接合交配测定在接合介入转移蛋白的序列特异性分析

Genetics

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Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).

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Abstract

Introduction

基因和蛋白质的在微观有机体水平转移起着细菌生存和进化以及感染过程的核心作用。的DNA在细菌之间或细菌和小区之间交换可以通过转化,接合或载体转导来实现。 1,2-共轭是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌之间缀合过程中的比较,以在转换和转导独特,DNA转移中的供体-控制的方式,由此复杂的高分子系统连接供体和受体细胞发生。偶联也是其中的细菌细胞与宿主细胞相互作用,以注入基因,蛋白质或化学品中的主机系统的最直接的方式。 3很多时候,这些药剂的转移在主机上拥有显着的效果,从发病机理和致癌主办进化和适应。它已经表明,共轭recombinatioN增加适应3倍的细菌具有高的突变率环境胁迫的条件下的速率。 4此外,缀合是迄今为止通过在细菌菌株的抗生素抗性基因被传播的最常见的途径。 5,6

微生物已经进化专门的分泌系统,以支持跨越细胞膜大分子的转移;目前有9种类型的革兰氏阴性细菌分泌系统(的TSS)的已经被描述:T1SS,T2SS,T3SS,T4SS,T5SS,T6SS,T7SS,以及上述Sec(分泌)和TAT(双精氨酸易位)通路。 7,8-每个型分泌系统的进一步分为不同的亚型,必然因蛋白质的多样性和所涉及的途径的独特性,在不同的细菌菌株。例如,在IV型分泌系统(T4SS),Ti和CAG系统便于执行传输而在F-质粒,R27一第二pKM101 T4SSs便于接合质粒转移。 7,9,10由生物体及其组成蛋白质组装各自的分泌系统和共享细胞内容与收件人或其周围环境的机制进行了详细的了解是有针对性的发展战略,以打击病原微生物的过程中的一个重要因素细胞感染。

以下在大肠杆菌中由莱德伯格&塔特姆,11初始识别接合大量的移动和接合质粒已被鉴定和表征。 12这种移动质粒显示出相当大的范围是尺寸(从1至200千碱基(kb的)),但是所有移动质粒含有一个relaxase,其识别传送(ORIT)从而使质粒的传输的起源。接合质粒进一步编码基因的功能性T4SS的装配以及一型四耦合蛋白。 12例如大肠杆菌的100 kb的˚F质粒编码33.3 KB转移(TRA)区域内的所有的共轭基因。 13时接合质粒转移有利于形成菌毛所有的蛋白质,交配对形成(MPF),DNA转移和排除功能的F质粒编码的TRA区域的基因。 10,14,15知识的显著体可用于接合T4SSs,但详细介绍了共轭蛋白质和复合物的结构研究只是最近变得可用。 16 - 28

为了组装工艺接合的全面视图,需要突变接合转移蛋白分析详细的结构研究的耦合。这可以通过接合交配试验来实现。为F质粒的TRA区域内编码的每个蛋白质起着的F -介导的共作用njugation;因此,敲除/缺失转印基因将废除细胞( 图1)的共轭的能力。而较小的移动质粒是更有利于标准的删除程序,对于较大接合质粒如F,基因敲除更容易通过同源重组,其中靶基因被替换为一个传送一个不同的抗生素抗性基因来实现的。在目前的协议中,我们采用同源重组,以取代在55 kb的质粒˚F衍生pOX38锝氯霉素乙酰转移酶(CAT)的兴趣转移基因; 29,30所得敲除质粒pOX38锝Δgene::厘米,有利于耐氯霉素中生长培养基的存在下(厘米)。供体细胞窝藏pOX38锝Δgene::厘米不能影响通过使用检测交配观察接合DNA转移/交配;一个pOX38锝Δgene::厘米施主小区的配合效率和正常RECIPient将减少,或者更多的时候,被废除。在pOX38锝Δgene::厘米质粒的接合转移可以通过一个小复苏质粒窝藏转移靶向基因来恢复。此恢复的质粒可以是一个能够提供组成型表达,如质粒pK184(pK184基因),31个或一个,只要该质粒正确靶向基因到细胞(细胞质或周质)内的正确位置提供了诱导型表达。因此,在这种新的供体之间的配合测定(窝藏pOX38锝Δgene::厘米+ pK184基因质粒) 和受体细胞,匹配效率有望恢复到接近一个正常的供受体匹配检测的。这个系统使得一个通过一系列pK184基因构建体(缺失或点突变)的产生来探测敲除基因的功能和测试每个构建体的还原pOX38锝Δgene::厘米窝藏的配合能力的能力供体细胞秒。

