c p, s eran proporcionales a las fluctuaciones de los parámetros de medición en la Ecuación 8. El efecto de la reflejada y la potencia del láser transmitida fue sub-proporcional, ya que estos parámetros no fueron factores individuales en la Ecuación 7. En consecuencia, el efecto de los errores en estos dos parámetros era más pequeña que las causadas por las fluctuaciones en la potencia del láser o la temperatura ambiente. En general, la medición se considera que es robusto porque todos los parámetros que intervienen en el cálculo de c p, s tenían un coeficientevariación de menos del 10% (Figura 4C y D).

Figura 4
Figura 4: capacidad de calor específico y conductividad térmica valores determinados para N. tabacum y N. benthamiana. A. Capacidad de calor específico y conductividad térmica de N. tabacum hojas de acuerdo con la posición de la hoja de la planta (hojas inferiores = viejos; media = hojas maduras; top = hojas jóvenes). Estrellas y triángulos indican plantas que eran 49 y 56 días de edad, respectivamente. B. Capacidad de calor específico y la conductividad térmica de N. benthamiana hojas de acuerdo con la posición de la hoja en la planta. Estrellas y triángulos indican las plantas que fueron cultivadas en un invernadero o fitotron, respectivamente. C. La sensibilidad de los valores de capacidad de calor específico a los cambios en los parámetros de entrada. Triangles muestran los valores de capacidad calorífica específicos resultantes de un aumento del 10% (rojo, hacia arriba) o disminución (azul, a la baja) en los parámetros del modelo individuales. D. La sensibilidad de los valores de conductividad térmica a los cambios en los parámetros de entrada. Triángulos marcan los valores de conductividad térmica de calzado resultantes de un aumento del 10% (rojo, hacia arriba) o disminución (azul, a la baja) en los parámetros del modelo individuales. Las barras de error en A y B indican la desviación estándar (n≥3), mientras que en C y D que representan la gama completa de valores obtenidos durante el análisis de sensibilidad variación 10%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cálculo de la conductividad térmica

La conductividad térmica (ʎ) se calculó a partir de los perfiles de temperatura por exponencialapropiado (Figura 3), combinada con ecuaciones de transferencia de calor por conducción y convección, así como la radiación térmica. Ecuación 15 dio valores medios de 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) para N. tabacum y 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) para N. benthamiana. No hubo correlación entre ʎ y edad de la planta o el ajuste de cultivo, aunque se observó una correlación entre la edad de la hoja y ʎ de N. benthamiana (Figura 4B), de acuerdo con informes anteriores diferencias dependientes de la edad en otras especies de plantas 14. Como se discutió anteriormente, el contenido de agua fue una razón probable de esta diferencia, ya que se encontró que era homogéneo a través de hojas de diversa madurez de N. benthamiana. En lugar de ello, se especula que los cambios en la ltejido EAF, por ejemplo, la composición de la pared celular, fueron responsables de esta observación mediante la alteración de las propiedades de transferencia de calor de las hojas y por lo tanto afectan al valor de ʎ. La determinación de ʎ era sensible a los cambios en la temperatura ambiente. Un análisis de sensibilidad reveló que las fluctuaciones de ± 2,3 K alteran el valor de ʎ por 64 a 125%. De acuerdo con la ecuación 15, la temperatura ambiente puede afectar por el poder de cuatro en la radiación térmica y por lo tanto afecta directamente el valor de ʎ.

