SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale
Biochemistry
 

Summary

小角X線散乱(SAXS)によるタンパク質の溶液構造の決意は、単分散のサンプルを必要とします。オンラインサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)とオンラインイオン交換クロマトグラフィー(IEC):ここでは、2つのサンプル調製およびデータ収集の間の最小遅延を保証する可能性を提示します。

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Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

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Abstract

生物学的な小角X線散乱(BioSAXS)を溶液構造、粒子のサイズおよび形状、および高分子の表面対体積比を決定するために使用される分子および構造生物学における強力な技術です。技術は、濃度、pH値、イオン強度、温度、添加剤などの広範囲にわたる溶液条件の非常に広範囲に適用可能であるが、試料が単分散であることが必要です。この警告は、SAXSのビームライン上の液体クロマトグラフィーシステムの導入につながりました。ここでは、ビームラインにサイズ排除(SEC)、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)の上流の統合を説明する、最適なバックグラウンド減算、およびデータ整理のための種々の方法。例として、我々はD5Nヘリカーゼドメインからなる、本質的なワクシニアウイルスタンパク質D5の断片上sec-およびIEC-SAXSを使用方法について説明します。我々は番目の六量体構造を示し、その全体的な形状及び分子量を決定しますEタンパク質。

Introduction

BioSAXSは、ナノサイズの物体1-4の形状を決定するための強力なツールです。 nmの範囲内の大きさの巨大分子を含む溶液によるX線の散乱は、非常に低い角度で記録されます。この角度範囲は、グローバルパラメータに関する情報が含まれています:回転半径を、最大の粒子内の距離。粒子形状。そして、折りたたみ、変性、または障害の程度。技術は、結晶を必要とせず、高分子が溶液中に留まり、従って、例えば、これらの要因の知識を判断するのに役立つ可能性があるのイオン強度、pH、などの細胞の特定の重要なパラメータを模倣する条件下で維持することができ、または、目的のタンパク質の生理学的に関連性のオリゴマー状態は、複合体の提案モデルの妥当性を検証します。異なる緩衝液条件でのタンパク質 - タンパク質相互作用の特徴付け、不足しているドメインのモデルの作成、相同性モデルの改良、およびデ個別の折り畳まれ展開状態の終了を迅速かつ容易5行うことができます。

未解釈のデータを生じ得る凝集または変性試料は、粒子の混合物を、不均質サンプル、放射線損傷、およびバッファの不一致:任意の技術と同様に、BioSAXSは、固有の弱点を有しています。多くの分析法のために、暗黙のうちに、試料は、実際に得ることはしばしば困難である要件は、単分散であることが想定されます。多くの場合、サンプルの分解は微妙であり、独自のデータで検出することができず、データを解釈しようとすると、不正確な、あるいは誤った結果を与えます。これらの障害を克服するために、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびSAXSの組み合わせは、データの品質を保証するために、ますます困難試料6-11については、この技術をよりアクセス可能にする多数のビームライン上で実施されました。最近、我々はオンラインでのイオン交換を開発することによって、レパートリーに新しいメソッドを追加しましたクロマトグラフィー(IEC)は、SAXS 12共役型。両方の技術は分析する以前は不可能生物学的粒子の広い範囲にSAXSを開いています。使用する方法の選択は、目的の粒子の生物物理学的特性に依存します。

SECは、見かけの分子量の少なくとも10%の差が分離のために必要とされるサイズ、によって高分子を分離します。カラムとサンプルの生理学的特性の物理的な限界は、疎水性表面、柔軟性、および安定性の欠如のように、また、データの収集、分析、および解釈を複雑にします。

従って、それらの電荷に基づいて分子を分離し、イオン交換クロマトグラフィーは、IECカラムへの結合親和性は、代わりに、またはSECに加えて使用することができます。全電荷は容易に制御エルための比較的簡単な方法を提供し、pHを変化させる、または緩衝液の塩濃度を変化させることによって操作することができますIECカラムから分子のution。電荷を用いて、他の方法で分離することが困難であろう類似の種類や分子の大きさの分離は、IECで日常的に行うことができます。また、IECは、一つのタンパク質を変性させるの潜在的リスクを伴う濃縮工程を回避することができ、希釈した試料を扱うことができるという利点を有します。電荷分布は非常にサンプルに依存しているとして残念ながら、IECは、pHや塩濃度13,14についての最適化が必要。

発現、精製、またはその両方することは困難であり、多くのタンパク質については、サンプルの唯一の低量は勉強するために利用可能です。効率的であることがあり、したがって、損失を精製工程の数を最小化しすることが重要です。この理由のために、最後の精製工程は、良好なデータセットを収集する可能性を高めるために、従来のSAXSデータ取得に直接オンラインです。