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Protocol

1.代DNA构建的

  1. 设计为低聚物靶基因的同源重组
    1. 设计单55-72 bp的正向寡聚物如下:(一)挑选同源该区域10-100碱基氯霉素乙酰转移酶基因的5'起始位点上游的DNA序列的19-32 bp的核苷酸序列在商业pBAD33质粒,32和(b)选择一个36-54 bp的核苷酸序列同源的区域10-150 bp的靶基因的5'起始位点下游 的兴趣
      1. 加入的核苷酸序列中的(a),从而得到单55-72长正向寡聚拾取的末端的3'拾取的(b)至5核苷酸序列的结束“。
    2. 设计单55-72 bp的反向寡聚物如下:(一)挑选同源该区域10-100碱基的DNA序列的19-32 bp的核苷酸序列的下游的3'在商业pBAD33质粒中氯霉素基因的末端,和(b)10-150碱基内选择3的上游的36-54 bp的核苷酸序列同源的区域“感兴趣的靶基因的端部位。
      1. 加入的核苷酸序列在采摘结束3'采摘(b)中的5核苷酸序列的结束“(一),使之成为单一的低聚物。
      2. 该低聚物复制到任何可用的生物信息学软件和转换序列为它的反向互补。这将给一个55-72 bp的反向低聚物。
    3. 使用任何可用的低聚分析仪程序,检查重组低聚物具有40%-60%之间的低发夹熔融温度(T M)低自我和异二聚体的Tm的GC含量。从任何首选生物技术公司订购合成和运输的引物。
  2. 从pBAD33 Cat盒(厘米的R扩增
  3. 以200rpm和37℃下振荡生长DH5α细胞窝藏pBAD33质粒在无菌LB培养基(LB)与20微克/毫升氯霉素(CM)的过夜(O / N,16-18高)的文化。
  4. 离心机6-8毫升在室温O / N培养,5000 xg离心3分钟。倒出上清液并使用质粒小量制备试剂盒( 材料表 )和制造商的协议从粒料提取pBAD33质粒。
  5. 做的pBAD33质粒DNA的消化通过将以下成给定的顺序的无菌管:双蒸水适当体积(DDH 2 O的),以50微升,pBAD33质粒1微克体积,5微升10X的最终体积AVAI限制性内切酶的酶反应缓冲液,和0.5微升(RE)。轻轻吹打混匀并让反应进行1小时,在37℃。热灭活反应在80 20分钟(分钟)C。在-20℃储存的样品为不超过24小时,再以减少粘性末端降解。
  6. 在一个250毫升锥形烧瓶中缓冲由混合1.2克琼脂糖用100mL 1×TAE的(; 20毫乙酸1mM EDTA的40毫摩尔Tris,pH值8.5)制备1.2%琼脂糖分离胶。热量和漩涡完全在微波炉中溶解。停止当液体开始沸腾,摇动烧瓶立即加热。
    1. 在室温下冷却3分钟在液体琼脂糖而旋转的,加入2微升10毫克/毫升溴化乙锭和涡流混合。倒入琼脂糖与井梳凝胶托盘,并允许它固化在室温下1小时。在4℃下储存的凝胶在1×TAE缓冲液2天。
  7. 混合每个RE消化从1.2.3吹打0.2倍体积的DNA样染料(每50微升反应染料的10微升)的。负载5μL的500微克/毫升DNA梯状到第一井和所有RE消化染料混合物的到另一个井的一garose凝胶。使用2-3井所有反应体积加载到凝胶上。
    1. 运行在1×TAE勉强浸没凝胶缓冲液,并在45-50 V(4.5-5伏/厘米),用于在凝胶电泳装置65分钟运行。
  8. 使用UV柜和无菌剃刀,迅速切断对应于CAT序列出凝胶,以减少DNA的UV曝光的2.8kb的带。提取使用凝胶提取试剂盒( 材料数据表 )按制造商的协议切出凝胶切片的DNA。
    注:请注意不要直接在紫外线暴露的皮肤和小心处理剃刀。
  9. 扩增使用包含突出端同源的基因序列,以允许同源重组在1.1设计引物通过聚合酶链反应(PCR)从1.2.6萃取CAT盒。 PCR反应是使用以下顺序的制造商的指导方针( 材料数据表 )设置在冰上:
    1. 成无菌PCR管中,添加的DDH 2的适当体积O操作50微升的最终体积,接着用10微升PCR缓冲液,10毫的dNTPs,10μM正向引物2.5微升,10μM反向引物2.5微升1微升从1.2.6 1-25纳克模板DNA和100​​单位/μLDNA聚合酶0.5μL。
    2. 设置一个带有相同的部件1.2.7.1但与模板DNA的异常的阴性对照。使用DDH 2 O的适当体积代替模板DNA。设置使用的模板DNA和已被证明在PCR反应中工作,如由制造商正控制提供的那些引物的阳性对照。
    3. 吹打轻轻混合所有的反应内容。
    4. 在98℃在98℃,20秒,延长每扩增子的碱基20号引物退火的初始变性30秒,变性的30个循环进行10秒72℃和一个:通过PCR,使用以下设置放大鳍人延伸在72℃10分钟。样品储存在-20ºC。
  10. 确认扩增通过琼脂糖凝胶电泳的正确大小(见1.2.4-1.2.5)通过使用每个反应的仅5微升。纯化使用PCR纯化试剂盒和制造商的协议的PCR扩增子。储存于-20ºC纯化DNA。
  • 该pK184基因质粒恢复
    1. 设计正向引物从5开始'端和朝向3将“按以下顺序端:(一)挑4个随机核苷酸为切割效率(腺嘌呤,胸腺嘧啶,鸟嘌呤和胞嘧啶的组合),附着的(b) EcoRI限制性酶(RE)的切割位点序列(GAATTC),接着(c)一种21-25 bp的核苷酸序列同源的目的基因,包括起始密码子的5'端。如果目标基因含有一个EcoRI位点,然后从pK184多克隆网站的另一个合适的RE。
    2. 在编码周质蛋白的基因的情况下,包括对RE位点和在正向引物的起始密码子之间的附加前导序列。
    3. 使用任何可用的低聚分析仪,检查引物有40%-60%之间的低自我和异二聚体的Tm的GC含量,低发夹Tm 。订购合成引物。
    4. 生长DY330R pOX38锝细胞的O / N培养在含有无菌的LB 10微克/毫升四环素(TC)与在32ºC和200rpm振荡。离心机6-8毫升在室温O / N培养,5000 xg离心3分钟。倒出上清,使用质粒小量制备试剂盒( 材料表 )和制造商的协议提取沉淀的质粒DNA。
    5. 使用pOX38锝作为模板(见1.2.7.1-1.2.7.3)从1.3.1-1.3.5扩增与引物感兴趣的全基因。
    6. 确认扩增通过琼脂糖凝胶电泳的正确大小(见1.2.4-1.2.5)通过使用每个反应的仅5微升。纯化使用PCR纯化试剂盒和制造商的方案扩增的DNA。储存于-20℃的纯化DNA。
    7. 做的市售pK184质粒DNA和扩增基因两者的双重消化(从1.3.7。),通过添加以下成给定的顺序的无菌管:DDH 2 O的适当的量,以50微升的最终体积,pK184质粒1微克体积,5微升10X酶反应缓冲液,并且每EcoRⅠ和HindⅢ的1微升。
      1. 轻轻吹打混合来进行反应1小时在37ºC。热灭活在80ºC20分钟的反应。在-20℃储存的样品为不超过24小时,再以减少粘性末端降解。
        注意:限制核酸酶的这里使用的类型取决于被工程化到在步骤1.3.1和1.3.2所述的引物的限制性核酸酶位点。
      2. 作为阳性对照,设立pK184质粒的单一消化通过制备如在1.3.8相同的反应,除了只的RE中的一个添加到反应管中。与两个单独的RE做到这一点。
    8. 使用协议1.2.4-1.2.5提取DNA双消化既pK184和基因的片段在1.2%琼脂糖凝胶上运行概要 根据感兴趣的步骤1.2.6。
    9. 3矢量:10×T4 DNA连接酶缓冲液中,1组成总100纳克的DNA的2微升:通过添加成分到无菌管中以下列顺序结扎基因插入到pK184载体插入(pK184:基因) 比,DDH 2 O的长达20μL的和1微升T4 DNA连接酶总体积。作为阴性对照,设立使用100ng的载体的无插入基因类似的反应。
      1. 轻轻混匀使用微量所有反应内容并在25℃下孵育30分钟。热灭活10分钟,将连接反应在65℃,然后放置在冰上。