Evaluación del aparato de medición

Fue posible establecer el conjunto de medición a menos de 3 h. Una vez que esto se completa, el tiempo de arranque del sistema fue de aproximadamente 15 min por series de mediciones. Mediciones individuales tuvieron menos de 3 min, incluyendo la preparación de la muestra y todo el ciclo de medición. Análisis del tiempo de exposición láser reveló que unatiempo de calentamiento de 0,5 s dio como resultado un aumento de temperatura de 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) fue el mejor compromiso entre la alta Delta T (logrado por pulsos de láser de largo) requerida para una buena relación señal-ruido (SNR) y el bajo Delta T (logrado por pulsos de láser cortos) necesario para evitar daños en los tejidos. duraciones de pulso más largas de 0,5 s dio lugar a la pérdida de masa de la muestra, lo que probablemente refleja la evaporación de agua y / o daños en el tejido de la hoja como la temperatura de la muestra alcanzado hasta 70 ° C, mientras que sólo el 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) fueron observados durante 0,5 s pulsos láser. Para duraciones de menos de 0,5 s, el ruido de temperatura de ± 0,31 K (desviación estándar, n = 25) representaron más del 5% de DT y era por lo tanto una parte importante de DT. Por el contrario, en 0,5 s el ruido representaron solamente el 2,5% de la señal y por lo tanto se consideró como insignificante. Además, las muestras no se calientan a más de ~ 45 ° C, que esuna temperatura que las plantas de tabaco también pueden estar expuestos en el trópico hábitat natural a la sub-trópico y que sólo es perjudicial para las especies de plantas que se encuentran en los hábitats de la tundra 15. La densidad de potencia del láser fue de 170 kW m -2, mientras que la radiación solar natural es típicamente en el intervalo de 1,0 a 1,4 kW m -2 16,17. Sin embargo, debido a la muy poco tiempo del pulso, esta dosis de energía más alto no probablemente no dañar el tejido de la hoja como se indica mediante un análisis microscópico recientemente publicado 11. Los datos de temperatura utilizados para calcular ʎ estaban restringidos a los primeros 20 s después del pulso de láser, ya que sólo durante este período hizo el ruido (± 0,31 K) representan menos del 5% de la señal de temperatura de la muestra y por lo tanto fue considerada como insignificante. Cuando se utilizaron los datos de temperatura de más allá de los 20 s marco de tiempo, los valores calculados para ʎ disminuyeron (Figura 3F). Una posible explicación es que algunos de los supuestoshecho para el cálculo de ʎ no era aplicable para valores bajos de DT. Especialmente, el término que describe la radiación térmica en la Ecuación 15 podría haber sido afectada, ya que se ve afectada por la cuarta potencia de la temperatura. Además, la zona de la hoja que rodea el punto de la muestra expuesta al láser podría haber calentado un poco y por lo tanto no podría haber sido el disipador de calor ideales asumida en el modelo de reducción de la DT efectiva x y en última instancia la ʎ calculado.

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Discussion

El método de medición sin contacto, no destructivo descrito anteriormente se puede utilizar para determinar c p, s y ʎ de una manera simultánea y reproducible. El cálculo de ʎ, en particular, depende de varios parámetros que son sensibles a los errores. Sin embargo, el impacto de estos errores se encontró era lineal o sub-proporcional, y el coeficiente de variación para todos los parámetros a ser inferior a 10%. A pesar de que el método por lo tanto puede ser considerado como robusta, algunas mejoras técnicas se pueden hacer para reducir las fuentes restantes de error.

Montaje de la muestra en el conjunto era técnicamente difícil porque una superficie de la hoja plana es preferible para la medición de la muestra, pero, naturalmente, tiene una superficie ondulada. Este problema podría superarse mediante el diseño de un soporte de muestras dedicado con geometrías ajustados con precisión a la muestra de la hoja, por ejemplo, el espesor y ancho de la hoja, la sujeción de la muestra en el preferirorientación poder. Este enfoque sería hacer las mediciones más reproducibles, pero pondría en peligro la naturaleza sin contacto de la medición debido a un contacto firme entre la muestra y el titular estaría obligado a tirar de la plana superficie de la hoja. Los beneficios de usar este tipo de soporte de por lo tanto dependen del contexto de la medición, es decir, si la naturaleza o precisión sin contacto de la medición es más importante. Por el contrario, estas consideraciones pueden no ser necesarios en absoluto para las hojas con una superficie inherentemente plana, por ejemplo, el arroz y especies relacionadas.