ここに、我々は提示し、オンラインSEC-SAXSとIEC-SAXSを比較します。両方の技術はグルノーブル、フランス15の欧州放射光施設(ESRF)でBioSAXSビームラインBM29上に実装されました。テストケースとして、我々は他の方法を用いて構造的に分析することはかなり困難であったワクシニアウイルスタンパク質D5のD5Nおよびヘリカーゼドメインを使用していました。ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のファミリーのメンバーであり、痘瘡ウイルス、天然痘の原因98%同一です。ワクシニアシステムを使用して、我々は本質的なヘリカーゼプライマーゼD5にここに焦点を当て、複製機構を研究しています。

D5は、システインクラスター領域(解像度。240から345)16に続いて、N末端archeo-真核生物ゼ(AEP)ドメイン16と95-kDaのタンパク質です。さらに(RES。460から785)C末端がD5Nドメイン常にD5型ヘリカーゼと関連している(RES。340から460)、そして最後にスーパーファミリー3(SF3)ヘリカーゼドメインを来に向けて17(FigurEの1A)。 D5のヘリカーゼドメインはタイトなDNAへの結合のために必要とされる六量体環構造を構築します。最近SAXSおよびEM研究のおかげで、プライマーゼおよびヘリカーゼドメインの低解像度構造は、現在18知られています。

ここでは、D5のC末端断片(残基323から785)の構造への洞察を得るためにESRFでBioSAXSビームラインBM29上に実装され、オンラインでのクロマトグラフィー技術を使用する方法を示しています。