    10. 在冰冷,添加pK184基因的15微升 从步骤连接反应在无菌1.5mL管中1.3.10至100μL的化学感受DH5α细胞。轻轻吹打混匀,并在冰上孵育10分钟。做为阴性对照样品是相同的。对于阳性对照,用20-100纳克作为pBAD33这样一个质粒,并将其转化为50DHαμL的细胞。
    11. 直接从冰转移样品到42℃水浴中,并孵育90秒。这提供了细胞的热休克,并允许他们摄取质粒DNA。
    12. 地方细胞回冰上另一5分钟,然后添加无菌LB的900微升孵育在37℃进行1小时,同时以125 rpm振摇。
    13. 分装在1.3.13每个连接反应的样品的100微升体积于含50微克/毫升卡那霉素(KM)的琼脂平板,并使用无菌吊具传播细胞。阳性对照板应该有适当的抗生素。保持无菌区,靠近火焰的工作。孵育板倒置,在37℃过夜。
    14. 使用无菌移液管或环,收获细胞的单个独特菌落并接种20毫升的无菌LB用50微克/毫升公里。保持无菌区,靠近火焰的工作。生长细胞O / N在37℃以200rpm振荡培养。
    15. 通过将O / N培养在无菌冷冻管无菌100%甘油(终50%体积/体积)的500微升500微升使转化DH5α细胞3-5甘油原液。存储在-80℃。
    16. 还离心机6-8毫升的O / N培养在室温下,5,000×g离心3分钟。倒出上清液并使用质粒小量制备试剂盒( 材料表 )和制造商的协议提取所述粒料的pK184基因恢复质粒。
  • pK184 - 基因 突变
    注意:设计用于缺失,插入和/或点突变的引物可以使用制造商的网上可用的工具很容易地产生。
    1. 通过挑选是同源的目的基因,包括起始密码子的5'端的18-32 bp的核苷酸序列,设计每一个正向引物。设计引物,使得每个正向引物退火前一个的30-180碱基下游,造成缺乏适当长度N-末端肽片段缺失突变体。
    2. 通过挑选是同源的,包括终止密码子感兴趣的基因的3'端的18-32 bp的核苷酸序列设计的反向引物。这种底漆复制到NY提供的生物信息学程序和序列转换成其反向互补。这是反向引物。
      1. 在编码周质蛋白的基因的情况下,设计反向引物是这样的基因的末端,并需要在周质中的蛋白质产物的正确定位的3'侧翼5的前导序列的结束“的反向互补。
    3. 使用任何可用的低聚分析仪程序,检查缺失引物有40%-60%之间的低发夹熔融温度(T M)低自我和异二聚体的Tm的GC含量。从任何可用的生物技术公司订购合成和运输的引物。
    4. 使用作为模板在1.3协议获得的pK184基因结构和1.2.7-1.2.8的指导方针,PCR扩增缺失构建与步骤1.4.1-1.4.3产生pK184基因扩增ΔX设计引物。商店扩增的DNA一至-20℃。
    5. 结扎使用任何可用的诱变试剂盒( 材料数据表 )扩增的构建体。
    6. 单独变换每个pK184基因ΔXligates成使用标准热休克协议(见1.3.11-1.3.13)化学感受DH5α细胞。
    7. 分装在1.4.12每个连接反应的样品的100微升体积于含50微克/毫升公里的琼脂平板,并使用无菌吊具传播细胞。保持无菌区,靠近火焰的工作。孵育板倒置,在37℃过夜。
    8. 使用无菌移液管或环,收获细胞的单个独特菌落并接种20毫升的无菌LB培养基用50微克/毫升公里。保持无菌区,靠近火焰的工作。生长细胞O / N在37℃以200rpm振荡培养。
    9. 使转化DH5α细胞3-5甘油股票混合的O / N培养用无菌100%甘油的500μL500μL(FINAL 50%体积/体积)的无菌冷冻管中。存储在-80℃。
    10. 离心机6-8毫升在室温O / N培养,5000 xg离心3分钟。倒出上清液并提取pK184 基因质粒ΔX使用质粒小量制备试剂盒( 材料表 )和制造商的协议从颗粒构建。在-20℃储存DNA。
  • 2.代pOX38锝Δgene的::厘米株