La transferencia de calor por convección, debido al movimiento del aire en el entorno de la muestra se debe mantener a un mínimo durante las mediciones, porque esto afecta fuertemente el cálculo de tanto c p, s y ʎ 18. Por tanto, el aparato debe estar colocado lejos de corrientes de aire generadas por los sistemas de aire acondicionado, radiadores u otros equipos, tales como computadora conventiladores de refrigeración integrales. Esto también es importante porque los cambios en el contenido relativo de agua de las hojas 19 que pueden ocurrir antes o durante la medición debido a la evaporación, que se puede aumentar mediante movimientos de aire 20, no se tuvieron en cuenta en el modelo. Por lo tanto, las mediciones, especialmente con hojas desprendidas, deben llevarse a cabo rápidamente como se describe en la sección de protocolo para evitar errores durante la adquisición de datos. En el futuro, los efectos de la evaporación en la medición pueden reducirse o evitarse si la medición se lleva a cabo en una cámara de medición, al menos parcialmente cerrado con un control de la humedad en práctica.

La precisión de c p, s y los valores ʎ se puede aumentar mediante la medición de los parámetros utilizados en las ecuaciones correspondientes con mayor precisión. En el caso de c P, S estos parámetros son la potencia del láser, el volumen máximo y la temperatura ambiente y la muestra, es decir, el producto de laser área de la mancha y el espesor y la densidad de la muestra (Ecuación 8). Los dos últimos parámetros deben determinarse en experimentos que acompañan a la medida real y su fiabilidad se pueden mejorar si se prueban varias réplicas biológicas representativas. Sin embargo, incluso cuando se utilizó una simple medición de línea de calibre, la diferencia de grosor de la hoja en comparación con un análisis microscópico fue sólo 11%, lo que afectó a los valores calculados para C p, s y ʎ por el mismo grado. Por el contrario, las temperaturas y la potencia del láser pueden ser monitorizados a lo largo de la medición. La precisión de c p, s se puede mejorar si se utilizan estos datos en línea en lugar de valores fijos para la potencia del láser y la temperatura ambiente, y los datos se recogieron usando sensores bien calibrados. Estas consideraciones también se aplican a ʎ, pero el ambiente y la temperatura de la muestra son los parámetros más importantes debido a que tanto afectan el valor calculado por el poder de cuatro.

El cálculo actual de ʎ se basa en varios supuestos relativos a la transferencia de calor por convección y radiación térmica. Por ejemplo, la emisividad (ε) y el coeficiente de transferencia de calor por convección (h) no se midieron o calcularon de manera explícita en el método presentado anteriormente, pero se obtuvieron de publicaciones anteriores 18,21. Por tanto, la exactitud de ʎ se podría mejorar mediante la determinación de estos dos parámetros en las condiciones de medición reales. Sin embargo, el uso de los datos de la literatura para los cálculos, sin embargo, dado los valores ʎ que estaban dentro del rango determinado experimentalmente para otras especies de plantas para las que se puede esperar propiedades similares debido a su filogenia de las especies de Nicotiana y su fisiología, es decir, plantas herbáceas 3. Incluso si los valores de ε y h se variaron en todo el rango informado anteriormente para estos valores en las plantas, por ejemplo, 0,93 a 0,98 para ε 21, su efecto sobre el valor final de ʎ era <10% y por lo tanto dentro de la variación natural observada aquí.

El método presentado no sólo fue capaz de determinar las propiedades térmicas de las hojas intactas y sin daños hojas desprendidas, sino que también identifica correctamente los diferentes tipos de daños más graves introducido intencionadamente antes de la medición. Por lo tanto, los diferentes tipos de muestras de hojas se pueden distinguir fácilmente, proporcionando una herramienta para extraer, antes del análisis, las muestras pobres que producen datos de baja calidad. Esta característica podría ser utilizado para el control de calidad en el seguimiento de los materiales biológicos, por ejemplo, muestras de no cumplir con las especificaciones en términos de c p, s y ʎ podrían ser excluidos de su procesamiento posterior. Esta sería una ventaja en el contexto de un proceso altamente reguladas como la agricultura molecular 4.