Protocol

1.オフラインの準備の説明とD5削除タンパク質のサンプルの生成

注:D5 323から785構築物( 図1A)をクローニングし、発現、および18に記載されているよう精製しました。

  1. pProEx HTBベクターに構築物を複製します
    1. 製造業者の助言以下5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'および5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3'プライマーおよびポリメラーゼを用いたPCR反応混合物を、使用D5Rのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行います。
    2. 製造元の助言に従い、スピンカラムを介してPCR断片を精製します。
    3. 緩衝液組成及びインキュベーション時間に関する製造業者の推奨に従って、NcoIおよびHindIII制限酵素でPCR断片とプラスミドを消化。
    4. 0.5×TAE緩衝液(20mMのTris、10mMの酢酸、1%アガロースゲル上で断片を実行しますおよび0.5mM EDTA)およびDNA色素でゲルを染色します。
    5. UV光にゲルを公開します。
      注意:個人の安全装置を着用してください!メーカーの推奨に従って、消化したPCR断片のバンドと消化されたプラスミドを切り出し、ゲル精製スピンカラムキットを用いてDNAを精製。
    6. 製造業者の推奨に従って、迅速ライゲーションキットを用いてプラスミドに精製されたPCR断片を連結。
    7. プラスミド増幅のために最適化されたコンピテント細菌への連結反応からの熱ショックを経て製品を変換します。
      1. 細菌のバイアルにライゲーション産物の半分を追加します。
      2. 20分間氷上で反応チューブをインキュベートします。
      3. 30秒間42℃でチューブをインキュベートします。
      4. 2分間氷上にチューブを置きます。
      5. 抗生物質を含まないルリア・ベルターニ(LB)ブロス(ミラー)の1 mLを加え、細胞を1時間、37℃で回復しましょう。
      6. 16,100×gでのfoで細胞をスピンダウンR卓上マイクロチューブ遠心機で3秒と媒体の大部分を除去。
      7. アンピシリン(50μgの/ mLの最終)を含むLB寒天プレート上に細胞を広げ、コロニーを37℃で一晩成長させ。
    8. アンピシリン(50μgの/ mLの最終)とLBの3 mLの中にコロニーを入れ、一晩160 rpmで振とうしながら、37℃で培養物を成長させます。
    9. プラスミドを抽出するためのミニプレップキットの指示に従ってください。
    10. 配列決定のためのプラスミドのサンプルを送信し、変異の不在のため、正しい挿入するためのシーケンスを分析します。
    11. pProEx HTB D5 323から785は、タンパク質発現のために最適化された細菌に構築(1μLを使用して、ステップ1.1.7の手順に従ってください)変換します。アンピシリン(50μgの/ mLの最終)を含むLB寒天プレート上に細菌を広げます。
    12. 出発培養物を作成するには、アンピシリン(50μg/ mlの決勝)でLB 300mLに1つのコロニーを入れて、160 Rで振盪し、37℃で細菌を育てます午後一晩。
  2. OD 600 = 0.3に達するまで、アンピシリンの存在下でのLBの12×1 L(最終を50μg/ mL)を、37℃でpProEx HTB D5 323から785菌スターターカルチャー20mLの各を接種します。 18℃まで温度を低下させ、1mMのIPTGでOD 600 = 0.5で発現を誘導します。 160 rpmで、18°Cで一晩、それらを振って、文化をインキュベートします。
  3. 30分間50,000×gで、4℃での遠心分離によって細菌を回収。 (50mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、5mMのMgCl 2、10mMのβメルカプトエタノール、および10%グリセロール)1×プロテアーゼ阻害剤と、25単位(溶解緩衝液約150mLに細菌ペレットを再懸濁U)/ 10mLのDNアーゼ。溶解氷上で超音波処理を介した細菌(1インチプローブ、50%のパワー、0.5秒パルス、0.5秒休止、3×5分)。
  4. ニッケル親和性カラム(ニッケルカラム、1.5 mLのベッドボリューム)上に上清をロードし、Bの10カラム容量(CV)でそれを洗浄します緩衝液(50mMのTris-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10mMのβメルカプトエタノール、および10%グリセロール)、洗浄緩衝液(50mMのTris-HCl [pHが7]、1MのNaCl、10のCVをinding mMのβメルカプトエタノール、および10%グリセロール)、およびイミダゾール洗浄(50mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10mMのβメルカプトエタノール、10%グリセロール、30 mMイミダゾール)の10 CV。 D5 323から785(20mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10mMのβメルカプトエタノール、10%グリセロール、及び200mMイミダゾール)を溶出します。
  5. ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) - ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を介して別の精製工程を点検します。
    1. (4%SDS、20%グリセロール、120mMのトリス-HCl [pH6.8の]、および青色0.02%重量/体積ブロモフェノール2×)10上の各精製工程のフロースルー混合1Xローディング色素との負荷2-20μL %SDSゲルおよびバッファー(25 mMトリス、0.192 Mグリシン、および0.1%SDS)を実行して1×レムリで200 Vでそれらを実行します。
    2. すぐに使用できるクマシーブルー溶液でゲルを染色します。
  6. EXCハンゲ、製造元のマニュアルに従って脱塩カラムを用いて、結合緩衝液で溶出したタンパク質のバッファー。
  7. タンパク質溶液にタバコエッチウイルス核封入、エンドペプチダーゼ (TEV、タンパク質1ミリグラム/ 100 mg)を添加することによって、Hisタグを切断します。室温で一晩インキュベートします。
  8. SDS-PAGEを行うことにより、消化をチェックする(ステップ1.5を参照してください)
  9. 結合緩衝液中のNi-カラムを平衡化します。タンパク質溶液を通過させるフロースルーを収集しながらイミダゾール洗浄バッファー2 CVでビーズを洗浄します。
  10. 0.5 mLの最終体積に遠心濃縮器を用いてタンパク質を濃縮します。
  11. ゲル濾過緩衝液で平衡化したサイズ排除カラム上に濃縮されたタンパク質を注入(20mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10%グリセロール、及び1mMジチオスレイトール[DTT])。
  12. フロースルー0.5-mL画分中を収集します。
  13. によって、ピークサンプル中のタンパク質の存在および純度を確認しますSDS-PAGEを行う(ステップ1.5を参照してください)。
  14. D5 323から785の溶出ピークの画分を兼ね備えています。一定のトリスとDTTの濃度を維持しながら、20mMのトリス-HCl中のタンパク質溶液5mL [pHが7]、150mMのNaCl、10%グリセロール、及び1mM DTTため(25mMのNaCl及び5%グリセロールにサンプルを希釈します最初の20mMのTris-HCl 5mLの[pHが7]および1mM DTTを追加し、20mMのトリス-HCl [pHが7]、5%グリセロール、及び1mM DTT)の20 mLを加え。
  15. イオン交換カラムにサンプルをロードします。バッファ使用(20mMトリス[pHが7]、25 mMの塩化ナトリウム、5%グリセロール、及び1mM DTT)及び緩衝液B(20mMトリス[pHが7]、1 MのNaCl、5%グリセロール、及び1mM DTT) 1 Mに25ミリモルの塩勾配を形成します
  16. 1.5-mL画分に溶出したタンパク質を収集します。
  17. (ステップ1.5および図1Bを参照)SDS-PAGEを行うことにより、ピークサンプル中のタンパク質の存在および純度を確認します
  18. 0.5 mLの最終体積に遠心濃縮器中のタンパク質溶液を再濃縮。
  19. Rerunは、ゲル濾過緩衝液中のサイズ排除カラムで濃縮されたタンパク質(20mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、5%グリセロール、及び1mM DTTは、ステップ1.11参照します)。