    1. DY330R pOX38锝Δgene::厘米击倒
      1. 制备DY330R pOX38锝细胞在10ml的无菌LB含有10微克/毫升锝的O / N培养。成长的文化O / N在32℃和200转。
      2. 做一个1:70的稀释O / N培养成20毫升新鲜无菌LB的生长在32℃的细胞,直到数中期(OD 600nm的 0.4-0.6)的增长。
      3. 转移10毫升培养物至无菌烧瓶中,并以150rpm在42℃孵育15分钟,在振荡水巴日。这将引起在DY330R重组特异性蛋白质的表达。
      4. 冷却在冰水浴中培养10分钟。制备电感受态细胞如下。
        1. 转移冷冻细胞进入预冷的锥形管和离心机在4000 XG 7分钟,4ºC。所有管和移液管在即将到来的步骤中使用应放置在4℃或冰上冷却。
        2. 除去上清液并在1mL冰冷的DDH 2 O中轻轻重悬细胞添加冰冷的DDH 2 O的另外30毫升
        3. 离心细胞(4000 xg离心7分钟,4℃),弃去上清液并再轻轻悬浮细胞在1mL冰冷的DDH 2 O的
        4. 转移悬浮细胞成预先冷却1.5毫升微量离心管并离心以15,000 xg离心1分钟,4ºC。
        5. 轻轻重悬浮沉淀在冰冷的DDH 2 O的和等分的200微升在50微升体积。 Electrocompetent的细胞可以被储存在-80℃下
      5. 添加从1.2扩增CAT盒的300毫微克到电感受DY330R pOX38锝细胞50μL的同时通过上下吹打在冰上混合,轻轻。重复使用未修饰的pBAD33质粒作为阳性对照此步骤。
      6. 转移细胞到预冷却的(-20℃)1毫米电穿孔杯中。电穿孔细胞在1.8千伏的时间常数为5.5毫秒,使用电穿孔。立即施加脉冲后,稀释细胞用1 SOC的毫升媒体并传送到一个新的微量离心管中。孵育所述细胞在32℃下2小时。
      7. 等份100μL的每个样品在含有10微克/毫升Tc和20微克/毫升Cm和散布使用无菌吊具琼脂平板。保持无菌区,靠近火焰的工作。孵育板倒置于32℃过夜以选择为成功的重组体。引入细胞中的CAT盒将进行同源重与感兴趣的基因组合,并创建DY330R pOX38锝Δgene::厘米(RIF R, R,厘米R)的克隆。
        注意:在42℃下产生电感受态细胞之前在32℃下生长DY330R细胞,用15分钟的诱导的例外步骤2.1.3,因为在高温下延长的生长是很重要的风险的细胞死亡是由于生产有毒产品负责DY330R重组功能L 操纵。 33,34
      8. 制备O / DY330R pOX38锝Δgene氮::厘米细胞通过收获细胞的单个独特菌落用无菌移液管或环,并接种20毫升的无菌LB培养基用10微克/毫升Tc和20微克/毫升厘米。保持无菌区,靠近火焰的工作。生长细胞O / N在32℃下以200rpm振荡。
      9. 建立从O / N 3-5甘油股票用无菌100%的GL 500μL混合O / N培养的500微升在无菌冷冻管ycerol(最终50%体积/体积)。存储在-80℃。
      10. 离心机6-8毫升在室温O / N培养,5000 xg离心3分钟。倒出上清液并提取pOX38锝Δgene::厘米 使用质粒小量制备试剂盒( 材料表 )和制造商的协议从粒料构造;储存纯化的DNA在-20℃。
      11. 执行使用XK1200细胞作为受体,以确认基因敲除结合的破坏按照协议3.1一个共轭匹配检测。
    2. DY330R pOX38锝Δgene::厘米+ pK184基因
      1. 通过电穿孔转化电感受DY330R pOX38锝Δgene::厘米细胞与pK184基因构建体的300毫微克按步骤2.1.4-2.1.7。所有选择培养基必须包含20微克/毫升Cm和50微克/毫升公里。孵育在32℃。在电穿孔的细胞回收质粒现在将恢复淘汰基因的功能在DY330R pOX38锝Δgene::厘米细胞。
      2. 制备O / DY330R pOX38锝Δgene氮::厘米+ pK184基因重组细胞通过收获的细胞的单个独特菌落用无菌移液管或环,并接种20毫升的无菌LB培养基用20微克/毫升厘米和50微克/毫升公里。保持无菌区,靠近火焰的工作。生长细胞O / N在32℃下以200rpm振荡。
      3. 通过将O / N培养在无菌冷冻管无菌100%甘油(终50%体积/体积)的500微升500微升使从O / N 3-5甘油原液。存储在-80℃。
      4. 同样是执行协议3.1生成XK1200 pOX38锝Δgene::厘米的重组细胞
    3. XK1200 pOX38锝Δgene::厘米+ pK184基因突变和
      1. 准备电感受态XK1200 pOX38锝Δgene::厘米细胞(从步骤2.2.4)。
      2. 分别电穿孔pK184基因或pK184基因突变质粒的300纳克成ELE 50微升ctrocompetent XK1200 pOX38锝Δgene::厘米细胞按步骤2.1.4-2.1.7。所有选择培养基应含有10微克/毫升萘啶酸(NAL),20微克/毫升厘米,和50微克/毫升Km和在37℃下培养。
      3. 制备O / XK1200 pOX38锝Δgene氮::厘米+ pK184基因重组细胞通过收获的细胞的单个独特菌落用无菌移液管或环,并接种有碘化钠,20微克/毫升20毫升的无菌LB培养基厘米和50微克/毫升公里。保持无菌区,靠近火焰的工作。生长细胞O / N在37℃以200rpm振荡培养。
      4. 通过将O / N培养在无菌冷冻管无菌100%甘油(终50%体积/体积)的500微升500微升使从O / N 3-5甘油原液。存储在-80℃。