Las ventajas de este nuevo método en comparación con otros enla literatura incluyen la manipulación rápida de la muestra, un mínimo de preparación, medición simultánea y no destructiva sin contacto de c p, s y ʎ, y el uso de equipo común que se puede encontrar en muchos laboratorios ópticos. Esto facilitará aplicaciones más amplias del método en comparación con aquellos que requieren dispositivos especializados y costosos tales como calorímetros de exploración diferencial. Además, calorimetría requiere el contacto directo con la muestra 22 por lo que hay un riesgo de daño, y el método se limita generalmente a la medición de la capacidad de calor específico 22. Por el contrario, mientras que la termografía puede detectar necrosis o cambios físicos en hojas o plantas enteras de una manera sin contacto 23, sino que también requiere de análisis de imágenes complejas y dispositivos especializados dedicados 24, que podría ser superada en el futuro por las cámaras de infrarrojos más baratos y más potentes y acompañando a los dispositivos periféricos. El análisis espectral es otro contacto-frmétodo ee para el análisis de contenido de agua y los niveles de clorofila 25, pero aún no se ha utilizado para determinar la capacidad de calor específico y / o la conductividad térmica.

El enfoque de medición informado en el presente documento es un método robusto para determinar las propiedades térmicas de hojas de la planta con costes de inversión bajos y tiempos de medición cortos. Fue utilizado con éxito para determinar c p, s y ʎ en N. tabacum y N. benthamiana, dos especies que son relevantes en el ámbito de la agricultura molecular 4. Los valores calculados para ambos parámetros en base a los perfiles de temperatura de las hojas estaban en buena concordancia con los reportados previamente para otras especies de plantas 3. El método es no destructiva, sin contacto, y no requiere la preparación de la muestra compleja, proporcionando ventajas sobre todos los métodos alternativos actuales para el análisis de las propiedades térmicas. El diseño simple también puede facilitar el desarrollo de la mano-held dispositivos para aumentar la flexibilidad.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" tube Thorlabs SM1L10E Tube for fiber holder
Agarose Sigma Aldrich A0701 Agarose
Bi-Convex lense f=25.4 Thorlabs LB1761 Lense
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console Thorlabs PM100D Console for thermal surface absorber sensor
Digital Phosphor Oscilloscope  Tektronix DPO7104 Oscilloscope
DMR light microscope Leica n.a. Light microscope
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-2 Pycnometer
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Fiber holder Thorlabs Fiber holder
Forma -86 °C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Infrared Detector Optris CT Optris OPTCTLT15 Infrared detector
Infrared Detector Software Compact Connect Optris n.a. Control software for infrared detector
Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer PerkinElmer L1050 UV/VIS Spectrophotometer
Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module DILAS M1F-SS2.1 Laser
Laser cover Amtron LM200 Laser Cover
Laser Driver  Amtron CS 408 Laser Driver
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Photodiode sensor  Thorlabs PDA20H-EC Power sensor for transmission measurements
Precision weight Ohaus Analytical Plus Ohaus 80251552 Precision weight
Sample frame Fraunhofer ILT n.a. Fixation of the leaf sample
Software Pyro Control Amtron n.a. Laser Power Control Software
Stainless-steel-holder n.a. n.a. Holder for measurement set-up
Teflon plates 2 cm Fraunhofer ILT n.a. Teflon attenuation
Thermal surface absorber Power sensor Thorlabs S314C Sensor for laser power measurements
Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome
Zoc/Pro 6.51  EmTec Innovative Software n.a. Laser Control Software 

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References

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