2.データ収集

注:可能な限り早期にビームタイムを要求します。 ESRFのために、利用可能なアクセスタイプにして、アプリケーションを提出する方法のガイドラインで発見することができます:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying 。実験のための提案と招待の受諾した後、すべての参加者は、安全教育を完了する必要があります。訓練の検証の後、サンプルに必要な安全性情報と共に、実験のためにビームラインを客員研究員を宣言する(ESRFユーザポータルを介して)「A型」に記入。実験を議論するために地元の担当者にお問い合わせください。

  1. SEC-SAXSデータ収集
    注:ONLについてINEの精製は、BM29に設置高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムを使用します。システムは、インライン脱気装置、バイナリーポンプ、バッファ選択やグラデーション、オートサンプラー、UV-VISアレイphotospectrometer、および伝導度のためのバルブで構成されています。これは、直接SAXS露光ユニット19のフロースルー毛細管に装着されています。
    1. 脇ゲルろ過緩衝液1mlを入れてください。 SECシステムにバッファボトルを接続します(デフォルトはポートAです)。
    2. 使用中の列に応じて流量を選択してください。注:ここで使用されるサイズ排除カラムは、流速は0.1ミリリットル/分です。カラムの最大圧力を定義し、背圧のノートを取り、少なくとも1.2 CVに取得時間を設定します。
    3. 「自動パージ」機能を経由してポンプと上流管をフラッシュします。
    4. システムは緩衝液で満たされるまで待ってから、カラムを接続します。少なくとも1.5 CVを通過させることにより、カラムを平衡化します。
    5. インターロックハッチと放射線損傷に起因する信号の変動を制御するために、サンプルチェンジャーを使用して、ステップ2.1.1に確保されたバッファを測定します。バッファへの放射線損傷がない場合にのみ継続。
    6. HPLCモードにビームラインの制御システムを切り替えます。フレームあたり1秒で200フレームを収集し、バッファのテストランを行います。加算された強度プロットに検出器によって与えられたカウント数を書き留めます。
      注:信号は、以前に測定されたバッファと一致する必要がありますし、時間をかけて加算された強度は一定のままであるべきです。信号が一致しないか、または一定でない場合、システムのより長い平衡化が必要とされます。
    7. 少なくとも10分間、卓上マイクロチューブ遠心機で13,000×gでサンプルをスピンダウン。
    8. (提供)HPLC互換のガラスバイアルに試料を充填し、自動注入器に入れて。井戸の位置に注意してください。
    9. ユーザーの安全に関する研修で説明したように、標準的な手順を使用して実験ハッチを連動。
    10. ログインし、ビームライン制御ソフトウェアを介してデータ保存用のフォルダを作成します。
    11. プログラム「クイックバッチ」機能を使用してHPLCシステム。ステップ2.1.10で作成したフォルダにUVデータを保存する場所を設定します。同じフォルダにASCIIファイルを格納し、UVデータの自動ASCII変換を活性化することを確認します。
      1. 注入量とよく位置を選択します。 「スタート」ボタンを押して、キューに測定を追加します。ソフトウェアは、バッチを保存するように要求されます。保存のための準備が、これは自動的に測定を開始するように、「保存」ボタンを押さないでください。
    12. ビームライン制御ソフトウェアのデータ収集パラメータを設定します。総データ収集時間は、ステップ2.1.2で定義された取得時間のわずかに過剰であるようにフレーム数を選択します。
    13. 安全シャッターを開き、ビームライン制御ソフトウェアを使用して、SAXSデータ収集を開始。データがCORであることを確認しますrectly取得しました。ステップ2.1.6で収集したデータに新たに収集したデータを比較し、加算された強度のカウント数は、少なくとも100フレームのために一定のままであり、ステップ2.1.6からの値と一致していることを確認してください。
      1. SECは、ステップ2.1.11で調製し、「保存」ボタンを押すことで実行開始し、注入が完了し、UVデータ収集が開始されたときにcamserverソフトウェアに表示されているフレーム番号をメモします。