    3.接合交配测定

    1. 接合交配产生XK1200 pOX38锝Δgene::厘米细胞
      1. 准备一个20毫升无菌LB O / N的小路DY330R pOX38锝Δgene的TURE ::厘米+ pK184-基因的细胞使用无菌移液管或环接种含有20微克/毫升Cm和50微克/毫升公里与甘油或单个菌落在一个20毫升的无菌LB琼脂平板上。在32℃生长以200rpm晃动。用10微克/毫升碘化钠制备用于XK1200细胞相同的20mL无菌LB,在37℃下生长。
      2. 使各培养物1:70稀释液分别在2mL无菌的LB具有相同的抗生素的内容;至100mM的终浓度添加葡萄糖至所有供体细胞。生长细胞,在37℃对数中期(OD 600 0.5-0.7)以200rpm摇动。
      3. 离心(4,000×g离心5分钟,4℃)以沉淀细胞,弃去上清液,用冷的无菌LB洗一次,以去除抗生素和悬浮细胞在2ml冷的无菌LB。
      4. 分装100微升每一种文化的到无菌LB培养基的800微升,并允许他们在32℃交配1小时无晃动。
      5. <李>涡旋的细胞30秒,以破坏交配对,并把它们在冰上10分钟,以防止进一步的配合。
      6. 分装100μL的细胞混合物的在含有10微克/毫升碘化钠和20微克/毫升厘米选择用于XK1200 pOX38锝Δgene::厘米细胞的琼脂平板。使用无菌吊具传播细胞。保持无菌区,靠近火焰的工作。培养板O / N在37℃上下颠倒。
      7. 收获了新的XK1200 pOX38锝Δ基因的单个菌落::厘米 使用无菌移液管或回路并在无菌的LB用20微克/毫升厘米,O / N生长在敲除菌株 37℃以200rpm振荡培养。通过将O / N培养在无菌冷冻管无菌100%甘油(终50%体积/体积)的500微升500微升使从O / N 3-5甘油原液。存储在-80℃。
        注意:现在将所得的细胞能够用于与pK184基因构建体(协议1.3和1.4),用于屁股改造制成主管咝声的基因及其突变体上的能力,以恢复在协议3.2接合转移。
    2. 共轭交配试验从XK1200捐助者MC4100收件人
      1. 准备XK1200 pOX38锝Δgene的O / N培养::厘米+ pK184基因 细胞在20ml无菌的LB用20微克/毫升厘米,50微克/毫升Km和MC4100细胞在5mL的LB用50微克/毫升链霉素(SM),使用的细胞从甘油或单菌落在琼脂平板上和无菌吸管或循环。生长在文化 37℃200rpm振荡。
      2. 使分别在2mL的无菌LB具有相同的抗生素从每个O / N培养1:70稀释液。至100mM的终浓度添加葡萄糖至所有供体细胞。生长细胞,在37℃对数中期(OD 600 0.5-0.7)以200rpm摇动。
      3. 离心(4,000×g离心5分钟,4℃)以沉淀细胞,弃去上清液,用冷的无菌LB洗一次,以去除antibio抽动,并在2毫升无菌冷LB中悬浮细胞
      4. 一式两份,分装100微升每一种文化到无菌LB培养基的800微升,并允许他们在37℃交配1小时无晃动。
      5. 涡旋单元30秒以破坏交配对,并把它们在冰上10分钟,以防止进一步的配合。
      6. 使用对数中期培养物从步骤3.2.2和新鲜无菌LB,从10 -2准备供体和受体细胞的6系列稀释到10 -7。
      7. 在每个含有10微克/毫升碘化钠,20微克/毫升Cm和50微克/毫升公里的琼脂板的两半,斑XK1200供体细胞的每个稀释的10μL的等分试样,作为示于图2。重复的收件人MC4100细胞在含有50微克/毫升的Sm琼脂平板稀释液。孵育板O / N在37℃。
      8. 从步骤3.2.5和新鲜无菌LB使用涡旋混合,准备稀释6(10 -2至10 -7 如图2选择用于转导MC4100 pOX38锝Δgene::厘米细胞。重复这两个重复的混合物。保持无菌区,靠近火焰的工作。孵育板O / N在37℃。
      9. 作为协议3.3描述确定每个构造的匹配效率。
      10. 重复此协议所有恢复质粒来评价一个特定的突变对结合效率的效果。
    3. 配合高效的计算
      1. 从相同的稀释斑点每个供体,受体和转导细胞对各自平板计数菌落数。
      2. 算收件人菌落来测试,会导致从具有比在该给定的稀释收件人大量转导的任何偏差。
      3. Calculate配合效率转导结合体菌落由供体的菌落数除以数。乘以100,以获得每100供体细胞的效率值。

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    Representative Results

    ˚F质粒驱动接合的过程中是一个协调的过程,涉及到的F质粒即组装一T4SS便于菌毛的合成和接合DNA转移的TRA区域内转移蛋白。蛋白质TRAF(GenBank登录#BAA97961;的UniProt编号P14497)所需的接合的F-菌毛形成。 10,14,35 - 37蛋白质包含一个C-末端硫氧还蛋白样结构域,但它不具有催化CXXC基序。 35,38虽然已预测到通过其N-末端结构域的TraH蛋白质相互作用,如图39的区域比其C-末端结构域更动态,37否则不被知道关于该蛋白质的结构特征。为了评估与结构研究的结合TRAF蛋白质的功能方面,我们首先通过同源击倒了TRAF基因上pOX38锝重组,产生在大肠杆菌 DY330R细胞pOX38锝ΔtraF::厘米质粒( 表1)。 33,34还产生来自TRAF特异性引物( 表2)的pK184-TRAF质粒以提供偶联的回收和使探测蛋白质的序列。所述pOX38锝ΔtraF::厘米质粒转移到XK1200单元40从DY330R细胞时pK184-TRAF 在反式提供了(转导10微克/毫升捺生长,10微克/毫升Tc和20微克/毫升厘米)表示是:(a)在pOx38锝ΔtraF::厘米TRAF淘汰赛提供了一种在框架的CAT盒,和(b),该pK184-TRAF可以恢复共轭的功能。

    采用采用XK1200 pOX38锝ΔtraF::厘米+ pK184-TRAFΔX的共轭匹配法37分析产生一系列的TRAF突变细胞和细胞MC4100 41分别为供体和受体。一个代表性突变体是TRAF 55-247( 表1)中,N末端缺失突变体,去除该蛋白质的区域的预测与TraH交互。当全长TRAF蛋白被提供给供体细胞,接合转移被恢复( 图2),同时提供空质粒pK184不( 见表3)。同样,当用质粒pK184-TRAF 55-247( 表3)设置在XK1200供体细胞接合功能没有恢复。这表明,该蛋白质的截短区域是接合装置内TRAF的功能是重要的,可能是通过与TraH相互作用,并提供了该蛋白质的区域为目标进行进一步突变分析。

    图1
    在反通过回收质粒(pK184基因)提供,以促进结合。所得pOX38锝Δgene::厘米质粒转移至XK1200应变(步骤2),用于使用交配测定用MC4100收件人(步骤3)的基因的进一步评估。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图2
    图2: ING检测,以评估结合靶基因的功能。供体和受体细胞大肠杆菌 XK1200 pOX38锝ΔtraF::分别厘米转化有pK184-TRAF和MC4100。由此产生的接合子(MC4100 pOX38锝ΔtraF::厘米)生长在含Sm和CM平板,说明接合功能成功恢复。实验一式两份在单一琼脂平板上,并连续稀释以计算恢复性基因的突变体( 表2)的配合效率使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

    细菌菌株/质粒 相关特性 选择性标记(S)† 参考
    菌株
    DY330R W3110ΔlacU169gal490λc1857Δ(CRO-的bioA)里夫- [R 里夫 33,34
    XK1200 F - lacΔU124Δ(NADA aroG加仑attλ生物的gyrA) NAL 40
    MC4100 araD139Δ(ARGF-LAC)U169 rpsL150 relA1 flbB3501 deoC1 ptsF25 rbsR 41
    向量和结构
    pBAD33 从对araBAD的下质粒表达厘米 32
    pK184 2.4 kb的克隆载体,P15A复制千米 31
    pK184-TRAF‡</ TD> ˚FTRAF从pOX38在pK184 千米 35
    pK184-TRAF 56-247 ˚FTRAF AA 56-247从pK184-TRAF 千米
    接合质粒
    pOX38锝 IncFI,茶+,RepFIA +,女,迷你-TN的F1 HindIII片段 29,30
    pOX38锝ΔtraF::厘米 pOX38锝与CAT插入TRAF 锝厘米 35
    †厘米,氯霉素;公里,卡那霉素;最终,萘啶酸;里夫,利福平; SM,链霉素; TC,四环素
    ‡所有TRAF构建包含19个残基的前导序列,以确保本地化的周质空间。

    表格1: 菌株和质粒 在这项研究中使用。

    构造 底漆*
    TRAF-CM-对于 5'- GATCGAGGCTGGCAGTGGTATAACGAGAAAATAAATCCGAAGGA - CTGTGACG GAAGATCACTTC -3'
    TRAF-CM-启 5'- TCTTCAGAAACGTTCAGGAACTGTTTTGCCAGGTCGTCCT - CTTATTCAGGCGT AGCACCAG -3'
    pK184-TRAF-对于 5'- GAATTC TTTTTT -3 TATGAATAAAGCATTACTGCCAC“
    pK184-TRAF-REV 5'- TTTTTT AAGCTT TAAAAATTGGGTTTAAAATCTTCAGAAA -3'
    pK184-TRAF 55-247 -对于 5'- TACG CATATG ATGGCCGCACTGCAGACGG -3'
    pK184-TRAF 55-247 5'- TACG CATATG TCCTGACGCCGGAAAAATAAAGCAGCAGAGTAA -3'
    †表改编自伦托等。 2016年35许可
    * TRAF悬垂区域斜体。限制酶位点加有下划线(HindⅢ位:AAGCTT,EcoRI位:GAATTC,NdeI位:CATATG)

    表2:本研究中使用的引物列表。

    供体质† 回收质粒 结合子‡§(细胞毫升-1) 配合Efficiency§||
    pOX38锝ΔtraF::厘米没有 0 0
    pOX38-TçΔtraF::厘米 pK184 0 0
    pOX38锝ΔtraF::厘米 pK184-TRAF 5×10 3 0.0167
    pOX38锝ΔtraF::厘米 pK184-TRAF 55-247 0 0
    *表改编自伦托等。 2016年35许可
    †供体细胞是大肠杆菌 XK1200,以3×10 7细胞毫升的平均浓度-1
    ‡收件人细胞大肠杆菌 MC4100。转导结合为阳性对照的数量是从10-5稀释。 0表示没有从10-2稀释转结合。
    对于每个构建体进行的两到四个交配实验§An平均。
    ||交配效率defin编按100供体细胞转导。 0交配效率表示没有从10-2稀释转导