    14. データ収集後、オープンで「データ収集」タブをISPyBデータベース20を開き、データセットと自動解析21の結果にアクセスするには、「戻る」ボタンを押してください。
  2. IEC-SAXSデータ収集
    注:代わりに、一般IEC実験に適用され、連続線形勾配は、バッファBの量が予め設定された離散的なステップで増加させる段階的勾配を用います。
    1. samplためのHPLCプログラムを作成します。電子空きバッファラン。プログラム段階的勾配0%緩衝液Bから開始し、バッファBが100%に達するまで、2 CV後に5%ポイント増加します。
    2. 脇各バッファの一部を入れてください。ポートAへの低塩緩衝液AとポートBへの高塩緩衝液Bで1とボトルを接続します
    3. 流量を選択し、列(この例では、1mL /分)の圧力限界以下とどまります。
    4. ステップ2.1.3のように、「自動パージ」機能を使って、ポンプや上流のチューブをフラッシュします。
    5. 低塩緩衝液A中でシステムを平衡化する(ステップ1.15参照)、イオン交換カラムを接続します。カラムは完全に(少なくとも1.5 CV)を平衡化されるまで待ちます。
    6. ステップ2.1.5のように、サンプルチェンジャーを使用して、放射線損傷のための緩衝液A及びBを調べるために、ステップ2.2.2で確保されたバッファを使用してください。
    7. ステップ2.1.6のように、カラムから出てくるバッファを確認してください。ステップ2.2.6で記録された緩衝液Aの信号に信号を比較してください。再び注意加算された強度プロット内のカウント数。
    8. バッファの実行のためのデータ保存用のフォルダを作成します。
    9. HPLCシステムモードでデータ収集を設定します。総データ収集時間は、IECの実行の合計時間を超えているように、フレーム数を選択する(ステップ2.2.1を参照)。
    10. 安全シャッターを開き、SAXSデータ収集を開始。それが正しく進行していることを確認して、加算された強度は、少なくとも100フレームのためのステップ2.2.7で述べた値で一定のままであることを再確認してください。
    11. HPLCソフトウェアの「単一ファイル名を指定して実行」機能を使用し、ステップ2.2.1でプログラム段階的勾配を開始します。注射のために、この段階で何のサンプルを注入しないために、-1にバイアル番号を設定します。プログラムが起動すると、取得したフレーム数を書き留めます。
    12. サンプル実行のためのHPLCプログラムを作成します。プログラムステップ1.1.5でオフライン測定バッファB.見積もりの​​0%から各ピークのバッファBの割合を開始する段階的勾配( 図1C)のためにそれぞれ設定します。 2.5 CVのための100%緩衝液Bでの最終ステップを追加します。
    13. 少なくとも10分間、卓上マイクロチューブ遠心機で13,000×gでサンプルをスピンダウン。
    14. 20mMのトリス-HCl [pHが7]、10%グリセロール、及び1mMのDTTと混合することにより、バッファA(25mMの)の塩濃度に希釈D5 323から785。
    15. カラムに手動でサンプルをロードします。気泡の形成を回避するために、ポンプを一時停止した後、希釈した試料中にバッファに入力されたチューブを入れてください。直接フロースルーカラムからを収集するために、検出器からカラムを取り外します。
      1. 試料容器がほぼ空になると、バッファA(チューブを移動させながら、再びポンプを一時停止)に入力されたチューブを返し、カラムにチューブからサンプルを転送するために緩衝液Aでポンプを再起動します。全サンプルは、一旦ロードされ、緩衝液Aの2 CVを通過し、その後、検出器にカラムを再接続します。
    16. サンプル実行のために、データ保存用のフォルダを作成します。
    17. 安全シャッターを開き、SAXSデータ収集を開始。データ収集が正常に進行していることを確認して、加算された強度は、少なくとも100フレームのためのステップ2.2.7で述べた値で一定のままであることを再確認してください。
    18. ステップ2.2.12でプログラム段階的勾配を開始するために、HPLCソフトウェアの「単一ファイル名を指定して実行」機能を使用します。注射のために、この段階で何のサンプルを注入しないために、-1にバイアル番号を設定します。プログラムが起動すると、取得したフレーム数を書き留めます。
    19. オープンISPyB 20の「データ収集」を押して、データセットと自動分析21を見て「行きます」。
    20. 「ポストラン解析」ソフトウェアを使用してASCII形式にHPLCシステムからのUVデータをエクスポートします。

3。SEC-SAXSデータ削減と解析

  1. 「移動」ボタンを押すことによりISPyBにおけるデータ収集中のデータを開きます。 SAXSデータ収集のフレームは溶出ピークに対応概要で決定します。回転半径がピークを通して安定であることを確認します。
  2. 自動化されたバッファの補正が正しく行われたことを確認してください。実験SAXSデータファイル22で操作を行い、それらを平均化プログラムにピークの中心部からロードフレーム。その後、自動的に生成されたバッファのファイルをロードし、平均フレームの高Q領域とバッファフレームが一致するかどうかを確認してください。
  3. CORMAPテスト23を使用して定量的にピークを通して取得したフレームを比較してください。
    1. 関心領域をカバーするフレームが自動的に作成減算(* _sub.datファイル)をロードします。
    2. 「スケール」ボタンを押すことによって、相互にそれらをスケール。
    3. 比較例「データの比較」機能を使用して電子。ピーク全体でフレーム間には系統的な変化があってはなりません。
  4. 、関心のあるすべての* -_ sub.datフレームを開き、「マージ」ボタンを使用して、それらをマージし、.datファイルの形式でマージされたファイルを保存します。
  5. 低解像度でのデータの後のトリミングのためのギニエ範囲内の最初のデータ点を指摘し、プログラム中の「半径旋回」ツールで回転半径を決定します。
  6. プログラム中の「距離分布」ツールと対距離分布関数を決定し、gnom.out結果として得られるの.outファイルを保存します。

4. 第一原理モデル

  1. Unixマシンでは、対称性の制約を受けることなく40× アブイニシオモデルの再構築プログラムを実行します。新しいフォルダを作成し、そこにgnom.outファイルをコピーします。次のようにプログラムを実行します。
    以下のための((I = 1; iは= 40 <;私は++)); gnom.out -ms -p dammifp1_ $私dammif行います。 D1
  2. 同様に、2番目のフォルダ内の6回対称のための対称性制限のある第一原理モデルの再構築プログラムを実行します。
    以下のための((I = 1; iは= 40 <;私は++)); DO dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $私;終わりました
  3. すべての第一原理モデルの再構築プログラムの出力ファイル(* -1.pdb)を合わせます。ステップ4.1および4.2からの2つのフォルダでは、damaver -a * -1.pdbを実行します。
  4. すべてのモデル(damaver.pdb)の組合だけでなく、適切な分子可視化ソフトウェア26に正しいボリューム(damfilt.pdb)にフィルタモデルを開き、それらを比較。
  5. テキストエディタでdamsel.logファイルを開きます。ファイルの一番下にある「参照」と記載されているモデルは、最も代表的なモデルです。

5. IEC-SAXSデータ削減、分析、およびモデル

  1. 実験SAXSデータファイル22で操作を行うプログラムでは、負荷約50 SAXSは、それぞれの混合工程からフレームバッファラン、「AVERAGE」ボタンを押して、結果を保存します。
  2. ISPyBを介して利用可能な自動処理結果に基づいて、実験のフレームは、タンパク質の溶出に対応し、旋回の(予備)半径がピーク全体で安定していることを確認している特定します。
  3. 実験SAXSデータファイル操作プログラム22にフレームをロードし、バッファフレーム(ステップ5.1を参照)のために行われるよう、それらを平均します。次に、ステップ5.1で生成されたバッファ・ファイルをロードし、ピークからの平均と一致するバッファを見つけるために、(4.2ナノメートル-1以上)高いQの領域を比較します。
    注:ピークからの平均とバッファ間のオフセット体系があってはなりません。サンプル曲線は、2つのバッファカーブの間に入るように思われる場合は、平均値を算出することにより、それらの曲線を補間します。
  4. ピーク画分の平均散乱曲線からベストマッチとして識別バッファを減算し、その結果subtrを保存ファイルを務めました。また、減算の誤差を推定するために、前後の混合工程から平均バッファ曲線を用いてサブトラクション曲線を作成します。
  5. 繰り返しは、ピークの左半分と右半分のために個別に5.3および5.4ステップと、ピーク全体で信号の安定性を確認するためにステップ5.4からのものと結果を比較します。
  6. ステップ5.4から手順をすべての3つの減算の曲線3.5および3.6に従ってください。
  7. すべての3つの減算の曲線の結果を比較してください。
    注:引き算の誤差内で堅調結果だけを信頼することができます。
  8. ステップ5.3で識別された最良の減算のためのステップ4.1と4.2のようにモデリングを行います。
  9. モデルを整列させるために、最も代表的なものを識別するために、4.5にステップ4.3に従ってください。

結果の6.比較

  1. SECの代表的なモデルで12の 3D構造を重畳するためのプログラムを実行し(ステップ4.5)AND IEC-SAXSデータ(ステップ5.9)P6の対称性を持つ:supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. 分子可視化ソフトにmodel_sec.pdbとmodel_iec-r.pdbをインポートします。
  3. modelsec.pdbの.firファイルやスプレッドシートのmodeliec-r.pdbを開き、実験と計算された散乱曲線の2Dグラフを作成します。