    表3: 由TRAF缺失构建废止交配效率。

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    Discussion

    接合方法提供通过该细菌可以传播基因在挑战性的环境,如抗生素抗性标记的蔓延生长提供进化优势的装置。因为许多接合型质粒的是如此之大,在通过靶基因的突变对接合型质粒本身涉及的传送装置的组件中的蛋白12的功能的研究是非常笨重。本文详述的协议提供了通过其中一个可以更容易地通过使用更小,更容易管理的表达质粒( 图1)的评估的目的靶基因的方法。我们采用在F质粒衍生pOX38-TC( 表1)研究˚F质粒介导的结合;其他接合质粒可以使用这里详细的协议和相应的衍生质粒进行研究。概述的交配实验已经改编自弗罗斯特和他的同事,42与一些modificati附件。在以前的研究中,8,33,42所述的pOX38锝Δgene::厘米构建体的创建是通过用合适的限制性酶切割的感兴趣的基因和插入扩增的CAT盒插入pOX38锝实现。 42在目前的方法,我们采用的重组工程大肠杆菌 DY330R 33,34同源重组敲除的靶基因,并与CAT磁带替换它。这具有允许所得DY330R应变窝藏pOX38锝Δgene::厘米构造充当用于特定基因敲除的控制的优点进行的F-T4SS介导的经由传输使用pK184基因恢复质粒回收接合转移。而有可能产生使用CRISPER-Cas9方法,43击倒我们没有在这个时候探讨这种可能性。

    该过程的F衍生质粒pOX38锝基因敲除的产生开始(FIGURË1)。这是通过在DY330R细胞同源重组( 表1)来实现,也可以使用具有类似的功能,如DY329,DY331和DY378其它菌株。引物最初设计PCR扩增从pBAD33质粒32对CAT盒和包含悬垂是特异于靶基因( 表2)的碱;然后将PCR产物电穿孔到DY330R细胞携带pOX38锝。同源重组产生敲除质粒pOX38锝Δgene::其中CAT盒被插在帧中的靶基因内,有效地破坏T4SS组件和缀合,同时提供Cm抗性厘米。同时,靶基因的PCR从pOX38锝扩增并插入到小表达质粒;在这个协议中,我们使用pK184用于组成型表达,但如果需要,人们可以选择质粒与靶基因的诱导表达。然后pK184基因质粒转化入DY330R pOX38锝Δgene::厘米细胞,这些细胞随后被用作供体转移pOX38锝Δgene::厘米经由缀合构造成XK1200细胞交配测定。在交配试验中,供体和受体细胞是XK1200 pOX38锝Δgene::分别Cm和MC4100。在pK184基因恢复的质粒,以及靶基因(缺失或点突变)的系列的突变体,提供给供体细胞,以评估其恢复交配,并确定其效率的能力,用MC4100受体细胞( 图2 ;表3)。

    关键的步骤是利用适当的供体和受体菌株( 表1),和所使用的引物的设计。对于设计各引物,有应该遵循的一般准则。而我们严格尝试用40-60%的GC含量遵守,这可能不总是可能的。在这样的情况下,它是实验者的判断来测试的引物瓦特第i GC含量稍低于或高于此范围。正向和反向引物的熔化温度(T M)必须是相似的,和退火温度(T A)的值应始终大于由2-5℃,用于PCR的Tm 低。自由能可用于允许发夹开发应比T 低得多,而均聚物和杂二聚化的Tm的必须非常低(低于-10千焦和30℃)。引物可以被设计为期望的探测缺失,插入或点突变。它当然是至关重要的是,所得的基因构建被放大并连接到在框架中,使得它被适当表达的恢复质粒。感受态细胞转化可通过电穿孔或热休克使用或电感受化学感受态细胞分别进行。我们发现,电是大型结构,如pOX38-TC和同源重组oligonucle更高效otide,而较小的表达质粒如pK184-TRAF可以容易地转化为利用热休克方法细胞。最后,要记住,会有在整个协议使用多种抗生素,因为这两个供体和受体菌株需要不同的电阻是从在接合和回收的质粒所用的那些不同,它是重要的。

    除了此处所描述的配合检测技术,但是也有一些用于研究接合等方法,在他们的方法稍有不同。水平基因转移是一种工艺,其中的细菌的质粒转移到受体细胞,包括种间的收件人。 44达尔伯格和同事例如使用44接合确定物种间的基因水平转移的程度的研究。他们利用绿色荧光蛋白(GFP)的成克隆到KT2442细胞质粒掺入;染色体在KT2442细胞交流I Q基因抑制GFP表达。当质粒携带绿色荧光蛋白被转移到一个物种不与lac I Q基因,荧光观察。 44尽管其限制,以提供在不同物种的蛋白质的特定功能时,种间偶联实验也可能会被加上这里提出以使对于不同物种之间的蛋白质-蛋白质相互作用的进化预测的协议。

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    Disclosures

    作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

    Acknowledgments

    这项研究是由来自加拿大的自然科学与工程理事会授予发现(NSERC)的支持。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
    GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
    GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
    Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
    Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
    Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
    Electroporator Eppendorf 4309000027
    Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
    Enzymes
    AvaI New England Biolabs R0152S
    EcoRI New England Biolabs R0101S
    HindIII New England Biolabs R0104L
    NdeI New England Biolabs R0111S
    Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
    T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
    DpnI New England Biolabs R0176S
    Antibiotics Final Concentrations
    Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
    Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
    Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
    Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
    Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
    Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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