Representative Results

モデルフリー不変分析の結果を表1に記載されています。 D5 323から785 SEC-SAXSデータの分析は、338 kDaの対345キロダルトンの(Porod分析からの)分子量の推定値を示し、IEC-SAXSを用いて観察しました。両方とも、ヘキサマーのための6倍の53.5キロダルトン(321キロダルトン)の予想質量と一致しています。両方のデータセットの第一原理モデリングはなし課さ対称で行われた(SEC-SAXS:χ2 = 0.88、IEC-SAXS:χ2 = 3.1)とC6の対称性を用いて、(SEC-SAXSを:χ2 = 1.0、IEC-SAXS :χ2 = 4)。両方の再構成のための散乱データの全体的な適合が、両方の場合( 図1D及びE)に匹敵するように、C6対称性を仮定することができます。したがって、このモデルは、部分的に(SEC遮ら表示され、中央チャネル、と六角形の円錐状の構造に対応します。 図1F; IEC: 図1H)。平均化の前に、個々のモデルの検査は、この障害は、平均化処理のアーチファクトである可能性が高いことを示しています。

図1
1:SAXS データ分析およびD5 323 -785(参考文献12および18から適応図) の比較 。 D5タンパク質とD5 323から785A)概略ドメイン構造。 B)3のピークの表示とオフラインイオン交換クロマトグラム。オレンジ色の曲線:280nmの(AU)、青色の曲線の吸光度:ピークのバッファBのバッファB.パーセンテージの割合が示されています。 C)オンラインイオン交換クロマトグラム。 B.のようにカラーキーはさらに、測定された強度は、緑色で表示されます。実験的散乱曲線aND SEC-SAXS D)及びIEC E)D5 323から785までのデータの解析によって得られたモデルの曲線を計算しました。 SECデータとG)IECデータに基づいて、D5 323から785F)ビーズモデル。 SECおよびIECモデルのH)オーバーレイ。 F内のパネル)Hへ)は、分子可視化ソフトウェア24を使用して作成されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

データ収集パラメータ
楽器: ESRF BM29
波長(Å) 150
Q-範囲(Å-1) 0.0032から0.49
サンプル・ツー・検出器までの距離 2.864メートル
露出時間(秒) フレームあたり1
濃度域
温度(K) 293
検出器ピラトゥス1M(Dectris)
フラックス(光子/秒) 1×10 12
ビームサイズ(μmの2) 700×700
D5 323から785、SECのための構造パラメータ
I 0(-1)[ギニエから] 0.0237
RG(Å)[ギニエから] 48
R g最小 Q -ギニエに使用Q 最大 R g 0.77から1.24
D 最大 (Å)[P(R)から] 145
P(R)(Å-1)のために使用されるQ-範囲 0.02から0.17
Porod体積V P(A 3)[散布から] (570±5)10×3
分子質量M R(kDaの)[V pから] 345
シーケンスから計算された単量体氏(kDaの) 321
D5 323から785、IECのための構造パラメータ
I 0(-1)[ギニエから] 0.386
RG(Å)[ギニエから] 46.5±0.1
R g最小 Q -ギニエに使用Q 最大 R g 0.44から1.29
D 最大 (Å)[P(R)から] 120
P(R)(Å-1)のために使用されるQ-範囲 0.03から0.18
Porod体積V P(&#197; 3)[散布から] (577±5)10×3
分子質量M R(kDaの)[V pから] 339
シーケンスから計算された六量氏(kDaの) 321

1:SAXS データパラメータ。テーブルには、SAXSデータ収集と分析のパラメータをまとめたものです。

Discussion

多くの巨大分子は、クロマトグラフィーを用いて、最終的な精製工程は、良質のデータセットを取得するためにSAXSデータ収集の前に必要とされます。しかしながら、全てのサンプルは安定したままで、彼らは、オリゴマー化状態の混合物に凝集または再平衡化する傾向があります。したがって、ビームラインの最終オンライン精製工程は、最高の品質のSAXSデータを得るために、精製し、データ収集の間の時間を最小化するために必要とされます。関心対象のタンパク質の生物物理学的特性に依存して、SEC-SAXSまたはIEC-SAXSは、最適なサンプル品質が得られるように選択されるかもしれません。ここでは、ヘリカーゼ/プライマーゼD5由来タンパク質構築に、両方の技術を説明し、議論されています。

SEC-SAXSデータの取得は、より多くの標準化になって、多くのBioSAXSビームラインで使用可能です。データ分析、特にバックグラウンド減算は、比較的単純で簡単です。しかし、安定したバッファ信号そして、高分子種の十分な分離が不可欠まま。したがって、完全にカラムを平衡化するのに十分な時間を確保することが重要です。この方法の失敗は、目的のタンパク質と同様のサイズ、低濃度、および放射線に敏感なバッファの永続的な汚染物質であることができます。

実際には、最初に、SEC-SAXSは、ほとんどの高分子試料のための選択の方法として使用される可能性があります。それでも、多くの精製プロトコルは、汚染物質または凝集の存在による前IECステップを必要とします。各濃縮およびクロマトグラフィー工程は、試料(30〜50%と推定される)と、時間の損失と関連していることを考えると、直接IEC-SAXSが有利です。 SECによって精製することができないサンプルについては、原因で同様の大きさの「汚染物質」の存在又はそれが必要な濃度で激しく集約、IEC-SAXSは、常により良い適したアプローチになるので、それをすること。また、より高い流量がサポート多くのIECカラムによって精製および測定間の通過時間を減らすのを助けることができます。ここで紹介する例では、IECは慎重に塩濃度のステップを選択することにより、汚染物質からD5 323から785の近いピークの分離を可能にする段階溶出で使用されました。原理的には、ステップの数は無制限ですが、実用上、ピークごとに少なくとも1ステップが必要であり、あまりにも多くはないが選択されるべきです。上述の背景差分法の場合は、一致するものを見つけるために別のバッファ組成物の比較的高い数を測定することが重要です。

両方の技術の共有欠点は、正確なタンパク質濃度情報の欠如です。これにより、前方散乱に基づいた正確な質量決意は不可能です。このようなD5 323から785のような球状タンパク質の場合、Porod量はあまり正確で、質量推定いえますが、非常に柔軟なまたは無秩序なタンパク質のために、代替手段を提供します、このアプローチは有効ではありません。

ここで提示段階的勾配IEC-SAXS法の変化ではなく、線形勾配を使用することです。段階的溶出を用いてサブピークを単離するために、所望の直線勾配法で、完全にSAXSを開始する前にピークを分離するために慎重に勾配条件を最適化するために必要とされることは、多くのステップで動作することが可能であるが実験。このアプローチでバックグラウンド減算は、フレーム単位に行うことができ、個々のフレームを比較することにより確認することができ、それは、より高度なデータ処理を必要とし、専用のソフトウェアがまだ存在していません。

それは巨大分子種の分離を決定するなどの適切な列の選択は、両方の技術のために重要です。イオン交換カラムは、種類や濃度が変化しながら、サイズ排除カラムは、充填容量、分離可能な巨大分子のサイズ範囲、および解像度が異なりますその固定化された電荷の。

ここで紹介するプロトコルはESRFビームラインBM29に固有のものですが、他のSAXSビームラインへの適応は、原理的には、簡単です。主な要件は、作成することができる十分に高いX線束秒以下の範囲内で合理的な信号対ノイズデータを取得するための適切な検出器(理想的には単一光子計数)、およびオンライン液体クロマトグラフィーシステムでありますグラデーション。正確な実装は、もちろん、ローカルビームラインの環境に依存します。

2つの方法を使用してD5 323から785に得られた結果が若干異なります。回転半径は、SECデータよりもIECデータに対して僅かに小さく、かつ散乱曲線の極小値は、わずかに大きい散乱ベクトルにシフトされます。これは、IEC-SAXSで測定D5 323から785は、SEC-SAXSでもう少しコンパクトD5 323から785よりも測定されることを意味します。これは、bの可能性がありますSEC精製したサンプル中の汚染物質への精製および測定の間の時間における試料調製の違いに起因する電子(IECが高速です)、または、可能性が低いです、。両方の方法で完全に独立して得られたビーズのモデルは( 図1H)程度です。 D5 323から785までは期待中空、六量構造18を示しいます。

結論として、オンラインイオン交換およびオンラインサイズ排除クロマトグラフィーは、SAXS 6,7,9-12,25,26に直接結合することができる重要な生化学的精製法です。 IEC-SAXSデータのバックグラウンド減算は、SEC-SAXSのためのよりもわずかに困難とあいまいですが、それにもかかわらず可能です。目的のタンパク質の生物物理学的特性に応じて、SECおよびIEC-SAXSの両方が固有の利点を有する種の分離の最適化を可能にします。検証ステップは、(説明したように)正確に観察されること、得られたデータを分析することができるウィットを提供H自信、およびモデルは、コミュニティ内で利用可能な標準ツールを使用して決定することができます。一緒に、両方の技術は、標準的な静的測定を介してアクセスされないデータを得、生体高分子の広い範囲のためのオンライン分離を可能にします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

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References

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